FR2635788A1 - Sequence d'adn comprenant la partie fonctionnelle du locus sacuh de b. subtilis, vecteurs contenant la sequence correspondante, et leur utilisation dans des procedes de production de proteines - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un fragment d'acide nucléique contenant une séquence fonctionnelle de nucléotides contenue dans un fragment de 14 kb, issu du chromosome d'une souche de B. subtilis présentant une mutation sacU**h, ladite séquence étant caractérisée en ce qu'elle est capable, lorsqu'elle est introduite dans un B. subtilis - ou dans un autre micro-organisme, capable d'exploiter à son profit l'information portée à ce fragment - d'y induire une surproduction de protéines ou de lui conférer un phénotype Deg**h. L'invention concerne également un procédé de stimulation de la production d'un polypeptide déterminé par un micro-organisme approprié par introduction du susdit fragment d'ADN dans les cellules du micro-organisme dont le génome ou le chromosome a été modifié de manière à ce qu'il contienne une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide déterminé.

Description

SEQUENCE D'ADN COMPRENANT LA PARTIE FONCTIONNELLE DU
LOCUS sacUh DE B SUBTILIS, VECTEURS CONTENANT LA SE
QUENCE CORRESPONDANTE, ET LEUR UTILISATION DANS DES
PROCEDES DE PRODUCTION DE PROTEINES
La présente invention concerne une séquence d'ADN comprenant une partie fonctionnelle du locus sacU situé sur le génome de B. subtils, ainsi que les vecteurs contenant cette séquence, et l'application de cette séquence et des vecteurs à la stimulation de la production de protéines par B. subtilis ou tout autre micro-organisme approprié dans lesquels ils auront au préalable été incorporés.

Il a déjà été fait référence, sous la désignation "gène sacU", à un gène de régulation de l'expression de gènes de structure codant pour des enzymes de dégradation chez B. subtilis (LEPESANT et al, Mol. Gen.

Genet., 118 : 135-160 (1972) ; KUNST et al, Biochimie 56
1"81-1489 (1974) ; STEINMETZ et al, Mol. Gen. Genet., 148 281-285 (1976) ; ZUKOWSKI et al, Gene., 46 247-255 (1986)).

Il existe également chez B. subtilis au moins deux autres gènes de régulation de l'expression d'une.

classe de gènes de structure codant pour des enzymes dégradatives, le gène DrtR (NAGAMI et al, J. Bacteriol., 166 20-28 (1986) : YANC et al, J. Bacteriol., 169 434-437 (1987)), et le gène sac (LEPESANT et al (1972), précédemment cité, KUNST et al (1974), précédemment cité TOMIOKA et al, J. Biotechnol., 3 : 85-96 (1985) ; YANG et al, J. Bacteriol., 66 : 113-119 (1986) ; AMORY et al,
J. Bacteriol., 169 : 324-333 (1987)).

Ces trois types de gènes de régulation sont des gènes pléiotropes contrôlant l'expression d'un grand nombre de gènes codant pour la production d'enzymes dégradatives dans diverses souches de Bacillus.

Parmi les enzymes codées par les gènes structuraux sous le contrôle de sacU, sacO et DrtR, et secrétées par B. subtilis dans le milieu de culture, on distingue principalement la lévane-saccharase, les protéases alcaline et neutre, l'-amylase, des glycanases (PRIEST, Bacteriol. Rev., 41 : 711-753 (1977)).

Des mutations intervenant au niveau des loci sacU et sacO du génome de B. subtilis conduisent à l'hyperproduction par ce dernier des enzymes sus-mentionnées.

De telles mutations, désignées par les génotypes sacUh et sacs, peuvent conférer aux souches de B.

subtilis les phénotypes Lvs h prth et Amyh se manifestant respectivement par des hyperproductions de lévanesaccharase, de protéases et d'a-amylase.

A l'inverse, un autre type de mutation, mise en évidence uniquement au niveau du locus sacU, réduit considérablement les taux de synthèse de lévane-saccharase et de protéase chez B. subtilis. Cette dernière mutation confère aux souches de B. subtilis'les phénotypes Lvs et Prit , et est désignée par le génotype sacU
En résumé, les loci sacU et sacO seront décrits par sacU+, sac+ indiquant le niveau de synthèse de la souche de B. subtilis Marburg 168 de référence et ses dérivés, ou par les génotypes mutés sacUh, sacOh indiquant un niveau de synthèse augmenté ou par sacU indiquant un niveau de synthèse considérablement réduit.

Au locus sacU, les mutations sacU - et sacUh sont étroitement liées (6 à 9 % de recombinaison par transformation) et sont donc soit portées par le meme gène soit portées par deux gènes étroitement liés (STEINMETZ et al, Mol. Gen. Genet., 148 : 281-285, (1976)).

Les loci sacU et sacO semblent agir de manière dépendante. Le phénotype de l'hyperproduction d'enzymes (ou encore phénotype Degh, synthèse d'enzymes dégradatives haut niveau) conféré par la présence, soit d'une mutation sacOh chromosomique, soit de multiple copies de sac0 portées par un plasmide, dans la cellule hôte, est aboli par la présence d'une mutation sacU . Par contre, le gène prote, introduit dans une cellule hôte sous forme de multiple copies par l'intermédiaire d'un plasmide, conduit à un phénotype d'hyperproduction en présence d'un allèle sacU (HENNER et al, Proceedings of the fifth international symposium on the genetics of industrial microorganisms, Split, Yugoslavia, pp 81-90, 1986).

C'est donc en raison de leurs effets, dont on a montré qu'il s'exerçait au niveau transcriptionnel sur la synthèse de différentes enzymes chez Bacillus, que des loci sacU, sac0, ou autres séquences d'ADN d'activité comparable, issus de différentes souches de
Bacillus suscitent beaucoup d'intérêt, notamment pour leur application dans le domaine de la synthèse d'enzymes particulièrement intéressantes au niveau industriel.

Notamment, plusieurs équipes de recherche ont récemment décrit le clonage de fragments d'ADN, à partir de différentes souches de Bacillus, lesdits fragments permettant l'hyperproduction de protéases, ou d'autres enzymes, chez B. subtilis.

Le brevet japonais déposé le 19/07/1983 par
OKADA et al sous le n 60-30 685 décrit un ADN recombinant contenant une séquence d'insertion originaire du génome d'un B. licheniformis présenté comme codant pour une protéase de ce dernier type de micro-organisme. Les auteurs du brevet ont utilisé cet ADN recombinant pour transformer des cultures de Bacillus subtilis en vue d'accroître leur capacité à produire des protéases alcaline et neutre.

OKADA et al (Appl. Microbiol. Biotechnol., 20 406-412, (1984)) ont cloné un fragment EcoRI de 3,6 kb à partir de B licheniformis qui stimule aussi bien la secrétion de la protéase neutre que celle de la protéase alcaline (70x), mais n'a qu'un faible effet sur les enzymes du type a-amylase (2x) ; le phénotype observé est conservé à l'occasion du clonage d'un fragment PvuII de 1,25 kb et meme d'un fragment Sau 3A1 de 0,37 kb obtenu à partir du fragment EcoRI.

TOMIOKA et al (J. Biotechnol., 3 : 85-96; (1985)) ont aussi décrit la stimulation de la production des protéases neutre (10x) et alcaline (9x) avec un fragment EcoRI de 4 kb provenant de B. amvlolisuefaciens ; ce fragment a pu être réduit à 1,75 kb comprenant des phases ouvertes de lecture non identifiées ; il ne permet pas la stimulation de la synthèse d'a-amylase.

Un fragment d'ADN issu de Bacillus natto a été décrit comme permettant une hyperproduction de protéases alcalines et neutres et de lévane-saccharase (J.

Bacteriol., 166 : 20-29, (1986)). Les auteurs ont envisagé qu'un polypeptide de 60 acides aminés pouvait intervenir dans la stimulation de cette production.

Des polypeptides de 46 acides aminés codés par le gène sacO de B. subtilis (polypeptide SacQ5 (J
Bacteriol., 166 : 113-119, (1986)), et de B.

amvloliauefaciens (polypeptide SacQA) (J. Biotechnol., i, 85-96, (1985)) ont été décrits comme étant des activateurs de la synthèse d'enzymes dégradatives.

Le brevet français déposé le 18/08/1986 sous le n 86.11826 aux noms de l'INSTITUT PASTEUR et du CENTRE
NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE décrit ltidentifi cation du gène SacO de B. licheniformis ainsi que du polypeptide SacQt codé par ledit gène sacO, et un procédé de stimulation de la production d'un polypeptide déterminé par une souche de B. subtilis dont le génome avait été modifié de manière à ce qu'il comprenne soit de ma nière intégrée dans le chromosome, soit sur un plasmide, une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide déterminé et à laquelle avait également auparavant été incorporé un fragment d'ADN, codant pour Sac,.

Toutefois, le locus sacU n'a jamais été cloné et n'a, par conséquent, jamais été utilisé pour la mise en oeuvre d'un procédé de surproduction d'enzymes, par réintroduction dans une cellule-hôte capable ou rendue capable de produire ces enzymes, ce procédé utilisant une séquence fonctionnelle de ce locus pour ses propriétés stimulantes à l'égard de cette production.

L'objectif de la présente invention est le clonage du gène sacU, sous une forme sauvage ou portant une mutation sacuh afin de permettre l'utilisation de ce locus sacU ou d'une séquence fonctionnelle de ce locus pour la mise en oeuvre d'un procédé de surproduction d'enzymes ou d'autres protéines par B. subtilis ou par tout autre micro-organisme approprié avec un taux de surproduction aussi élevé que possible.

En effet, les tentatives de clonage du gène sacU qui ont été antérieurement envisagées, ont échoué. Celle décrite dans l'article d'AUBERT et al paru en 1985 dans
J. Bacteriol., 161 : 1182-1187, qui décrivait une tentative de clonage de sacU par l'intermédiaire de plasmides navettes capables de se répliquer à la fois dans Escherichia coli et Bacillus subtilis, a été reniée par les mêmes auteurs, dans un autre article en 1987, dans J.

Bacteriol., 169 : 3393, au motif qu'elle était érronnée
La stratégie décrite par DEBARBOUILLE et al, dans FEMS Microbiol. lett., 41 : 137-140 (1987)) et qui a été appliquée avec succès au clonage du gène sacS, n'a pas pu être transposée au clonage et à l'identification de sacU. En particulier, il a été procédé à une tentative d'introduire une banque de gênes (sous forme de plasmides recombinants les contenant et obtenus chez
Escherichia coli), dans une souche de B. subtilis dont le génome portait une mutation sacU ainsi qu'un gène de résistance à la kanamycine sous le contrôle du promoteur du gène sacB codant pour la lévane-saccharase. Sous l'effet de sacU , le gène sacB et celui codant pour la résistance à la kanamycine sont très faiblement exprimes.Il était espéré qu'un des plasmides recombinants qui pouvait contenir le locus sacU, serait capable de conférer à la souche de B. subtilis sacU , sus-mentionnée, un haut niveau de résistance à la kanamycine et de restaurer la production de lévane-saccharase chez cette même souche. Mais il n'a pas été possible d'isoler un plasmide comportant le locus sacU de cette manière.

La présente invention découle de l'hypothèse (qui semble s'être vérifiée) que ces divers échecs étaient peut-être dus à une toxicité du locus sacU à l'égard d'E. coli.

Aussi, un des buts de la présente invention a été de proposer une méthode pour le clonage du locus sacU directement chez Bacillus. subtils.

Les caractéristiques essentielles du processus qui a conduit à l'invention seront plus aisément appréhendées à la lumière des dessins dans lesquels
- la figure 1 est une représentation schématique du plasmide pBU3, avec dans la partie supérieure de la figure, le fragment BamHI de 13,5 kb, issu de B.

subtilis BD1238, contenant le transposon Tn917lacZ à proximité du locus sacU, et dans la partie inférieure de la figure, le vecteur plasmidique utilisé pour le clonage de ce fragment BamHI,
- la figure 2 est une représentation schématique du plasmide pBU14 avec dans la partie supérieure de la figure, un fragment SalI de 3,9 kb issu du plasmide pBU3 de la figure 1 contenant le locus sacU, et, dans la partie inférieure de la figure le vecteur plasmidique utilisé.

- la figure 3 représente schématiquement les plasmides pHV1431 et pHV1436 utilisés pour le clonage de sacU,
- la figure 4 est une carte de restriction du locus sacU de B. subtilis délimité par les sites SalI et
SPhI,
- la figure 5 représente la séquence complète et la carte de restriction d'un fragment de 2550 paires de bases comprenant le locus sacU, avec l'indication de ses sites de restriction,
- la figure 6 représente la phase de lecture ouverte comprise dans le fragment de 2,55 kb de B.

subtilis et codant pour le polypeptide Sacs,
- la figure 7 représente la séquence en acides aminés du polypeptide SacU5,
- la figure 8 représente la comparaison des parties N terminales des polypeptides SacU5, Dye, OmpR,
SpoOF, SpoOA.

Au cours d'une analyse génétique effectuée sur
B. subtilis Marburg 168 et ses dérivés (LEPESANT et al,
Mol. Gen. Genet., 118 : 135-160 (1972)) il avait été montré par les inventeurs que la région sacU pouvait être située sur le génome à proximité du marqueur hisAl.

Partant de ce résultat, leur attention devait être attirée par la souche de B. subtilis BD1238 (décrite par HAHN et al, J. Bacteriol., 169 : 3104-3109 (1987), et ALBANO et al, J. Bacteriol., 169 : 3110-3117 (1987)) dans laquelle le transposon Tn917lacZ était introduit à proximité du marqueur hissa1.

Le génome de B. subtilis BD1238 est en effet caractérisé par la mutation com-524 proche de hisA1, due à l'insertion dans son génome du transposon Tn9î7lacZ dont la carte de restriction apparait dans la figure 1.

Cette région Tn9171acZ comprend le marqueur de résistance à l'érythromycine (PERKINS et al, Proc. Natl.

Acad. Sci., USA, 83 : 140-144 (1986) ; SHAW et al, J.

Bacteriol., 164 : 782-796 (1985)).

Les inventeurs devaient en déduire que chez B.

subtilis BD1238 (de génotype sacU+), le locus sacU+ devait être à proximité de la région Tn917lacZ.

Le clonage de la région correspondante du génome de B. subtilis BD1238 en utilisant le marqueur de résistance à l'érythromycine comme moyen de sélection, dans un plasmide capable de se répliquer dans B.

subtilis, devait confirmer la validité de cette hypothèse.

La présence d'un site BamHI unique à l'extrémité gauche de Tn9171acZ, a conduit les inventeurs à utiliser l'enzyme de restriction correspondante pour fragmenter le génome de B. subtilis BD1238. Les fragments BamHI obtenus ont été ligaturés dans des plasmides appropriés (figure 1); ces derniers ont été utilisés pour transformer des cellules de B. subtilis non résistantes à l'érythromycine, et les 'cellules de B. subtilis devenues résistantes à l'érythromycine ont été sélectionnées.

Les inventeurs ont ainsi isolé un plasmide (plasmide pBU3) et l'ont utilisé pour transformer des cellules de B. subtilis porteuses d'une mutation sacU (phénotype Lvs-) (figure 1).

Ils ont ainsi déterminé que ce plasmide contient un fragment BamHI de 13,5 kb -issu de B. subtilis BD1238 capable de restaurer la synthèse de la lévane-saccharase (phénotype Lvs+) chez une souche de B. subtilis portant une mutation sacU (phénotype Lvs ).

Un premier sous-clonage d'un fragment SalI qui comprend un fragment SalI-BamHI provenant de l'ADN de
B.subtilis BD1238 de 3,6 kb et un fragment de 0,28 kb
BamHI-SalI de pBR322 donne le plasmide pBU14 (figure 2) qui est aussi capable de restaurér la synthèse de la lévane-saccharase chez un mutant sacU . L'élimination dans ce fragment de la séquence comprise entre les deux sites EcoRI et la religature conduit à un plasmide qui a perdu toute activité et ne complémente plus un souche sacU . D'autre part, le clonage du fragment compris entre les deux sites EcoRI dans le vecteur pHV1432 (S.D.

EHRLICH et al, INRA, Jouy-en-Josas, FRANCE)) conduit également à un plasmide qui ne complémente pas une souche sacU . Au contraire des expériences précédentes, le sous-clonage à partir du plasmide pBU14 par digestion avec l'enzyme de restriction SphI a permis d'obtenir un plasmide pBU16 contenant un fragment SalI-SPhI de 2,55 kb issu de B.subtilis BD1238, capable de restaurer la synthèse de la lévane-saccharase chez un mutant sacU
Donc le fragment SalI-SPhI de 2,55 kb, porté par le plasmide pBU16, comprend le locus sacU et plus particulièrement la région fonctionnelle du locus sacU de B. subtilis. Il est caractérisé par la carte de restriction indiquée sur la figure 4. La séquence nucléotidique de ce fragment correspond pour l'essentiel à celle présentée à la figure 5.

En outre, l'introduction de ce fragment de 2,55 kb par l'intermédiaire d'un vecteur approprié, dans une souche de B. subtilis de phénotype Lvs+, conduit dans cette souche à une surproduction des enzymes exocellulaires qu'élle est normalement apte à synthétiser. En d'autres termes, cette séquence a la capacité de conférer le phénotype Degh à ladite souche de B subtilis.

La méthode de clonage du gène sacU décrite cidessus est également applicable au clonage du gène sacUh en utilisant une souche de B. subtilis comportant une mutation sacUh, notamment à l-'aide de la souche de
B.subtilis QB136 décrite ci-après.

L'invention concerne par conséquent toute séquence de nucléotides contenu dans un fragment SalI-SDhI de 2,55kb, issu du chromosome d'une souche de B.subtilis, ou d'une souche de B.subtilis comportant une mutation de type sacUh, ladite séquence étant capable, lorsqu'elle est introduite dans une souche de B.

subtilis - ou dans tout autre micro-organisme capable d'exploiter à son profit l'information portée par ce fragment - de conduire à une surproduction d'enzymes endo- ou exocellulaires ou de toute autre protéine.

De façon générale, l'invention concerne tout séquence homologue du fragment SalI-ShI de 2,5 kb susmentionné, cette séquence étant elle-même fonctionnelle pour conférer un phénotype Deqh à une souche de B .subtilis, cette séquence étant en particulier apte à s'hybrider au fragment de 2,55 kb défini ci-dessus, et ce lorsque les opérations d'hybridation comporte les étapes suivantes
- pré-traitement (pré-hybridation) du filtre de nitrocellulose supportant le fragment d'ADN à tester avec le tampon d'hybridation (5 x SSC, 1 x Denhardt, 0,1 | SDS), cette opération étant effectuée à 42iC pendant 1 heure
- remplacement du tampon d'hybridation au contact du support par du tampon d'hybridation de meme composition, et addition de la séquence de 2,55 kb en tant que sonde, notamment marquée radioactivement, et préalablement dénaturée par un traitement à 100XC pendant 5 minutes
- incubation de la séquence homologue à tester fixée sur le support dans ce tampon d'incubation avec le fragment de 2,55 kb à 42iC pendant une durée de 16 à 24 heures,
- l'élimination du tampon contenant la sonde non fixée, par lavages successifs 1 x 50 ml de 5 x SSC, 0,1 -. SDS à 42'C pendant 20 minutes et 2 x 50 ml de 2 x
SSC, 0,1 s SDS pendant 2 x 20 minutes à 42'C.

Il est à rappeler que la composition de la solution de Denhardt est la suivante : 1 % Ficoll, 1 % polyvinylpyrrolidone, 1 eÓ BSA (albumine de sérum de boeuf), et que 1 x SSC est constitué de 0,15 M de NaCl et 0,015 M de citrate de sodium, pH 7.

Les conditions qui précèdent correspondent en particulier à des conditions non stringentes.

L'invention concerne plus particulièrement les séquences homologues conférant aux souches de B.

subtilis un phénotype Deah et qui s'hybrident dans des conditions stringentes avec le fragment de 2,55 kb, ces conditions d'hybridation comprenant les étapes suivantes
- traitement de pré-hybridation du filtre de nitrocellulose supportant la séquence d'ADN à tester à 42-C pendant 1 heure avec un tampon ayant la composition suivante : 50 % formamide, 5 x SSC, 1 x Denhardt
- remplacement du tampon d'hybridation au contact du support par du tampon d'hybridation de même composition, et addition de la séquence de 2,55 kb en tant que sonde, notamment marquée radioactivement, et préalablement dénaturée par un traitement à 100-C pendant 5 minutes
- une incubation à 42XC pendant une durée de 16 à 24 heures, et
- lavages successifs avec les solutions suivantes
1 x 50 ml, 5 x SSC, 50 % formamide, 20 minutes à 42vC
2 x 50 ml, 2 x SSC, 0,1 % SDS, 2 x 20 minutes à 42*C
1 x 50 ml, 0,2 x SSC, 0,1 Dó SDS, 20 minutes à 42*C
Le fait qu'une séquence d'ADN qui après ce traitement reste hybridée à la séquence d'ADN de 2,55 kb plus particulièrement définie en rapport avec la figure 5, indique que les deux séquences sus-mentionnées possèdent un certain degré d'homologie.

En ce qui concerne le protocole à suivre avant de procéder aux expériences d'hybridation du fragment
SalI-SPhI de 2,55 kb, on peut procéder de toute façon bien connue de l'homme du métier.

A titre d'exemple, on définit ci-après les conditions dans lesquelles cette fixation peut être effectuée
- le marquage radioactif du fragment par translation de césure (nick-translation),
- transfert de l'ADN à tester sur un filtre de nitrocellulose,
- dépôt de ce filtre sur du papier Whatmann n'3, imbibé de NaOH 0.5 N, NaCl 0.9 M et incubation pendant 20 minutes à température ambiante,
- répétition de l'opération sur papier imbibé de
Tris-HCl M, pH 7, 10 minutes,
- séchage bref,
- répétition de l'opération sur papier imbibé de 2 x SSC,
- séchage sur papier, puis à l'étuve à 80C pendant 2 heures, permettant la fixation de l'ADN à tester sur le filtre.

Il est à remarquer que les opérations d'hybridation qui précèdent sont avantageusement directement effectuées dans des conditons stringentes, s'agissant d'identifier la séquence sacU ou sacUh dans une souche de B. subtilis.

Cette technique est appliquée particulièrement à.

l'isolement de la séquence sacUh dune souche de B.

subtilis sacUh.

En revanche,-les conditions non stringentes sont en tout cas recommandées dans les procédés opératoires s'agissant d'isoler une séquence fonctionnelle à partir d'un autre micro-organisme, notamment du type Bacillus, par exemple B. licheniformis.
Il apparaitra immédiatement que l'homme de métier peut, soit par le traitement complémentaire soit du fragment de 2,55 kb sus-spécifié, soit d'une séquence homologue à ce fragment par les enzymes de restriction appropriées, soit par une digestion de ses extrémités au moyen d'une enzyme exonucleolytique telle que Bal31, produire des fragments plus petits à partir du fragment SalI-SDhI et tester à nouveau, notamment dans les conditions exposées plus loin, leur capacité à conférer le phénotype Degh à une souche de B. subtilis.En d'autres termes, l'homme du métier est désormais à même de localiser avec précision la partie active du locus sacU.

L'étude de la séquence nucléotidique entière du susdit fragment d'ADN de 2,55 kb montre que le fragment d'ADN de 990 paires de bases délimité par les nucléotides situés aux positions 1320 et 2310 (correspondant respectivement aux sites de restriction AsuII et NdeI) de la figure 5, comprend au moins une phase ouverte de lecture soutenant l'hypothèse que cette phase code pour une protéine (ci-après dite "SacU" ou "SacU5,,) de 229 acides aminés (figure 7). Cette phase ouverte de lecture qui est délimitée par les nucléotides situés aux positions 1452 et 2139 (figure 6) est précédée par une séquence nucléotidique présumée fournir les signaux typiques de liaison de l'ARN messager aux ribosomes (dite séquence Shine-Dalgarno). Cette séquence semble être située dans la région délimitée par les nucléotides situés aux positions 1437 et 1443.La phase de lecture ouverte parait être suivie d'un terminateur de transcription compris entre les nucléotides situés aux positions 2151 et 2176 de la figure 5.

On doit noter que cette phase ouverte de lecture est située de part et d'autre de l'un des sites EcoRI.

On a montré que la délétion de la séquence comprise entre ces deux sites supprime l'activité sacU du fragment cloné. On voit que cette délétion élimine plus de la moitié de la séquence codante.

D'après les triplets ou codons successifs de cette phase de lecture, on peut déduire la séquence théorique en acides aminés du peptide correspondant.

Cette séquence montre une homologie avec celles de plusieurs protéines qui sont des activateurs de transcription, notamment des protéines de E. coli, Dye, OmpR, une protéine de Salmonella tvphimurium, CheY (DRURY et al, J. Biol. Chem., 260 : 4236-4242 (1985)) ou des protéines de B. subtilis, SpoOA, SpoOF (TRACH et al,
Proc. Natl. Acad. Sci., 82 : 7260-7264 (1985)).

On peut en déduire que la protéine codée par cette séquence appartient vraisemblablement à cette famille de protéines, activateurs spécifiques de transcription.

Pour les besoins de la représentation formelle des homologies de structure partielle entre SacU5 et les autres protéines apparaissent à la figure 8, certains acides aminés se trouvent quelquefois davantage écartés de ceux qui normalement les jouxtent, de façon à permettre la mise en évidence (grâce à des encadrements verticaux) desdites homologies partielles.

L'examen de la séquence nucléotidique du susdit fragment d'ADN de 2,55 kb montre l'existence d'une autre phase de lecture ouverte entre les nucléotide situés aux positions 848 et 1366 de la figure 5. Cette séquence ne parait pas précédée d'une séquence typique de liaison aux ribosomes. Elle est entièrement incluse dans le fragment EcoRI-EcoRI dont on a montré l'inactivité.

Cette séquence ne peut donc être active par elle-même mais on ne peut éliminer le fait qu'elle puisse jouer un râle dans l'expression de la protéine SacU5.

L'invention concerne toute séquence d'ADN issue du fragment SalI-S > hI de 2,55 kb mentionné plus haut, séquence incluant en particulier la séquence codant pour le polypeptide SacU capable de conférer le phénotype les aussi que les séquences nucléotidiques comprenant les éléments de régulation de l'expression de ce dernier
A titre d'exemples de fragments conformes à l'invention et satisfaisant à l'ensemble des conditions qui ont été rappelées dans la définition sus-indiquée du fragment d'ADN selon l'invention, on mentionnera
- le polynucléotide délimité par des nucléotides situés aux positions 1 et 2310 respectivement de la figure 5, présumé comprendre le promoteur de transcription, le site de liaison ribosomique, le gène de struc ture du polypeptide SacU et le terminateur de trans
s cription.

- tout polynucléotide contenant le fragment délimité par des nucléotides d'extrémités correspondant aux positions 1 à 2310 respectivement de la figure 5, et comprenant, en outre, en amont dudit fragment, une séquence suffisamment longue pour également inclure le promoteur endogène permettant la transcription dans la cellule hôte, notamment par B. subtilis.

L'invention concerne également tout fragment d'ADN capable de s'hybrider avec le fragment d'ADN SalI-SPhI de 2,55 kb sus-mentionné, dans des conditions stringentes ou non stringentes sus-mentionnées.

L'invention concerne plus particulièrement tout fragment d'ADN issu d'une souche de B subtilis comportant une mutation sacUh, notamment dans les conditions décrites ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider avec le fragment d ADN de 2,55 kb de la figure 5, et en ce qu'il confère le phénotype
Degh à la souche bactérienne , notamment de B. subtilis, dans laquelle il est incorpore.

L'invention concerne aussi tout acide nucléique recombinant contenant la partie fonctionnelle de sacU contenue dans le fragment SalI-SDhI sus-défini en particulier le fragment du type sus-indiqué codant pour le polypeptide SacU5 conférant le phénotype Degh associé avec des fragments d'acide nucléique hétérologues vis-àvis dudit fragment, c'est-à-dire des fragments d'acide nucléique qui peuvent avoir un effet en combinaison avec la séquence codant pour le polypeptide, par exemple des séquences d'acide nucléique susceptibles de contenir un promoteur fort ou une séquence régulatrice ayant pour effet d'augmenter la production de la protéine SacU sauvage ou modifiée dans l'hâte utilisé.

A ce titre, l'invention concerne tout ADN recombinant contenant un fragment d'ADN selon l'invention, conférant le phénotype Degh, associé avec un promoteur de transcription reconnu par une cellule hôte, autre que celle dont ledit fragment d'ADN est issu. Avantageusement, le susdit promoteur utilisé est un promoteur fort tel que le promoteur du gène sacB (A. KLIER et al,
Molec. Microbiol., 1 : 233-241 (1987)), ou le promoteur
Pn25 du bactériophage T5 (M. ZUKOWSKI et L.MILLER,
Gene, 46 : 247-255 (1986)). Avantageusement, cet ADN recombinant comprend un fragment d'ADN selon l'invention, un promoteur, notamment un promoteur fort, et, le cas échéant, un terminateur de transcription hétérologue par rapport à l'ADN de B. subtilis, ce promoteur et, le cas échéant, ce terminateur étant néanmoins reconnu par la cellule hâte, dans des conditions permettant au susdit fragment d'ADN selon l'invention d'y être exprimé, lorsque ledit ADN recombinant y aura été introduit. Par exemple, cet ADN recombinant comprend un promoteur et, le cas échéant, un terminateur d'un autre microorganisme.

A cet égard, l'invention concerne plus particulièrement les ADN recombinants consistant en des vecteurs, contenant un fragment d'ADN selon l'invention en l'un de leurs sites non essentiels pour leur réplication, notamment du type plasmide, qui sont aptes à se répliquer dans une cellule hôte tout en permettant à la partie fonctionnelle du locus sacU de manifester son activité, notamment à permettre l'expression de la séquence codant pour le polypeptide SacU
s
Avantageusement, le susdit promoteur de transcription est un promoteur inductible. A titre d'exemple de promoteur inductible, on citera le promoteur de sacB inductible par le saccharose (SHIMÔTSU et HENNER, J.

Bacteriol., 168 / 380-388 (1986), KLIER et al., Molec.

Microbiol. (1987) précédemment cité), et le promoteur sPac (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 439-443, (1984)) inductible par l'IPTG (isopropyl B-D-thiogalactoside).

Les vecteurs selon l'invention peuvent être choisis parmi ceux capables de se répliquer dans la cellule hôte, c'est-à-dire sans pour autant modifier le chromosome de ladite cellule (tels que les plasmides multicopies capables de se multiplier en un grand nombre de copies à l'intérieur de la cellule hôte). La transformation d'une cellule hôte par les vecteurs du type réplicatifs sus-mentionnés conduit à l'introduction d'une information génétique supplémentaire dans le génome de la cellule mais pas dans son chromosome.

Des vecteurs intégratifs capables de modifier le chromosome de la cellule hôte peuvent également être utilisés. De tels vecteurs permettent l'insertion d'un fragment d'ADN selon l'invention dans le chromosome de la cellule hôte, notamment par un mécanisme de simple ou de double recombinaison.

D'une manière générale, l'ensemble des vecteurs faisant l'objet de la description qui suit sont soit du type réplicatif, soit du type intégratif.

L'invention concerne également le polypeptide
SacU5 et les fragments peptidiques actifs qui en découlent, en tant qu'ils sont capables d'activer l'expres- sion d'un, ou de plusieurs gènes de structure de l'organisme, notamment de type Bacillacées qui les héberge.

L'invention a également pour objet un polypeptide hybride construit par fusion de tout ou partie d'un fragment d'ADN selon l'invention, notamment toute ou partie de la séquence SacU5 et d'un fragment hétérologue de manière à produire dans la cellule hôte un polypeptide hybride composé de tout ou partie du polypeptide codé par le fragment d'ADN selon l'invention, notamment SacU5 et une séquence d'acides aminés hétérologue.

L'invention concerne donc un procédé visant à accroître la capacité de production de protéines, notamment d'enzymes ou de polypeptides, par un micro-organisme approprié, ce procédé comprenant la transformation des cellules dudit micro-organisme au moyen d'un des plasmides sus-indiqués, contenant un fragment d'ADN selon l'invention, la mise en culture des cellules hôtes transformées dans un milieu de culture approprié et la récupération desdites protéines, soit à partir de ces cellules (notamment par lyse des cellules dans le cas de la production de protéines endocellulaires), soit à partir du milieu de culture (dans le cas de la production d'enzymes exocellulaires).

Parmi les micro-organismes transformables par le procédé sus-mentionné, ainsi que par les autres procédés selon l'invention décrits ci-après, on distinguera notamment les bactéries Gram , telles que les genres
Bacillus et Clostridium.

Les protéines ainsi produites sont celles dont les gènes de structure sont naturellement sous le con trâle du gène sacU dans le chromosome des cellules bactériennes utilisées pour la mise en oeuvre du procédé selon 1 'invention.

Par exemple, un tel procédé selon l'invention permet la surproduction, par B. subtilis, d'un grand nombre d'enzymes endo- ou exocellulaires, dont par exemple les protéases, la lévane-saccharase, l'v-amylase et des glycanases.

L'invention vise également un procédé de production d'un polypeptide determiné par un micro-organisme approprié dont le génome, ou le chromosome, a été modifié de manière à ce que le génome, ou le chromosome, contienne une séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide dont la production doit être stimulée, qui comprend la transformation des cellules dudit microorganisme au moyen d'un des plasmides sus-indiqués, contenant un fragment d'ADN selon l'invention, la mise en culture des cellules du micro-organisme ainsi transformées dans un milieu approprié, et la récupération dudit polypeptide à partir desdites cellules ou du milieu de culture.

L'effet de contrôle par le locus sacU de la synthèse des enzymes chez les micro-organismes utilisés pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention susmentionnés, est probablement le résultat de l'action sur une séquence cible, comprise dans le génome desdits micro-organismes; soit du polypeptide codé par un fragment d'ADN selon l'invention, notamment du polypeptide SacU , soit d'un autre produit exprimé'sous le contrôle dudit polypeptide.

Les séquences cibles sus-mentionnées sont généralement situées en amont des gènes de structure codant pour les enzymes secrétées par B. subtils.

A titre de séquence cible, on peut citer notamment : - celle comprise dans un fragment de 440 paires de bases, délimité par les sites de restriction Sau3A1 Rsaî, et situé en amont du site de liaison avec ribosomes et de la séquence d'ADN codant pour la lévanesaccharase chez B. subtilis,
- celle comprise dans une région d'environ 200 paires de bases située en amont du début de la transcription du gène de la protéase alcaline (HENNER et al,
J.Bacteriol., 170 : 296-300 (1988)).

La cellule hôte utilisée par la mise en oeuvre du procédé sus-mentionné est donc transformée, d'une part, au moyen d'un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide déterminé précédée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, et, d'autre part, au moyen d'un des vecteurs sus-indiqués contenant un fragment d'ADN selon l'invention.

Selon un autre mode de réalisation d'un tel procédé de production d'un polypeptide déterminé selon l'invention, la cellule hôte utilisée dans ledit procédé est transformée à l'aide d'un plasmide contenant à la fois, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, un fragment d'ADN selon l'invention et une séquence nucléotidique codante pour le polypeptide déterminé précédée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence codant pour la synthèse du polypeptide déterminé, plus particulièrement à l'intérieur de la cellule.

D'une manière générale, toute protéine naturellement secrétée par une bactérie Gram+, notamment du genre Bacillus, est tout d'abord traduite sous forme d'un polypeptide précurseur dont la séquence en acides aminés correspond à celle d'un peptide signal suivie de celle de la protéine secrétée. Au moment de la secrétion cellulaire, seule la forme mature correspondant à la protéine elle-même est secrétée hors de la cellule.

Ainsi l'invention concerne également un procédé de production d'un polypeptide déterminé qui comprend la transformation de la cellule hôte de manière à ce que le génome, ou le chromosome, de cette dernière contienne une séquence codant pour un polypeptide déterminé précédée par une séquence signal, ainsi qu'un fragment d'ADN selon l'invention, la mise en culture desdites cellules dans un milieu approprié et la récupération du polypeptide déterminé à partir du milieu de culture dans lequel il est secrété par le micro-organisme utilisé dans ledit procédé.

La cellule hôte utilisée pour la mise en oeuvre d'un tel procédé est transformée, d'une part, au moyen d'un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, la séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé, précédée d'une séquence signal, qui est elle-meme précédée par une séquence cible et par une séquence nucléotidique comprenant les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence signal et de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, et d'autre part par un des plasmides sus-indiqués contenant un fragment d'ADN selon l'invention.

L'invention a également pour objet un procédé de production d'un polypeptide déterminé par un micro-organisme approprié qui comprend la transformation des cellules dudit micro-organisme au moyen d un vecteur contenant à la fois, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, un fragment d'ADN selon 1 'inven- tion, codant pour un activateur du phénotype Degh, et une séquence d ADN codant pour le polypeptide déterminé, cette dernière séquence d'ADN étant précédée par une séquence signal, qui est elle-meme précédée par une séquence cible et par une séquence nucléotidique comprenant les éléments nécessaires pour permettre l'ex- pression de la séquence signal et de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, la mise en culture desdites cellules transformées dans un milieu approprié, et la récupération dudit polypeptide à partir du milieu de culture.

La séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé peut également être insérée en aval d'une séquence signal endogène dans le chromosome de la cellule hôte utilisée à l'aide notamment d'un vecteur contenant une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide déterminé.

Avantageusement les cellules hôtes utilisées pour la mise en oeuvre de l'ensemble des procédés de production de protéines sus-mentionnés, sont également transformées à l'aide d'un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une ou plusieurs séquences d'ADN codant pour un autre activateur conduisant au phénotype Degh que celui codé par un fragment d'ADN selon l'invention, et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de ladite séquence d'ADN.

Parmi les activateurs du phénotype Degh indiqués ci-dessus, on citera notamment les polypeptides Sac,, Sac51 Sac,, codés respectivement par les gènes sacO de
B licheniformis, B subtilis et B amvlolisuefaciens, et le polypeptide de 60 acides aminés codé par le géne PrtR de B. natto.

Avantageusement, le vecteur sus-mentionne' comprend une séquence d'ADN codant pour le polypeptide SacQ.

Les tranformations de la cellule hôte de manière à ce que son génome, ou son chromosome, contienne une, ou plusieurs, séquence(s) d'ADN codant pour un activateur autre que celui codé par un fragment d'ADN selon l'invention, peut également etre réalisée par l'intermédiaire de tout vecteur utilisé pour la mise en oeuvre de l'ensemble des procédés de l'insertion décrits ci-dessus, ledit vecteur contenant un autre fragment d'ADN codant pour un, ou plusieurs, des activateurs sus-mentionnés.

A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, un fragment d'ADN selon l'invention, ainsi qu'un fragment d'ADN pour un, ou plusieurs, activateur(s) conduisant au phénotype Degh autre(s) que celui codé pour le fragment d'ADN selon l'invention, et contenant les éléments nécesaires pour permettre l'expression de ce dernier fragment d'ADN.

L'invention concerne aussi le vecteur sus-mentionné contenant également un fragment d'ADN contenant une séquence d'ADN codant pour un polypeptide déterminé précédée par une séquence d'ADN contenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence codant pour ledit polypeptide.

L'invention concerne plus particulièrement le vecteur tel que décrit ci-dessus et comprenant également en amont de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, une séquence signal ainsi que les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence signal et descelle codant pour ledit polypeptide.

Avantageusement, le vecteur sus-mentionné com prend une séquence d'ADN codant pour le polypeptide activateur Sac,.

Parmi les séquences signal utilisées, pour la construction des vecteurs de l'invention, on citera notamment celle permettant la secrétion de la protéase alcaline, de la lévane-saccharase, de la cellulase et de l'a-amylase.

D'une manière générale, toute séquence pouvant jouer le rôle de séquence signal précédant la séquence d'ADN codant pour une enzyme par un micro-organisme approprié peut être utilisée.

L'invention concerne également les cellules de
B.subtilis, ou de tout autre micro-organisme approprié, transformées par les plasmides sus-mentionnés comprenant un fragment d'ADN selon l'invention conduisant au phénotype Degh, notamment un fragment d'ADN codant pour le polypeptide SacU51 ceux-ci étant capables de se répliquer dans ces cellules.

L'invention concerne plus particulièrement les cellules bactériennes sus-mentionnées qui sont transformées par un plasmide contenant un fragment d'ADN selon l'invention et une, ou plusieurs, séquence(s) codant pour un autre activateur conduisant au phénotype
Degh que celui codé par le fragment d'ADN de 1 'invention.

L'invention a également pour objet les cellules bactériennes transformées par un plasmide tel que décrit ci-dessus et contenant également une séquence codant pour un polypeptide déterminé, éventuellement précédée par une séquence signal, cette dernière étant avantageusement précédée par une séquence cible, tel que décrit plus haut.

Ces cultures de cellules sont alors capables de produire des quantités accrues de protéines, notamment d'enzymes, et/ou du polypeptide déterminé.

Bien entendu, l'homme du métier appéciera que les polypeptides recherchés, plus particulièrement le polypeptide déterminé, peuvent être purifiés de toute façon en soi connue, par exemple par électrophorèse sur gel et récupération du polypeptide recherché. On peut également encore avoir recours à toute autre technique par exemple à la chromatographie liquide sous haute pression.

Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit des vecteurs préférés et des conditions dans lesquelles ils peuvent être utilisés, étant entendu que cette description ne saurait être interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications.

1) Materiels et méthodes
- Souches bactériennes et Plasmides
Les souches de B. subtilis suivantes ont été utilisées : la souche de référence de B. subtilis 168.

(trn C2) (sacU , phcnotype Lvs Prt ) ; le mutant sacU
QB254 (sacU42, sacA321, his A1, trPC2) ne synthétisant pas de lévane-saccharase et de protéase (phénotype Lvs-,
Prt-) (LEPESANT et al, Mol. Gen. Genet. 118 : 135-160 (1972)) ; le mutant sacUh QB136 (sacU32, leuA8, trpC2) (KUNST et al, 1974, précédemment cité) la souche 1A510, qui est déficiente en recombinaison intermoléculaire (recE4, leuA8, aro-15. thrA5. stp) (OSTROFF ET PENE, J.

Bacteriol., 156 : 934-936 (1983)) ; la souche BD 1238 (!L=4::Tn917lacZ hisAl leu metB5) (HAHN et al, J.

Bacteriol., 169 : 3104-3109 (1987) ; ALBAN0 et al, J.

Bacteriol., 169 : 3110-3117, (1987)).

Les vecteurs de clonage pHV1431 et pHV1436 construits par JANNIERE L. et EHRLICH S.D. (INRA,
Jouy-en-Josas, FRANCE) et présentés sur la figure 3, permettent de maintenir de manière stable de larges fragments d'ADN chez B subtils. Le plasmide pHV1431 (10,8 kb ; portant un gène de résistance au chloramphenicol CmR) contient une origine de réplication provenant du plasmide pAMF1 (LEBLANC et LEE, J. Bacteriol., 157 445-453 (1984)) et est maintenu, à un grand nombre de copies, chez B. subtilis.

Le plasmide pHV1431d est un dérivé de 8,3 kb de pHV1431. obtenu par délétion spontanée chez E. coli, éliminant un fragment d'ADN contenant les deux sites
EcoRI de pHVî43î.

Le plasmide pHV1436 (8,7 kb, CmR) contient une origine de réplication provenant du plasmide pTB19 (IMANAKA et al, J. Bacteriol., 146 : 1091-1097 (1981)) et est maintenu à un faible nombre de copies chez B.

subtilis.

- Milieux et tests qualificatifs
E. coli. est cultivé dans un milieu L (tryptone 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, NaCl 5 g/l) et Br subtilis dans le milieu AM3 (Penassay, DIFCO) ou dans le milieu MMCH qui est composé de K2HP04 60 mM, KH2PO4 44 mM, (NH4)2S04 15 mM, citrate de Na3 3 mM, Mg S04 2 mM, MnCl2 0,01 mM, citrate d'ammonium ferrique 22 mg/l, hydrolysat de caséine 0,05 8, et de facteurs d'auxotrophie (100 mg/l).

Les boites de Petri L ou SP ont été préparées par addition de 17 g/l de Bacto-agar (DIFCO) au bouillon L ou au milieu SP (AMORY et al, J. Bacteriol., 169 324-333 (1987), LEPESANT et al (1972) précédemment cité).

Les milieux sélectifs contiennent des antibiotiques aux concentrations suivantes ampicilline (Ap) 25 pg/ml : chloramphenicol (Cm) 5 pg/ml : erythromycine (Em) 1 pg/ml et 25 pg/ml de lincomycine.

Les recombinants capables de produire de la lévane-saccharase (phénotype Lvs+) ont été identifiés sur des boites ST qui contiennent 20 g de saccharose stérilisé par filtration (BDH), 1 g de tryptone (DIFCO), 17 g/l d'agar purifié (DIFCO), 13 mM de KCl et 1 mM de
MgS04. Les milieux STCm et STEm contiennent, respectivement, 5 pg/ml de chloramphenicol et 1 pg/ml d'erythromycine additionné de 25 pg/l de lincomycine.L'aspect muqueux des lévanes entourant les clones Lvs+ sur les boites ST permet de distinguer ces clones Lvs+ des clones Lvs
- Détermination de l'activité lévane-saccharase
Des dilutions appropriées de surnageants de cultures sur milieu MMCH sont incubés à 37*C en présence de 10 % de saccharose, et 50 mM de tampon phosphate de potassium (pH 6.0) dans un volume final de 1 ml. Les réactions sont arrêtées par ébullition. La quantité de glucose est mesuré à l'aide du réactif GOD-Perid (BOEHRINGER). Une unité correspond à 1 pmole de glucose produit par minute. La quantité totale de protéine est estimée à partir de la densité optique de la culture.

- Transformation des cellules comPétentes
Ces transformations sont réalisées à l'aide des méthodes décrites pour la transformation d'E. coli (COHEN et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69 2110-2114 (1972)), ou de B. subtilis (ANAGNOSTOPOULOS et
SPIZIZEN, J. Bacteriol., 81 : 741-746 (1961) ; NIAUDET et EHRLICH, Plasmid, 2 : 48-58 (1979)).

L'ADN donneur est incubé avec des cellules compétentes de B. subtilis pendant 20 minutes à 37-C.

De l'extrait de levure et des facteurs d'auxotrophie sont alors additionnés à des concentrations finales de 10 mg/ml et 50 pg/ml, respectivement. Après incubation avec agitation à 37-C en présence d'antibiotiques (0,5 pg/ml de chloramphenicol pendant 45 minutes, et 0,5 pg/ml de chloramphenicol plus 0,15 ugil d'érythromycine pendant 90 minutes), les cellules sont étalées sur des boites SP additionnées soit de chloramphenicol seul, soit de chloramphenicol, d'érythromycine et de lincomycine.

- Manipulations d'ADN et Procédures de clonage.

L'ADN plasmidique est extrait d'E. coli ou de B.

subtilis par la méthode de la lyse alcaline (MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor New York, (1982) ; AMORY et al (1987) précédemment cité), suivie d'une centrifugation en gradient de chlorure de césium dans le cas d'extractions préparatives à partir de grands volumes de cultures. Les fragments d'ADN sont obtenus à partir de gels d'agarose, notamment par électro-élution.

Les enzymes de restriction et l'ADN-ligase de T4 ont été utilisées suivant les recommandations de leur fabricant respectif.

Les banques de gênes des plasmides recombinants contenant des fragments d'ADN de la souche de U.

subtilis BD 1238, ont été construits par ligature in vitro en utilisant des concentrations élevées d'ADN (100 pg/ml), afin de promouvoir la formation de multimères d'ADN qui transforment efficacement les cellules de B.

subtilis.

Les plasmides sous forme de monomères ont une faible, voire aucune, activité de transformation (CANOSI et al, Mol. Gen. Genet., 166 : 259-267 (1978)). Deux pg d1ADN de pHV1436 ou pHV1431d linéarisés avec BamHI et 2 pg d'ADN issu de BD1238 digéré par BamHI sont ligaturés en présence d'ADN-ligase de T4 dans des volumes réactionnels de 20 pl. Puisque les fragments d'ADN inséré s dans les vecteurs plasmidiques et le chromosome de la souche réceptrice de B subtilis sont homologues, des recombinaisons entre les deux peuvent avoir lieu dans des souches Rec . Pour cette raison, une souche 1A510 a été utilisée.En effet, la mutation recE de cette souche conduit à une déficience en recombinaison intermoléculaire (Rec-) mais n'affecte pas les mécanismes de recombinaison nécessaires à la transformation des plasmides multimères (entrant dans la cellule) en plasmides monomères (MICHEL et al, EMBO. J., 1 : 1565-1571 (1982 > ; TANAKA, J. Bacteriol., 139 : 775-782 (1979). Le plasmide pBU2 est obtenu en utilisant directement le mélange de ligature pour transformer la souche 1A510.

pBU3 dérive de pBU2 par transfert de l'insertion BamHI (13,4 kb) de ce dernier au vecteur pHV1431d. Dans un volume réactionnel de 20 ijl, l'ADN de pHV7431d linéarisé au préalable par BamHI et l'ADN de pBU2 digéré au préalable par BamHI ont été ligaturés. Le plasmide pBU14 dérive de pBU3 par ligature de 2 pg d'ADN de pBU3 digéré par SalI dans un volume réactionnel de 20 pl. De même, le plasmide pBU16 est construit à partir de pBU14 par ligature de l'ADN de pBUî4 digéré par SDhI. Ces plasmides sont tous introduits dans deux souches de B.

subtilis : la souche QB254 afin de tester leur capacité de restauration de la synthèse de lévane-saccharase dans cette souche sacU, et la souche 1A510, pour le maintien des plasmides et leur extraction préparative.

2) Isolement du locus sacU dans le plasmide
Le clonage du locus sacU dans les vecteurs plasmidiques est réalisé à l'aide de la mutation com-524 (HAHN et alr (1987) ; ALBANO et al, (1987), précédemment cités). Cette mutation apparait par insertion du transposon Tn917lacZ (PERKINS et al, (1986) ; SHAW et al, (1985), précédemment cités) dans une région proche du locus sacU.

Afin de mesurer la liaison génétique existant entre com-524 et sacUr l'ADN de la souche BD1238 a été extrait et utilisé à une concentration finale non saturée pour transformer la souche sacU QB254. 50 z des transformants résistants à l'érythromycine, possédent la capacité de produire la lévane-saccharase (Lvs +) sur boites de Pétri STEm et ont donc hérité l'allèle sacU+, ce qui indique que le locus sacU et le marqueur de résistance à l'érythromycine com-524 sont très proches.

La détermination de cette liaison génétique et le fait que la carte de restriction de Tn9î7lacZ est connue, ont été très utiles pour le clonage du locus sacU. Un site BamHI est localisé à proximité de l'extrémité gauche de Tn9î7lacZ et deux sites Ba;II sont localisés à la droite du marqueur érythromycine (figure 1).

La procédure de clonage a donc été réalisée en insérant des fragments BamHI de l'ADN chromosomique de
BD1238 dans le plasmide pHV1436. Un plasmide recombinant qui confère la résistance à l'érythromycine aux cellules hôtes (EmR) a été sélectionné en utilisant comme souche réceptrice 1A1510. Ainsi le plasmide recombinant CmR
EmR obtenu a été appelé pBU2.

Le plasmide pBU2 contient un fragment BamH1 de l'ADN de BD1238 inséré au niveau du site H1 de pHV1436. Ce fragment comprend le transposon Tn917lacZ dans sa presque totalité et des séquences d'ADN situées à la droite de Tn9171acZ.

Afin de déterminer si pBU2 contient l'allèle sacU à proximité du Tn917lacZ, ce plasmide a été utilisé pour transformer le mutant sacU QB254. Les cellules résistantes au chloramphenicol ont été sélectionnées. Il a ainsi été déterminé que le plasmide pBU2 contient au moins une partie de l'allèle sacU+, puisque ce plasmide est capable de conférer le phénotype Lvs + à la souche
QB254.

Toutefois, le plasmide pBU2 est difficile à manipuler pour deux raisons. Premièrement, le rendement de ce plasmide est très faible. Après centrifugation en gradient de densité de chlorure de césium, environ 3 pg d'ADN plasmidique est obtenu par litre de culture.

Deuxièmement, il n'est pas possible de transférer ce plasmide en entier chez E. coli.

Par conséquent, le fragment BamHI contenant Tn9171acZ et le locus sacU est transféré dans un vecteur qui peut etre maintenu à un nombre de copies élevé chez
B.subtilis. Le vecteur sus-mentionné correspond au plasmide pHV1431 décrit dans la figure 3. Toutefois, le plasmide pHV1431 est instable chez E. coli, et a par conséquent été remplacé par le plasmide pHV1431d. Ce dernier, est obtenu par élimination d'un fragment chevauchant les deux sites EcoRI de pHV1431, et se maintient de façon stable chez E. coli et chez B.

subtilis. L'ADN de p"V1431d est linéarisé au niveau de son site unique BamHI et ligaturé au fragment BamHI contenant le locus sacU de pBU2 pour produire pBU3. Le rendement du plasmide pBU3 est bien meilleur que celui de pBU2 (50 à 100 pg/l de culture).

Le locus sacU de pBU3 a été localisé en sousclonant un fragment SalI de 3,9 kb de pBU3. L'ADN de pBU3 est digéré avec SalI, les fragments religaturés, et utilisés pour transformer la souche QB254. 8 clones CmR
Lvs+ ont été choisis et leurs plasmides ont été extraits. Un de ces plasmides recombinants, pBU14, qui contient un fragment Sali unique de 3,9 kb en plus du fragment SalI de 8 kb du vecteur a été plus particulièrement étudié. Ce fragment SalI de 3,9 kb comprend un fragment SalI-BEmHi de 0,28 kb de pBR322et un fragment SalI-BamHI de 3,6 kb (figure 2). Après une seconde étape de sous-clonage, le plasmide pBU16 a été isolé et il contient un fragment SalI-SPhI de 2,6 Kb de l'ADN de B.

subtilis. Ce plasmide restaure également l'activité de synthèse de la lévane-saccharase chez le mutant sacU QB254. De plus l'introduction soit de pBU14, soit de pBU16 dans une souche Rec tA510 conduit à l'hyper- production de lévane-saccharase (tableau I). Ces données montrent que le gène sacU, ou au moins une partie fonctionnelle de ce gêner est localisé à l'intérieur du fragment SalI-S > hI de 2;6 kb.

Il va naturellement de soi que toute séquence nucléotidique modifiée, mais qui se distingue de celle qui code pour SacU5 et, qui a été envisagée dans ce qui précède, uniquement par la substitution de nucléotides qui n'entraînent pas la modification de la structure polypeptidique correspondante, ou qui entraine la modification sacUh, doit être considérée comme faisant partie de l'invention et comme étant protégée par les revendications qui s'y réfèrent plus particulièrement.

TABLEAU I
Secrétion de lévane-saccharase par la souche 1A510 contenant les plasmides recombinants indiqués ci-dessus.

<tb>

: <SEP> Plasmide <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> de <SEP> lévane-saccha-:
<tb> : <SEP> : <SEP> rase <SEP> (U/mg <SEP> x <SEP> 10 ) <SEP> :
<tb> : <SEP> : <SEP> glycerol <SEP> : <SEP> saccharose <SEP> :
<tb> : <SEP> pHV1431d <SEP> : <SEP> < <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 17
<tb> : <SEP> (vecteur <SEP> de
<tb> : <SEP> contrôle)
<tb> : <SEP> pBU14 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 330
<tb> : <SEP> pBU16 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 670
<tb>
La souche de B. subtilis 1A510 contenant les plasmides sus-indiqués est cultivée sur milieu MMCH additionné de chloramphenicol et soit de- 1 "" de glycerol (en poids/volume) ("glycerol"), soit de 2 % de saccharose (en poids/volume) ("saccharose").Les surnageants des cultures de cellules en phase exponentielle de croissance ont été dialysés pendant une nuit contre TPK (tampon phosphate de potassium) 0,05 M, pH 6,0, et les activité enzymatiques de la lévane-saccharase ont été mesurées. Les activités spécifiques ont été quantifiées par unités de lévane-saccharase par mg de protéine totale.

3) Techniques d'hybridation sur filtre de nitrocellulose
- purifier à partir du plasmide pBU16 le fragment SalI-SphI (2,55 kb),
- marquer ce fragment radioactivement par translation de césure (nick-translation),
- transférer l'ADN à tester sur un filtre de nitrocellulose,
-déposer ce filtre sur du papier Whatman n" 3 (marque déposée) imbibé de NaOH 0.5 N, NaCl 0.9 M et laisser 20 minutes à température ambiante,
- sécher brièvement sur papier,
- répéter l'opération sur papier imbibé de M
Tris-HCl, pH 7, 10 minutes,
- sécher brièvement,
- répéter l'opération sur papier imbibé de 2 x
SSC (1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0,015 M Na3citrate, pH 7),
- sécher sur papier, puis à l'étuve à 80*C pendant 2 heures,
Système homologue :: poursuivre selon A (conditions stringentes),
Système hétérologue : poursuivre selon B (conditions non stringantes).

A) conditions strinaentes
Hybrider le filtre avec 20 à 40 ml de tampon d'hybridation (50 % formamide, 5 x SSC, 1 x Denhardt ).

Préhybrider pendant 2 heure à 42 C.

- Changer le tampon d'hybridation et ajouter environ 4 x 106 c.p.m. de la sonde dénaturée (5 minutes à 100 C).

- Incuber de 16 à 24 heures à 42-C.

- laver successivement avec 1 x 50 ml 5 x SSC, 50 8 formamide 20 minutes à 42"C, 2 x 50 ml 2 x SSC, 0,1 % SDS 2 x 20 minutes à 42"C,
I x 50 ml 0,2 x SSC, 0,1 a SDS 20 minutes à 42 C.

B) Conditions non strinqentes
- Hybrider le filtre avec 20 à 40 ml de tampon d'hybridation (5 x SSC, 1 x Denhardt , Ori % SDS), préhybrider pendant 1 heure à 42"C.

- Changer le tampon d'hybridation et ajouter environ 4 x106 c.p.m. de la sonde dénaturée (5 minutes à 100-C) .

- Incuber de 16 à 24 heures à 42'C.

- Laver successivement avec 1 x 50 ml 5 x SSC, 0,1 "" SDS 20 minutes à 42 C, 2 x 50 ml 2 x SSC, 0,1 t SDS 2 x 20 minutes à 42"C.

* solution de Denhardt : 1 % Ficoll, 1 % polyvinylpyrrolidone, 1 t BSA.

(WHAL et al, Proc. Natl. Acad. Sci.r USA : 76, 3683-3687 (1979) ; MANIATIS et al, Molecular Cloningr Cold Spring
Harbor Press, NEW YORK (1982).

Les légendes correspondant aux figures illustrant les expériences et observations qui précèdent sont les suivantes
- Figure 1
Carte de restriction du plasmide pBU3. La partie supérieure de la figure représente le fragment BamHI de l'ADN de B. subtilis BD1238. Les localisations du gène lacZ du marqueur de résistance à l'érhythromycine (erm), et de Tn 917 sont respectivement représentées par une bande hachurée, une bande noire et une autre bande hachurée. Le fragment SalI-SDhI qui contient le locus sacU est indiqué par une bande blanche. La partie inférieure de la figure représente le vecteur plasmidique avec son origine de réplication chez B.

subtilis (bande noire), le marqueur de résistance au chloramphénicol (Cm), et les séquences de pBR322 (bande blanche).

- Figure 2
Carte de restriction du plasmide pBU14. La partie supérieure de la figure représente le fragment
SalI qui comprend le fragment d'ADN SalI-BamHI de 3,6 kb de B. subtilis (en pointillé) et un fragment BamHI-SalHI de 0,28 kb de pBR322 (simple trait noir). Le plasmide pBU16, dérivé de pBU14 ne contient qu'un fragment de
B.subtilis de 2,55 kb compris entre les sites SalI-SphI et indiqué par une bande blanche. La partie inférieure de la figure représente le vecteur plasmidique (symbôles identiques à ceux de la figure 1).

- Figure 3
Représentation schématique du plasmide pHV1436 (8,7 kb), se répliquant à un faible nombre de copies, et du plasmide pHV1431 (10,8 kb) se répliquant à un nombre élevé de copies. Les origines de réplication fonctionnelle chez B subtilis, sont indiquées par une bande pointillée (pHV1436) ou par une bande noire (pHV1431) ; le marqueur de résistance au chloramphenicol est représenté par une bande hachurée, et les séquences de pBR322 sont indiqués par une bande blanche.

- Figure 4
Carte de restriction simplifiée d'un fragment d'ADN de 2550 paires de bases comprenant le locus sacU de B. subtilis.

- Figure 5
Séquence nucléotidique et carte de restriction détaillées du fragment d'ADN comprenant le locus sacU de B. subtilis.

- Figure 6
Représentation de la phase de lecture ouverte située entre les nucléotides correspondant aux positions 1452 et 2139 et codant pour le polypeptide SacUs (ou protéine SacU).

- Figure 7
Repésentation de la séquence de 229 acides aminés du polypeptide SacUs.

- Figure 8
Comparaison de la protéine SacU (ou polypeptide SacUs) et des protéines DyE, OmpR, SpoOF, SpoOA. Les homologies de structure partielle de ces différentes protéines sont indiquées par des encadrements verticaux.

Cette comparaison a été réalisée à partir de 120 acides aminés de la partie NH2 terminale de la protéine SacU.

Les homologies sont nombreuses au niveau des parties NH2 terminales de ces protéines, et très faibles dans leurs parties COOH terminales.

Les souches de B subtilis de génotypes sacU et sacUh utilisées pour le clonage des fragments d'ADN selon l'invention, ont été déposées à la COLLECTION
NATIONALE DE CULTURES DE MICRO-ORGANISMES (C.N.C.M.) à l'INSTITUT PASTEUR de PARIS respectivement sous les numéros I-741 et I-744.

Une étude plus approfondie de la séquence nucléotidique entière du fragment d'ADN de 2,55 kb sus-mentionné, montre que la phase ouverte de lecture située entre les nucléotides aux positions 848 et 1366 de la figure 5, et décrite ci-dessus dans le premier paragraphe de la page 15, est en fait délimitée par les nucléotides situés aux positions 220 et 1374 de la figure 9, et code pour un polypeptide (ci-après dit
SacU51, ou DegS) de 385 acides aminés. Cette phase ouverte de lecture sera encore désignée dans ce qui suit par l'expression ORFI.

Le polypeptide SacU5 décrit ci-dessus est égale- ment représenté sur la figure 9 ; il est codé par une.

phase ouverte de lecture (ci-après désigné par ORF2) qui est délimitée par les nucléotides situés aux positions 1460 et 2146 de la figure 9, soit un décalage de 8 nucléotides par rapport aux positions 1452 et 2139 de la figure 5 qui avaient été initialement précisées à la dernière ligne de la page 13. Le polypeptide SacU5 sera désigné dans ce qui suit par SacU52 ou DegU.

Ces deux phases ouvertes de lecture ORF1 et
ORF2, sont précédées par des séquences nucléotidiques présumées fournir les signaux typiques de liaison de l'ARN messager aux ribosomes (dites séquences
Shine-Dalgarno), ces séquences étant respectivement situées dans les régions délimitées d'une part par les nucléotides situés aux positions 209 et 215, et d'autre part, par les nucléotides situés aux positions 1445 et 1451 de la figure 9.

Aucun signal de terminaison de la transcription n. a pu être déterminé entre ORFI et ORF2. Par conséquent, ORF1 et ORF? pourraient former, ou faire partie, d'un opéron. ORF2 parait etre suivie d'un terminateur de transcription compris entre les nucléotides situés aux positions 2159 et 2184 de la figure 9.

Comme il l'a été précisé à la page 14 de ce texte, le polypeptide SacU52, d'une part, semble nécessaire pour l'activation de la synthèse des enzymes de dégradation chez B. subtilis, puisque l'inactivation de
ORF2 (par insertion au niveau du site EcoRI) conduit à un phénotype Lvs (déficience en iévane-saccharase), et, d'autre part, appartient vraisemblablement à une famille de protéines, activateurs spécifiques de transcription.

Il semble que l'ORF1 ne permette pas lorsqu'elle est introduite chez une souche de B subtilis portant la mutation sacU-42 de restaurer l'activité de synthèse d'enzymes de dégradation. Toutefois, l'inactivation de
ORF1 (par insertion dans cette dernière d'un ADN étranger) chez une souche de B. subtilis sacU+, conduit également à un phénotype Lvs
Il est par conséquent probable que le produit codé par l'ORFî soit nécessaire, en addition au produit codé par l'ORF2, pour l'obtention du phénotype
B. subtilis.

L'analyse de la séquence en acides aminés du polypeptide SacU51 codé par l'ORF1, montre que cette séquence présente une certaine homologie avec celles des protéines qui sont des capteurs de signaux, notamment avec la protéine CheA de S. tvphimurium (figure 12), et qui transmettent à des activateurs, notamment ceux susmentionnés, l'information nécessaire à l'activation de la transcription.

Les polypeptides SacUS1 et SacU52 fonctionnent probablement suivant un système dans lequel SacU51 est un capteur de changements spécifiques de l'environnement et qui transmet cette information par l'intermédiaire de SacU52 au niveau du système de transcription.

L'invention concerne toute séquence d'ADN issue du fragment SalI-SDhI de 2,55 kb mentionné plus haut, séquence incluant en particulier les séquences codant pour les polypeptides SacUS1, et SacU52 capables de conférer le phénotype Degh, ainsi que les séquences nucléotidiques comprenant les éléments de régulation de l'expression de ces derniers.

L'invention concerne également tout fragment d'ADN capable de s'hybrider avec le fragment d'ADN SalI-S > hI de 2,55 kb de la figure 9, dans des conditions stringentes ou non stringentes sus-mentionnées.

L'invention concerne plus particulièrement l'ensemble des vecteurs sus-mentionnés dans la description qui précède et contenant à titre de fragment d'ADN selon l'invention, le fragment d'ADN de la figure 9, ou toute séquence d'ADN issue de ce fragment et qui conserve la propriété de ce dernier de conférer le phénotype Degh à la cellule hôte, dans laquelle ledit vecteur est susceptible d'être introduit.

L'invention a également pour objet l'utilisation de tels vecteurs dans les procédés de production de protéines décrits ci-dessus.

L'invention concerne également le polypeptide SacU51 représenté sur la figure 9 ainsi que les frag ments peptidiques actifs qui en découlent, en tant qu'ils sont capables d'activer l'expression d'un, ou de plusieurs gènes de structure de l'organisme, notamment de type Bacillacées qui les héberge.

L'invention a également pour objet un polypeptide hybride construit par fusion de tout ou partie d'un fragment d'ADN selon l'invention, notamment toute ou partie de la séquence codant pour SacU51, et d'un fragment hétérologue de maniere à produire dans la cellule hâte un polypeptide hybride composé de tout ou partie d'un polypeptide codé par le fragment d'ADN selon l'invention, notamment SacU51, et une séquence d'acides aminés hétérologue.

L'invention concerne également le fragment d'ADN codant pour le polypeptide SacU51, ainsi que celui codant pour le polypeptide sacU52, lesdits fragments étant compris dans le fragment d'ADN de 2,55 kb susmentionné. L'invention a plus particulièrement pour objet des vecteurs du type de ceux décrits ci-dessus et contenant le fragment d'ADN codant pour SacUS1, ou celui codant pour SacU52r en lieu et place du fragment D'ADN de 2,55 kb sus-mentionné, et l'utilisation de tels vecteurs dans des procédés de production de protéines tels que décrits ci-dessus, les génomes des cellules hôtes utilisées dans de tels procédés contenant alors les éléments nécessaires pour permettre au polypeptide SacUS1 ou SacUS2 d'induire le phénotype Deghchez ces cellules.

Notamment, lorsque le vecteur sus-mentionné comprend un fragment d'ADN codant pour SacU51, le génome des cellules hôtes utilisées dans ledit procédé contiendra avantageusement un fragment d'ADN codant pour un activateur (tel que SacUs2) capable de recueillir l'information portée par le polypeptide SacU51 ; et lorsque ledit vecteur comprend un fragment d'ADN codant pour SacU52, le génome desdites cellules contiendra avantageusement un fragment d'ADN codant pour un capteur (tel que SacUS1) capable de transmettre l'information au polypeptide SacU52 pour l'activation de la transcription.

Des caractéristiques supplémentaires concernant le fragment d'ADN de 2,55 kb représenté sur la figure 9, apparaitront encore au cours de la description qui suit, étant entendu que cette description ne saurait etre interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications.

A) ANALYSE GENETIQUE FINE DE LA STRUCTURE DU
LOCUS sacU.

Afin de localiser le locus sacU à l'intérieur du fragment inséré dans pBU16, des délétions ont été effectuées au niveau dudit fragment et les plasmides suivants ont été construits. Le plasmide pBU101 dérive du plasmide pBU14 par élimination d'un fragment EcoRI de 2,4 kb.

Le plasmide pBU100 a été construit en introduisant ce fragment EcoRI au niveau du site unique EcoRI du plasmide vecteur pHV1432. Puisque les deux plasmides pBU100 et pBU101 sont incapables de transformer la souche QB254 de génotype sacU en une souche de génotype sacU+ (Lvs (figure 10), il a été conclu que les séquences d'ADN essentielles entourent le site EcoRI de pBU16. Ceci a été confirmé en introduisant des cassettes d'ADN au niveau des sites EcoRI et BstBI de pBU16 conduisant respectivement aux plasmides pBU102 et pBU103. Puisque pBU14 et pBU16 ne pouvaient pas être maintenus chez
E. coli, ces plasmides pBU102 et pBU103 ont été obtenus par clonage direct chez B subtilis. Une séquence d'ADN de 4,5 kb contenant lacZ et erm a été insérée au niveau du site EroRI unique de pBU16 afin de créer pBU102. Ce plasmide a été introduit dans des cellules compétentes de B. subtilis 168 par sélection des transformants EmR
CmR. Des cellules EmR Cm5 apparaissent spontanément par récombinaison homologue (un mécanisme de double crossover conduisant à l'intégration de lacZ erm dans le chromosome).Le plasmide pBU103 a été construit de la même manière en insérant un fragment ClaI de 1,55 kb contenant un marqueur de résistance à la kanamycine aPhA3 provenant de StreDtococcus faecalis (TRIEU-CUOT P.

et al, (1983), Nucleotide sequence of the StrePtococcus faecalis plasmid gene encoding 3'5"-amino-glycoside phosphotransferase typeIII. Gene. 23 : 331-341) au niveau du site unique BstBI de pBU16. Comme il l'a été indiqué ci-dessus, après introduction de pBU103 dans B.

subtilis 168, les cellules Km R Cm5 apparaissent par insertion du marqueur KmR à l'intérieur du locus sacU. Ces fragments lacZ erm et agha3 ansi insérés au niveau des sites EcoRI et BstBI respectivement par l'intermédiaire des plasmides pBU102 et pBU103 confèrent aux cellules de
B. subtilis ainsi transformées un phénotype Lvs
B) SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DU LOCUS sacU
Le fragment SphI-SalI de 2,5 kb de pBU16 a été séquencé au niveau de ses deux brins par la méthode de terminaison de chaine didésoxy (SANGER F. et al, (1977)
DNA sequencing chain terminating inhibitors, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467). Il a ainsi été trouvé deux phases ouvertes de lecture ci-après désignées par
ORF1 (385 codons) et ORF2 (229 codons) (figure 9). Ces phases ouvertes de lecture sont précédées par des sites de liaison aux ribosomes correspondant respectivement aux séquences GGAGGGA (AG = -78 kJ/mol) et AAGGAGG (AG = -74 kJ/mol). Aucun signal de terminaison de transcription n'a été trouvé entre ORF1 et ORF2. ORF1 et ORF2 codent pour des polypeptides possédant des poids moléculaires de 44.906 daltons et 25.833 daltons respectivement.

C) EXPRESSION IN VITRO DES POLYPEPTIDES
CODES PAR sacU
Le plasmide pBU16 contenant le locus sacU a été incubé invitro en présence de E. coli. Les polypeptides ont été marqués par de la methionine S35 (activité specifique supérieure à 39TBq/mmole) et séparés par SDS
PAGE et visualisés par autoradiographie (figure 11). La comparaison des polypeptides synthétisés par le plasmide recombinant avec ceux codés par le plasmide pHV1431d indique la présence de bandes nouvelles, deux d'entre elles ayant des poids moléculaires apparents en accord avec ceux des polypeptides déduits à partir des orf i et orf2 (respectivement 45 000 daltons et 30 000 daltons).

D) COMPARAISON DES SEQUENCES EN ACIDES AMINES
DES POLYPEPTIDES SacU51 et SacU82 AVEC CELLES DE
PROTEINES DE REGULATION CONNUES
Une recherche informatique des homologies avec d'autres protéines indique que le polypeptide SacU51 codé par ORF1 présente une homologie avec les membres d'une classe de protéines "capteurs", c'est-à-dire avec
CheA de S tvphimurium, CpxA de E. coli, VirA de A.

tumefaciens, PhoR de E. coli, NtrB de K Dneusoniae (figure 12) (DRUMMOND M. et al, (1986), Sequence and domain relationships of ntrC and nifA from Klebsiella pneumonie : homologies to other regulatory proteins,
EMBO. J., 5 : 441-477 ; NIXON B.T. et al, (1986), two-component regulatory systems responsive to environmental stimuli share strongly conserved domains with the nitrogen assimilation regulatory genes ntrB and
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83 : 7850-7854 ; RONSON C.

W. et al, (1987), Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli,
Cell, 49 : 579-581). Dans les parties C-terminales de ces protéines, 5 régions d'amino-acides conservées, qui ont été numérotées de 1 à 5 (du côté N-terminal au côté
C-terminal), ont déjà été décrites (Stock A. et al, (1988), CheA protein, a central regulator of bacterial chemotaxis, belongs to a family of proteins that control gene expression in response to changing environmental conditions, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85 : 14031407). Des homologies particulièrement frappantes ont été trouvées dans une large zone comprénant les régions 4 et 5 (figure 12).Toutefois, la séquence en acides aminés du polypeptide SacU51 correspondant à la région 4 ne présente qu'une faible homologie avec la séquence consensus décrite pour les organisme Gram (STOCK et al précédemment cité). La'protéine Sac51 et une protéine capteur de E coli CpxA, présentent des degrés similaires d'homologie avec la protéine capteur de CheA de S. tYPhimurium (figure 12).

La protéine de SacU52 codée par ORF2 présente des homologies avec une classes de protéines régulatrices (ou polypeptides "activateurs"). Les protéines OmpR et Dye de E. coli et les protéines SpoOA et spoOF de B.

subtilis présentent des homologies avec la protéine ORF2 du locus sacU au niveau N-terminal (figure 13). La protéine MalT de E. coli (Cole S.T. et al, (1986),The nucleotide sequence of the malT gene encoding the positive regulator of the Escherichia coli maltose regulation, Genre, 42 : 201-208) et le régulateur codé par ORF1 du locus uvrC (SHARMA S. et al, (1986), Multiple control elements for the uvrC gene unit of Escherichia coli,
Nucleic Acids Res., 14 : 2301-2318) présentent des homologies avec la protéine codée par ORF2 de locus sacU au niveau C-terminal (figure 14). L'ORF2 du locus uvrC (référence identique à celle sus-mentionnée) est un cas spécial, puisqu'il présente des homologies avec le polypeptide codé par ORF2 au niveau des parties C- et
N-terminales (figures 13 et 14).

Beaucoup des protéines sus-mentionnées fonctionnent par paires afin de réguler l'expression d'un gène au niveau de la transcription et ceci en réponse à un des changements dé l'environnement tels que la limitation en éléments nutritifs ou une osmolarité altérée (MATSUYAMA, S. I. et al, (1986) Interaction between two regulatory proteins expression in omnF et omPC genes in
Escherichia coli : a novel omDR mutations suppresses pleiotropic defects caused by an envZ mutation; J.

Bacteriol., 168 : 1309-1314). Il pourrait en être de même pour les polypeptides SacU51 et SacU52 respectivement codés par ORF1 et ORF2 du locus sacU. La région
N-terminale du polypeptide SacUS2 peut soit interagir avec la protéine capteur ou avec l'appareil transcriptionnel lui conférant ainsi une fonction d'anti-terminaison ou d'activation de la transcription. Alternativement, cette fonction peut se localiser au niveau
C-terminal puisque ORF2 présente des homologies avec des régulateurs tels que MalT de E. coli.

Différents types d'interaction entre protéines capteur et régulateur ont été proposés : contact direct protéine-protéine dans le cas du couple EnvZ/OmpR (MATSUYAMA, S. I. et al, (1986) sus-mentionné) ou phosphorylation de l'activateur (encore appelé régulateur) dans le cas des couples CheA/CheY et NtrB/NtrC (NINFA and MAGASANIK et al, (1986), Covalent modification of the alnG product, NRI, by the snlL product, NRII, regulates the transcription of the anlALG operon Escherichia coli, Procl. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 5909-5913
WYLIE M. E. et al, (1988) Sensory transduction in bacterial chemotaxis involves phosphotransfer between
Che proteinsr Biochem. Biophys. Res. Comm., 151 891-896).Il a été suggéré que la protéine capteur CheA subit une auto-phosphorylation en présence d'ATP afin de produire une phospho-CheA. La protéine capteur phosphorylée donne alors son groupe phosphoryl à l'activateur
CheY d'une manière qui peut être comparable aux réactions de phosphotransférase du système de phosphotransférase des sucres (WYLIE D. et al, sus-mentionné). Pour ce qui concerne l'organisation du locus sacU, ORF1 et
ORF2 peuvent appartenir à un même opéron, comme il l'a été proposé dans le cas d'autres systèmes de capteurs/activateurs (NtrB, NtrC) (NIXON B. T. et al, (1986), précédemment citée.

Le système sacU affecte la production d'enzymes qui dégradent les sources d'azote et de carbone (par exemple lévanesaccharase, -amylase, 8-amylase(s), protéases). Il est probable que le signal transmis à la protéine capteur soit le reflet d'une limitation de carbone et/ou d'azote. Aucun segment transmembranaire n'a pu être détecté chez l'un ou l'autre des deux polypeptides codés par le locus sacU. Il est par conséquent probable que le système sacU réponde à un signal intracellulaire de limitation de matières nutritives.

Les légendes des figures illustrant la description qui précède sont les suivantes
- Figure 9
Séquence nucléotidique détaillée du fragment d'ADN contenant le locus sacU selon l'invention. Les polypeptides SacU51 et SacU52 sont représentés au dessus des phases de lectures ouvertes ORF1 et ORF2 codant respectivement pour ces polypeptides ; ORF1 est délimitée par les nucléotides situés aux positions 220 et 1374, et ORF2 est délimitée par les nucléotides situés aux positions 1460 et 2146.

- Figure 10
Carte de restriction simplifiée d'insertion d'ADN dans des plasmides. La capacité des plasmides pBU14, pBU16, pBU100, pBU101, pBU102 et pBU103, à restaurer la synthèse de lévane-saccharase chez la souche de B. subtilis QB254 de génotype sacU est indiquée. Les positions de ORF1 et OFR2 sont indiquées par des bandes hachurées. La direction de la transcription est de gauche à droite. ORF2 est interrompue dans le plasmide pBU102 par une cassette lacZ ermr et ORFI est interrompue dans le plasmide pBU103 par une cassette agha3.

- Figure 11
Identification des polypeptides SacU51 et
SacU52. 1 ijg d'ADN plasmidique circulaire, covalent et fermé a été utilisé dans cette manipulation in vitro.

Les produits de traduction ont été marqués avec 35S méthionine, séparés par SDS-PAGE, et détectés par autoradiographie. La ligne 1 correspond au vecteur pHV1431d, et la ligne 2 au plasmide pBU16 contenant ORF1 et ORF2.

La migration de protéines standard est indiquée par les flèches à gauche. Les flèches de droite indiquent des bandes correspondant à des poids moléculaire d'environ 45 000 et 30 000.

- Figure 12
Comparaison des parties C-terminales du polypeptide SacU51 codé par ORFI du locus sacU de B. subtilis, et des protéines CheA de S. thvphimurium et CpxA de E.

coli.

- Figure 13
Comparaison des parties N-terminales du polypeptide SacU52 codé par ORF2 du locus sacU de B. subtilisr et des protéines Dyer UvrC (codé par l'ORF2), OmpR de E.

coli, et SpoOA, SpoOF de B subtilis.

- Figure 14
Comparaison des parties C-terminales du polypeptide SacU52 de B. subtilis, et des protéines UvrC (codées par ORF1 et ORF2) et MalT de E. coli.

- Fiaure 15
Séquence nucléotidique et carte de restriction détaillée du fragment d'ADN selon l'invention contenant le locus sacU (la numérotation des nucléotides est décalée d'un nucléotide par rapport à la numérotation utilisée pour la figure 9 ; par exemple, le nucléotide T en position 10 de la figure 9 est en position 11 sur la figure 15).

L'invention concerne plus particulièrement encore des acides nucléiques comportant le locus sacUh, en particulier un fragment d'environ 14 kb issu d'une souche de B. subtilis porteuse d'une mutation sacUh. Ce fragment est capable de s'hybrider, dans les conditions de stringence définies ci-dessus, au fragment d'ADN de 2,55 kb portant l'allèle sacU+ sus-mentionné.

Le clonage de l'allèle sacUh a été réalisé en introduisant la mutation com-524 de la souche de
B. subtilis BD1238 dans la souche de B. subtilis QB136 portant la mutation sacUh32. Un transformant résistant à l'érythromycine (EmR) ayant retenu la mutation sacU-32 a été isolé. Cette souche, appelé QB4209, contient donc à la fois la mutation com-524 et la mutation sacUh32.

Des fragments de restriction BamHI de l'ADN chromosomique de la souche QB4209 ont été insérés dans le site BamHI de pHV1436. Un plasmide recombinant CmR
EmR a été sélectionné et appelé pBUH1. Ce plasmide est capable de restaurer la synthèse de la lévane-saccharase chez un mutant sacU (B. subtilisQB254).

L'invention concerne donc encore un fragment d'acide nucléique contenant une séquence de nucléotides contenue dans un fragment d'ADN de 14 kb issu d'une souche de B subtilis portant une mutation sacUh ladite séquence étant caractérisée en ce que - elle est capable de restaurer l'activité de synthèse de lévane-saccharase chez une souche de B. subtilis portant une mutation sacU-, lorsque ce fragment a été incorporé à cette souche
- d'induire une surproduction de protéines, ou de conférer un phénotype Degh, chez B. subtilis - ou chez un autre micro-organisme, capable d'exploiter à son profit l'information portée par ce fragment - lorsque ladite séquence est introduite dans ce micro-organisme - de s'hybrider -- et de rester hybridé -- avec un fragment d'ADN SalI-SPhI de 2,55 kb issu de B subtilis
BD1238 (figure 3) dans les conditions suivantes
pré-traitement (pré-hybridation) du filtre de nitrocellulose supportant ledit fragment d'acide nucléique avec le tampon d'hybridation (5 x SSC, 1 x Denhardt, 0,1 z SDS), cette opération étant effectuée à 42-C pendant 1 heure
remplacement du tampon d'hybridation au contact du support, sur lequel fragment d'acide nucléique est alors fixé par un tampon d'hybridation de même composition, et addition de la séquence de 2,55 kb en tant que sonde, notamment marquée radioactivement, et préalablement dénaturée par un traitement à 100*C pendant 5 minutes incubation dudit fragment d'acide nucléique fixé sur le support, au contact du fragment de 2,55 kb dans ce tampon d'incubation à 42'C pendant une durée de 16 à 24 heures, élimination du tampon contenant la sonde non fixée,
soit par lavages successifs 1 x 50 ml de 5 x
SSC, 0,1 % SDS à 42-C pendant 20 minutes et 2 x 50 ml de 2 x SSC, 0,1 % SDS pendant 2 x 20 minutes à 42iC,dans des conditions non stringentes,
soit par lavages successifs avec les solutions suivantes
1 x 50 ml, 5 x SSC, 50 % formamide, 20 minutes à 42-C
2 x 50 ml, 2 x SSC, 0,1 % SDS, 2 x 20 minutes à 42-C
1 x 50 ml, 0,2 x SSC, 0,1 Ó SDS, 20 minutes à 42"C, dans des conditions stringentes.

L'invention a également pour objet les ADNs recombinants comprenant le fragment d'ADN susmentionné ayant au plus les 14 kb, et leur utilisation, notamment dans des plasmides, pour la mise en oeuvre de procédés de surproduction d'enzymes, ou d'un polypeptide déterminé, tels que ceux décrits ci-dessus.

Les propriétés du fragment d'ADN de 14 kb susmentionné sont plus particulièrement détaillées dans ce qui suit.

Une souche de B subtilis QB4181 a été construite, portant à la fois la mutation sacU-42 et une fusion de transcription sacR-aPhA3 (intégrée dans le chromosome de B. subtilis par double "crossing over" au locus sacC, le gène de structure de la lévanase). Le gène de résistance à la kanamycine aPhA-3 est contrôlée par les signaux de transcription de la région sacR. Cette région contient notamment le promoteur du gène de structure sacB de la lévane-saccharase, la cible du gène régulateur sacU activant l'expression de sacB et la cible du gène régulateur sacS impliqué dans l'induction de la lévane-saccharase par le saccharose.

En raison de la présence de 1'allèle sacU dans la souche QB4081, l'expression de sacB et celle de sacR-aDhA3 est déficiente. Par conséquent, la souche
QB4181 est incapable de croître en présence de kanamycine sur boîte de milieu SMMHCKm100 (milieu minéral de
Spizizen (J. Bacteriol., li, 741-756 (1981)) additionné de saccharose (20 g/l) additionnné d'hydrolysat de caséine (0,5 g/l), tryptophane (20 pg/ml), kanamycine (100 pg/ml). Par contre, le remplacement de l'allèle sacU 42 par l'allèle sacUh32 dans la souche QB4081 permet une activation de l'expression de sacR-aDhA3 entraînant une résistance à la kanamycine.

Dans des expériences de transformation, mettant en jeu la souche QB4181 comme souche réceptrice et l'ADN chromosomique extrait d'un mutant sacUh32 comme souche donneuse, des transformants (cellules transformées) sacUh32 sont sélectionnés directement grâce à leur résistance à la kanamycine (KmR) sur milieu SMMHCKm100.

D'une manière comparable, des transformants KmR dans des expériences de transformation de la souche
QB4181 à l'aide du plasmide pBUH1 ont été obtenus. Ces transformants portent l'allèle sacUh32, car ils expriment complètement le phénotype "hyperproduction d'enzymes sécrétées". Un explication possible est que la méthode utilisée conduit à la sélection. de recombinants dans lesquels la mutation sacUh32 a pu être transférée du plasmide sur le chromosome. Ceci impliquerait que le plasmide utilisé comme ADN donneur porte la mutation sacUh32 et que la présence d'un allèle chromosomique sacUh32 entraîne l'expression complète du phénotype "hyperproduction d'enzymes secrétées".

La souche QB254 ou une souche Rec (in510) porteuses du plasmide pBUH1 semblent produire, d'après des tests effectués sur boites de Pétri, moins de protéases et moins de lévane-saccharase que la souche QB136 portant une une mutation chromosomique sacUh32. Puisque le fragment d'ADN couvrant la mutation sacuh32 a bien été inséré dans le plasmide pBUH1 (cf. ci-dessus), il semble que, dans les conditions expérimentales utilisées, la mutation sacU 32 portée par ce plasmide ne conduit qu'à une expression partielle du phénotype d'hyperproduction d'enzymes secrétées.

Comme on l'a déjà mentionné plus haut, en ce qui concerne la localisation et l'obtention d'une séquence plus petite portant le locus sacUh à partir du fragment de 2,55 kb, l'homme du métier peut, par le traitement du fragment de 14 kb sus-spécifié, - soit par des enzymes de restriction appropriées permettant l'isolement de fragments plus petits et la sélection de ceux qui, lorsqu'ils ont été incorporés dans une souche sacU , confèrent à celle-ci un phénotype
Degh, - soit par une digestion de ses extrémités au moyen d'une enzyme exonucleolytique, telle que Bat31, digérant le fragment 14 kb pour produire des fragments plus petits à partir du fragment SalI-SDhI et tester à nouveau, notamment dans les conditions exposées plus haut leur capacité à conférer le phénotype Degh à une souche de B.subtilis.En d'autres termes, l'homme du métier est désormais à même de localiser avec précision la partie active du locus sacUh dans le susdit fragment de 14 kb.

Il va de soi que toutes les techniques qui ont été décrites plus haut pour la transformation de cellules réceptrices, notamment des Bacillacées, avec le fragment de 2,55 kb, sont applicables au fragment de 14 kb ou des sous-fragments qui peuvent en être dérivés pour tirer pleinement profit des propriétés du locus sacUh qu'ils contiennent, bien entendu sous réserve que les techniques soient adaptées en conséquence. Ces adaptations qui tiennent essentiellement aux différences de structures nucléotidiques des fragments 2,55 kb et 14 kb relèvent bien entendu aussi des compétences normales de l'homme du métier.

Une souche de B.subtilis contenant le plasmide pBUH1 a été déposée à la Collection Nationale des
Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur de Paris, Francer le 13 juillet 1988 sous le nv I-782.

A ce titre, l'invention concerne aussi tout acide nucléique recombinant contenant, d'une parut, un premier fragment contenant la partie fonctionnelle de sacUh obtenue à partir du fragment 14 kb, en particulier tout fragment du type sus-indiqué codant pour le polypeptide SacUh conférant le phénotype Degh et, d'autre part, au moins un second fragment d'acide nucléique hétérologue associé au premier fragment et, par exemple, un troisième fragment contenant une séquence d'acide nucléique contenant un promoteur fort ou une séquence régulatrice ayant pour effet d'augmenter la production de la protéine SacU sauvage ou modifiée dans l'hôte utilisé.

Dans ce qui suit, et pour la commodité du langage, il est entendu que ltexpression "fragment 14 kb" ou "séquence 14 kb" recouvre aussi bien le fragment ou la séquence qui a effectivement une taille de 14 kb que les sous-fragments ou sous-segments contenant la séquence codant pour SacUh ou partie de SacUh néanmoins fonctionnelle dans les conditions qui ont été indiqués.

A ce titre, l'invention concerne tout ADN recombinant contenant le fragment 14 kb conférant le phénotype Degh, associé avec un promoteur de transcription reconnu par une cellule hôte, autre que celle dont ledit fragment d'ADN est issu. Des exemples de promoteurs forts utilisables ont été indiqués plus haut. Ces ADNs recombinants contiennent le cas échéant aussi un terminateur de transcription hétérologue par rapport à l'ADN de B.subtilis, le promoteur et, le cas échéant, le terminateur étant néanmoins reconnus par la cellule hôte, dans des conditions permettant au fragment d'ADN selon l'invention d'y être exprimé, lorsque ledit ADN recombinant y aura été introduit. Par exemple, cet ADN recombinant comprend un promoteur et, le cas échéant, un terminateur d'un autre micro-organisme.

A cet égard, l'invention concerne plus particulièrement les ADNs recombinants consistant en des vecteurs, contenant un fragment 14 kb en l'un de leurs sites non essentiels pour leur réplication, notamment du type plasmide, qui sont aptes à se répliquer dans une cellule hôte tout en permettant à la partie fonctionnelle du locus sacUh de manifester son activité, notamment à permettre l'expression de la séquence codant pour le polypeptide SacU5.

L'acide nucléique recombinant conforme à l'invention peut en outre comporter une séquence de nucléotides codant pour un polypeptide déterminé dont la production doit être induite dans l'hôte cellulaire utilisé ; cette séquence étant alors avantageusement aussi placée sous le contrôle du même promoteur et, le cas échéant, associée avec le même terminateur.

Les vecteurs mentionnés plus haut, en rapport plus particulièrement avec la séquence 2,55 kb, notamment du type réplicatif ou intégratif, peuvent également être mis en oeuvre avec le fragment 14 kb ou les sous-fragments qui en sont dérivés.

L'invention concerne également le polypeptide
SacUh et les fragments peptidiques actifs qui en découlent, en tant qu'ils sont capables d'activer l'expression d'un, ou de plusieurs gènes de structure de l'org anismer notamment de type Bacillacées qui les héberge.

L'invention a également pour objet un polypeptide hybride construit par fusion de tout ou partie du fragment 14 kb et d'un fragment hétérologue de manière à produire dans la cellule hôte un polypeptide hybride composé de tout ou partie du polypeptide SacUh, et une séquence d'acides aminés hétérologue.

L'invention concerne donc un procédé visant à accroître la capacité de production de protéines, notamment d'enzymes ou de polypeptides, par un micro-organisme appropriés ce procédé comprenant la transformation des cellules dudit micro-organisme au moyen d'un des plasmides sus-indiqués contenant une séquence 14 kb, la mise en culture des cellules hôtes transformées dans un milieu de culture approprié et la récupération desdites protéines, soit à partir de ces cellules (notamment par lyse des cellules dans le cas de la production de protéines endoceilulaires), soit à partir du milieu de culture (dans le cas de la production d'enzymes exocellulaires).

Parmi les micro-organismes transformables par le procédé sus-mentionné, ainsi que par les autres procédés selon l'invention décrits ci-après, on distinguera notamment les bactéries Gram , telles que les genres
Bacillus et Clostridium.

Les protéines ainsi produites sont celles dont les gènes de structure sont naturellement sous le contrôle du gène sacUh dans le chromosome des cellules bactériennes utilisées pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

La séquence 14 kb ou ses sous-fragments peuvent également être mis en oeuvre dans le procédé évoqué plus haut pour induire la surproduction, chez B. subtilis, d'un grand nombre d'enzymes endo- ou exocellulaires, dont par exemple les protéases, la lévane-saccharase, l' -amylase et des glycanases.

L'invention vise également un procédé de production d'un polypeptide determiné par un micro-organisme approprié dont le génome, ou le chromosome, a été modifié de manière à ce que le génome, ou le chromosome, contienne une séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide dont la production doit être stimulée, qui comprend la transformation des cellules dudit microorganisme au moyen d'un plasmide approprié contenant cette séquence 14 kb ou une sous-séquence fonctionnelle, la mise en culture des cellules du micro-organisme ainsi transformées dans un milieu approprié, et la récupération dudit polypeptide à partir desdites cellules ou du milieu de culture.

L'invention concerne aussi encore un vecteur, notamment plasmide, contenant1 en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, un ADN recombinant tel qu'il a été défini ci-dessus, contenant en outre, en amont des fragments précédemment définis, une séquence cible telle qu'elle a été définie plus haut.

Selon un autre mode de réalisation d'un tel procédé de production d'un polypeptide déterminé selon l'invention, la cellule hôte utilisée dans ledit procédé est transformée à l'aide d'un plasmide contenant à la fois, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, un fragment d'ADN comportant la séquence de 14 kb ou une sous-séquence fonctionnelle issue de celle-ci et une séquence nucléotidique codant pour ce polypeptide, l'ensemble étant précédé par une séquence nucléotidique comprenant une séquence cible et les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence codant pour la synthèse du polypeptide déterminé, à l'intérieur de la cellule.Avantageusement, cette dernière séquence est précédée d'une séquence distincte codant pour un peptide signal convenablement choisi pour permettre la - sécrétion ultérieure dudit polypeptide.

Ainsi l'invention concerne également un procédé de production d'un polypeptide déterminé qui comprend la transformation de la cellule hôte de manière à ce que le génome, ou le chromosome, de cette dernière contienne une séquence codant pour un polypeptide déterminé précédée par une séquence signal, ainsi qu'un fragment 14 kb, la mise en culture desdites cellules dans un milieu approprié et la récupération du polypeptide déterminé à partir du milieu de culture dans lequel il est secrété par le micro-organisme utilisé dans ledit procédé.

La cellule hôte utilisée pour la mise en oeuvre d'un tel procédé est transformée, d'une part, par un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, la séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé, précédée d'une séquence signal, qui est elle-meme précédée par une séquence cible et par une séquence nucléotidique comprenant les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence signal et de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, et d'autre part par un des plasmides sus-indiqués contenant la séquence 14 kb/ou ladite sous-séquence fonctionnelle.

L'invention a également pour objet un procédé de production d'un polypeptide déterminé par un micro-orga- nisme approprié qui comprend la transformation des cellules dudit micro-organisme au moyen d'un vecteur contenant à la fois, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, un fragment d'ADN contenant la séquence 14 kb ou la sous-séquence fonctionnelle correspondante, et une séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé r cette dernière séquence d'ADN étant précédée par une séquence signal, qui , est elle-meme précédée par une séquence cible et par une séquence nucléotidique comprenant les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence signal et de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, la mise en culture desdites cellules transformées dans un milieu approprié, et la récupération dudit polypeptide à partir du milieu de culture.

La séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé peut également être insérée en aval d'une séquence signal dans le chromosome de la cellule hôte utilisée à l'aide notamment d'un vecteur contenant une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide déterminé.

Avantageusement les cellules hôtes utilisées pour la mise en oeuvre de l'ensemble des procédés de production de protéines sus-mentionnés, sont également transformées à l'aide d'un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une ou plusieurs séquences d'ADN codant pour un autre activateur conduisant au phénotype Degh que celui codé par la séquence 14 kob et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de ladite séquence d'ADN.

Parmi les activateurs conduisant phénotype Degh indiqués ci-dessus, on citera notamment les polypeptides SacQL, SacQ5, Sacra, codés respectivement par les gènes sacO de B. licheniformis, B. subtilis et B.

amvloliauefaciens, et le polypeptide de 60 acides aminés codé par le géne prtR de B. natto.

Avantageusement, le vecteur sus-mentionné comprend une séquence d'ADN codant pour le polypeptide SacQt.

A ce titre, l'invention concerne aussi des variantes de vecteurs du même type que celles qui ont été envisagées plus haut r notamment - un plasmide contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une séquence 14 kb ou sous-séquence fonctionnelle correspondante, ainsi qu'un fragment d'ADN pour un, ou plusieurs, activateur(s) conduisant au phénotype Degh autre(s) que celui codé par la séquence 14 kb, ce plasmide contenant les éléments nécessaires pour permettre l'expression du dernier fragment d'ADN mentionné - un vecteur du type sus-mentionné contenant également un fragment d'ADN contenant une séquence d'ADN codant pour un polypeptide déterminé précédée par une séquence d'ADN contenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence codant pour ledit polypeptide.

- un vecteur tel que décrit ci-dessus et comprenant également en amont , de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, une séquence signal ainsi que les éléments nécessaires pour permettre l'expresFion de la séquence signal et de celle codant pour ledit polypeptide.

Avantageusement, le vecteur sus-mentionné comprend une séquence d'ADN codant pour le polypeptide activateur Sac,.

Parmi les séquences signai utilisées, pour la construction des vecteurs de l'invention, on citera notamment celle permettant la secrétion de la protéase alcaline, de la lévane-saccharase, de la cellulase et de l'-amylase.

D'une manière générale, toute séquence pouvant jouer le rôle de séquence signal précédant la séquence d'ADN codant pour une enzyme par un micro-organisme approprié peut être utilisée.

L'invention concerne, comme dans les cas évoqués en rapport avec le fragment 2,55 kb, les cellules de B.subtilis, ou de tout autre micro-organisme approprié, transformées par les plasmides sus-mentionnés comprenant une séquence 14 kb ou sous-séquence fonctionnelle conduisant au phénotype Degh, notamment un fragment d'ADN codant pour le polypeptide SacUh, ceux-ci étant capables de se répliquer dans ces cellules.

L'invention concerne plus particulièrement les cellules bactériennes sus-mentionnées qui sont transformées par un plasmide contenant une séquence 14 kb ou sous-séquence fonctionnelle correspondante et une, ou plusieurs, séquence(s) codant pour un autre activateur conduisant au phénotype Degh que celui codé par la séquence 14 kb.

L'invention a également pour objet les cellules bactériennes transformées par un plasmide tel que décrit ci-dessus et contenant également une séquence codant pour un polypeptide déterminé, éventuellement précédée par une séquence signal, cette dernière étant avantageusement précédée par une séquence cible, tel que décrit plus haut.

Ces cultures de cellules sont alors capables de produire des quantités accrues de protéines, notamment d'enzymes, et/ou du polypeptide déterminé, lequel peut comme indiqué plus haut, être purifié de toute façon en soi connue.

L'invention concerne enfin tout polypeptide ayant les mêmes caractéristiques fonctionnelles que celles que manifeste le locus SacUh, lorsqu'un vecteur le contenant est introduit dans une cellule ayant compétence pour l'exploiter. Il s'agit de tout polypeptide correspondant à un cadre de lecture ouverte (open reading frame) contenue dans la région SacUh elle-même.

Il va sans dire que les dépôts de plasmides qui ont été effectués dans le cadre de la présente demande de brevet constituant des équivalents complets de la description des séquences nucléotidiques dont ils sont constitués, du seul fait qu'ils seront rendus accessibles aux tiers dans les conditions prévus par le traité de Budapest etl de ce fait, séquençable par ces tiers.

Claims (4)

REVENDICATIONS

1. Fragment d'acide nucléique issu d'une souche de B. subtilis portant une mutation sacUh, contenant une séquence fonctionnelle de nucléotides et comportant au plus 14 kb, ladite séquence étant caractérisée en ce que - elle est capable de restaurer l'activité de synthèse de lévane-saccharase chez une souche de B. subtilis portant une mutation sacU-, lorsque ce fragment a été incorporé à cette souche

- d'induire une surproduction de protéine, ou de conférer un phénotype Degh, chez B subtilis - ou chez un autre micro-organisme, capable d'exploiter à son profit l'information portée par ce fragment - lorsque ladite séquence est introduite dans ce micro-organisme - de s'hybrider -- et de rester hybridé -- avec un fragment d'ADN SalI-SphI de 2,55 kb issu de B. subtilis

BD1238 (figure 3) dans les conditions suivantes pré-traitement (pré-hybridation) du filtre de nitrocellulose supportant ledit fragment d'acide nucléique avec le tampon d'hybridation (5 x SSC, 1 x Denhardtr 0,1 z SDS), cette opération étant effectuée à 42vC pendant 1 heure remplacement du tampon d'hybridation au contact du support, sur lequel le fragment d'acide nucléique est alors fixé par un tampon d'hybridation de même composition, et addition de la séquence de 2155 kb en tant que sonde, notamment marquée radioactivement, et préalablement dénaturée par un traitement à 100-C pendant 5 minutes incubation dudit fragment d'acide nucléique fixé sur le support, au contact du fragment de 2,55 kb dans ce tampon d'incubation à 42*C pendant une durée de 16 à 24 heures, l'élimination du tampon contenant la sonde non fixée,

soit par lavages successifs 1 x 50 ml de 5 x

SSC, 0,1 g SDS à 42*C pendant 20 minutes et 2 x 50 ml de 2 x SSC, 0,1 % SDS pendant 2 x 20 minutes à 42 C, dans des conditions non stringentes,

soit par lavages successifs avec les solutions suivantes

1 x 50 ml, 5 x SSC, 50 t. formamider 20 minutes à 42"C

2 x 50 ml, 2 x SSC, 0,1 % SDS, 2 x 20 minutes à 42"C

1 x 50 ml, 0,2 x SSC, 0,1 z SDS, 20 minutes à 42 C, dans des conditions stringentes.

2. Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce qu il comporte la séquence nucléotidique (codant pour le polypeptide SacUS1) délimitée par les nucléotides situés aux positions 220 et 1374 de la figure 9.

3. Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence nuc-léotidique (codant pour le polypeptide SacUS2) délimitée par les nucléotides situés aux positions 1460 et 2146 de la figure 9.

4. Fragment d'acide nucléique caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider -- et de rester hybridé -- avec le fragment SalI-pI de 2,55 kb caractérisé par la séquence de nucléotides de la figure 9r et ce lorsque les opérations d'hybridation comportent les étapes suivantes

- pré-traitement (pré-hybridation) du filtre de nitrocellulose supportant ledit fragment d'acide nucléique avec le tampon d'hybridation (5 x SSC, 1 x Denhardtr 0,1 % SDS), cette opération étant effectuée à 42vC pendant 1 heure

- remplacement du tampon d'hybridation au contact du support, sur lequel ledit fragment d'acide nucléique est alors fixé, par un tampon d'hybridation de même composition, et addition de la séquence de 2,55 kb en tant que sonde, notamment marquée radioactivement1 et préalablement dénaturée par un traitement à 100-C pendant 5 minutes

- incubation dudit fragment d'acide nucléique fixé sur le support dans ce tampon d'incubation avec le fragment de 2,55 kb à 42C pendant une durée de 16 à 24 heures,

- l'élimination du tampon contenant la sonde non fixée, . soit par lavages successifs 1 x 50 ml de 5 x SSCr 0,1 % SDS à 42*C pendant 20 minutes et 2 x 50 ml de 2 x

SSC, 0,1 t. SDS pendant 2 x 20 minutes à 42 C, dans des conditions non stringentes, . soit par lavages successifs avec les solutions suivantes

1 x 50 ml, 5 x SSC, 50 % formamide, 20 minutes à 42"C

2 x 50 ml, 2 x SSC, 0,1 % SDS, 2 x 20 minutes à 42'C

1 x 50 ml, 0,2 x SSC, 0,1 \ SDS, 20 minutes à 42 C, dans des conditions stringentes.