WO2002036756A2 - Souche de lactobacillus sakei, et plasmide heberge par ladite souche - Google Patents

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WO2002036756A2
WO2002036756A2 PCT/FR2001/003367 FR0103367W WO0236756A2 WO 2002036756 A2 WO2002036756 A2 WO 2002036756A2 FR 0103367 W FR0103367 W FR 0103367W WO 0236756 A2 WO0236756 A2 WO 0236756A2
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nucleic acid
cncm
plasmid
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PCT/FR2001/003367
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Carl-Alfred Alpert
Monique Zagorec
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • Lactobacillus sakei is a lactic acid bacteria commonly used in the manufacture of certain fermented food products, in particular products derived from meat or fish, or sauerkraut. Its main role is the production of lactic acid, by fermentation of the carbohydrates naturally present in small quantities in the starting product (for example glucose or ribose), or added (mainly glucose, sucrose, dextrins, or from lactose in the form of skimmed milk powder) to this to stimulate fermentation.
  • the lactic acid thus produced plays an essential role in the texture and hygienic quality of the final product.
  • the entry of sugar into the cell is coupled to a cascade of phosphorylations, which involve the non-specific enzymes El and HPr, and the enzymes EIIA, and EIIB / EIIC, which are specific for a given sugar.
  • This process begins with the phosphorylation of E1 from phosphoenolpyruvate (PEP), and leads to the phosphorylation of EIIB, according to the following sequence: EI ⁇ HPr ⁇ EIIA ⁇ EIIB.
  • the phosphorylated EIIB enzyme, associated with the transmembrane protein EIIC simultaneously catalyzes the entry of sugar into the cell and its phosphorylation.
  • Lactose is thus imported into the cell in the form of lactose phosphate; this is hydrolyzed by a P- ⁇ -galactosidase to glucose, which enters directly into glycolysis, and to galactose-6P, which is converted by the tagatose- ⁇ P pathway, before being metabolized by the triose pathway- phosphate.
  • Lactobacillus casei which includes the lacT gene coding for an antiterminator, the lacE and lacF genes, coding respectively for the specific enzymes EIIBC lac and EIIA lac of the lactose PTS system, and the lacG gene coding for P- ⁇ -galactosidase ;
  • lacRABCDFEGX genes from Lactococcus lactis, which includes:
  • lacR gene coding for a repressor of the transcription of the lacABCDFE operon
  • lacABCDFE operon which comprises the lacA and lacB genes coding respectively the A and B subunits of galactose 6-P isomerase, the lacC and lacD coding respectively for tagatose 6-P kinase and tagatose 1,6-diP aldolase, the lacE and lacF genes, respectively encoding the specific enzymes EIIBC ac and EIIA ac ,
  • Lactobacillus sakei a large production of EPS is generally not desirable; Indeed, these EPS can cause a sticky appearance, badly accepted by the consumer in the case of certain products, for example meat products.
  • lactose is a characteristic which, in the Lactobacillus sakei species, is very variable from one strain to another. It has been reported (OBST et al., FEMS Microbiol. Lett., 97, 209-214, 1992) that strains of Lactobacillus sakei may have either ⁇ -galactosidase activity, or P- ⁇ -galactosidase activity, or two activities, or neither.
  • an active ⁇ -galactosidase does not necessarily imply a functional lactose metabolism, for example, the laboratory strain model 23K, as well as its mother strain 23 have a Lac phenotype " although they express an active ⁇ -galactosidase.
  • lactose is also frequently unstable, which is particularly troublesome in the case of strains intended for industrial use, the properties of which must be controllable and reproducible. This instability has also been observed in lactic acid bacteria other than Lactobacill us sakei and has been attributed to the plasmid localization of the genes which code for enzymes capable of etabolizing lactose. Loss of the plasmid during repeat cultures would result in the loss of the Lac + phenotype.
  • the present invention aims to provide strains meeting these characteristics, as well as the tools for obtaining them.
  • RV332 a strain of Lactobacillus sakei, hereinafter called RV332, capable of assimilating lactose via a functional PTS system; they also identified, in this strain, a new plasmid, hereinafter called pRV500, capable of being maintained and of replicating stably in Lactobacillus sakei.
  • pRV500 a new plasmid
  • the inventors identified the genes involved in the metabolism of lactose by the phosphotransferase pathway in the strain RV332; they found that, unexpectedly, these genes presented a very significant homology (approximately 95% identity at the level of the nucleotide sequence) with the genes specific for the lac-PTS system of Lactococcus lactis, and were organized in an identical manner, namely in the form of a cluster of lacRABCDFEGX genes, comprising from 5 'to 3': the lacR, lacA, cB, cC, cD, cE, lacF, lacG, and lacX genes.
  • the lacRABCDFEGX gene cluster is located on the chromosome of the RV332 strain; it is flanked on either side by sequences having strong homologies with IS insertion sequences: the sequence of a chromosomal DNA fragment of the strain RV332 comprising the genes specific to the lac-PTS system is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1.
  • the inventors have also sequenced the plasmid pRV500; this plasmid carries an open reading frame encoding proteins significantly similar to known RepA proteins, in particular a RepA protein of Tetragenococcus halophilus, open reading frames encoding proteins similar to lactococcal proteins, and open reading frames encoding proteins significantly similar to HsdM, HsdS and HsdR proteins of a restriction / modification system for resistance to bacteriophages.
  • the complete sequence of the plasmid pRV500 is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 11.
  • the subject of the present invention is the strain of
  • Lactobacillus sakei RV332 which was deposited under the Budapest Treaty, March 15, 2000, with the C.N.C.M.
  • the present invention also encompasses molecules of biological interest, obtained from said strain. These are in particular nucleic acid molecules which can be used for the genetic transformation of lactic acid bacteria, and more particularly:
  • nucleic acid molecules comprising at least one gene from the lacRABCDFEGX cluster of the RV332 strain, and in particular at least one gene involved in the catabolism of lactose by the phosphotransferase pathway, chosen from the lacR gene, the lacA gene, the lacB gene, the lacC gene, the cD gene, the lacF gene, the cE gene, and the cG gene,
  • nucleic acid molecules comprising at least one fragment of said plasmid, and in particular nucleic acid molecules comprising the replication system of said plasmid, or nucleic acid molecules comprising at least one gene of said plasmid chosen from hsdM, hsdS or hsdR.
  • said gene involved in the catabolism of lactose by the phosphotransferase route is chosen from the lacA gene, the lacB gene, the lacC gene, the lacD gene, lacF gene, lacE gene and lacG gene.
  • a nucleic acid molecule in accordance with the invention comprises several genes from the lacRABCDFEGX cluster; these may be non-limiting examples:
  • nucleic acid molecule comprising at least all of the genes allowing the metabolism of lactose by the phosphotransferase route; a nucleic acid molecule comprising all of the lacABCDFE genes;
  • nucleic acid molecule comprising at least the combination of lacAB genes, and thus allowing the expression of a galactose 6-P isor ⁇ érase;
  • nucleic acid molecule comprising at least the combination of lacCD genes, and thus allowing the expression of the enzymes of the ⁇ -P tagatose pathway;
  • nucleic acid molecule comprising at least the combination of lacEF f genes and thus allowing the expression of specific enzymes EIIBC ac and EIIA Lac for transporting lactose.
  • nucleic acid molecule according to the invention can also comprise the lacR regulatory gene, as well as the lacX gene.
  • Nucleic acid molecules in accordance with the invention containing at least one gene involved in the catabolism of lactose by the phosphotransferase route, can be used in particular for the genetic transformation of lactic acid bacteria, in particular lactobacilli, such as Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii fsubsp. delbrueckii or bulgaricus), Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum,
  • Lactobacillus zeae Lactobacillus helveticus, etc. and in particular Lactobacillus sakei, in order to give them the ability to use lactose through phosphotransferases.
  • the present invention also provides means for selecting strains of Lactobacillus sakei capable of using lactose by the phosphotransferase route.
  • the subject of the present invention is a method for selecting a strain of Lactobacillus sakei capable of metabolizing lactose by the phosphotransferase route, characterized in that it comprises the detection of the presence, in strains of Lactobacillus sakei, test, for genes cA, cB, lacC, lacD, lacF, lacE, and lacG, respectively having at least 90% identity with the genes lacA, cB, lacC, cD, cF, lacE, and lacG , of the strain CNCM 1-2398, and the selection of a strain comprising all of said genes.
  • the method according to the invention may also comprise the detection of the presence of the lacR and lacX genes.
  • the method according to the invention can in particular be implemented using, for the detection of the presence of the lacA, lacB, cC, lacD, cF, lacE, and lacG genes, and optionally lacR and lacX genes, nucleic acid probes derived from the corresponding genes of the strain CNCM 1-2398, or alternatively nucleic acid probes derived from the homologous genes of Lactococcus lactis.
  • the expression of proteins encoded by these genes can be detected, for example using antibodies directed against them or against their Lactococcus lactis counterparts.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a strain of Lactobacillus sakei capable of metabolizing lactose by the phosphotransferase route, characterized in that it comprises the transformation of Lactobacillus sakei with at least one acid sequence nucleic acid chosen from:
  • nucleic acid sequence having at least 90% identity with the lacA gene of the CNCM 1-2398 strain - A nucleic acid sequence having at least 90% identity with the lacB gene of the strain CNCM 1-2398;
  • nucleic acid sequence having at least 90% identity with the lacG gene of the CNCM 1-2398 strain is a nucleic acid sequence having at least 90% identity with the lacG gene of the CNCM 1-2398 strain.
  • it further comprises the transformation of said strain with a nucleic acid sequence having at least 90% identity with the lacR gene of the CNCM 1- strain. 2398, and / or with a nucleic acid sequence having at least 90% identity with the lacX gene of the strain CNCM 1-2398.
  • the percentage identity of a sequence with a reference sequence is defined here as the percentage of residues of this sequence which are identical with those of the reference sequence on an alignment of the 2 sequences ensuring maximum correspondence between the positions of the residues .
  • genes or combinations of genes derived from the CNCM 1-2398 strain or genes or combinations of homologous genes derived from any other strain of Lactobacillus sakei, or genes or combination of homologous genes from Lactococcus lactis.
  • an integrative vector will advantageously be chosen, making it possible to insert the chosen sequence into the bacterial chromosome, and thus to obtain stable transformants.
  • the insertion into the bacterial chromosome can be carried out for example by using the insertion sequences flanking the lacRABCDFEGX cluster, or else by homologous recombination; in the latter case, it will preferably be carried out at the level of a non-essential gene or region of Lactobacillus sakei, for example at the level of the lacLM operon, as described in Application PCT / EP00 / 03099 cited above. above, or else at the level of the chromosome region of Lactobacillus sakei homologous to that in which the lacRABCDFEGX cluster is inserted in the strain RV332.
  • replicating plasmid capable of being maintained in a stable manner in Lactobacillus sakei; the present invention also provides new plasmids which can be used in particular for this purpose. It is the plasmid pRV500 and derivatives thereof comprising its replication system.
  • replication system of the plasmid pRV500 is understood to mean a nucleic acid fragment comprising:
  • the repR gene of pRV500 or a sequence coding for a protein having at least 70% identity, preferably at least 80% identity, and very preferably at least 90% identity with the RepA protein encoded by said gene.
  • a subject of the present invention is therefore also also also a plasmid capable of replicating in Lactobacillus sakei, chosen from:
  • the plasmids in accordance with the invention have a theta-type replication system and allow the insertion of large nucleic acid sequences, in particular several contiguous genes or a complete operon. They are therefore particularly advantageous in the context of the implementation of the present invention for obtaining transformed strains of Lactobacillus sakei capable of assimilating lactose, but also for the introduction and maintenance of any other gene or set of genes of interest in Lactobacillus sakei. They can also be used not only che ?
  • Lactobacillus sakei but also in other species of lactic bacteria, for example lactococci such as Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, etc. , and advantageously in lactobacilli, such as Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii (subsp. delbrueckii or bulgaricus), Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum,
  • Lactobacillus zeae Lactobacillus helveticus, etc.
  • shuttle vectors capable of replicating in Escherichia coli can also be used to obtain shuttle vectors capable of replicating in Escherichia coli.
  • the present invention also relates to plasmids derived from the plasmids in accordance with the invention defined above, and in particular plasmids with conditional replication.
  • conditional replication plasmid a plasmid whose replication takes place only under certain conditions (for example temperature, pH, concentration of mineral salts, presence in the culture medium of a particular compound , etc.), for example because one or more sequence (s) of said plasmid involved in its replication (in particular the origin of replication and / or the repA gene) carries (are) a conditional mutation, or else because that one or more of the proteins involved in replication are placed under the control of an inducible promoter.
  • certain conditions for example temperature, pH, concentration of mineral salts, presence in the culture medium of a particular compound , etc.
  • the transformation can thus be carried out in two stages: in the first, the bacteria are cultured under conditions allowing replication of the plasmid, which allows a first selection of those in which it has replicated; in the second, the bacteria are cultivated under conditions which do not allow replication of the plasmid, which makes it possible to select those in which the sequences of the plasmid are integrated into the chromosome.
  • This system makes it possible to decouple transformation and recombination, making it possible to modify weakly transformable strains.
  • Examples of plasmids with conditional replication are for example the plasmids of the pGhost family (BIS AS et al., J.
  • Plasmids with similar properties which can be used in Lactobacillus sakei can for example be obtained by carrying out mutations in the repA gene of pRV500 at level of the region analogous to that of the repA gene of the plasmid pWVO1 carrying the heat-sensitive mutation.
  • the reading frames present on the plasmid pRV500 and in particular the sequences encoding the proteins HsdM, HsdS and HsdR, can also be used to transform lactic acid bacteria, for example to increase their resistance to bacteriophages.
  • the present invention also relates to strains of Lactobacillus sakei derived from the strain RV332 (CNCM 1-2398), and in particular:
  • Lactobacillus sakei strains derived from the RV332 strain, by modification of one or more regulatory elements (in particular promoters) of the expression of one or more genes of the lacRABCDFEGX cluster.
  • EXAMPLE 1 ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF THE RV332 STRAIN.
  • Lactococcus lactis i.e. the lacABCD genes of galactose 6-P isomerase, and of the tagatose 6-P pathway, and the lacFE 'transport genes (enzymes EIIA Lac and enzyme EIIBC Lac ) (VAN ROOIJEN et al ., J. Biol. Chem., 266, 7176-7181, 1991).
  • Lac 4 " strains may indicate either that they have a PTS system that does not have sufficient similarity with the probes used to be detected, or that their Lac + phenotype is due to a permease / ⁇ -galactosidase system, not a PTS system.
  • the RV332 strain was selected for the research of the genes of the PTS system. 4 clones, corresponding to the restriction fragments by Hindi II and / or EcoRI, hybridizing with the probes derived from Lactococcus lactis were obtained from the total DNA of RV332: pRV501 (2 kb, EcoRI), pRV502 (1 , 75 kb, HindiII EcoRI, pRV503 (1.8 kb, Hindlll) and pRV504 (1.6 kb, Hindlll / EcoRI).
  • pRV501 includes the sequences corresponding to cRAB', and pRV503 those corresponding to lac 'BCD'.
  • the coding regions identified on these clones have a remarkably high percentage of identity (approximately 95%) with the known sequences of the lac region of Lactococcus lactis (GenBank M60447).
  • the sequence of a fragment of 17075 bp comprising the entire lac region of the strain RV332 of Lactobacillus sakei is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1; the polypeptide sequences of the enzymes of the lac-PTS system encoded by this fragment are also represented in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 10.
  • the entire lac region of RV332 is located on the bacterial chromosome. This chromosomal location was confirmed by the sequencing of the only RV332 plasmid, pRV500 (see example 4 below).
  • the 5 ′ region of the operon has 2 elements having a high sequence similarity with insertion elements flanking 2 open reading frames encoding proteins having significant similarity with redoxase-type mercuric redoxases and with a protein of Lactobacillus rhamnosus, the function of which is currently unknown.
  • lacX is followed directly by a second copy of an iso-ISS30 element; other sequences recalling those of insertion elements are also present in this region.
  • Table la indicates the position of the regions identified on the strand of sequence SEQ'ID NO: 1, as well as their characteristics
  • Table Ib indicates the position of the regions identified on the reverse complementary strand as well as their characteristics.
  • EXAMPLE 2 FUNCTIONALITY OF THE LACTOBACILLUS SAKEI LAKE REGION.
  • mutants of these mutants are as follows: derivatives of pRV300 containing fragments obtained by PCR homologous to the region to be modified, with the exception of the mutation to be introduced, are introduced into the chromosome by simple crossing-over; the selection of the integrants is carried out on the basis of the resistance to erythromycin, conferred by the sequences of pRV300. The insertion of a single copy of the plasmid into the target gene is verified by PCR.
  • the recombinants obtained are cultured in MRS medium (DE MAN et al., Journal of Applied Bacteriology, 23, 130-135, 1960) for 100 generations, under non-selective conditions (that is to say in the absence of erythromycin ), which allows the loss of resistance to erythromycin, during a second crossing-over. If this second crossing-over occurs on the same side of the site intended for the mutation, the wild character is restored; on the other hand, if the second crossing-over occurs on the other side of the site provided for the mutation, the region of the chromosome carrying the wild character situated between the locations of the two crossing-over is exchanged with the mutated region.
  • Mutants constructed in this way do not contain any exogenous or plasmid DNA, since the pRV300 derivatives used cannot replicate autonomously in Lactobacillus sakei.
  • RV3001 The resulting strain, named RV3001, was then used for the construction of the following mutant strains:
  • the tagatose-6P pathway is inactivated by a deletion in the lacB gene coding for tagatose-6P kinase, resulting in a Lac- phenotype; - RV3008 in which the specific enzyme
  • EIIBC Lac is inactivated by a deletion in the lacE gene encoding this enzyme, resulting in a Lac- phenotype.
  • the deletions were carried out in such a way that the reading frames located downstream remained in phase, in order to avoid any effect of polarity on the translation of the genes in 3 'of the deletion.
  • RV332 in which the general enzyme E1 of the PTS system is inactivated was constructed, by mutation of the pts1 gene, identical to that carried out on the mutant strain RV3005; a Lac- phenotype of this strain makes it possible to verify that the lactose metabolism in RV332 depends solely on the activity of the lac-PTS system.
  • the mutant strains were characterized by their growth behavior on chemically defined medium (MCD) (LAURET et al., Appl. Environ. Microbiol., 62, 1922-1927, 1996), supplemented with either glucose, lactose or galactose.
  • MCD chemically defined medium
  • RV332 exhibits a relatively long latency phase if it is precultured on medium comprising glucose, while the constitutive mutant RV3003 exhibits no latency phase under these conditions.
  • the lac operon also appears to be induced during growth on galactose in lactose-inducible strains, as well as in Lac- strains due to inactivation of the tagatose-6P pathway. However, it is not inducible in pts strains. As there should not be any transport of galactose by the residual EIIBC Lac activity in RV3008, whose lac operon is however induced by this substrate, it can be assumed that there is a separate PTS system for galactose, which would produce a free inducer of the lac operon, or whose optimal activity would depend on the accessory activity of the tagatose-6P pathway of the lac operon.
  • RV3004 and RV3005 reach a higher final OD on galactose than the other strains.
  • Several explanations are possible: for example, it is possible that the gain in total cell mass in relation to the number of cells is faster in RV3004 and RV3005 than in other strains, or else, due to the absence of a galactose metabolism via the PTS the quantity of galactose available for the production of exopolysaccharides is greater, this which would lead to a higher final OD due to the presence of these exopolysaccharides.
  • a regulatory effect of PTS on the metabolism of galactose is also possible.
  • EXAMPLE 3 STABILITY OF THE LAC + PHENOTYPE The stability of the Lac + phenotype in prolonged cultures was studied on the strains RV332 and RV3003.
  • Bacteria from these 2 strains from frozen glycerol stock cultures are streaked on MRS agar and incubated at 30 ° C. The isolated colonies are returned to culture in MCD medium 0.05% Glucose / 1% Lactose.
  • Successive dilutions of these cultures are spread on boxes of solid MRS agar medium, to determine the number of bacteria at generation 0. 100 ⁇ l of a dilution 10 ⁇ 3 of these cultures are inoculated in 100 ml of MRS medium and incubated for 24 hours which corresponds to growth for about 20 generations.
  • the enumeration of the lac + bacteria and that of the lac- bacteria are carried out on another sample of each culture, according to the following protocol: Successive dilutions of each sample are spread on MRS agar to isolate the colonies. Each of the isolated colonies is inoculated into one of the wells of a microtiter plate (96 wells / plate) in 100 ⁇ l of MCD medium, containing 10 g / 1 of lactose, and 15 mg / 1 of bromocresol purple (indicator pH). The plates are incubated for 24 hours at 30 ° C; under these conditions, the lac + colonies grow in the wells of microtiter plates and the bromocresol purple turns yellow. On the other hand, the lac- colonies do not grow and the coloration remains purple.
  • Controls are carried out by incubation of wells without bacteria and by incubation of wells inoculated with generation 0 bacteria and control strains Lac + (RV332) and Lac- (mutants).
  • Lac + seems to stabilize at a plateau of around 50%.
  • the stability of RV3003 can therefore be sufficient for certain uses, in particular if it is possible to reduce the culture time under non-selective conditions for the Lac + phenotype, for example by carrying out a preculture on a medium containing lactose. A 1 liter preculture under these conditions already allows obtaining
  • the strain RV332 is preferable, because of its much greater stability for the Lac + phenotype.
  • EXAMPLE 4 ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF THE PRV500 PLASMID
  • the plasmid pRV500 was purified from the strain RV332, by a method adapted from the protocol described by ANDERSON and Me KAY (Applied and Environ ental Microbiology, 46, 549-552, 1983), or by separation, from a crude cell lysate obtained by lysozyme treatment, using a QIAGEN plasmid MAXIPREP purification kit by following the protocol recommended by the manufacturer (QIAGEN, France).
  • the plasmid pRV500 is shown diagrammatically in FIG. 3.
  • ORFs open reading frames
  • RBS ribosome binding sites
  • ORFs represent a total of 11,139 nucleotides, ie 86% of the size of the plasmid.
  • the hsdM gene overlies the hsdS ORF on 3 codons, encodes only a partial HsdS protein (HsdS 1 ), which is joined to a complete hsdS sequence, which is itself preceded by ORF-2, encoding a protein similar to XerC-type integrases / recombinases.
  • the orientation of the hsdR gene is opposite to that of ORF-2, and in the same direction as hsdM and hsdS '.
  • the proteins HsdM and HsdS ' both have approximately 51% identity with proteins from Klebsiella pneumoniae, while HsdS has 25% identity with a protein hypothetical of Methanococcus jannaschii and HsdR has 39% identity with a hypothetical protein of Haemophilus influenzae.
  • the low GC region can be divided into 2 sub-regions: one comprising the replication functions of the plasmid and ORF-6, and the other comprising ORFs 8 to 13.
  • ORF-8 and ORF-10 to ORF-13 have percentages of identity of 45%, 90%, 86%, 85% and 29% respectively with the proteins closest to the databases. However, no function is known for these proteins.
  • the replication region contains a gene encoding a RepA protein having 79% identity with RepA of the plasmid pUCL287 (access number: X75607) from Tetragenococcus halophilus. Downstream of repA and in the same orientation is ORF-6, which has 62% identity with an ORF of the plasmid pSRQ900 from Lactococcus lactis. In pRV500 and pSRQ900 repA and ORF-6 are organized identically. These genes are preceded by 2 sets of concatenated direct repeat sequences (three times ACCTCTTTTA and four and a half times TTTATCAAGTAGGTTTTGTCTG).
  • Table VIII summarizes the GC% of the different ORFs, as well as their% similarity with the closest proteins.
  • the plasmid pRV566 was established in Escherichia coli TG1, then transferred by electroporation to the model strain Lactobacillus sakei 23K. No growth was observed on the dishes produced from control cultures of Lactobacill us sakei 23K treated with the electroporation buffer without DNA; on the other hand, on the dishes produced from the 23K / pRV566 cultures, a large number of colonies are observed, indicating that the recombinant plasmid pRV566 can replicate in Lactobacillus sakei.
  • 23K / pRV566 is cultured at 30 ° C for 24 hours in 100 ml MRS, without selection by antibiotics. 100 ⁇ l of a 10 ⁇ 3 dilution are then transferred to 100 ml of fresh MRS and cultured again for 24 hours. Each transfer is considered to represent a growth of 20 generations in 24 hours.
  • FIG. 5 represents the percentage of colonies resistant to erythromycin as a function of the number of generations.
  • EXAMPLE 6 REPLICATION OF PRV566 IN DIFFERENT LACTIC BACTERIA.
  • the replication capacity of pRV566 was studied on the basis of the plasmid content of different lactic acid bacteria before and after transformation with pRV566.
  • L. sakei 23K, G3AF, 160K and 64F are totally (23K, 160K) or partially (64F, G3AF) laboratory strains containing their endogenous plasmids described by BERTHIER et al. (Microbiology, 1273-1279, 1996). These strains like the L. sakei ATCC15521, L. curvatus 116, T402 and T411 (BERTHIER and EHRLICH, Int. J. Syst. Bacteriol., 49, 997-1007, 1999), L. curva tus ATCC20019, L. tarum plan ATCC8014 and ATCC14917, and L. casei BL23 (GOSALBES et al., J.
  • Bacteriol., 181, 3928-3934, 1999) are used as receptor strains for obtaining transformants after electroporation, with pRV566 obtained as described in Example 5, according to the method described by BERTHIER et al. (1996, publication cited above).
  • the strains can also be transformed by electroporation with other replication plasmids, pGh st4 (BIS AS et al., J. Bacteriol., 175, 3628-3635, 1993) and pIL253 (SIMON and CHOPIN, Biochemistry, 70, 559 -566, 1988) purified from E. coli, in order to compare the transformation efficiency obtained with pRV566.
  • Lactobacilli are grown at 30 ° C, or 37 ° C for L. casei, in MRS containing 1% glucose, without selection by antibiotics.
  • a concentration of 5 mg / ml of erythromycin in the culture medium of the transformants is used to select those resistant to this antibiotic.
  • the number and the size of the plasmids is determined by agarose gel electrophoresis and the presence of pRV566 is also verified by Southern hybridization using pRV566 labeled using an ECL kit (Amersham) as probe, according to methods. molecular biology (SAMBROOK et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; MALLERET et al., Microbiology, 144, 3327-3333, 1998) . The presence of pRV566 has been demonstrated in all transformed strains. In addition, in all transformed strains, with the exception of L.
  • Plasmid pRV566 is originally prepared from dXE. coli TGl. Transformants L. sakei 23K and L. sakei 160K, obtained after electroporation with pRV566, are lysed by a prolonged treatment with lysozyme.
  • the plasmid PRV566 is purified using a QIAGEN plasmid MAXIPRER purification kit, according to the manufacturer's instructions (QIAGEN, France). The plasmid pRV566 is then used to transform the same batches of electrocompetent bacteria of various strains of L. sakei.
  • Plasmids extracted from weakly transformable strains were hybridized with pRV566 to determine whether endogenous plasmids sharing homologies with pRV566 may be involved in plasmid incompatibility. A strong hybridization signal was observed with the L plasmids. sakei G3AF, L. curva tus T402 and L. curva tus 116, for which no transformants can be obtained.
  • EXAMPLE 7 STABILITY OF PRV566 IN LACTOBACILLES.
  • the lactobacilli transformed by pRV566 are cultivated at 30 ° C, or at 37 ° C for L. casei, for 24 hours in 100 ml of MRS, without selection by antibiotics. Every 24 hours, 100 ⁇ l of a 10 ⁇ 3 dilution are transferred into 100 ml of fresh MRS and cultured again for 24 hours. Each transfer is considered to represent a growth of approximately 20 generations per 24 hours. At the same time as each transfer, diluted aliquots are spread on boxes of MRS-agar medium and of MRS-agar medium containing 5 mg / ml of erythromycin, in order to determine the percentage of lactobacilli which remain resistant to erythromycin. The stability of pRV566 during successive transfers has been studied.
  • the strains of L. casei used during the fermentation process of meat are inoculated at a high cell density, and only grow for about 12 generations during fermentation.
  • the use of pRV500 derivatives as vectors in lactobacilli can therefore be considered.

Abstract

L'invention est relative à une nouvelle souche de L. sakei, apte à assimiler le lactose, et à un nouveau plasmide hébergé par ladite souche, et utilisable pour transformer L. sakei.

Description

SOUCHE DE LACTOBACILLUS SAKEI, ET PLAS IDE HEBERGE PAR LADITE SOUCHE
L' invention est relative à une nouvelle souche de Lactobacillus sakei et à ses utilisations. Lactobacillus sakei est une bactérie lactique utilisée communément dans la fabrication de certains produits alimentaires fermentes, notamment les produits dérivés de la viande ou du poisson, ou la choucroute. Son rôle principal est la production d'acide lactique, par fermentation des hydrates de carbones présents naturellement en faibles quantités dans le produit de départ (par exemple le glucose ou le ribose) , ou ajoutés (principalement du glucose, dusaccharose, des dextrines, ou du lactose sous forme de poudre de lait écrémé) à celui-ci pour stimuler la fermentation. L'acide lactique ainsi produit joue un rôle essentiel dans la texture et la qualité hygiénique du produit final .
Dans le cadre de la fabrication de produits fermentes ou dans celui de la production de ferments destinés à cette fabrication, il est important de disposer de cultures de Lactobacillus sakei dont la croissance soit rapide, bien maîtrisée, et reproductible. Ces propriétés dépendent essentiellement de la capacité de ces cultures à utiliser les sucres comme source de carbone pour assurer leur croissance, et notamment le lactose, qui est fréquemment employé par les industriels pour activer la fermentation.
Chez les bactéries, deux voies différentes de métabolisme du lactose ont été décrites.
La mieux connue est celle qui fait intervenir le système perméase/β-galactosidase. Cette voie métabolique a été initialement mise en évidence chez Escherichia coli , et des systèmes similaires ont été ensuite observés chez de nombreuses bactéries, y compris des bactéries Gram-positives . Le lactose importé par la perméase dans la cellule bactérienne, est clivé par la β-galactosidase en glucose et galactose, qui entrent ensuite dans le métabolisme des sucres . Une autre voie de métabolisme des sucres, et entre autre du lactose a été observée chez certaines bactéries Gram-positives : il s'agit du système des phosphotransférases (PTS) . Dans ce système l'entrée du sucre dans la cellule est couplée à une cascade de phosphorylations, qui font intervenir les enzymes non-spécifiques El et HPr, et les enzymes EIIA, et EIIB/EIIC, qui sont spécifiques d'un sucre donné. Ce processus débute par la phosphorylation de El à partir du phosphoénolpyruvate (PEP) , et aboutit à la phosphorylation de EIIB, selon l'enchaînement suivant : EI→HPr→EIIA→EIIB.
L'enzyme EIIB phosphorylée, associée à la protéine transmembranaire EIIC catalyse simultanément l'entrée du sucre dans la cellule et sa phosphorylation.
Ainsi, le lactose est importé dans la cellule sous forme de lactose phosphate ; celui-ci est hydrolyse par une P-β-galactosidase en glucose, qui entre directement dans la glycolyse, et en galactose-6P, qui est converti par la voie du tagatose-βP, avant d'être métabolisé par la voie des trioses-phosphate .
Les gènes codant les enzymes spécifiques du système PTS sont organisés en opéron ; chez les bactéries à Gram positif, 4 opérons PTS spécifiques du lactose ont été caractérisés jusqu'à présent :
- un opéron lacTEGF de Lactobacillus casei , qui comprend le gène lacT codant un antiterminateur, les gènes lacE et lacF, codant respectivement les enzymes spécifiques EIIBClac et EIIAlac du système PTS du lactose, et le gène lacG codant la P-β-galactosidase ;
- un amas de gènes lacRABCDFEGX de Lactococcus lactis, qui comprend :
* le gène lacR, codant un répresseur de la transcription de l' opéron lacABCDFE, * l' opéron lacABCDFE qui comprend les gènes lacA et lacB codant respectivement les sous-unités A et B de la galactose 6-P isomerase, les gènes lacC et lacD codant respectivement la tagatose 6-P kinase et la tagatose 1,6-diP aldolase, les gènes lacE et lacF, codant respectivement les enzymes spécifiques EIIBCac et EIIAac,
* l' opéron lacGX, qui comprend le gène lacG codant la P-β-galactosidase, et le gène lacX qui pourrait intervenir dans la recombinaison ;
- les amas de gènes lacRABCDFEG de Staphylococcus aureus, et de Streptococcus mutans, qui comprennent tous deux les gènes la cR, la cA, la cB r la cC, lacD , lacE , lacF, et la cG. Les régions du génome comprenant ces opérons sont représentés sur la Figure 1.
II est généralement admis que les sucres importés par le PTS sont plus rapidement métabolisés que ceux importés par le système perméase/β-galactosidase, et sont utilisés préférentiellement . En outre, dans le cas du système perméase/β-galactosidase, une partie du galactose résultant du clivage du lactose par la β-galactosidase, peut être utilisée pour la synthèse de polysaccharides de paroi ou d' exopolysaccharides (EPS) ; en revanche, le galactose-δP issu du système PTS n'est disponible que pour la croissance et non pour la production d'EPS. Dans le cas de Lactobacillus sakei , une production importante d'EPS n'est généralement pas souhaitable ; en effet, ces EPS peuvent entraîner un aspect poisseux, mal accepté par le consommateur dans le cas de certains produits, par exemple les produits carnés. Cependant, la capacité à utiliser le lactose est un caractère qui, chez l'espèce Lactobacillus sakei , est très variable d'une souche à l'autre. Il a été rapporté (OBST et al . , FEMS Microbiol. Lett . , 97, 209-214, 1992) que des souches de Lactobacillus sakei pouvaient posséder soit une activité β-galactosidase, soit une activité P-β-galactosidase, soit les deux activités, soit aucune des deux. En outre, la présence d'une β-galactosidase active n' implique pas forcément un métabolisme du lactose fonctionnel, par exemple, la souche de laboratoire modèle 23K, ainsi que sa souche-mère 23 ont un phénotype Lac" bien qu'elles expriment une β-galactosidase active.
L'aptitude à utiliser le lactose est en outre fréquemment un caractère instable, ce qui est particulièrement gênant dans le cas de souches destinées à un usage industriel, dont les propriétés doivent être contrôlables et reproductibles. Cette instabilité a également été observée chez des bactéries lactiques autres que Lactobacill us sakei et a été attribuée à la localisation plasmidique des gènes qui codent pour les enzymes capables de étaboliser le lactose. La perte du plasmide au cours des cultures répétées entraînerait la perte du phénotype Lac+.
Il apparaît donc souhaitable de disposer de souches de Lactobacillus sakei capables d'utiliser le lactose via le système des phosphotransférases et dans lesquelles les gènes responsables de ce métabolisme sont situés sur le chromosome, ou du moins sur un plasmide stable.
La présente invention a pour but de fournir des souches répondant à ces caractéristiques, ainsi que les outils permettant leur obtention.
Les Inventeurs ont isolé et caractérisé une souche de Lactobacillus sakei , dénommée ci-après RV332, capable d'assimiler le lactose par l'intermédiaire d'un système PTS fonctionnel ; ils ont en outre identifié, dans cette souche, un nouveau plasmide, dénommé ci-après pRV500, capable de se maintenir et de se répliquer de façon stable chez Lactobacillus sakei .
Les Inventeurs ont identifié les gènes impliqués dans le métabolisme du lactose par la voie des phosphotransférases chez la souche RV332 ; ils ont constaté que, de manière inattendue, ces gènes présentaient une homologie très importante (environ 95% d'identité au niveau de la séquence nucléotidique) avec les gènes spécifiques du système lac-PTS de Lactococcus lactis , et étaient organisés de manière identique, à savoir sous forme d'un amas de gènes lacRABCDFEGX , comprenant de 5' en 3' : les gènes lacR, lacA, la cB, la cC, la cD , la cE, lacF, lacG , et lacX.
L'amas de gènes lacRABCDFEGX est localisé sur le chromosome de la souche RV332 ; il est flanqué de part et d'autre de séquences présentant de fortes homologies avec des séquences d'insertion IS : la séquence d'un fragment d'ADN chromosomique de la souche RV332 comprenant les gènes spécifiques du système lac-PTS est représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1.
Les Inventeurs ont également séquence le plasmide pRV500 ; ce plasmide porte un cadre ouvert de lecture codant des protéines significativement similaires à des protéines RepA connues, notamment une protéine RepA de Tetragenococcus halophilus, des cadres ouverts de lecture codant des protéines similaires à des protéines de lactocoques, et des cadres ouverts de lecture codant des protéines significativement similaires à des protéines HsdM, HsdS et HsdR d'un système de restriction/modification de résistance aux bactériophages .
La séquence complète du plasmide pRV500 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 11.
La présente invention a pour objet la souche de
Lactobacillus sakei RV332, qui a été déposée selon le traité de Budapest, le 15 mars 2000, auprès de la C.N.C.M.
(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France), sous le
• numéro 1-2398.
La présente invention englobe également des molécules d'intérêt biologique, obtenues à partir de ladite souche. Il s'agit en particulier de molécules d'acide nucléique utilisables pour la transformation génétique de bactéries lactiques, et plus particulièrement :
- de molécules d'acide nucléique comprenant au moins un gène de l'amas lacRABCDFEGX de la souche RV332, et notamment au moins un gène impliqué dans le catabolisme du lactose par la voie des phosphotransferases, choisi parmi le gène lacR, le gène lacA, le gène lacB, le gène lacC, le gène la cD, le gène lacF, le gène la cE, et le gène la cG,
- du plasmide pRV500, ou de molécules d'acide nucléiques comprenant au moins un fragment dudit plasmide, et notamment de molécules d'acide nucléiques comprenant le système de réplication dudit plasmide, ou de molécules d'acide nucléique comprenant au moins un gène dudit plasmide choisi parmi hsdM, hsdS ou hsdR . Selon un mode de réalisation préféré d'une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention, ledit gène impliqué dans le catabolisme du lactose par la voie des phosphotransferases, est choisi parmi le gène lacA, le gène lacB, le gène lacC, le gène lacD, le gène lacF, le gène lacE et le gène lacG.
Avantageusement une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention comprend plusieurs gènes de l'amas lacRABCDFEGX ; il peut s'agir à titre d'exemples non- limitatifs :
- d'une molécule d'acide nucléique comprenant au moins l'ensemble des gènes permettant le métabolisme du lactose par la voie des phosphotransferases ; d'une molécule d'acide nucléique comprenant l'ensemble des gènes lacABCDFE ;
- d'une molécule d'acide nucléique comprenant au moins la combinaison de gènes lacAB, et permettant ainsi l'expression d'une galactose 6-P isorαérase ;
- d'une molécule d'acide nucléique comprenant au moins la combinaison de gènes lacCD, et permettant ainsi l'expression des enzymes de la voie du tagatose β-P ;
- d'une molécule d'acide nucléique comprenant au moins la combinaison de gènes lacEFf et permettant ainsi l'expression des enzymes spécifiques EIIBCac et EIIALac de transport du lactose.
Eventuellement, une molécule d'acide nucléique conforme à l' invention peut également comprendre le gène de régulation lacR, ainsi que le gène lacX.
Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, contenant au moins un gène impliqué dans le catabolisme du lactose par la voie des phosphotransferases, peuvent être utilisées notamment pour la transformation génétique de bactéries lactiques, notamment de lactobacilles, tels que Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii fsubsp. delbrueckii ou bulgaricus) , Lactobacillus curvatus , Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum,
Lactobacillus zeae, Lactobacillus helveticus, etc.. et en particulier de Lactobacillus sakei , afin de leur conférer la capacité d'utiliser le lactose par la voie des phosphotransferases .
La présente invention fournit également des moyens de sélection de souches de Lactobacillus sakei capables d'utiliser le lactose par la voie des phosphotransferases .
En particulier la présente invention a pour objet un procédé de sélection d'une souche de Lactobacillus sakei capable de métaboliser le lactose par la voie des phosphotransferases, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence, chez les souches de Lactobacillus sakei à tester, de gènes la cA, la cB, lacC, lacD, lacF, lacE, et lacG, présentant respectivement au moins 90% d'identité avec les gènes lacA, la cB, lacC, la cD, la cF, lacE, et lacG, de la souche CNCM 1-2398, et la sélection d'une souche comprenant l'ensemble desdits gènes. Eventuellement, le procédé conforme à l'invention peut en outre comprendre la détection de la présence des gènes lacR et lacX.
Le procédé conforme à l'invention peut en particulier être mis en œuvre en utilisant, pour la détection de la présence des gènes lacA, lacB, la cC, lacD, la cF, lacE, et lacG, et éventuellement des gènes lacR et lacX, des sondes d'acide nucléique dérivées des gènes correspondants de la souche CNCM 1-2398, ou bien des sondes d'acide nucléique dérivées des gènes homologues de Lactococcus lactis . Alternativement, on peut détecter l'expression des protéines codées par ces gènes, par exemple à l'aide d'anticorps dirigés contre celles-ci ou contre leurs homologues de Lactococcus lactis . La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une souche de Lactobacillus sakei capable de métaboliser le lactose par la voie des phosphotransferases, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de Lactobacillus sakei par au moins une séquence d'acide nucléique choisie parmi :
- une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacA de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacB de la souche CNCM 1-2398 ;
- une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacC de la souche
CNCM 1-2398 ;
- une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacD de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacF de la souche CNCM 1-2398 ;
- une séquence d' acide nucléique présentant au moins "90% d'identité avec le gène lacE de la souche CNCM 1-2398 ;
- une séquence d' acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacG de la souche CNCM 1-2398.
Selon un mode de mise en œuvre préféré du procédé conforme à l'invention, il comprend en outre la transformation de ladite souche avec une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacR de la souche CNCM 1-2398, et/ou avec une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacX de la souche CNCM 1-2398.
Le pourcentage d'identité d'une séquence avec une séquence de référence est défini ici comme le pourcentage de résidus de cette séquence qui sont identiques avec ceux de la séquence de référence sur un alignement des 2 séquences assurant une correspondance maximale entre les positions des résidus .
Pour la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention, on peut notamment utiliser des gènes ou combinaisons de gènes issus de la souche CNCM 1-2398, ou des gènes ou combinaisons de gènes homologues issus de toute autre souche de Lactobacillus sakei, ou des gènes ou combinaison de gènes homologues issus de Lactococcus lactis . Pour déterminer le gène ou la combinaison de gènes le plus approprié, on peut au préalable effectuer, comme indiqué ci-dessus, la détection de la présence, chez la souche à transformer, d'un ou plusieurs des gènes lacA, lacB, lacC, lacD, lacF, lacE, et lacG, et éventuellement des gènes lacR et/ou lacX, et effectuer la transformation avec une molécule d'acide nucléique comprenant le ou les gènes manquants .
Des méthodes de transformation de Lactobacillus sakei et des vecteurs convenant à la mise en œuvre de ces méthodes sont connus en eux-mêmes (cf. par exemple AXELSSONN et al . , FEMS Microbiol. Lett . , 168,137-143, 1998 ; BERTHIER et al . , Microbiology, 142, 1273-1279, 1996 ; LANGELLA et al . F FEMS Microbiol. Lett., 139, 51-56, 1996 ; Demande PCT EP/00/03099 au nom de l'INRA).
Dans le cadre de la mise en œuvre de la présente invention, on choisira avantageusement un vecteur intégratif, permettant d'insérer la séquence choisie dans le chromosome bactérien, et ainsi d'obtenir des transformants stables. On peut par exemple utiliser le vecteur pRV300, décrit par LELOUP et al . (Appl. Environm. Microbiol., 63, 2117-2123, 1997) .
L' insertion dans le chromosome bactérien peut s'effectuer par exemple en utilisant les séquences d'insertion flanquant l'amas lacRABCDFEGX, ou bien par recombinaison homologue ; dans ce dernier cas on l'effectuera de préférence au niveau d'un gène ou d'une région non- essentiels de Lactobacillus sakei, par exemple au niveau de l' opéron lacLM, comme décrit dans la Demande PCT/EP00/03099 citée ci-dessus, ou bien au niveau de la région du chromosome de Lactobacillus sakei homologue à celle dans laquelle l'amas lacRABCDFEGX est inséré dans la souche RV332.
On peut également utiliser comme vecteur un plasmide réplicatif capable de se maintenir de façon stable chez Lactobacillus sakei ; la présente invention fournit également de nouveaux plasmides utilisables en particulier dans ce but. Il s'agit du plasmide pRV500 et des dérivés de celui-ci comprenant son système de réplication. On entend par « système de réplication » du plasmide pRV500, un fragment d'acide nucléique comprenant :
- l'origine de réplication de pRV500,
- le gène repA de pRV500 ou une séquence codant pour une protéine présentant au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 90% d'identité avec la protéine RepA codée par ledit gène.
La présente invention a en conséquence également pour objet un plasmide, capable de se répliquer chez Lactobacillus sakei, choisi parmi :
- le plasmide pRV500, de la souche CNCM 1-2398 ;
- un plasmide comprenant au moins le système de réplication dudit plasmide pRV500. Les plasmides conformes à l'invention ont un système de réplication type thêta, et permettent l'insertion de grandes séquences d'acide nucléique, notamment plusieurs gènes contigus ou un opéron complet. Ils sont donc particulièrement intéressants dans le cadre de la mise en œuvre de la présente invention pour l'obtention de souches transformées de Lactobacillus sakei capables d'assimiler le lactose, mais également pour l'introduction et le maintien de tout autre gène ou ensemble de gènes d' intérêt chez Lactobacillus sakei . Ils peuvent également être utilisés non seulement che? Lactobacillus sakei mais également chez d'autres espèces de bactéries lactiques, par exemple des lactocoques tels que Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, etc . , et avantageusement chez des lactobacilles, tels que Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii (subsp. delbrueckii ou bulgaricus) , Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum,
Lactobacillus zeae, Lactobacillus helveticus, etc.
Ils peuvent aussi être utilisés pour l'obtention de vecteurs navettes capables de se répliquer chez Escherichia coli .
La présente invention a également pour objet des plasmides dérivés des plasmides conformes à l'invention définis ci-dessus, et notamment des plasmides à réplication conditionnelle .
On définit ici comme « plasmide à réplication conditionnelle » un plasmide dont la réplication ne s'effectue que dans certaines conditions (par exemple de température, de pH, de concentration en sels minéraux, de présence dans le milieu de culture d'un composé particulier, etc.), par exemple du fait qu'une ou plusieurs séquence(s) dudit plasmide intervenant dans sa réplication (notamment l'origine de réplication et/ou le gène repA) porte (nt) une mutation conditionnelle, ou bien du fait qu'une ou plusieurs des protéines intervenant dans la réplication sont placées sous contrôle d'un promoteur inductible.
La transformation peut ainsi être effectuée en deux étapes : dans la première, les bactéries sont cultivées dans des conditions permettant la réplication du plasmide, ce qui permet une première sélection de celles dans lesquelles il s'est répliqué ; dans la seconde, les bactéries sont cultivées dans des conditions ne permettant pas la réplication du plasmide, ce qui permet de sélectionner celles dans lesquelles les séquences du plasmide sont intégrées au chromosome. Ce système permet de découpler la transformation et la recombinaison, rendant possible la modification de souches faiblement transformables. Des exemples de plasmides à réplication conditionnelle sont par exemple les plasmides de la famille pGhost (BIS AS et al . , J. Bacteriol., 175, 3628-3635, 1993 ; Demande PCT WO 93/18164 ; MAGUIN et al . , J. Bacteriol., 178, 931-935, 1996) , qui sont des dérivés thermosensibles du plasmide pWVOl de Lactococcus lactis, résultant d'une mutation au niveau du gène repA. Chez Lactococcus lactis, ces plasmides se répliquent normalement à 28 °C, et leur réplication est inactivée à 37 °C ; en revanche, ils ne sont pas thermosensibles chez Lactobacillus sakei . Des plasmides dotés de propriétés similaires, utilisables chez Lactobacillus sakei peuvent par exemple être obtenus en effectuant des mutations dans le gène repA de pRV500 au niveau de la région analogue à celle du gène repA du plasmide pWVOl portant la mutation thermosensible.
Les cadres de lecture présents sur le plasmide pRV500, et notamment les séquences codant les protéines HsdM, HsdS et HsdR, peuvent également être utilisés pour transformer des bactéries lactiques, par exemple pour augmenter leur résistance aux bactériophages .
La présente invention a également pour objet des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche RV332 (CNCM 1-2398), et notamment :
- des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche RV332, par délétion des séquences d'insertion flanquant l'amas lacRABCDFEGX, afin d'augmenter encore la stabilité de leur phénotype Lac+ ; - des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche RV332, par délétion ou inactivation du gène lacR ; ces souches peuvent assimiler le lactose de manière constitutive ;
- des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche RV332, par modification d'un ou plusieurs éléments de régulation (notamment promoteurs) de l'expression d'un ou plusieurs gènes de l'amas lacRABCDFEGX.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'isolement, la çaractérisation, et l'utilisation de la souche RV332, et du plasmide pRV500.
EXEMPLE 1 : ISOLEMENT ET ÇARACTERISATION DE LA SOUCHE RV332.
192 souches de Lactobacillus sakei isolées de produits carnés fermentes, ont été criblées sur la base de leur capacité à assimiler le lactose.
9 souches possédant un phénotype Lac+ ont été identifiées. 4 d'entre elles apparaissant identiques après analyse de leur génome par RAPD, 6 souches ont été retenues pour la suite des analyses. Parallèlement, la souche LTH1182 (fournie par le laboratoire du Prof. HAMMES, Université de Hohenhei ; Stuttgart, Allemagne) , qui est connue pour exprimer à la fois une activité β-galactosidase et une activité P-β-galactosidase, ainsi que la souche type de Lactobacillus sakei ATCC15521 ont été analysées à titre de témoins . La présence de séquences codant des gènes impliqués dans le métabolisme du lactose, a été recherchée à l'aide de sondes dérivées du plasmide pLZ617 (ALPERT et CHASSY, J. Biol. Chem., 265, 22561-22568, 1990), qui comprend les séquences codant la portion C-terminale de 1' antiterminateur LacT, l'enzyme LacIIBC, et la majeure partie de la P-β-galactosidase de Lactobacillus casei
(lac ' TEG ') . D'autres sondes ont été dérivées des plasmides pNZ391 et pNZ392, qui codent pour l' opéron lacABCDFE 'de
Lactococcus lactis, c'est à dire les gènes lacABCD de la galactose 6-P isomerase, et de la voie du tagatose 6-P, et les gènes de transport lacFE ' (enzymes EIIALac et enzyme EIIBCLac) (VAN ROOIJEN et al . , J. Biol. Chem., 266, 7176-7181, 1991) .
Dans le cas des sondes dérivées de pLZ617 on n'observe d'hybridation qu'avec une souche de L . casei utilisée à titre de contrôle positif ; aucune hybridation n'est observée avec les souches de Lactobacillus sakei testées.
Dans le cas des sondes dérivées de Lactococcus lactis, on n'observe d'hybridation qu'avec la souche LTH 1182, et l'une des 6 souches Lac+ étudiées (souche RV332) . Les profils de restriction HindIII et HindIII/EcoRI de LTH1182 et de RV332 sont similaires ; cependant, les profils de restriction EcoRI diffèrent par le décalage d'une bande, ce qui confirme qu'il s'agit de 2 souches différentes.
Le fait qu' aucune hybridation ne soit observée avec les autres souches Lac4" peut indiquer soit qu'elles possèdent un système PTS ne présentant pas de similitude suffisante avec les sondes utilisées pour être détecté, soit que leur phénotype Lac+ est du à un système perméase/β- galactosidase, et non d'un système PTS.
La souche RV332 a été retenue pour la recherche des gènes du système PTS. 4 clones, correspondant aux fragments de restriction par Hindi II et/ou EcoRI, s'hybridant avec les sondes dérivées de Lactococcus lactis ont été obtenus à partir de l'ADN total de RV332 : pRV501 (2 kb, EcoRI ) , pRV502 (1,75 kb, HindiII EcoRI , pRV503 (1,8 kb, Hindlll) et pRV504 (1,6 kb, Hindlll / EcoRI ) . Le séquençage de ces clones montre que pRV502 est compris dans pRV501, et pRV504 dans pRV503, et permet leur localisation au niveau de l'extrémité 5' de la région lac : pRV501 comprend les séquences correspondant à la cRAB ' , et pRV503 celles correspondant à lac 'BCD ' .
De manière surprenante, les régions codantes identifiées sur ces clones ont un pourcentage d'identité remarquablement élevé (environ 95%) avec les séquences connues de la région lac de Lactococcus lactis (GenBank M60447) .
Cette observation a permis d'obtenir directement le reste de la région lac à partir de l'ADN génomique de la souche RV332, à l'aide d'amorces dérivées de la séquence de 1' opéron lac de Lactococcus lactis. II a ainsi été constaté que le niveau élevé d'identité entre les séquences de Lactococcus lactis et de Lactobacillus sakei persiste sur la totalité de la longueur de la région lac (9 kb) , y compris le gène lacX, dont la fonction n'est pas encore bien identifiée. Des déviations mineures entre les 2 séquences sont observées au niveau des régions intergéniques, dans lesquelles on trouve des insertions ou des délétions de petite taille, qui n'ont probablement pas d' influence sur la fonction globale de la région. La séquence d'un fragment de 17075 pb comprenant la totalité de la région lac de la souche RV332 de Lactobacillus sakei est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ; les séquences polypeptidiques des enzymes du système lac-PTS codées par ce fragment sont également représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 10. Contrairement à l' opéron lac de Lactococcus lactis, qui a été clone à partir d'un plasmide, (pMG820) la totalité de la région lac de RV332 est située sur le chromosome bactérien. Cette localisation chromosomique a été confirmée par le.-séquençage du seul plasmide de RV332, pRV500 (cf exemple 4 ci-dessous) .
Caractérisation des régions du chromosome flanquant l' opéron lac .
Les régions du chromosome de Lactobacillus sakei flanquant l' opéron lac ont été séquencées :
La région en 5' de l' opéron présente 2 éléments possédant une similitude de séquence élevée avec des éléments d'insertion flanquant 2 cadres ouverts de lecture codant des protéines possédant une similitude significative avec des oxydo-réductases du type réductase mercurique et avec une protéine de surface de Lactobacillus rhamnosus , dont la fonction est à l'heure actuelle inconnue.
Dans la région en 3' de l' opéron, lacX est suivi directement par une seconde copie d'un élément iso-ISS30 ; d'autres séquences rappelant celles d'éléments d'insertion sont également présentes dans cette région.
La localisation des différentes régions caractéristiques du fragment de 17075pb est récapitulée sur les Tableaux la et Ib ci-après. Le Tableau la indique la position des régions identifiées sur le brin de séquence SEQ'ID NO: 1, ainsi que leurs caractéristiques, et le Tableau Ib indique la position des régions identifiées sur le brin complémentaire inverse ainsi que leurs caractéristiques.
TABLEAU la
Figure imgf000017_0001
TABLEAU Ib
Figure imgf000017_0002
EXEMPLE 2 : FONCTIONNALITE DE LA REGION LAC DE LACTOBACILLUS SAKEI .
Construction de mutants lac.
Afin de déterminer si les gènes identifiés à l'exemple 1 ci-dessus, étaient fonctionnels et intervenaient effectivement dans le métabolisme du lactose chez Lactoba cill us sakei , différents mutants de RV332 ont été construits par double crossing-over, selon la technique décrite par STENTZ et ZAGOREC (J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1(1), 165-173, 1999), en utilisant le plasmide pRV300, non-réplicatif chez Lactobacill us sakei [LELOUP et al . , 1997, publication précitée].
Le principe de construction de ces mutants est le suivant : des dérivés de pRV300 contenant des fragments obtenus par PCR homologues de la région à modifier, à l'exception de la mutation à introduire, sont introduits dans le chromosome par simple crossing-over ; la sélection des intégrants s'effectue sur la base de la résistance à l' érythromycine, conférée par les séquences de pRV300. L'insertion d'une seule copie du plasmide dans le gène cible est vérifiée par PCR. Les recombinants obtenus sont cultivés en milieu MRS (DE MAN et al . , Journal of Applied Bacteriology, 23, 130-135, 1960) pendant 100 générations, en conditions non-sélectives (c'est à dire en l'absence d' érythromycine) , ce qui permet la perte de la résistance à l' érythromycine, lors d'un second crossing-over. Si ce second crossing-over intervient du même côté du site prévu pour la mutation, le caractère sauvage est restauré ; en revanche, si le second crossing-over intervient de l'autre côté du site prévu pour la mutation, la région du chromosome portant le caractère sauvage située entre les emplacements des deux crossing-over est échangée avec la région mutée.
Les mutants construits de cette manière ne contiennent aucun ADN exogène ou plasmidique, puisque les dérivés de pRV300 utilisés ne peuvent pas se répliquer de façon autonome chez Lactobacillus sakei .
Dans un premier temps, une délétion a été introduite dans l' opéron lacLM qui code la β-galactosidase, afin de vérifier que le système lac-PTS est fonctionnel dans RV332, et afin d'éliminer une activité β-galactosidase potentielle, qui interférerait avec les mesures d'activité P-β-galactosidase. La souche résultante, dénommée RV3001 a ensuite été utilisée pour la construction des souches mutantes suivantes :
- RV3003, dans laquelle l'expression de l' opéron lac est rendue constitutive par l' inactivation du répresseur, par une délétion dans lacR ;
- RV3005, dans laquelle l'enzyme générale El du système PTS est inactivée par une mutation du gène ptsl, entraînant le remplacement de l'histidine en position 190 par une alanine, et résultant en un phénotype Lac- (STENTZ et ZAGOREC, 1999, publication précitée) ;
- RV3007, la voie du tagatose-6P est inactivée par une délétion dans le gène lacB codant la tagatose-6P kinase, résultant en un phénotype Lac- ; - RV3008 dans laquelle l'enzyme spécifique
EIIBCLac est inactivée par une délétion dans le gène lacE codant cette enzyme, résultant en un phénotype Lac-.
Les délétions ont été effectuées de manière à ce que les cadres de lecture situés en aval demeurent en phase, afin d'éviter tout effet de polarité sur la traduction des gènes en 3' de la délétion.
En outre, un mutant de la souche RV332 (RV3004) dans lequel l'enzyme générale El du système PTS est inactivée a été construit, par mutation du gène ptsl, identique à celle effectuée sur la souche mutante RV3005 ; un phénotype Lac- de cette souche permet de vérifier que le métabolisme du lactose chez RV332 dépend uniquement de l'activité du système lac-PTS.
Les caractéristiques de ces mutants sont récapitulées dans le Tableau II ci-après.
TABLEAU II
Figure imgf000019_0001
Caractérisation des mutants lac.
Les souches mutantes ont été caractérisées par leur comportement de croissance sur milieu chimiquement défini, (MCD) (LAURET et al . , Appl . Environ. Microbiol., 62, 1922-1927, 1996), supplémenté avec soit du glucose, du lactose ou du galactose.
Les résultats des expérimentations sont illustrés ci-après dans les Tableaux III (cultures avec glucose) , IV,
Figure imgf000020_0001
Parallèlement, les activités β-galactosidase et P-β-galactosidase de ces souches ont été mesurées : les résultats sont illustrés par le Tableau VI ci-dessous.
Figure imgf000021_0001
nd : non déterminé
Ces résultats montrent que le système lac-PTS est fonctionnel chez Lactobacillus sakei , et que l'utilisation du lactose chez RV332 s'effectue par l'intermédiaire de ce système. Il est à noter que RV332 présente une phase de latence relativement longue si elle est pré-cultivée sur milieu comprenant du glucose, tandis que le mutant constitutif RV3003 ne présente aucune phase de latence dans ces conditions.
D'autre part, l' opéron lac apparaît également être induit pendant la croissance sur galactose chez les souches inductibles par le lactose, ainsi que chez les souches Lac- du fait d'une inactivation de la voie du tagatose-6P. En revanche, il n'est pas inductible chez les souches pts . Comme il ne devrait pas y avoir de transport du galactose par l'activité résiduelle EIIBCLac chez RV3008, dont 1' opéron lac est cependant induit par ce substrat, on peut supposer qu'il existe un système PTS séparé pour le galactose, qui produirait un inducteur gratuit de l' opéron lac, ou bien dont l'activité optimale dépendrait de l'activité accessoire de la voie tagatose-6P de l' opéron lac.
Il faut également noter- que les souches pts
RV3004 et RV3005 atteignent une DO finale sur galactose plus élevée que les autres souches. Plusreurs explications sont possibles : par exemple, il est possible que le gain de masse cellulaire totale par rapport au nombre de cellules soit plus rapide chez RV3004 et RV3005 que chez les autres souches, ou bien que, du fait de l'absence d'un métabolisme du galactose par la voie des PTS la quantité de galactose disponible pour la production d' exopolysaccharides soit plus importante, ce qui entraînerait une DO finale plus élevée due à la présence de ces exopolysaccharides . Un effet régulateur du PTS sur le métabolisme du galactose est aussi envisageable.
EXEMPLE 3 : STABILITE DU PHENOTYPE LAC+ La stabilité du phénotype Lac+ en cultures prolongées a été étudiée sur les souches RV332 et RV3003.
Des bactéries de ces 2 souches issues de cultures de réserve congelées dans le glycérol sont striées sur MRS agar et incubées à 30°C. Les colonies isolées sont remises en culture dans du milieu MCD 0,05% Glucose/1% Lactose.
Des dilutions successives de ces cultures sont étalées sur des boites de milieu solide MRS agar, pour déterminer le nombre de bactéries à la génération 0. 100 μl d'une dilution 10~3 de ces cultures sont inoculés dans 100 ml de milieu MRS et incubés pendant 24 heures ce qui correspond à une croissance pendant environ 20 générations.
A cette étape, 100 μl d'une dilution 10~3 de chacune de ces cultures sont prélevés, et inoculés dans 100 ml de milieu MRS pour continuer la croissance.
Parallèlement, le dénombrement des bactéries lac+ et celui des bactéries lac- sont effectués sur un autre prélèvement de chaque culture, selon le protocole suivant : Des dilutions successives de chaque prélèvement sont étalées sur MRS agar pour isoler les colonies. Chacune des colonies isolées est inoculée dans l'un des puits d'une plaque de microtitration (96 puits/plaque) dans 100 μl de milieu MCD, contenant 10 g/1 de lactose, et 15 mg/1 de pourpre de bromocresol (indicateur de pH) . Les plaques sont incubées 24 heures à 30°C ; dans ces conditions, les colonies lac+ poussent dans les puits des plaques de microtitration et le pourpre de bromocresol vire au jaune. En revanche, les colonies lac- ne poussent pas et la coloration reste violette.
Des contrôles sont effectués par incubation de puits sans bactéries et par incubation de puits inoculés avec des bactéries de la génération 0 et des souches témoins Lac+ (RV332) et Lac- (mutants) .
Ces opérations sont répétées toutes les 20 générations. Ces - résultats sont illustrés par la Figure 2
Les premières pertes détectables du phénotype
Lac+ interviennent, dans le cas de la souche RV3003, après
60 générations, où entre 60 et 90% des colonies testées conservent leur phénotype Lac+ (Fig. 2 : O et V : 2 expérimentations séparées avec RV3003) .
La perte est beaucoup moins prononcée dans le cas de RV332 (•) , ou plus de 50% des colonies conservent le phénotype Lac+ au delà de 300 générations.
Les essais de stabilité du phénotype Lac+ de la souche RV332 ont été .poursuivis pendant plus de
600 générations, pour suivre le processus complet de perte du phénotype Lac+ ; de manière surprenante, il a été constaté qu'au-delà de 380 générations, le pourcentage de cellules
Lac+ semble se stabiliser à un plateau d'environ 50%. On peut estimer qu'à partir d'une bactérie, il faut 55 générations pour obtenir une culture de 10 m3 avec une densité de 1,8 x 109 cfu/ml ; 4 générations supplémentaires sont suffisantes pour atteindre une densité de 2,9 x 109 cfu/ml dans un volume de 100 m3. La stabilité de RV3003 peut donc être suffisante pour certaines utilisations, notamment s'il est possible de diminuer le temps de culture en conditions non-sélectives pour le phénotype Lac+, par exemple par réalisation d'une préculture sur milieu contenant du lactose. Une préculture de 1 litre dans ces conditions permet déjà l'obtention des
41 premières générations.
Toutefois, pour les utilisations dans lesquelles on ne recherche pas l'expression constitutive de l' opéron lac, la souche RV332 est préférable, du fait de sa stabilité beaucoup plus importante pour le phénotype Lac+ .
Une activité plus importante de transposition des séquences d'insertion flanquant l' opéron lac pourrait expliquer la perte plus rapide du phénotype Lac+ chez RV3003. En effet, la probabilité que la transcription à partir du promoteur en amont de lacA, franchisse l'opéron lac jusqu'à la séquence iso-ISS30 en aval de lacX est plus importante dans la souche RV3003, où la transcription de l'opéron lac est constitutive, que dans celui de RV332, où la transcription de l'opéron lac est fortement réprimée dans les cultures sur glucose (activité spécifique de la P-β-galactosidase en cultures sur glucose : 3 nmoles/min/mg pour RV332 ; 576 nmoles/min/mg pour RV3003) . La même explication peut s'appliquer dans la direction opposée ; la transcription interviendrait alors à partir du promoteur du gène lacR, jusqu'à la séquence iso-ISS30 en amont de ce gène. EXEMPLE 4 : ISOLEMENT ET CARACTERISATION DU PLASMIDE PRV500 Le plasmide pRV500 a été purifié à partir de la souche RV332, par une méthode adaptée du protocole décrit par ANDERSON et Me KAY (Applied and Environ ental Microbiology, 46, 549-552, 1983), ou par séparation, à partir d'un lysat cellulaire brut obtenu par traitement au lysozyme, à l'aide d'un kit de purification QIAGEN plasmid MAXIPREP en suivant le protocole recommandé par le fabricant (QIAGEN, France) .
Plusieurs sous-clones ont été obtenus chez Escherichia coli dans le vecteur de clonage pBLUESCRIPT®. Le séquencage de ces clones a permis d'établir la séquence complète de 12955 nucléotides de pRV500.
Cette séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 11. Le plasmide pRV500 est schématisé sur la Figure 3.
13 cadres ouverts de lecture (ORFs) , précédés par des sites potentiels de liaison aux ribosomes (RBS) ont été identifiés. La localisation de ces ORFs est représentée dans le Tableau VII ci-après.
Les séquences des protéines RepA et ORF-6 codées par le plasmide RV500 sont représentées respectivement dans la liste de séquences jointe en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 13. TABLEAU VII
Figure imgf000025_0001
Ces ORFs représentent au total 11139 nucléotides soit 86% de la taille du plasmide.
Bien que le GC% global de pRV500 (38,1%) soit compris dans les limites usuelles pour Lactobacillus sakei , il convient de noter que ce plasmide apparaît divisé en 2 régions: les séquences hsdR à hsdM, avec un GC% de 38,3% à 43,3% (région à GC élevé) et la région de ORF-6 à ORF-13 avec un GC% de 31,3% à 38,3% (région à GC faible) ; toutefois, ORF-10, localisé dans cette seconde région atteint un GC% de 38,3%, c'est à dire environ 2,2% au dessus du GC% d'ORF-12 (36,1%) .
La majeure partie de la région à GC élevé code pour des protéines similaires aux systèmes de restriction/modification bactériens de type I. Elle possède également quelques caractéristiques inhabituelles au niveau de son organisation : le gène hsdM recouvre sur 3 codons l'ORF hsdS, qui code seulement une protéine HsdS partielle (HsdS1), et qui est joint à une séquence hsdS complète, qui est elle-même précédée par ORF-2, codant une protéine similaire à des intégrases/recombinases de type XerC.
L'orientation du gène hsdR est opposée à celle d'ORF-2, et dans la même direction qu' hsdM et hsdS '. Les protéines HsdM et HsdS' ont toutes deux environ 51% d'identité avec des protéines de Klebsiella pneumoniae, tandis qu'HsdS possède 25% d'identité avec une protéine hypothétique de Methanococcus jannaschii et HsdR possède 39% d'identité avec une protéine hypothétique d' Haemophilus influenzae.
La région à GC faible peut être divisée en 2 sous-régions: l'une comprenant les fonctions de réplication du plasmide et ORF-6, et l'autre comprenant les ORFs 8 à 13.
Aucun homologue d'ORF-9 n'a été identifié dans les bases de données disponibles ; en revanche, ORF-8 et ORF-10 à ORF-13 présentent des pourcentages d'identité de respectivement 45%, 90%, 86%, 85% et 29% avec les protéines les plus proches des bases de données. Cependant, on ne connaît aucune fonction pour ces protéines.
La région de réplication contient un gène codant une protéine RepA présentant 79% d'identité avec RepA du plasmide pUCL287 (numéro d'accès : X75607) de Tetragenococcus halophilus . En aval de repA et dans la même orientation se trouve ORF-6, qui présente 62% d'identité avec un ORF du plasmide pSRQ900 de Lactococcus lactis . Dans pRV500 et pSRQ900 repA et ORF-6 sont organisés de manière identique. Ces gènes sont précédés par 2 ensembles de séquences répétées directes concaténées (trois fois ACCTCTTTTA et quatre fois et demie TTTATCAAGTAGGTTTTGTCTG) .
Le Tableau VIII ci-dessous récapitule les GC% des différentes ORFs, ainsi que leur % de similarité avec les protéines les plus proches.
TABLEAU VIII
Figure imgf000027_0001
EXEMPLE 5 : CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE REPLICATIF STABLE CHEZ LACTOBACILLUS SAKEI, A PARTIR DU REPLICON DE PRV500
Afin de démontrer la fonctionnalité de la région comprenant les fonctions de réplication, un fragment Kpnl-EcoRI de pRV500 couvrant les séquences répétées, ainsi que les ORFs repA et ORF-6, a été clone aux sites correspondants de pRV300 (LELOUP et al . , 1997, précité). Le plasmide résultant est dénommé pRV566. Les étapes du clonage sont illustrées par les
Figures 4A et 4B.
Le plasmide pRV566 a été établi chez Escherichia coli TG1, puis transféré par électroporation chez la souche modèle Lactobacillus sakei 23K. On n'observe aucune croissance sur les boites réalisées à partir de cultures contrôle de Lactobacill us sakei 23K traitées par le tampon d' électroporation sans ADN ; en revanche, sur les boîtes réalisées à partir des cultures de 23K/pRV566, on observe un nombre important de colonies, indiquant que le plasmide recombinant pRV566 peut se répliquer chez Lactobacillus sakei .
23K/pRV566 est cultivée à 30 °C pendant 24 heures dans 100 ml MRS, sans sélection par antibiotiques. 100 μl d'une dilution 10~3 sont ensuite transférés dans 100 ml de MRS frais et cultivés à nouveau pendant 24 heures. On considère que chaque transfert représente une croissance de 20 générations en 24 heures.
Parallèlement à chaque transfert, des aliquotes sont étalées à la fois sur boîtes de milieu MRS-agar et de milieu MRS-agar contenant 5 mg/1 d' érythromycine, afin de déterminer le pourcentage de bactéries restées résistantes à
1' érythromycine .
La stabilité du plasmide pRV56β au cours des transferts successifs a été étudiée.
Les résultats sont illustrés par la Figure 5, qui représente le pourcentage de colonies résitantes à 1' érythromycine en fonction du nombre de générations.
Ces résultats montrent que la perte de la résistance à l' érythromycine intervient lentement ; environ 80% des colonies conservent ce phénotype après 60 générations, et même après 100 générations, on obtient un score d'au moins 40%. Cette stabilité apparaît d'ores et déjà suffisante pour la plupart des études d'expression en conditions non-sélectives.
Ces expériences montrent que la région comprenant repA, et les séquences répétées directes de pRV500 permet la réplication d'un plasmide chez Lactobacillus sakei . En outre, le transfert de pRV566 entre Escheri chia coli et La ctobacillus sakei montre qu'il est possible de construire des vecteurs navette pour ces 2 organismes avec les éléments de réplication de pRV500 et une origine de réplication de Escherichia coli .
D'autre part, la similitude de la protéine de réplication RepA de pRV500 avec celles de plasmides d'autres bactéries permet de supposer que ce plasmide possède un spectre d'hôtes plus large, et en outre qu'il se réplique selon un mécanisme de type thêta, ce qui présente un intérêt particulier dans la construction de vecteurs ; en effet il a été observé que les plasmides de ce type peuvent accepter des inserts de tailles variées, ce qui permet de cloner non seulement des gènes isolés, mais également des ensembles de gènes, voire des opérons complets.
EXEMPLE 6 : REPLICATION DE PRV566 CHEZ DIFFERENTES BACTERIES LACTIQUES .
La capacité de réplication de pRV566 a été étudiée sur la base du contenu plasmidique de différentes bactéries lactiques avant et après transformation par pRV566.
Les souches L . sakei 23K, G3AF, 160K et 64F sont des souches de laboratoire totalement (23K, 160K) ou partiellement (64F, G3AF) curées de leurs plasmides endogènes décrites par BERTHIER et al . (Microbiology, 1273-1279, 1996). Ces souches comme les souches L. sakei ATCC15521, L . curvatus 116, T402 et T411 (BERTHIER et EHRLICH, Int. J. Syst. Bacteriol., 49, 997-1007, 1999), L . curva tus ATCC20019, L . plan tarum ATCC8014 et ATCC14917, et L . casei BL23 (GOSALBES et al., J. Bacteriol., 181, 3928-3934, 1999) sont utilisées comme souches réceptrices pour l'obtention de transformants après électroporation, avec pRV566 obtenu tel que décrit à l'Exemple 5, selon le procédé décrit par BERTHIER et al . (1996, publication précitée) .
Les souches peuvent également être transformées par électroporation avec d'autres plasmides de réplication, pGh st4 (BIS AS et al . , J. Bacteriol., 175, 3628-3635, 1993) et pIL253 (SIMON et CHOPIN, Biochimie, 70, 559-566, 1988) purifiés à partir d' E . coli , afin de comparer l'efficacité de transformation obtenue avec pRV566. Les lactobacilles sont cultivés à 30°C, ou à 37°C pour L . casei , dans du MRS contenant 1% de glucose, sans sélection par antibiotiques.
Une concentration de 5 mg/ml d' érythromycine dans le milieu de culture des transformants est utilisée pour sélectionner ceux résistants à cet antibiotique.
Parmi les clones résistants à l' érythromycine obtenus par transformation, 35 clones des 5 souches différentes de L . sakei sont analysés par extraction de leur ADN plasmidique comme décrit pour pRV500 à l'Exemple 4. De façon similaire, 2 transformants L . plantarum ATCC8014, 8 transformants L . curvatus T411 et 8 transformants L. casei BL23 sont analysés pour leur contenu plasmidique.
Le nombre et la taille des plasmides est déterminé par électrophorèse en gel d' agarose et la présence de pRV566 est également vérifiée par hybridation de type Southern utilisant pRV566 marqué à l'aide d'un kit ECL (Amersham) comme sonde, selon des procédés usuels de biologie moléculaire (SAMBROOK et al . , Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd éd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ; MALLERET et al . , Microbiology, 144, 3327-3333, 1998) . La présence de pRV566 a été démontrée dans toutes les souches transformées. En outre, dans toutes les souches transformées, à l'exception de L . sakei RV332, pas d'autre changement dans le contenu plasmidique n'est observé, suggérant qu'aucune recombinaison n'est intervenue entre pRV566 et les plasmides endogènes de la souche hôte. Cependant dans 16 transformants de RV332 testés pour leur contenu plasmidique, pRV500 est perdu. Une telle perte plasmidique doit être le résultat d'une incompatibilité entre pRV500 et son dérivé pRV566. Cela montre que des gènes présents dans une partie de pRV500 qui n'est pas dans pRV566 ne sont pas essentiels.
Les résultats d'efficacité de transformation par pRV566 sont présentés dans le Tableau IX. L'efficacité est exprimée comme le nombre de clones résistants à l' érythromycine obtenus par μg d'ADN plasmidique. Le nombre total de plasmides endogènes naturellement présents dans chaque souche avant transformation est indiqué.
Figure imgf000031_0001
* Souches L. sa/ce/ transformées par pRV566 isolé de diverses espèces donneuses. ND : non déterminé
Pour comparaison, l'efficacité de transformation obtenue avec d'autres plasmides de réplication est indiquée : § pGhost4, §§ plL253.
Les résultats montrent que l'efficacité de transformation varie en fonction de la souche réceptrice utilisée. Quelques souches transformées avec un rendement élevé par certains plasmides ne le sont pas ou peu par pRV566. Aucune corrélation entre l'efficacité de transformation et les groupes RAPD ou phénotypiques déterminés précédemment n'est observée (BERTHIER et ERLICH, 1999, publication précitée) . De même, aucune corrélation précise ne peut être observée entre la présence de plasmides endogènes dans les souches réceptrices et leur efficacité de transformation. Par exemple, L . curva tus 116 contient au moins 3 plasmides endogènes et ne peut être transformée par pRV566, pIL253 ou pGhost4, alors que L . curva tus ATCC20019 qui ne contient pas de plasmide naturel peut être transformée par pIL253 mais pas par pRV566.
Cependant, la présence de plasmides endogènes, conduisant à une incompatibilité plasmidique, peut expliquer la faible efficacité de transformation observée avec certaines souches. De même, la présence de quelques systèmes de restriction/modification peut être importante pour la tranformation plasmidique. Par conséquent, afin d'obtenir plus d' informations sur la variabilité observée dans l'efficacité de transformation à l'intérieur des souches, l'effet de l'origine du plasmide (souche donneuse du plasmide) et le lien potentiel avec la présence de plasmides dans les souches réceptrices ont été testés.
Le plasmide pRV566 est préparé à l'origine à partir dXE . coli TGl. Des transformants L . sakei 23K et L . sakei 160K, obtenus après électroporation avec pRV566, sont lysés par un traitement prolongé au lysozyme. Le plasmide PRV566 est purifié à l'aide d'un kit de purification QIAGEN plasmid MAXIPRER, selon les instructions du fabricant (QIAGEN, France) . Le plasmide pRV566 est alors utilisé pour transformer les mêmes lots de bactéries électrocompétentes de diverses souches de L. sakei .
Les résultats présentés dans le tableau IX ci- dessus montrent que le plasmide pRV566 extrait soit d' E . coli TGl soit de L . sakei 23K peut transformer L . sakei 160K alors qu'aucun transformant ne peut être obtenu lorsque pRV566 est extrait de L . sakei 160K. Ce résultat peut résulter d'une incompatibilité entre les systèmes de restriction/modification de la souche réceptrice L . sakei RV332 et de la souche donneuse L . sakei 160K. Pour les souches L . sakei ATCC15521, G3AF et 64F faiblement transformables, aucune amélioration de l'efficacité de transformation n'est observée quand le plasmide pRV566 est extrait de L . sakei 23K au lieu d' E. coli TGl. Les plasmides extraits de souches faiblement transformables ont été hybrides avec pRV566 afin de déterminer si les plasmides endogènes partageant des homologies avec pRV566 peuvent être impliqués dans l'incompatibilité plasmidique. Un fort signal d'hybridation a été observé avec les plasmides de L . sakei G3AF, L . curva tus T402 et L . curva tus 116, pour lesquelles aucun transformant ne peut être obtenu.
Un signal moins important a également été observé avec le contenu plasmidique de L . sakei ATCC15521 qui est faiblement transformable. Enfin, un faible signal est détecté avec les plasmides de L . plantarum ATCC8014 et ATCC14917 qui sont faiblement et non-transformables, respectivement, par pRV566.
Ces résultats indiquent que l'incompatibilité plasmidique due aux homologies entre les plasmides endogènes et pRV566 peut être la cause de la faible efficacité de transformation observée dans les souches ci-dessus.
EXEMPLE 7 : STABILITE DE PRV566 CHEZ LES LACTOBACILLES.
La persistance du phénotype de résistance à l' érythromycine des lactobacilles transformés par pRV566 a été utilisée pour étudier la stabilité réplicative de ce dernier.
Les lactobacilles transformés par pRV566 sont cultivés à 30°C, ou à 37°C pour L . casei, pendant 24 heures dans 100 ml de MRS, sans sélection par antibiotiques. Toutes les 24 heures, 100 μl d'une dilution 10~3 sont transférés dans 100 ml de MRS frais et cultivés de nouveau pendant 24 heures. On considère que chaque transfert représente une croissance d'environ 20 générations par 24 heures. Parallèllement à chaque transfert, des aliquots dilués sont étalés sur boîtes de milieu MRS-agar et de milieu MRS-agar contenant 5 mg/ml d' érythromycine, afin de déterminer le pourcentage de lactobacilles restées résistantes à l' érythromycine. La stabilité de pRV566 au cours des transferts successifs a été étudiée.
Les résultats sont illustrés par le Tableau X qui représente le pourcentage de colonies résistantes à l' érythromycine en fonction du nombre de générations. TABLEAUX
Souches 20 40 60 80 100
L sa/ce/ ATCC15521 84,9 95,0 99 90,2 97,1
L sakei 160 K 75,7 58,0 34,1 20,7 11 ,6
L. sakei RV332 84,1 70,3 73,3 62,5 65,0
L. sakei 23K 97,0 86,8 58,8 41 ,0 18,3
L. sakei 64F 90,4 95,7 85,9 68,9 27,6
L. plantarum ATCC8014 87,3 90,3 65,0 57,1 29,7
L curvatus T411 75,0 88,3 74,7 68,8 21 ,6
L casei BL23 89,9 38,4 22,0 15,9 12,0
Les résultats montrent que la perte de la résistance à l' érythromycine varie selon les souches. Toutefois plus de 50% des colonies conservent ce phénotype après 40 générations, sauf la souche L . casei BL23.
Cette stabilité de pRV566 est satisfaisante du fait que la croissance en laboratoire pour des études physiologiques est généralement réalisée -sur un faible nombre de générations.
D'autre part, les souches de L . casei utilisées durant le processus de fermentation de viande, par exemple dans la fabrication des saucissons, sont inoculées à une densité cellulaire élevée, et croissent seulement pendant environ 12 générations au cours de la fermentation. L'utilisation de dérivés de pRV500 comme vecteurs chez les lactobacilles peut par conséquent être envisagée.

Claims

REVENDICATIONS 1) Souche de Lactobacillus sakei déposée auprès de la CNCM le 15 mars 2000 sous le numéro 1-2398. 2) Molécule d'acide nucléique susceptible d'être obtenue à partir de la souche de La ctoba cillus sakei CNCM 1-2398 et utilisable pour la transformation génétique de bactéries lactiques, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : - une molécule d'acide nucléique comprenant au moins un gène de l'amas lacRABCDFEGX de la souche RV332 (CNCM 1-2398) ;
- une molécule d' acide nucléique comprenant au moins un fragment du plasmide, dénommé pRV500, de la souche CNCM 1-2398.
3) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un gène impliqué dans le catabolisme du lactose par la voie des phosphotransferases, choisi parmi le gène la cR, le gène la cA, le gène lacB, le gène la cC, le gène lacD, le gène la cF, le gène la cE, et le gène lacG de la souche RV332.
4) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : - les molécules d'acide nucléique comprenant le système de réplication du plasmide pRV500 ;
- les molécules d' acide nucléique comprenant au moins un gène du plasmide pRV500 choisi parmi hsdM, hsdS ou hsdR . 5) Utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 3 ou 4, pour la transformation génétique d'une bactérie lactique.
6) ' Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite bactérie lactique est un lactobacille .
7) Procédé de sélection d'une souche de Lactobacillus sakei capable de métaboliser le lactose par la voie des phosphotransferases, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence, chez les souches de Lactobacill us sakei à tester, de gènes lacA, lacB, lacC, la cD, lacF, la cE, et lacG, présentant respectivement au moins 90% d' identité avec les gènes la cA, la cB, la cC, lacD, la cF, lacE, et lacG, de la souche CNCM 1-2398, et la sélection d'une souche comprenant l'ensemble desdits gènes.
8) Procédé d'obtention d'une souche de Lactoba cillus sakei capable de métaboliser le lactose par la voie des phosphotransferases, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de Lactobacillus sakei par au moins une séquence d'acide nucléique choisie parmi :
- une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène la cA de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d' identité avec le gène lacB de la souche CNCM 1-2398 ;
- une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène la cC de la souche CNCM 1-2398 ;
- une séquence d' acide nucléique présentant au moins 90% d' identité avec le gène lacD de la souche CNCM 1-2398 ;
- une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacF de la souche
CNCM 1-2398 ;
- une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d' identité avec le gène lacE de la souche CNCM 1-2398 ; - une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacG de la souche CNCM 1-2398.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu' il comprend en outre la transformation de ladite souche avec une séquence d'acide nucléique présentant au moins ' 90% d'identité avec le gène lacR de la souche CNCM 1-2398, et/ou avec une séquence d'acide nucléique présentant au moins 90% d'identité avec le gène lacX de la souche CNCM 1-2398.
10) Plasmide, capable de se répliquer chez La ctoba cill us sakei , choisi parmi : - le plasmide pRV500, de la souche CNCM 1-2398 ;
- un plasmide comprenant au moins le système de réplication dudit plasmide pRV500.
11) Utilisation d'un plasmide selon la revendication 10 pour la transformation génétique d'une bactérie lactique.
12) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite bactérie lactique est un lactobacille.
13) Souche de Lactobacillus sakei dérivée de la souche CNCM 1-2398, et choisie parmi :
- des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche CNCM 1-2398, par délétion des séquences d'insertion flanquant l'amas lacRABCDFEGX ;
- des souches de Lactobacillus sakei dérivées de la souche CNCM 1-2398, par délétion ou inactivation du gène la cR .
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