KR20020069324A - 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법 - Google Patents

비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20020069324A
KR20020069324A KR1020010009526A KR20010009526A KR20020069324A KR 20020069324 A KR20020069324 A KR 20020069324A KR 1020010009526 A KR1020010009526 A KR 1020010009526A KR 20010009526 A KR20010009526 A KR 20010009526A KR 20020069324 A KR20020069324 A KR 20020069324A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bifidobacterium
gene
vector
plasmid
shuttle vector
Prior art date
Application number
KR1020010009526A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100457879B1 (ko
Inventor
지근억
박명수
강윤희
서정민
Original Assignee
주식회사 비피도
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 비피도 filed Critical 주식회사 비피도
Priority to KR10-2001-0009526A priority Critical patent/KR100457879B1/ko
Priority to PCT/KR2001/000527 priority patent/WO2002068662A1/ko
Priority to US10/258,440 priority patent/US6887702B2/en
Priority to JP2002568756A priority patent/JP2004519236A/ja
Priority to EP01917936A priority patent/EP1319080A4/en
Publication of KR20020069324A publication Critical patent/KR20020069324A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100457879B1 publication Critical patent/KR100457879B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법에 관한 것으로서,서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 플라스미드 pMG1; 상기 플라스미드 pMG1을 포함하는 균주 비피도박테리움 롱검 MG1(Bifidobacterium longumMG1); 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제되며서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는Mob유전자,서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는Rep유전자 및 선별 유전자를 포함하는 셔틀벡터에 관한 것이다. 본 발명의 셔틀벡터 및 프로모터를 이용하면 목적 유전자를 발현시 별도의 정제 과정이 필요 없으며, 비피도박테리움 내에서 발현된 목적 유전자를 바로 식품에 첨가할 수 있어 식품 첨가물 또는 경구용 백신의 제조에 사용될 수 있는 장점이 있다. 또한, 이러한 셔틀벡터 개발을 통하여 비피도박테리움을 이용한 프로바이오틱스의 잠재력과 가능성을 획기적으로 높일 수 있다.

Description

비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법{Plasmid originated from Bifidobacterium, recombinant expression vector using the plasmid and transformation method}
본 발명은 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법에 관한 것으로서,서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 플라스미드 pMG1; 상기 플라스미드 pMG1을 포함하는 균주 비피도박테리움 롱검 MG1(Bifidobacterium longumMG1); 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제되며서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는Mob유전자,서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는Rep유전자 및 선별 유전자를 포함하는 셔틀벡터에 관한 것이다.
인간의 장내에는 여러 종류의 미생물이 번식하면서 장내 세균총을 형성하고 있다. 이러한 장내 세균총의 조성과 활성은 인간 또는 동물의 건강뿐만 아니라 영양, 생체 기능, 약물의 효율, 암화, 노화, 면역 반응, 감염에 대한 저항성 및 신체에 대한 다른 스트레스에도 광범위하게 영향을 미친다. 장내 세균총은 500개 이상의 서로 다른 세균종을 포함하며, 위 및 상부 소장에는 상대적으로 적은 수의 세균이 존재하고 있고 세균수는 대장으로 갈수록 증가한다. 상기 서술한 바와 같이, 장내 세균총은 인간의 건강에 포지티브(positive)한 영향을 주며, 장내 세균총 중 특히 비피도박테리움(Bifidobacterium)이 가장 중요한 것으로 알려져 있다. 이러한 사실은 비피도박테리움이 출생 이후로 일생 동안 사람의 대장 내에 서식하는 것을 관찰함으로써 알 수 있으며 또한, 우유를 먹이는 유아보다 모유를 먹이는 유아에서 비피도박테리움의 수가 더 많아 설사 질환에 걸릴 위험이 낮은 것으로 나타났다. 이러한 비피도박테리움의 수는 나이가 들수록 급격히 감소하는 것으로 나타났다.
한편, 장내 균총의 분포상황은 연령, 인종, 생활환경, 음식성분 등 각종 요인에 의해 변화하고 있다. 특히, 장내 균총은 일반적으로 음식 종류에 의해 큰 영향을 받으며, 건강하게 오래 사는 장수자들 또는 성인병의 발병율이 낮은 사람들은 장내 유산균이 다른 사람에 비하여 많이 존재하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 정장 효과를 고양시키기 위한 음식의 중요성이 대두되고 있으며, 유산균 섭취를 통한 정장 효과를 얻기 위하여 최근에는 요구르트를 포함하는 종래의 유제품에 유산균을 첨가한 상품을 개발하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
이와 같이 최근 건강에 대한 관심이 높아가면서 유산균을 건강 식품 및 의약품 등에 사용하려는 많은 시도들이 이루어져 왔고, 실제로 다양한 유산균 식품 및 유산균 의약품이 개발되었다. 우리나라에서 사용되고 있는 유산균들은 모두 외국에서 개발된 것으로 우리나라 사람의 장내에 존재하는 균주들과 그 특성에 차이가 있을 수 있다. 또한, 우리나라 사람의 장내에만 존재하는 유산균은 지금까지 개발된 그 어느 유산균보다 우리나라 사람에게 더욱 적합하여 높은 생리 활성을 나타낼 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 우리나라 사람으로부터 유용한 한국형 유산균을 분리하여 우리나라 사람에게 적합한 새로운 유산균 식품 및 의약품 등을 개발하려는 시도가 이루어지게 되었다 .
비피도박테리움은 그람 양성균으로 Y 모양 또는 V 모양이며, 운동성이 없는 혐기성 균으로 포자를 형성하지 않는 발효균이다. 전통적으로 비피도박테리움은 젖산균에 속하는 것으로 분류되어 왔다. 비피도박테리움의 발효 주요 산물은 아세테이트 및 락테이트로 이들은 3:2의 비율로 생산되며, DNA의 GC 함유율은 55 내지 64%이다. 비피도박테리움은 숙주균에 특이적인 것으로 알려졌으며, 사람에서는 비피덤(B. bifidum), 롱검(B. longum), 브레베(B. breve), 인판티스(B. infantis) 및 아돌레센티스(B. adolescentis)가 발견되고 있으며, 상기 5 종류의 균주는 프로바이오틱스로 사용되고 있다. 프로바이오틱스란 인간이나 동물에 살아있는 미생물을 분말 또는 발효산물의 형태로 투여했을 때, 장내 미생물의 바람직한 균형 및 그들의 생리 특성을 증진시키며 숙주에게 유익한 효과를 나타내는 미생물 식품 강화제를 의미한다(Fuller, R.,Journal of Applied Biotechnology, 66:365-378, 1989).
지금까지 젖산균인 락토바실러스(Lactobacillus) 및 락토코쿠스(Lactococcus)에서는 많은 벡터 시스템이 개발되었으며, 유전자 개량에 의한 상품화가 가까운 장래에 실현될 수 있을 것으로 전망되고 있다. 장내 정착성이 더욱 우수한 것으로 알려진 비피도박테리움의 벡터 시스템 개발은 아직 초보단계에 있다. 지금까지 비피도박테리움의 균종류에서 플라스미드에 대한 연구는 다음과 같다.
먼저, 처음에는 사람에서 분리된 균 중에서 롱검(B. longum)에만 플라스미드가 존재한다고 보고되었고, 상기 균주로부터 분리한 플라스미드를 대장균 유래 형질전환용 벡터와 연결한 셔틀벡터가 개발되었다. 또한, 글로보숨(B. globosum),아스테로이드(B. asteroides),인디컴(B. indicum) 등에도 플라스미드가 존재하는 것으로 보고되었으며, 상기 균주들은 전기영동 패턴 또는 서던 혼성화(Southern hybridization) 등을 통하여 상동성에 따라 그룹으로 나누어 졌다. 또 다른 균주인 브레베(B. breve)에도 플라스미드가 존재한다고 보고된 바 있다(Sgorbati, B.et al,Microbiologica., 6:169-173, 1983; Tannock, G. W.et al.,Microbiology, 28:1225-1228, 1990).
비피도박테리움의 플라스미드를 이용한 벡터 개발은 1990년대에 들어서야 보고되기 시작하였다. 롱검(B. longum)B2577의 1.9kb 플라스미드 pMB1을 대장균 벡터에 클로닝하여 제한효소지도가 작성되었다. 1994년에는 pMB1을 기본 벡터로 하여 대장균과 롱검(B. longum)에서 상호 복제되는 셔틀벡터인 pRM2가 개발되었으며, 전기천공법(electroporation)에 의해 롱검(B. longum)을 형질전환(transformation)하는데 성공하였다. 또한, 최근에는 상기 pMB1의 전체 염기서열이 밝혀졌다(Mateuzzi, D.,et al.,Letters in Applied Microbiology, 11:220-223, 1990; Missichi, R.,et al,Plasmid, 32:208-211, 1994; Argnami, A.et al.,Microbioloy, 142:109-114, 1996). 비피도박테리움은 두꺼운 다층의 세포벽과 여러 종류의 펩티도글라이칸(peptidoglycan), 다당류(polysaccharide), 리포테이코산(lipoteichoic acid) 및 단백질로 구성된 세포벽을 갖고 있으며, 이러한 세포벽의 특성은 외부 DNA 분자를 받아들이는데 장벽이 되어왔다. 비피도박테리움을 형질전환 시키기 위하여 학문적 또는 산업적인 차원에서 다양한 시도가 이루어졌으나 성공된 바가 드물었으며, 롱검(B. longum)을 전기천공법을 이용하여 낮은 효율로나마 형질전환체를 제조한 연구가 보고된 바 있다(Missich, R.et al.,Plasmid, 32:208-211, 1994).
상기에서 분리된 플라스미드 pMB1을 이용하여 셔틀벡터 pNC7을 제조하였으며, 다양한 종의 비피도박테리움에 이용할 수 있는 형질전환 방법을 개발하였고, 그 효율은 균에 따라서 1.0 × 101에서부터 1.2 × 105CFU/㎍ DNA 까지 다양하게 나타났다. 상기 형질전환 방법에 있어서 악틸라이트 P(ActilightⓡP)를 배지의 당원으로 사용하였고, 대수 증식기 초기에 균을 회수하여 컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하였으며, 전기천공법의 조건을 12.5 kV/cm, 100 Ω, 25 ㎌으로 조정하여 형질전환을 수행하였다. 일본에서는 비피도박테리움 롱검(B. longum)에서 분리된 3.6kb 플라스미드(pTB6,표 1참고)를 이용하여 대장균과 비피도박테리움에서 상호 복제되는 셔틀벡터를 개발한 바 있다(Matsummura, H.et al.,Biosci. biotech. Biochem., 61(7):1211-1212, 1997).
우리나라에서는 1994년에 처음으로 비피도박테리움에서 플라스미드를 분리하였고, 서던 혼성화(Southern hybridization)에 의하여 몇 가지 상동 그룹으로 분류하였다(정현서 등, 한국식품과학회 춘계 학술 발표, 1994; 이주훈 등, 한국식품과학회 춘계 학술 발표, 1997). 이들 중 두 균주는 각각 에리트로마이신(erythromycin) 및 테트라싸이클린(tetracyclin)에 대하여 상대적으로 강한 내성을 보였으며, 플라스미드가 소실되면 내성도 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 또 다른 균주인 비피도박테리움 롱검(B. longum)KJ는 두 개의 서로 다른 플라스미드인 pKJ36 및 pKJ50(표 1참고)를 보유하고 있었다. 이들을 대장균 유래 형질전화용 벡터에 클로닝하여 이를 바탕으로 두 개의 플라스미드에 대한 유전자 지도를 작성하였으며, 전체 염기서열을 밝히고 이를 비교 분석하였다(박명수 등, 한국 산업미생물학회 추계 학술 발표, 1995, 1996, 1997). 그 결과 두 개의 플라스미드는 매우 유사한 구조적 특징이 있었고, 그램 양성 및 그램 음성 미생물들의 플라스미드에서 발현되는 Rep 단백질 및 Mob 단백질과 아미노산 상동성을 가지는 ORF를 포함하고 있음을 알 수 있었다. 상기 각각의 ORF는 번역/전사(translation/transcription) 수준에서 발현되는 것이 확인되었다. 이와 같은 분석자료를 바탕으로 대장균과 비피도박테리움에서 상호 복제되는 셔틀벡터 pBKJ50F, pBKJ50R 및 pBRepA를 제조하여 비피도박테리움을 형질전환 하는데 사용하였다.
상기에서 살펴본 비피도박테리움의 플라스미드를 이용하여 개발된 벡터들은 모두가 외래의 항생제 내성 유전자를 선별 유전자(selection marker)로 함유하고 있어 이들을 직접 식품에 사용할 수 없는 단점이 있다. 따라서, 식품에 안전하게 사용할 수 있는 식품 등급용 벡터(food-grade vector)의 개발이 요구되고 있다. 이를 위해 항생제 내성 유전자들을 제거하고 식품 등급(food grade)으로 사용할 수 있는 선별 유전자로 대체할 뿐만 아니라 외래 유전자의 발현을 조절할 수 있는 프로모터/오퍼레이터(promoter/operator)등을 삽입함으로써 새로운 셔틀벡터의 개발이 진행 중에 있다. 하기표 1에 비피도박테리움에 포함된 플라스미드 및 이로부터 개발된 셔틀벡터를 나타내었다.
플라스미드(kb) 숙주 세포 벡터 선별 유전자
pMB1(1.9) 비피도박테리움 롱검 pRM2 스펙티노마이신(spectinomycin)a암피실린(ampicillin)bpNC7 클로람페니콜(chloramphenicol)a암피실린bpKJ36(3.6) 비피도박테리움 롱검 KJ pEKJ36 클로람페니콜a암피실린bpKJ50(5.0) 비피도박테리움 롱검 KJ pBKJ50F 클로람페니콜a,bpBKJ50R 클로람페니콜a,bpBRepApNBb1(5.6) 비피도박테리움 브레베 개발되지 않았음pTB6(3.6) 비피도박테리움 롱검 pBLES100 스트랩토마이신(streptomycin)a암피실린b
a: 비피도박테리움에 대한 선별 유전자
b: 대장균에 대한 선별 유전자
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점들을 해결하면서 목적 유전자를 비피도박테리움에서 발현시 별도의 정제 과정 없이도 식품에 첨가할 수 있는 식품 첨가물 또는 경구용 백신의 제조에 사용될 수 있는, 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제가 가능하면서 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 셔틀벡터 및 상기 목적 유전자를 비피도박테리움 내에서 강하게 발현시킬 수 있는 프로모터를 개발함으로써본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드와 상기 플라스미드를 포함하는 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 셔틀벡터에 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자를 삽입한 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
마지막으로, 본 발명의 또 다른 목적은 비피도박테리움 내에서 목적 유전자를 고효율로 발현시킬 수 있는 비피도박테리움에서 분리한 프로모터를 제공하는 것이다.
도 1은 비피도박테리움 롱검 MG1(Bifidobaterium longumMG1)에서 분리한 pMG1의 개략적인 개열지도를 나타낸 것이고,
도 2는 대장균과 비피도박테리움 내에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터 pBES2의 제조 과정을 나타낸 것이며,
도 3은 도 2에서 제조된 셔틀벡터 pBES2를 이용하여 목적 유전자로 아밀라아제 유전자를 삽입한 재조합 벡터 pYBamy59의 제조 과정을 나타낸 것이고,
도 4는서열번호 4또는서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 비피도박테리움 GE65(Bifidobaterium sp. GE65)의 프로모터, pbifGPF7 또는 pbifGPF10를 분리하는 과정을 나타낸 것이며,
도 5는 도 4에서 제조한 pbifGPF7 또는 pbifGPF10에서 프로모터 및 GFP를 분리하여 pBES2에 삽입한 pYBGFP7 또는 pYBGFP10의 제조 과정을 나타낸 것이고,
도 6은 셔틀벡터 pBES2의 제조에 이용되는 pEK104 벡터의 개략적인 개열지도를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 플라스미드 pMG1과 상기 플라스미드를 포함하는 균주 비피도박테리움 롱검 MG1(Bifidobacterium longumMG1)을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제되며서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는Mob유전자,서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는Rep유전자 및 선별 유전자를 포함하는 셔틀벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 셔틀벡터에 있어서, 상기 셔틀벡터는 플라스미드 pMG1과 대장균 유래 형질전환용 벡터를 이용하여 제조되는 것이 바람직하다. 상기 대장균 유래 형질전환용 벡터는 구체적으로 pEK104(고려대학교 생명공학원 유전생화학실험실, 장효일 교수에게서 분양 받음), pUC19(Clontech) 및 pBR322(Clontech)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에서는 플라스미드 pMG1과 pEK104를 이용하여 제조된 셔틀벡터 pBES2를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 셔틀벡터에 있어서, 선별 유전자는 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 가나마이신(kanamycin) 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 셔틀벡터 pBES2에 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비피도박테리움 유래 플라스미드와 대장균 유래 플라스미드를 이용하여 비피도박테리움과 대장균에서 상호 복제되는 셔틀벡터를 제조하는 단계;
상기 셔틀벡터에 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자를 결합시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 재조합 벡터로 형질전환시키기 위한 숙주세포로서 상기 셔틀벡터의 제조에 이용된 비피도박테리움을 이용하는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은서열번호 4또는서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 비피도박테리움 GE65(Bifidobaterium sp. GE65)의 프로모터를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명은서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 플라스미드 pMG1과 상기 플라스미드 pMG1을 포함하는 균주 비피도박테리움 롱검 MG1(Bifidobacterium longumMG1)을 제공한다. 본 발명자들은 한국인의 장내에 서식하고 있는 새로운 유산균을 분리하기 위하여 사람의 분변으로부터 공지의 유산균 분리 방법에 따라 새로운 신규한 플라스미드와 균주를 분리하였다.
비피도박테리움은 숙주균에 특이적인 것으로 알려졌으며, 사람에서는 비피덤(B. bifidum), 롱검(B. longum), 브레베(B. breve), 인판티스(B. infantis) 및 아돌레센티스(B. adolescentis)가 발견되고 있다. 본 발명자들은 사람의 분변에서 이전에 발견되지 않았던 비피도박테리움 롱검 신균주를 분리하고, 상기 비피도박테리움 롱검 신균주로부터 신규 플라스미드를 분리하였다. 그리고, 본 발명자들은 상기 비피도박테리움 롱검 신균주를 비피도박테리움 롱검 MG1으로, 상기 신규 플라스미드를 pMG1으로 명명하였다. 상기 플라스미드 pMG1을 포함하는 비피도박테리움 롱검 MG1은 2001년 2월 15일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁번호 KFCC-11273으로 기탁되었다.
본 발명에서 신규 분리한 비피도박테리움 롱검 MG1은 그람 염색 및 비피더스균의 고유 효소인 F6PPK(fructose 6 phosphate phosphoketolase) 검사를 수행하여 동정되었고, 그 결과 형태학적으로는 곤봉모양이나 Y자형등의 특징이 있었고, 그람 염색 결과 그람 양성균이었으며, K6PPK 활성을 나타내는 비피더스 균임이 확인되었다.
본 발명에서 분리한 플라스미드 pMG1은 그 크기가 3,682 bp이고, G+C 함량은 65.1%로 나타났다. 염기서열을 DNASIS(Hitachi)로 분석한 결과, 발현이 예상되는 ORFs(open reading frames)가 있었으며 이 중 다른 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 높은 서열을 각각 ORF I 및 ORF II라 명명하였다. ORF I은 분자량이 29,000 Da으로 여러 종류의 그람 음성 또는 그람 양성 세균의 복제 단백질(replication protein)과 높은 상동성을 나타냈으며, 그 상부(upstream)에는 22bp 단위로 네 번 반복되는 이테론(iteron)이라 알려진 염기서열이 존재한다. ORF II는 분자량이 71,000 Da으로 다른 세균들의 이동 단백질(mobilization protein)과 높은 서열 상동성을 나타냈으며, 그 상부에는 접합(conjugation)에 중요한 역할을 할 것으로 추정되는ori-T염기 서열이 존재한다. 또한, 각 ORF의 10-15 bp 상부에 라이보좀 결합 부위(ribosome binding site)로 예상되는 AGGA 서열이 존재하며, ORF I의 상부에는 22 bp의 염기서열이 4번 반복적으로 나타나는 이테론(iteron) 구조가 존재하며 이러한 구조는 플라스미드의 복제를 조절하는 구조로 알려져 있다. 아울러, ORF II의 상부에는 12 bp로 이루어진ori-T구조가 존재하며 이 구조는 접합에 의해 플라스미드의 전이가 일어나는 기점으로 알려져 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제되며서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는Mob유전자,서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는Rep유전자 및 선별 유전자를 포함하는 셔틀벡터를 제공한다.
종래 형질전환 숙주세포로 주로 사용되는 대장균에서 목적 단백질을 발현시켜 이를 식품 첨가물 또는 경구용 백신으로 사용하기 위해서는, 대장균 단백질의 독성 등을 제거하기 위한 별도의 정제과정이 필요하기 때문에, 사람에 독성을 나타내지 않는 비피도박테리움을 숙주세포로 사용하려는 연구가 진행되어 왔다. 또한, 비피도박테리움의 플라스미드를 이용하여 개발된 벡터들은 모두 외래의 항생제 내성 유전자를 선별 유전자(selection marker)로 함유하고 있어서 이들을 직접 식품에 사용할 수 없었다.
본 발명은 이러한 문제점을 해결하여 식품에 안전하게 사용할 수 있는 식품 등급용 벡터(food-grade vector)를 제공하는데 특징이 있다.
구체적으로, 본 발명은 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제되며서열번호 2로 표시되는Mob유전자,서열번호 3으로 표시되는Rep유전자 및 선별 유전자를 포함하는 셔틀벡터 pBES2를 제공한다. 셔틀벡터 pBES2의 개략적인 개열지도와 제조과정이도 2에 도시되어 있다. 본 발명에 따른 셔틀벡터 pBES2는 30회 정도의 세포분열 후에도 세포 안에서 유지되는 높은 안정성을 보였다.
본 발명에 따른 셔틀벡터는 pMG1과 대장균 유래 형질전환용 벡터를 이용하여 제조될 수 있고, 상기 대장균 유래 형질전환용 벡터는 구체적으로 pEK104, pUC19(Clontech) 및 pBR322(Clontech)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에서는 플라스미드 pMG1과 pEK104를 이용하여 셔틀벡터 pBES2를 제조하였다.
셔틀벡터에 포함되는 선별 유전자로는 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 가나마이신(kanamycin) 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에서는 암피실린 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제 유전자를 사용하였다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 셔틀벡터 pBES2에 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 제공한다.
상기 목적 유전자는 아밀라아제 유전자, 백신유전자, 항암유전자 및 다양한 생리활성을 나타낼 수 있는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에서는 셔틀벡터 pBES2에 목적 유전자로 아밀라아제 유전자를 삽입한 재조합 벡터 pYBamy59를 제조하였다. 재조합 벡터 pYBamy59는 크기가 10.1 kb이고, 그 개략적인 개열지도와 제조과정이도 3에 도시되어 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 형질전환의 새로운 방법으로 셔틀벡터를 제조하기 위하여 사용하였던 플라스미드를 분리한 비피도박테리움을 목적 유전자가 삽입된 재조합 벡터로 형질전환함으로써 형질전환체가 목적 유전자를 높은 효율로 발현시킬 수 있음을 제시하였다. 상기 형질전환 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저, 비피도박테리움 유래 플라스미드와 대장균 유래 플라스미드를 이용하여 비피도박테리움과 대장균에서 상호 복제되는 셔틀벡터를 제조한다. 그리고나서, 상기 셔틀벡터에 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자를 결합시켜 재조합 벡터를 제조한다. 재조합 벡터를 제조하는 방법으로는 본 기술분야에서 일반적으로 알려진 공지의 방법이 사용될 수 있다.
이후, 상기 재조합 벡터로 형질전환시키기 위한 숙주세포로서 상기 셔틀벡터의 제조에 이용된 비피도박테리움을 이용한다는데에 본 방법의 특징이 있다.
이렇게 재조합 벡터로 형질전환시키기 위한 숙주세포로 재조합 벡터의 제조에 이용된 셔틀벡터가 유래된 원래의 비피도박테리움을 이용함으로써 형질전환 효율을 크게 향상시킬 수 있었다. 구체적으로, 본 발명에서는 재조합 벡터의 제조에 이용된 셔틀벡터가 유래된 비피도박테리움으로 컴피턴트 세포를 제조함과 동시에, 형질전환시 옥시레이즈(oxyrase) 효소를 처리함으로써 형질전환 효율을 10배 이상 증가시킬 수 있었다.
본 발명에 따른 재조합 벡터 pYBamy59로 형질전환된 비피도박테리움 롱검 MG1은 2001년 2월 24일자로 한국 미생물 보존 센터에 기탁번호 KFCC-11274로 기탁되었다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은서열번호 4또는서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 비피도박테리움 GE65(Bifidobaterium sp. GE65)의 프로모터를 제공한다. 비피도박테리움 내에서 목적 유전자의 발현 효율을 더욱 증가시키기 위하여 비피도박테리움 GE65로부터 활성이 강한 프로모터(promoter)를 분리하게 되었다.
상기 활성이 강한 프로모터를 분리할 수 있는 균주로는 비피도박테리움 GE65, 비피도박테리움 롱검 MG1, 비피도박테리움 아돌레센티스 INT57 및 비피도박테리움 롱검 ATCC15707를 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 비피도박테리움 GE65를 사용하여서열번호 3및4로 표시되는 프로모터를 분리하였다.
비피도박테리움의 프로모터를 스크리닝하는 방법으로는 당업계에서 알려진 통상의 방법이 이용될 수 있으나, 구체적으로, 본 발명에서는 리포터 유전자로 사용되고 있는 gfp 유전자를 이용하여 스크리닝하였다.
프로모터와 결합하는 프로모터 탐침 벡터(promoter probe vector)를 제조한 후, 상기 프로모터 탐침 벡터를 이용하여 대장균 DH5α에서 GFP를 발현하는 프로모터가 삽입되어 있는 벡터 pbifGFP1, 2, 4, 5, 6, 7 및 10을 각각 분리하였고, 이들 중 프로모터 활성이 상대적으로 강한서열번호 4로 표시되는 PG7 프로모터를 포함하는 벡터 pbifGFP7 및서열번호 5로 표시되는 PG10을 포함하는 벡터 pbifGFP10을 얻었다.도 4에 프로모터 탐침 벡터의 개략적인 제조과정과 벡터 pbifGFP7 또는 pbifGFP10의 개략적인 개열지도가 도시되어 있다. 상기 벡터 pbifGFP7 또는 pbifGFP10을 포함하는 대장균의 GFP 발현은 UV 파장을 조사하여 녹색 형광을 확인함으로써 선별할 수 있다. 구체적으로, 상기 벡터 pbifGFP7 또는 pbifGFP10과 본 발명에 따른 셔틀벡터 pBES2를 재조합하여 본 발명에 따른 프로모터 PG7 또는 PG10으로 목적 유전자인 아밀라아제를 발현시킬 수 있는 벡터 pYBGFP7 또는 pYBGFP10을 제조하였다. 상기 벡터 pYBGFP7 또는 pYBGFP10의 개략적인 개열지도가도 5에 도시되어 있다.
상기와 같이 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제되는 셔틀벡터에 목적 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 비피도박테리움에서 발현시킴으로써 목적 유전자 발현시, 별도의 정제 과정 없이도 식품에 첨가할 수 있는 식품 첨가물 또는 경구용 백신의 제조에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 종래에 개발된 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제되는 셔틀벡터를 이용하여 비피도박테리움을 형질전환시켜 목적 유전자를 발현시킬 때, 형질전환 효율이 매우 낮으면서 목적 유전자가 잘 발현되지 않는 문제점을 해결함으로써 상기 아밀라아제 유전자를 높은 효율로 발현시킬 수 있었다. 구체적으로, 본 발명에서는 셔틀벡터 pBES2의 제조시 사용하였던 플라스미드 pMG1을 분리한 비피도박테리움 롱검 MG1을 아밀라아제 유전자를 삽입한 재조합 벡터 pYBamy59로 형질전환시킴으로써형질전환체가 전분을 분해하는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 비피도박테리움 롱검 MG1의 분리 및 배양
본 발명자들은 한국인의 대장에 서식하는 새로운 유산균 균주를 분리하기 위하여 본 발명자들이 개발한 TP 배지를 사용하여 균주를 분리하였다(한국 특허출원 제 135,780호). 상기 TP 배지는 10 g 트립티케이즈(trypticase), 3.5 g 프로테오스 펩톤 No.3, 3 g 황산 암모니움(ammonium sulfate), 2 g KH2PO4, 1 g K2HPO4, 0.5 g 시스테인·HCl(L-cystein·HCl·H2O), 0.2 g MgSO4, 15 g 한천(agar), 50 ㎖ 트랜스갈락토올리고싸카라이드(transgalactoologosaccharide) 및 50 ㎖ 30% 소디움 프로피오네이트(sodium propionate)로 구성되어 있으며 pH를 7.0으로 조정하여 사용하였다.
사람의 분변을 0.85% NaCl로 구성된 희석액으로 108내지 109로 희석한 후 TP 배지에 도말한 후 혐기성 배양기(DIFCO)에서 37℃, 48시간 동안 배양하여 단일 콜로니를 분리하였다. 상기 단일 콜로니를 현미경으로 그 형태학적인 특징을 분석하고, 그람 염색 및 비피더스균 의 고유 효소인 F6PPK(fructose 6 phosphatephosphoketolase) 검사를 수행하여 균주를 동정하였다. 그 결과 형태학적으로는 곤봉형이나 Y자형의 특징이 있었고, 그람 염색 결과 그람 양성균이었으며, K6PPK 활성을 나타내는 비피더스 균임을 확인하였다. 또한, 분리된 균주 중 플라스미드를 함유한 균주만을 분리하였으며, 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 비피도박테리움 롱검 MG1(Bifidobacterium longumMG1)으로 동정되었다.
이와 같이 분리된 균주를 0.05% 시스테인·HCl(L-cysteine·HCl·H2O)이 포함된 BHI 또는 MRS 배지를 이용하여 보관 또는 배양하였다. BHI 배지는 37 g BHI(Difco), 0.01 g 헤민(Hemin), 0.05 g 시스테인 염산, 0.001 g 레사주린(resazurin) 및 0.001 g 비타민 K로 이루어져 있다. 또한, MRS 배지는 18.5 g 글루코스(glucose), 10 g 판크레아틴으로 분해한 젤라틴, 8 g 비프 익스트랙트(beef extract), 4 g 이스트 익스트랙트(yeast extract), 3 g 소디움 아세테이트(sodium acetate), 2 g K2HPO4, 2 g 암모니움 시트레이트(ammonium citrate), 1 g 폴리솔베이트(polysorbate) 80, 0.2 g MgSO4, 0.05 g MnSO4및 0.5 g 시스테인 염산으로 이루어져 있다.
<실시예 2> 비피도박테리움 롱검 MG1으로부터 pMG1의 분리 및 분석
<2-1> 비피도박테리움 롱검 MG1으로부터 pMG1의 분리
상기 실시예 1에서 분리·동정된 비피도박테리움 롱검 MG1으로부터 박 등의 방법(Park, M. S.et al.,Letters in Applied Misrobiology, 25:5-7, 1997)을 이용하여서열번호 1로 표시되는 플라스미드 MG1을 분리하였다.
비피도박테리움 롱검 MG1을 0.05% 시스테인·HCl을 포함하는 15-20 ㎖의 MRS 배지를 이용하여 37℃에서 혐기적으로 배양하였다. 원심분리하여 균체를 회수한 후, 다시 30 mM Tris·HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA로 구성된 TES(pH 8.0) 용액에서 2회 세척하였다. 상등액을 버린 후 40 mg/㎖의 라이소자임(lysozyme)을 포함하는 5% 수크로스, 50 mM Tris·HCl, 1 mM EDTA를 포함하는 200 ㎕의 수크로스 용액(pH 8.0)을 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 반응하였다. 여기에 3% SDS, 0.2 N NaOH를 포함하는 400 ㎕의 알칼라인 SDS 용액을 첨가한 후, 즉시 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 새로운 튜브에 옮기고, 여기에 650 ㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 잘 혼합하였다. 이 후, 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고 상등액을 제거하여 320㎕의 멸균수에 녹였다. 여기에 200 ㎕의 0.5 ㎎/㎖ EtBr을 포함하는 7.5 M 암모니움 아세테이트(ammonium acetate) 및 350㎕의 페놀/클로로포름(phenol/chloroform)을 첨가하였다. 볼텍싱(vortexing) 한 후 상등액을 새로운 튜브에 옮긴 후 에탄올로 침전하여 정제하였다.
<2-2> 비피도박테리움 롱검 MG1으로부터 pMG1의 분석
상기 실시예 2-1에서 분리한 플라스미드 pMG1을 제한효소PvuII,HincII,PstI,NcoI 및SmaI으로 처리하여 제한효소 지도를 작성하고 그 결과를도 1에 나타내었다.
또한, pMG1의 전체 염기서열을 결정하기 위하여, pMG1을PvuII으로 처리하고, 대장균 벡터 pUC19(ClonTech)의HincII 위치에 삽입하여 pBES1을 제조하였다. pBES1을 엑소뉴클레아제 III(exonuclease III)로 처리하여 결실 돌연 변이 플라스미드들을 얻은 후 이들을 각각 공지의 방법으로 시퀀싱(sequencing)하여 염기서열을 결정하였다.
그 결과 pMG1의 크기는 3,682 bp이고 G+C 함량은 65.1%로 나타났다. 염기서열을 DNASIS(Hitach)로 분석한 결과, 발현이 예상되는 ORFs(open reading frames)가 있었으며 이 중 다른 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 높은 서열을 각각 ORF I 및 ORF II라 명명하였다. ORF I은 분자량이 29,000 Da으로 여러 종류의 그람 음성 또는 그람 양성 세균의 복제 단백질(replication protein)과 높은 상동성을 나타냈으며, 그 상부(upstream)에는 22bp 단위로 네 번 반복되는 이테론(iteron)이라 알려진 염기서열이 존재한다. ORF II는 분자량이 71,000 Da으로 다른 세균들의 이동 단백질(mobilization protein)과 높은 서열 상동성을 나타냈으며, 그 상부에는 접합(conjugation)에 중요한 역할을 할 것으로 추정되는ori-T염기 서열이 존재한다. 또한, 상기 ORF I 및 ORF II의 세포 내 발현을 조사하기 위하여 RT-PCR 방법으로 ORF I 및 ORF II를 증폭한 결과 각각 750 bp 및 600 bp의 반응 산물을 확인하였다.
또한, 각 ORF의 10-15 bp 상부에 라이보좀 결합 부위(ribosome binding site)로 예상되는 AGGA 서열이 존재하며, ORF I의 상부에는 22 bp의 염기서열이 4번 반복적으로 나타나는 이테론(iteron) 구조가 존재하며 이러한 구조는 플라스미드의 복제를 조절하는 구조로 알려져 있다. 아울러, ORF II의 상부에는 12 bp로이루어진ori-T구조가 존재하며 이 구조는 접합에 의해 플라스미드의 전이가 일어나는 기점으로 알려져 있다.
<실시예 3> 셔틀벡터 pBES2의 제조
대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제되는 셔틀벡터를 제조하기 위하여, pUC19(Clontech)에 스타필로코코스(Staphylococcus) 유래의 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT) 유전자를 가진 pEK104를 제한효소PstI으로 절단한 후, 동일한 제한효소로 절단한 상기 실시예 2-1에서 분리한 pMG1과 연결하여 셔틀벡터 pBES2를 제조하였다.도 6에 상기 pEK104 벡터의 개략적인 개열지도가 도시되어 있다.도 2에 나타낸 바와 같이, 셔틀벡터 pBES2는 pMG1에서 유래한서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는Mob유전자, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는Rep유전자 및 pEK104에서 유래한 암피실린 저항성 유전자, CAT 유전자를 포함하고 있으며, 그 크기는 7.8 kb 이다. 상기 셔틀벡터는 30회 정도의 세포분열 후에도 세포 안에서 유지되는 높은 안정성을 보였다.
<실시예 4> 재조합 벡터의 제조 및 발현
상기 실시예 3에서 제조된 셔틀벡터 pBES2에 목적 유전자를 삽입하고 본 실시예에서 사용한 형질전환 방법을 이용하여 재조합 벡터를 제조하였다.
<4-1> 재조합 벡터의 제조
비피도박테리움 롱검 MG1에서 발현시킬 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis) Int57 유래의 아밀라아제 유전자를 포함하고 있는 pBB3(홍성용, 1991, 고려대학교 석사학위 논문)를XbaI,BamHI으로 각각 절단하였다. 절단한 상기 벡터에 동일한 제한효소로 절단된 상기 실시예 3에서 제조한 셔틀벡터 pBES2를 연결함으로써 재조합 벡터 pYBamy59를 구축하였다. 재조합 벡터 pYBamy59의 개략적인 개열지도와 제조과정이도 3에 도시되어 있다. 상기 재조합 벡터로 대장균 DH5α(Escherichia coli)를 전기천공법으로 형질전환하였다. 상기 형질전환체로부터 발현되는 아밀라아제 활성을 조사하기 위하여, 형질전환체를 1% 전분 및 20 ㎍/㎖ 클로람페니콜이 들어있는 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 플레이트 상의 콜로니에 루골 용액(0.5% I2, 5% KI;w/v)을 부어서 콜로니 주위에 투명환이 생기는 것을 확인함으로써 아밀라아제 활성을 확인하였다. 또한, 상기 대장균 형질전환체를 LB 배지에서 배양하고, pYBamy59를 공지의 플라스미드 분리 방법에 따라 분리하여 1.0-1.5 ㎍/㎕으로 농축시킨 후, 비피도박테리움을 형질전환하는데 사용하였다.
<4-2> 셔틀벡터를 이용한 비피도박테리움 롱검의 형질전환
실시예 1에서 분리한 비피도박테리움 롱검 MG1을 0.05% 시스테인·염산(cyctein·HCl), 0.5 M 수크로스(sucrose)가 포함된 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 혐기성 조건으로 밤샘 배양을 하였다. 상기와 동일한 조성의 배지 250 ㎖에 종배양액을 접종하여 600 nm에서의 흡광도 값이 0.2가 될 때까지 배양하였다. 상기 배양액을 6,000 rpm으로 10 분 동안 4℃에서 원심분리하여 균을 회수하고 회수된 균을 차가운 0.5 M 수크로스 용액으로 현탁하였다. 이와 같이 원심분리와 현탁을 2회 반복하여 컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하였다.
상기에서 제조된 컴피턴트 세포를 셔틀벡터 pBES2로 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환하였고, 이 때 옥시레이즈(oxyrase) 효소를 처리함으로써 형질전환 효율을 10배 이상 증가시킬 수 있었다.
<4-3> 재조합 벡터의 발현
상기 실시예 4-1에서 대장균으로부터 증폭한 pYBamy59로 비피도박테리움 롱검 MG1 및 비피도박테리움 롱검 KJ를 전기천공법으로 형질전환하였다. 상기 형질전환체를 1% 전분 및 4 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 포함하는 BHI 배지에서 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 실시예 4-1과 같은 방법으로 아밀라아제 활성을 확인하였다. 그 결과 본 발명에서 제조한 재조합 벡터 pYBamy59으로 비피도박테리움이 형질전환된 것을 확인했을 뿐만 아니라 아밀라아제가 비피도박테리움 내에서 높은 효율로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> 비피도박테리움 GE65의 프로모터 분리 및 발현
비피도박테리움 내에서 목적 유전자를 보다 효과적으로 발현시키기 위하여 비피도박테리움의 프로모터를 분리하여 그 발현 정도를 조사하였다.
<5-1> 비피도박테리움 GE65의 프로모터 분리
비피도박테리움의 프로모터를 스크리닝하기 위하여 리포터 유전자로 사용되고 있는 gfp 유전자를 사용하였다.도 4에 나타낸 바와 같이, pEGFP(Clontech)로부터 Plac을 제한효소PvuII 및HincII를 처리하여 제거하여 프로모터 탐침 벡터(promoter probe vector) pEGFP△pro를 제조하였다. 상기 프로모터 탐침 벡터를BamHI으로 절단한 후Sau3AI으로 부분 절단한 비피도박테리움(Bifidobacterium sp.) GE65 염색체 DNA와 연결하였다. 이로부터 대장균 DH5α에서 GFP를 발현하는 프로모터 pbifGFP1, 2, 4, 5, 6, 7, 10을 각각 분리하였고, 이들 중 프로모터 활성이 상대적으로 강한 pbifGFP7 및 10을 얻었다.도 4의 PG1, PG2, PG4, PG5, PG6, PG7, PG10는 pbifGFP에 클로닝된 각각의 프로모터를 나타내며, 화살표의 길이는 프로모터의 길이를 나타내는 것으로서열번호 4로 표시되는 PG7 및서열번호 5로 표시되는 PG10은 각각 그 크기가 228 및 224 bp이다. 상기 pbifGFP를 포함하는 대장균의 GFP 발현은 UV 파장을 조사하여 녹색 형광을 확인함으로써 선별하였다.
<5-2> 비피도박테리움 GE65의 프로모터 발현
본 발명에서 제조한 셔틀벡터 pBES2를 제한효소XbaI로 절단한 후, 상기 실시예 5-1에서 분리한 pbifGFP7 또는 10을 동일한 제한효소로 절단하여 얻은 프로모터 PG7 또는 PG10 및gfp유전자를 상기 셔틀벡터 pBES2에 삽입하여, 재조합 벡터 pYBGFP7 또는 pYBGFP10을 제조하였다. 상기 재조합 벡터 pYBGFP7 또는 pYBGFP10의개략적인 개열지도와 제조과정이도 5에 도시되어 있다. 상기 재조합 벡터 pYBGFP7 또는 pYBGFP10으로 비피도박테리움 롱검 MG1을 전기천공법으로 형질전환하였다. 상기 형질전환체를 MRS 배지에 도말한 후 소니케이션(sonication)으로 공기 중에 48시간 노출하고 UV를 조사하여 GFP 단백질의 녹색 형광을 확인함으로써 실시예 5-1에서 분리한 비피도박테리움의 프로모터 활성을 확인할 수 있었다. 또한, RT-PCR 방법(Sambrook, 1989)으로 GFP 단백질의 발현을 전사 단계에서 확인한 결과gfp유전자 크기에 해당하는 400 bp의 밴드를 확인할 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제가 가능하면서 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 셔틀벡터를 개발하고 비피도박테리움 내에서 목적 유전자를 강하게 발현시키는 프로모터를 분리하였다. 본 발명의 셔틀벡터 및 프로모터를 이용하면 목적 유전자를 발현시 별도의 정제 과정이 필요 없으며, 비피도박테리움 내에서 발현된 목적 유전자를 바로 식품에 첨가할 수 있어 식품 첨가물 또는 경구용 백신의 제조에 사용될 수 있는 장점이 있다. 또한, 이러한 셔틀벡터 개발을 통하여 비피도박테리움을 이용한 프로바이오틱스의 잠재력과 가능성을 획기적으로 높일 수 있다.

Claims (15)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 플라스미드 pMG1.
  2. 제 1항의 플라스미드를 포함하는 균주 비피도박테리움 롱검 MG1(Bifidobacterium longumMG1)(기탁번호 KFCC-11273).
  3. 대장균 및 비피도박테리움에서 상호 복제되며서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는Mob유전자,서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는Rep유전자 및 선별 유전자를 포함하는 셔틀벡터.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 셔틀벡터는 제 1항의 플라스미드 pMG1과 대장균 유래 형질전환용 벡터를 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 대장균 유래 형질전환용 벡터가 pEK104, pUC19 및 pBR322로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
  6. 제 1항의 플라스미드 pMG1과 pEK104를 이용하여 제조된 셔틀벡터 pBES2.
  7. 제 3항에 있어서, 선별 유전자는 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 가나마이신(kanamycin) 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
  8. 제 3항의 셔틀벡터에 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자를 삽입한 재조합 벡터.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 목적 유전자는 아밀라아제 유전자, 백신유전자, 항암유전자 및 다양한 생리활성을 나타낼 수 있는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  10. 제 8항의 셔틀벡터에 목적 유전자로 아밀라아제 유전자를 삽입한 재조합 벡터 pYBamy59.
  11. 제 8항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  12. 제 10항의 재조합 벡터 pYBamy59로 형질전환된 비피도박테리움 롱검 MG1(기탁번호 KFCC-11274).
  13. 비피도박테리움 유래 플라스미드와 대장균 유래 플라스미드를 이용하여 비피도박테리움과 대장균에서 상호 복제되는 셔틀벡터를 제조하는 단계;
    상기 셔틀벡터에 목적 단백질을 코딩하는 목적 유전자를 결합시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 재조합 벡터로 형질전환시키기 위한 숙주세포로서 상기 셔틀벡터의 제조에 이용된 비피도박테리움을 이용하는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
  14. 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 비피도박테리움 GE65(Bifidobacterium sp. GE65)의 프로모터.
  15. 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 비피도박테리움 GE65의 프로모터.
KR10-2001-0009526A 2001-02-24 2001-02-24 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법 KR100457879B1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0009526A KR100457879B1 (ko) 2001-02-24 2001-02-24 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법
PCT/KR2001/000527 WO2002068662A1 (ko) 2001-02-24 2001-03-30 Plasmid originated from bifidobacterium, recombinant expression vector using the plasmid and transformation method
US10/258,440 US6887702B2 (en) 2001-02-24 2001-03-30 Plasmid originated from bifidobacterium, recombinant expression vector using the plasmid and transformation method
JP2002568756A JP2004519236A (ja) 2001-02-24 2001-03-30 ビフィドバクテリウム由来の新規なプラスミド、これを利用した組換え発現ベクターおよび形質転換方法
EP01917936A EP1319080A4 (en) 2001-02-24 2001-03-30 PLASMID FROM BIFIDOBACTERIUM, RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR USING THE SAME, AND PROCESSING METHOD

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0009526A KR100457879B1 (ko) 2001-02-24 2001-02-24 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2004-0057847A Division KR100483934B1 (ko) 2004-07-23 2004-07-23 비피도박테리움 롱검 ｍｇ1 유래 신규 플라스미드를 함유하는 셔틀벡터

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020069324A true KR20020069324A (ko) 2002-08-30
KR100457879B1 KR100457879B1 (ko) 2004-11-18

Family

ID=19706236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2001-0009526A KR100457879B1 (ko) 2001-02-24 2001-02-24 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US6887702B2 (ko)
EP (1) EP1319080A4 (ko)
JP (1) JP2004519236A (ko)
KR (1) KR100457879B1 (ko)
WO (1) WO2002068662A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220104535A (ko) 2021-01-18 2022-07-26 김기혁 후라이드 치킨 제조방법

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4945440B2 (ja) 2005-04-08 2012-06-06 株式会社アネロファーマ・サイエンス ５−フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法
US20070048823A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-01 Cerenis Therapeutics, S.A. Compositions and Methods for Producing Apolipoprotein Gene Products in Lactic Acid Bacteria
EP2147105B1 (en) 2007-05-02 2013-04-24 Merial Limited Dna plasmids having improved expression and stability
DK2274422T3 (en) * 2008-04-17 2017-07-03 Anaeropharma Science Inc expression
US9730968B2 (en) 2008-04-17 2017-08-15 Anaeropharma Science, Inc. Therapeutic agent for ischemic diseases
EP2283810A1 (en) * 2009-07-16 2011-02-16 University College Cork-National University of Ireland, Cork Orally administered bacteria as vehicles for systemic delivery of agents
KR20120112824A (ko) * 2010-01-29 2012-10-11 가부시키가이샤 아네로파마?사이엔스 형질전환용 플라스미드

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220104535A (ko) 2021-01-18 2022-07-26 김기혁 후라이드 치킨 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
JP2004519236A (ja) 2004-07-02
EP1319080A1 (en) 2003-06-18
WO2002068662A1 (ko) 2002-09-06
US20040014221A1 (en) 2004-01-22
WO2002068662A8 (ko) 2002-09-26
EP1319080A4 (en) 2004-10-20
US6887702B2 (en) 2005-05-03
KR100457879B1 (ko) 2004-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Matteuzzi et al. Bifidobacterium suis n. sp.: A new species of the genus Bifidobacterium isolated from pig faces
US8741622B2 (en) Stress tolerant Bifidobacteria
JP4945440B2 (ja) ５−フルオロウラシル耐性菌およびその作製方法
AU753558B2 (en) Production of L(+)-Lactate
KR100457879B1 (ko) 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법
JPH09269A (ja) 乳酸菌産生エキソポリサッカライド
CN117946953A (zh) 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用
JPH10503643A (ja) 微生物中に遺伝物質を導入する方法およびその方法によってえられる形質転換体
JP3620831B2 (ja) 乳酸菌シャトルベクター
KR20040072545A (ko) 비피도박테리움 롱검 ｍｇ1 유래 신규 플라스미드를함유하는 셔틀벡터
KR100621657B1 (ko) 내산성과 내담즙성이 좋고 효소의 생산이 우수한 신규바실러스 서브틸리스 유비티-엠02 균주 , 이 신규 균주를이용 함유하는 사료첨가제 및 이 사료첨가제를 함유하는가축 사료
EP2057266B1 (en) Genetic remodeling in bifidobacterium
WO2022006748A1 (en) Genetically engineered live bacteria and methods of constructing the same
WO2005001068A1 (en) A BIFIDOBACTERIUM BREVE LMC520 STRAIN CONTAINING A PLASMID Pbc520, A METHOD FOR PREPARATION OF CONJUGATED FATTY ACIDS AND FERMENTED MILKS CONTAINING SUCH FATTY ACIDS USING THE SAME STRAIN, AND USE OF A PLASMID pBC520
KR0157757B1 (ko) 내산성 및 내담즙성 비피도박테리움의 분리방법
KR100357237B1 (ko) 한우 유래 락토페린 발현용 재조합 효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 락토페린
JPH02312590A (ja) プラスミドｐＴＹ１
Kumar et al. Evidence for the presence of plasmids in four therapeutically important strains of Lactobacillus acidophilus
MXPA98003427A (en) Production of l (+) - lact
WO2002036756A2 (fr) Souche de lactobacillus sakei, et plasmide heberge par ladite souche
KR20030010879A (ko) 비피도박테리움 아돌레센티스에서 분리된 β-갈락토시다제유전자

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20111103

Year of fee payment: 8

LAPS Lapse due to unpaid annual fee