KR20130120965A

KR20130120965A - 락토바실러스 속 미생물의 마이크로캡슐화

Info

Publication number: KR20130120965A
Application number: KR1020120067349A
Authority: KR
Inventors: 조종수; 최윤재; 강상기
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2012-06-22
Publication date: 2013-11-05

Abstract

본 발명은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 미생물을 함유하는 마이크로캡슐 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 위장 내에서 장기간의 생존력을 갖는 락토바실러스 살리바리우스 29(Lactobacillus salivarius 29: LS29) 및 락토바실러스 플란타룸 25(Lactobacillus plantarum 25: LP25) 마이크로캡슐의 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

락토바실러스 속 미생물의 마이크로캡슐화{Microencapsulation of Lactobacillus sp. microbe}

본 발명은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 미생물의 마이크로캡슐화에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 락토바실러스 살리바리우스 29(Lactobacillus salivarius 29: LS29) 및 락토바실러스 플란타룸 25(Lactobacillus plantarum 25: LP25)를 유효성분으로 포함하는 마이크로캡슐의 제조방법에 관한 것이다.

유엔식량농업기구(FAO) 및 세계보건기구(WHO)에 따르면, 프로바이오틱스(probiotics)란 적당한 양을 섭취했을 때 인체에 이로움을 주는 살아있는 미생물을 총칭하는 말로써 우리 몸에 유익을 주는 균을 말한다. 용어 'probiotics'가 주장된지 10년이 지난 지금, 프로바이오틱 연구분야에서는 놀라운 발전이 이루어졌다. 프로바이오틱스는 변비, 병원성 박테리아 및 바이러스에 의해 야기되는 설사, Helicobacter pylori의 감염, 과민성대장증후군(inflammatory bowel syndromes) 및 장암(intestinal cancer)과 같은 위장관과 관련된 질환에서의 폭넓은 적용이 보고되었다(Bertkova I, Hijova E, Chmelarova A, Mojzisova G, Petrasova D, Strojny L, Bomba A, Zitnan R. The effect of probiotic microorganisms and bioactive compounds on chemically induced carcinogenesis in rats. Neoplasma, 2010;57:422―28. Chen X, Tian F, Liu X, Zhao J, Zhang HP, Zhang H, Chen W. In vitro screening of lactobacilli with antagonistic activity against Helicobacter pylori from traditionally fermented foods. J Dairy Sci, 2010;93:5627―34. Song HJ, Kim JY, Jung SA, Kim SE, Park HS, Jeong Y, Hong SP, Cheon JH, Kim WH, Kim HJ, et al. Effect of probiotic Lactobacillus (Lacidofil^® cap) for the prevention of antibiotic-associated diarrhea: A prospective, randomized, double-blind, multicenter study. J Korean Med Sci, 2010;25:1784―91. Choi SC, Kim BJ, Rhee PL, Chang DK, Son HJ, Kim JJ, Rhee JC, Kim SI, Han YS, Sim KH, et al. Probiotic fermented milk containing dietary fiber has additive effects in IBS with constipation compared to plain probiotic fermented milk. Gut Liver, 2011;5:22―8. Dutta P, Mitra U, Dutta S, Rajendran K, Saha TK, Chatterjee MK. Randomised controlled clinical trial of Lactobacillus sporogenes (Bacillus coagulans), used as probiotic in clinical practice, on acute watery diarrhoea in children. Trop Med Int Health, 2011;16:555―61). 그 뿐만 아니라, 알레르기, 심혈관 질환 및 비뇨생식기 질환에 있어서도 프로바이오틱스의 유익한 효과가 보고되었다(Thomas DJ, Husmann RJ, Villamar M, Winship TR, Buck RH, Zuckermann FA. Lactobacillus rhamnosus HN001 attenuates allergy development in a pig model. PLoS One, 2011;6:e16577).

유산균은 인간을 포함해 동물의 위장관내에서 공생하는 그람-양성 코스모폴리탄 박테리아이다 (Nomoto, 2005;Suzuki et al., 2008). 숙주에서 기생하는 유산균은 면역세포와의 상호작용, 전염증성(pro-inflammatory) 및 항염증성(anti-inflammatory) 사이토카인의 균형적인 생산을 유도함으로써 숙주면역력의 조화된 조절을 도울 수 있다(Chon H, Choi B, Lee E, Lee S, Jeong G. Immunomodulatory effects of specific bacterial components of Lactobacillus plantarum KFCC11389P on the murine macrophage cell line RAW 264.7. J Appl Microbiol,2009;107:1588-97).

대식세포(macrophage)는 미생물 구성요소에 의해 활성화되는 조직-기반의 식세포로서, 숙주면역에 있어 초기방어의 최초 개시에서 중요한 역할을 수행한다. 활성화된 대식세포는 여러 가지 전염증성 및 항염증성 사이토카인을 생산함으로써 숙주면역력을 조절하고 전염증성 및 항염증성 사이토카인의 균형적인 생산은 숙주면역시스템에 있어서 중요하다. TNF-α및 IL-6와 같은 사이토카인은 다양한 면역세포의 증식과 분화에 있어서 중요한 역할을 담당한다. 그러나, 이와 같은 사이토카인의 과잉생산은 불균형 자가면역력의 원인이 됨으로써 결국은 전염증성 특성에 의한 패혈성쇼크, 염증 및 세포독성을 야기시킨다(Brown KL, Cosseau C, Gardy JL, Hancock RE. Complexities of targeting innate immunity to treat infection. Trends Immunol, 2007;28:260-6).

프로바이오틱스로 흔히 이용되는 세가지 유산균으로는 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리아(Bifidobacteria) 및 연쇄상구균(Streptococcus)이 잘 알려져 있다(Islam MA, Yun CH, Choi YJ, Cho CS. Microencapsulation of live probiotic bacteria. J Microbiol Biotechnol, 2010; 20:1367―77). 이 중 락토바실러스는 농업산업에 있어 관심의 대상이 되고 있는데 특히 동물축산업의 경우, 사료첨가제에 대한 합성항생제 남용에 있어 잠재적인 대안으로서 각광받고 있다. 그러나, 심각한 위상태에서 락토바실러스의 섭취는 이의 생체이용률을 저하시키는 원인이 된다. 락토바실러스의 고분자 마이크로캡슐(microcapsule)화는 궁극적으로 생체이용률을 증가시킴으로써 심각한 위상태에서 생존하는 박테리아를 성공적으로 보호할 수 있다.

마이크로캡슐화를 위해서 여러 종류의 고분자 물질이 사용되고 있지만, 알긴산 나트륨(sodium alginate)과 그 유도체가 생존하는 박테리아의 캡슐화를 위해 가장 널리 이용되고 있는 생체고분자이다(Islam MA, Bajracharya P, Yun CH, Kim EM, Jeong HJ, Choi YJ, Kim EB, Cho CS. Mucoadhesive alginate/poly(L-Lysine)/thiolated alginate microcapsules for oral delivery of Lactobacillus salivarius 29. Nano Sci Nanotechnol, 2011;11:7091-5). 살아있는 박테리아의 캡슐화는 단지 심각한 위장상태에서 박테리아의 생존력을 증가시킬 뿐만 아니라, 제어 대상으로의 운반을 향상시키는 목적도 있다. 제어 대상으로의 운반을 위해서, 키토산 및 Eudragit과 같은 여러 가지 점액점착성 고분자가 코팅제로 사용되어져 왔다.

대한민국 공개특허 제2002-0084655호에서는 젖산균 YL-3(Lactobacillus fermentum YL-3)를 4% 알긴산과 혼합하여 캡슐화한 후 1% 키토산으로 코팅하는 캡슐 제조방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 특허문헌에 따르면, 키토산의 점성에 의하여 제조된 마이크로캡슐이 서로 응결되는 단점이 있으므로 이를 개선하기 위한 캡슐화 방법이 요구되어 왔다.

한편, 본 발명자들은 락토바실러스 속 미생물의 항균효과를 극대화 하여 그의 생체이용률을 증가시키기 위한 연구를 수행하여 왔으며 최근, 락토바실러스 속 미생물 중 락토바실러스 살리바리우스 29(Lactobacillus salivarius 29: LS29)를 Alginate/Poly-L-Lysine/Thiolated alginate 마이크로캡슐화 하는 방법을 개시한 바 있다(Islam MA, Bajracharya P, Yun CH, Kim EM, Jeong HJ, Choi YJ, Kim EB, Cho CS. Mucoadhesive alginate/poly(L-Lysine)/thiolated alginate microcapsules for oral delivery of Lactobacillus salivarius 29. Nano Sci. Nanotechnol, 2011;11:7091―5). 더욱 상세하게는, L. salivarius 29를 alginate로 마이크로캡슐화 한 후 Poly-L-Lysine으로 1차 코팅하고 Thiolated alginate로 2차 코팅하였다. 그러나, 상기 선행기술의 고분자 물질 Poly-L-Lysine을 사용하는 경우 인체 내 세포 독성의 문제가 있을 뿐만 아니라 고가의 생산비가 소요된다는 단점이 있어서 실용화 하기에는 문제가 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 락토바실러스 속 미생물을 마이크로캡슐화(microencapsulation) 함에 있어서, 생분해성이면서 세포 독성이 없고 저가로 마이크로캡슐화(microencapsulation) 하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 특히 위장 내에서 장기간의 생존력을 갖으므로서 생체이용률이 획기적으로 증대된 락토바실러스 속 미생물의 마이크로캡슐을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 락토바실러스 속 미생물을 알긴산 나트륨으로 마이크로캡슐화(microencapsulation) 하는 단계와; 상기 마이크로캡슐을 키토산(chitosan)으로 1차 코팅한 후 알긴산 나트륨(sodium alginate)으로 2차 코팅하는 단계와; 모의 위액 내에서 상기 제조한 고분자 마이크로캡슐화에 의한 락토바실러스 속 미생물의 생존력 조사 단계와; 마이크로캡슐화에 의한 락토바실러스 속 미생물의 방출 수준 조사 단계와; 대식세포 세포주에서 상기 락토바실러스 속 미생물의 마이크로캡슐에 의한 사이토카인 유도능을 조사하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 프로바이오틱스인 락토바실러스 속 미생물을 유효성분으로 함유하는 마이크로캡슐의 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 LS29의 알긴산-키토산-알긴산 마이크로캡슐(ACA microcapsules)을 동결건조 전 및 후를 광학현미경으로 관찰한 사진도이다.
도 2는 LP25의 마이크로캡슐(ACA microcapsules)을 광학현미경으로 관찰한 사진도이다.
도 3은 모의 위액(pH 2.0) 및 모의 장액(pH7.4) 내에서 유리(free) LS29의 생존력을 나타낸 그래프이다.
도 4는 모의 위액(pH 2.0) 내에서 유리(free) LP25 및 마이크로캡슐화 된 LP25의 생존력을 나타낸 그래프이다.
도 5는 LS29의 마이크로캡슐을 모의 위액 내에서 생존력을 관찰한 그래프이다.
도 6은 동결건조한 LP25의 마이크로캡슐을 실온 및 4℃에서 보관하면서 LP25의 생존력을 관찰한 그래프이다.
도 7은 LS29의 마이크로캡슐(ACA-LS29) 및 이를 동결건조한 마이크로캡슐(FDACA-LS29)을 이용하여 모의 장액 내에서 LS29의 방출 정도를 살펴본 그래프이다.
도 8은 pH 6.0의 조건에서 LP25 마이크로캡슐의 동결건조에 따른 미생물의 방출 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 모의 장액(pH 7.2) 내에서 LP25 마이크로캡슐의 동결건조에 따른 미생물의 방출 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 유리(free) LS29, LS29 마이크로캡슐(ACA-LS29) 및 동결건조된 LS29 마이크로캡슐(FDACA-LS29)을 이용한 LS29의 생존력을 실온 및 4℃에서 조사한 결과이다.
도 11은 유리(free) LP25의 보관온도에 따른 생존력을 나타낸 그래프이다.
도 12는 대식세포 세포주(RAW264.7)에서 LS29의 사이토카인 유도능을 조사한 결과도이다.
도 13은 LP25의 마이크로캡슐에 의한 RAW264.7 및 JAWSⅡ의 IL-6 분비 수준을 나타낸 그래프이다.
도 14는 LP25의 마이크로캡슐에 의한 RAW264.7 및 JAWSⅡ의 TNF-α 분비 수준을 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 마우스를 이용한 immunization 일정을 나타낸 것이다.
도 16은 LP25 마이크로캡슐에 의한 anti-BmpB sIgA의 분비능을 마우스 분에서 조사한 결과이다.
도 17은 LP25 마이크로캡슐에 의한 anti-BmpB sIgA의 분비능을 마우스 소장에서 조사한 결과이다.
도 18은 LP25 마이크로캡슐에 의한 anti-BmpB IgG의 분비능을 마우스 serum에서 조사한 결과이다.
도 19는 LP25 마이크로캡슐에 의한 anti-BmpB IgG1 및 IgG2a의 분비능을 마우스 serum에서 조사한 결과이다.
이하, 본 발명의 구체적인 내용을 바람직한 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명한다.

본 발명에 사용된 알긴산 나트륨(low viscosity) 및 D-(+)-glucose는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 키토산(Chitosan, MW 10,000)은 Jakwang Co. Ltd. (Ansung, Korea)에서, DifcoTM skim milk, Lactobacilli MRS broth 및 Lactobacilli MRS agar는 BD (Sparks, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 마우스 TNF―α, 마우스 IL-10 및 IL-6 분석을 위한 ELISA kits는 Thermo Scientific (Rockford, IL,USA)에서 구입하였다.

본 발명에 사용된 락토바실러스 속 미생물은 락토바실러스 살리바리우스 29(Lactobacillus salivarius 29: LS29) 및 락토바실러스 플란타룸 25(Lactobacillus plantarum 25: LP25)로서 본 발명자에 의해 돼지 배설물에서 분리되었다(Yun JH, Lee KB, Sung YK, Kim EB, Lee HG, Choi YJ. Isolation and characterization of potential probiotic lactobacilli from pig feces. J Basic Microbiol, 2009;49:220-6).

본 발명 마이크로캡슐 제조에 사용된 균주수는 락토바실러스 살리바리우스 29(Lactobacillus salivarius 29: LS29)는 10⁵내지 10⁶ 및 락토바실러스 플란타룸 25(Lactobacillus plantarum 25: LP25)는 10⁷내지 10⁹ 를 사용하였다. 고분자 마이크로캡슐 제조는 2중량% 알긴산 나트륨으로 캡슐화 한 후 0.8중량% 키토산으로 1차 코팅한 뒤 0.1중량% 알긴산 나트륨으로 다시 2차 코팅하였다. 키토산은 점성이 있으므로 마이크로캡슐의 표면층이 최종적으로 알긴산 나트륨으로 코팅되어야 캡슐이 뭉치지 않으므로 상기 키토산으로 1차 코팅 후 반드시 알긴산 나트륨으로 2차 코팅하여야 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 락토바실러스 속 미생물의 알긴산/키토산/알긴산(alginate/chitosan/alginate; ACA) 마이크로캡슐(microcapsules) 제조

Lactobacillus 속 미생물인 LS29 및 LP25를 37℃에서 170 RPM으로 MRS 액체배지에서 배양한 후 30% glycerol에 넣어 -75℃에서 보관하여 본 발명실험에 사용하였다.

상기 보관한 LS29 및 LP25를 5 uL 취하여 5 mL의 MRS 액체배지에 접종한 후 37℃에서 170 RPM으로 12시간 동안 배양하였다. 배양액 500 uL를 다시 50 mL의 MRS 액체배지에 접종한 후 12시간 동안 배양한 뒤 4℃에서 3000 RPM으로 10분 동안 원심분리하여 박테리아 침전물을 얻었다. 획득한 침전물은 0.85% 식염수로 두 번 세척한 뒤 동일한 식염수 10 mL을 첨가하여 재현탁시켰다. 마이크로캡슐은 Albertini 등의 방법을 변형하여 제조하였다(Albertini B, Vitali B, Passerini N, Cruciani F, Di Sabatino M, Rodriguez P, Brigidi L. Development of microparticulate systems for intestinal delivery of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis. Eur J Pharm Sci, 2010;40:359―66). 즉, 락토바실러스 속 미생물, 알긴산 나트륨 및 냉동보호제인 15% glycerol(v/v)의 혼합물을 주사기에 넣어 N₂ 가스 존재하에서 0.1M CaCl₂ 내로 떨어뜨렸다. 알긴산 나트륨의 최종농도는 상기 언급한 균주수 즉, LS29 균주수 10⁵내지 10⁶ 및 LP25 균주수10⁷내지 10⁹에 대하여 2중량%였다. 알긴산 나트륨은 CaCl₂와 접촉했을 때 미생물을 내부로 감싸면서 단단해졌다. 반응하지 않고 남은 CaCl₂ 를 제거하기 위하여 상기 형성된 마이크로캡슐을 0.85% 식염수로 세척하였다. 0.85% 식염수는 하기 모든 코팅 과정에서 세척용액으로 사용되었다. 이후 마이크로캡슐은 0.8중량%의 키토산 용액으로 30분 동안 1차 코팅한 뒤 세척과정을 두 번 실시하였다. 키토산으로 코팅된 알긴산 나트륨 마이크로캡슐은 0.1중량%의 알긴산 나트륨으로 10분 동안 다시 2차 코팅한 후 세척하였다. LP25의 마이크로캡슐은 Brachyspira membrane protein B (BmpB) 백신을 생산하는(LP25-BmpB) 마이크로캡슐, 소장의 M세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 도입되어 BmpB를 생산하는 LP25 (LP25-M-BmpB) 및 대조구 펩타이드가 도입되고 BmpB를 생산하는 LP25 (LP25-P-BmpB)의 마이크로캡슐을 제조하였다.

제조된 마이크로캡슐은 -70℃에서 얼려서 3일간 freezer에서 동결건조 하였다.

실시예 1-1 : LS29 마이크로캡슐의 특성

상기 제조된 LS29의 마이크로캡슐을 도 1에 나타내었다. LS29의 ACA 마이크로캡슐은 1.04±0.12 ㎜의 크기를 가졌다. 비록 모든 마이크로캡슐이 동결건조 후 수축된 모양을 나타내었으나, 광학현미경 하에서 마이크로캡슐의 표면에 있어 현저한 균열은 관찰되지 않았다. 따라서, 동결건조 후에도 마이크로캡슐의 보호적인 성질(protective property)이 유지됨을 관찰할 수 있었다.

LS29의 캡슐화 효율은 초기 colony forming unit(CFU) 수치를 수세용액의 CFU와 비교함으로써 간접적으로 계산되었다. 실험결과 LS29의 ACA 마이크로캡슐로의 캡슐화 효율은 99% 이상이었으나, 동결건조 후 LS29의 캡슐화 효율은 약 77%로 감소하였다.

실시예 1-2 : LP25 마이크로캡슐의 특성

상기 제조된 LP25 마이크로캡슐은 1.11 mm의 크기로, 도 2에 나타낸 바와 같이 LP25, LP25-BmpB, LP25-M-BmpB 및 LP25-P-BmpB간에도 크기나 형태는 크게 차이가 없었다.

또한, LP25, LP25-BmpB, LP25-M-BmpB 및 LP25-P-BmpB 간의 마이크로캡슐화 효율은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 큰 차이가 없이 98-99%를 나타내었고 고분자 마이크로캡슐 당 균주수 10⁷내지 10⁹에서도 캡슐의 크기는 균주수가 많을수록 커졌지만 마이크로캡슐화 효율은 98-99%를 나타내어서 큰 차이가 없었다.

MCs	Size (mm)	Loading content (cfu/particles)	Encapsulation efficiency (%)
LP25	1.06±0.08	1.11×10⁷	98.30 ± 2.31
	1.11±0.22	2.08×10⁸	98.56 ± 1.33
	2.09±0.26	1.81×10⁹	97.36 ± 2.37
LP25-BmpB	1.12±0.27	1.32×10⁷	97.20 ± 3.13
	1.19±0.14	1.65×10⁸	98.10 ± 2.23
	2.20±0.30	1.81×10⁹	97.56 ± 1.33
LP25-M-BmpB	1.18±0.13	0.96×10⁷	97.42 ± 3.75
	1.09±0.27	1.87×10⁸	97.82 ± 2.07
	2.33±0.24	2.10×10⁹	96.66 ± 0.83
LP25-P-BmpB	0.93±0.11	2.01×10⁷	99.04 ± 0.30
	0.99±0.30	1.02×10⁸	98.13 ± 0.63
	2.04±0.23	1.84×10⁹	97.52 ± 1.26

실시예 2 : 모의 위액 및 모의 장액 준비

모의 위액(simulated gastric fluid: SGF, pH 2) 및 모의 장액((simulated intestinal fluid: SIF, pH 7.4)은 milk-based medium의 pH를 각 2 및 7.4로 맞추어 사용하였다. Milk-based medium 조성은 Lankaputhra 및 Shah에 의해 12% 탈지유, 2% glucose, 1% yeast extract 및 0.05% cysteine을 포함한다(Lankaputhra WEV, Shah NP. Survival of L. acidophilus and Bifidobacterium spp. in the presence of acid and bile salts. Cult Dairy Prod J, 1995;30:2―7).

실험예 1 : 위장 내에서의 락토바실러스 속 미생물의 생존율 조사

모의 위액 및 모의 장액 내에서 유리(free) LS29 및 LP25의 생존율을 시간별(0, 10, 30, 60, 90, 및 120분)로 37℃에서 100 RPM으로 배양한 후 colony forming unit (CFU) 계산을 통해서 조사되었다.

실험예 1-1 : 유리(free) LS29의 생존율 조사

실험결과 도 3에서 보는 바와 같이, 유리(free) LS29의 생존율은 모의 위액 내에서 37℃, 100 RPM으로 120분 동안 배양한 경우 급격하게 0으로 감소되었다. 즉, LS29의 생존율은 배양한지 60분 후에는 40% 감소, 90분 후에는 60%나 감소하였으며 120분 배양한 경우에는 살아있는 박테리아는 관찰되지 않았다. 한편, 모의 장액 내에서 120분 동안 배양한 경우에는 거의 100%의 LS29의 생존율이 유지됨을 관찰하였다.

실험예 1-2 : LP25의 생존율 조사

실험결과 도 4A에 나타낸 바와 같이, 유리(free) LP25의 생존율은 모의 위액 내에서 급격히 감소함이 관찰되었다. 그러나 유리 LP25의 기능성 미생물간에는 큰 차이가 없었다. 반면, 마이크로캡슐화 된 LP25는 pH 2.0에서 효과적인 보호효과가 관찰되었고, LP25의 기능성 미생물간에 큰 차이는 없었다(도 4B).

실험예 2 : ACA 마이크로캡슐화 된 락토바실러스 미생물의 생존율 조사

실험예 2-1 : LS29의 ACA 마이크로캡슐화에 의한 생존율 조사

모의 위액 내에서 마이크로캡슐화 된 LS29의 생존율을 시간별(0, 10, 30, 60, 90, 및 120분)로 37℃에서 100 RPM으로 배양한 후 CFU 계산을 통해 조사하였다.

실험결과 도 5에서 보는 바와 같이, LS29의 마이크로캡슐(ACA-LS29) 및 동결건조된 LS29의 마이크로캡슐(FDACA-LS29) 모두에서 120분 동안 배양한 경우 초기 생존율의 70%를 나타내었다.

실험예 2-2 : LP25의 ACA 마이크로캡슐화에 의한 생존율 조사

실험결과 도 6에서 보는 바와 같이, LP25의 마이크로캡슐을 실온에서 보관한 경우에는 8주째에 25%의 생존율을 나타낸 반면, 동결건조하여 4℃에서 보관한 경우 에는 약 60%의 생존율을 유지하였다. 그러나 LP25의 기능성 미생물간에는 큰 차이를 나타내지 않았다.

실험예 3 : ACA 마이크로캡슐화 된 락토바실러스 미생물의 in vitro 방출

마이크로캡슐로부터 락토바실러스 미생물의 장내 방출을 관찰하기 위해서, 마이크로캡슐을 모의 장액 내에서 37℃, 100 RPM으로 배양하면서 각 시간별(0.5, 1, 2, 4, 7, 12, and 24h)로 락토바실러스의 CFU를 조사하였다.

실험예 3-1 : 모의 장액 내에서 ACA 마이크로캡슐화 된 LS29의 방출 조사

LS29의 마이크로캡슐(ACA-LS29) 및 동결건조된 LS29의 마이크로캡슐(FDACA-LS29)을 비교해 본 결과, ACA-LS29는 30분 이내에 88%의 LS29를 방출하였으며 2시간 이내에는 92%의 LS29를 마이크로캡슐로부터 방출하였다. 그러나, FDACA-LS29는 배양한지 30분 이내 단지 65%의 LS29를 방출하였고, 7시간 배양한 후에야 97%의 LS29 방출이 관찰되었다(도 7). 따라서, LS29 마이크로캡슐의 동결건조(FDACA-LS29)는 LS29의 방출시간을 연장시킴으로 판단된다.

캡슐화된 LS29의 방출은 시간이 24시간으로 길어짐에 따라 ACA-LS29 및 FDACA-LS29 모두에서 증가하였으며, 12시간 이후 FDACA-LS29에서 관찰되는 100% 이상의 LS29 방출은 모의 장액 내에서의 LS29의 증식으로 판단된다.

실험예 3-2 : ACA 마이크로캡슐화 된 LP25의 방출 조사

도 8은 pH 6.0에서 LP25 마이크로캡슐의 시간에 따른 미생물의 방출을 조사한 것으로서, 30분에 약 80%가 방출이 되었고 24시간에 거의 100%가 방출되었지만(도 8A), 마이크로캡슐을 동결건조하면 30분에 약 70%의 LP25가 방출되어 방출속도가 늦어짐을 확인하였다(도 8B).

한편, pH 7.2에서는 LP25의 마이크로캡슐을 동결건조하지 않거나(도 9A) 또는 동결건조(도 9B)에 의하여 비교적 pH 6.0보다는 방출이 늦어지는 경향을 확인하였지만, LP25의 기능성 미생물간에는 큰 차이가 관찰되지 않았다.

실험예 4 : 락토바실러스 속 미생물의 장기보관에 의한 생존율 조사

실험예 4-1 : 장기보관에 의한 ACA 마이크로캡슐화 된 LS29의 생존율 조사

유리(free) LS29 및 상기 실시예 1에서 제조한 동결건조된 LS29의 ACA 마이크로캡슐(FDACA-LS29)을 4℃ 및 실온에서 보관하면서 살아있는 LS29의 생존율을 8주 동안 매주마다 CFU 계산을 통해 관찰하였다.

실험결과 도 10에서 보는 바와 같이, 유리(free) LS29를 4℃에서 보관한 경우 점점 감소하여 2주째에 생존율 0을 나타낸 반면, 실온에서 보관한 경우 LS29의 CFU는 6주 이후에 0로 감소하였다. 마이크로캡슐화 한 LS29(ACA-LS29)의 생존율은 4℃ 보관에 의해 2주 후에는 65%까지 감소한 반면, 동결건조한 마이크로캡슐(FDACA-LS29)은 LS29의 생존율을 오히려 증가시켰다. ACA-LS29는 실온과 4℃사이의 생존율을 구별하기는 매우 어려웠는데 이는 LS29의 마이크로캡슐 형태가(shapes) 3일 이후 캡슐내의 수분증발에 의해서 급격하게 변화했기 때문이다. FDACA-LS29는 4℃에서는 7주째까지 71.99%의 LS29의 생존율이 측정되었고, 8주째에는 61.65%가 생존하는 것으로 조사되었다.

실험예 4-2 : 장기보관에 의한 LP25의 생존율 조사

보존온도에 따른 유리(free) LP25의 생존율은 도 11에 나타낸 바와 같이, 실온에서는 5주째에 0에 가까웠으나, 4℃에서는 실온보다는 완만하게 감소하는 것이 관찰되었다. 그러나 어느 온도에서도 LP25의 기능성 미생물간에는 생존율의 차이를 나타내지 않았다.

실험예 5 : 마이크로캡슐화에 의한 락토바실러스 속 미생물의 사이토카인 유도 수준 조사

본 발명의 사이토카인 유도 조사를 위해서 면역세포 세포주 RAW264.7 또는 dendritic 세포에서 유래한 JAWSⅡ 세포를 사용하였다. 상기 세포배양을 위한 배지는 10% FBS(Fetal bovine serum; Hyclone) 및 1% antibiotics(Penicillin/Streptomycin)(Gibco)를 넣은 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; Hyclone, USA)를 사용하였고, 5% CO₂ 공급 및 37℃ 배양기 내에서 배양하였다. 세포 분주 24시간 후 배양배지를 제거한 뒤 DMEM 배지로 세포를 씻어준 다음, 항생제를 제거한 배지로 교체해 주었다.

실험예 5-1 : 면역세포에서의 LS29의 사이토카인 분비 조사

상기 면역세포주 RAW264.7을 유리(free) LS29 (1X10⁶CFU/mL), LS29의 ACA 마이크로캡슐(ACA-LS29) 및 empty ACA 마이크로캡슐(ACA)과 함께 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 양성대조군으로는 lipopolysaccharide(LPS, 1 ㎍/mL)가 사용되었고 음성대조군으로는 배양배지가 사용되었다. RAW264.7에서 생산된 사이토카인인 TNF-α 및 IL-10은 ELISA kits을 이용하여 측정하였다.

실험결과 마우스 면역세포 세포주인 RAW264.7의 형태학적 변화는 2 ㎍ LPS, 유리(free) LS29 및 ACA-LS29의 처리에서 관찰되었다(도 12(a)). 이는 RAW264.7 세포의 활성화를 의미한다. 또한, RAW264.7에서 생산된 사이토카인 TNF-α 및 IL-10을 세포배양 배지에서 측정해 본 결과(도 12(b) 및 12(c)), LPS와 흡사하게 유리(free) LS29는 대조군에 비해 TNF-α 및 IL-10의 유의적인 높은 수준을 나타내었다. ACA-LS29는 유리(free) LS29와 비교해 낮은 수준이긴하나 사이토카인 유도능을 나타내었다.

따라서, LS29는 lipopolysaccharide(LPS)와 유사한 면역조절작용을 나타내었고 캡슐화된 LS29는 면역세포에 있어 사이토카인 유도를 지속시켰다.

실험예 5-2 : 면역세포에서의 LP25의 사이토카인 분비 조사

LP25 마이크로캡슐에 의한 면역세포의 사이토카인 분비능을 조사해 본 결과, LPS 및 LP25의 마이크로캡슐에 의해서 RAW 264.7 세포(도 13A)와 JAWSⅡ 세포 (도 13B)에서 anti-inflammatory cytokine인 IL-6의 생산이 대조구(control) 보다 향상되었고, RAW 264.7 세포보다 JAWSⅡ 세포에서의 IL-6의 생산이 높았지만 기능성 미생물간에는 큰 차이를 나타내지 않았다. 그러나 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α는 RAW 264.7 세포(도 14A)에서 JAWSⅡ 세포(도 14B)보다 생산이 증가되었지만, LP25의 기능성 미생물간에는 IL-6와 같은 경향으로 큰 차이가 없었다.

실험예 6 : 마이크로캡슐화에 의한 락토바실러스 속 미생물의 in vivo 효과 검정

도 15에서 나타낸 바와 같이, 6주령의 female BALB/c 쥐를 각 그룹당 5 마리씩 총 8군으로 나누어서 1주에 두번씩 4주간에 걸쳐 immunization을 수행하였다. Antibody 분비능력을 조사하기 위하여 serum과 feces를 채취하였다.

실험예 6-1 : LP25의 마이크로캡슐에 의한 마우스 분에서 anti-BmpB sIgA 분비 조사

LP25의 기능성 미생물별 마이크로캡슐을 쥐에 경구투여한 후 4주동안 채취한 분에서 anti-BmpB sIgA의 분비 능력을 ELISA를 이용하여 분석하였다.

실험결과 도 16에 나타낸 바와 같이, 첫번째 투약 4주후에 분에서 anti-BmpB sIgA 분비량이 ACA-LP25-M-BmpB group은 ACA-LP25-WT group보다 6배, ACA-LP25-BmpB group보다 1.9배, LP25-M-BmpB group보다 2.5배, LP25-BmpB group보다 3배 증가하였다.

실험예 6-2 : LP25의 마이크로캡슐에 의한 마우스 소장에서 anti-BmpB sIgA 분비 조사

LP25의 기능성 미생물별 마이크로캡슐을 쥐에 경구투여한 후 4주동안 채취한 소장에서 anti-BmpB sIgA의 분비 능력을 ELISA를 이용하여 분석하였다.

실험결과 도 17에 나타낸 바와 같이, 첫번째 투약 4주후에 소장에서 anti-BmpB sIgA 분비량이 ACA-LP25-M-BmpB group는ACA-LP25-WT group보다 23.5배, ACA-LP25-BmpB group보다 2배, LP25-M-BmpB group보다 1.9배, LP25-BmpB group보다 5.9배 증가하였다.

실험예 6-3 : LP25의 마이크로캡슐에 의한 마우스 serum에서 anti-BmpB IgG 분비 조사

LP25의 기능성 미생물별 마이크로캡슐을 쥐에 경구투여한 후 4주동안 채취한 serum에서 anti-BmpB IgG의 분비 능력을 ELISA를 이용하여 분석하였다. 실험결과 도 18에 나타낸 바와 같이, 첫번째 투약 4주후에 serum에서 anti-BmpB IgG 분비량이 ACA-LP25-M-BmpB group는 ACA-LP25-WT group보다 5배, ACA-LP25-BmpB group보다 2배, LP25-M-BmpB group보다 1.4배, LP25-BmpB group보다 2.6배 증가하였다.

실험예 6-4 : LP25의 마이크로캡슐에 의한 마우스 serum에서 anti-BmpB IgG1 및 IgG2a 분비 조사

LP25의 기능성 미생물별 마이크로캡슐을 쥐에 경구투여한 후 4주동안 채취한 serum에서 anti-BmpB IgG의 분비 능력을 ELISA를 이용하여 분석하였다.

실험결과 도 19에 나타낸 바와 같이, 첫번째 투약 4주후에 serum에서 anti-BmpB IgG1과 IgG2a 분비량이 ACA-LP25-M-BmpB group는 다른 group보다 모두 증가하였다. 특히, ACA-LP25-M-BmpB group의 IgG1는 ACA-LP25-BmpB group보다 2배, LP25-M-BmpB group보다 1.4배, LP25-BmpB group보다 2배 증가하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 락토바실러스 속 미생물의 마이크로캡슐화를 통해 위장 내에서 장기간 생존력을 갖는 유산균를 제공하는 효과가 있으므로 프로바이오틱스를 이용한 건강 기능성식품 및 동물사료소재산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

락토바실러스 속 미생물을 알긴산 나트륨으로 마이크로캡슐화 한 후 키토산으로 1차 코팅한 뒤 알긴산 나트륨으로 다시 2차 코팅함을 특징으로 하는 마이크로캡슐 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 락토바실러스 살리바리우스 29 또는 락토바실러스 플란타룸 25 중의 어느 하나임을 특징으로 하는 마이크로캡슐 제조방법.
제1항 또는 제2항의 제조방법에 의해 제조된 마이크로캡슐.
제3항에 기재한 마이크로캡슐을 동결건조하여 된 것이 특징인 프로바이오틱스.