FI112666B - Itiöimätön Bacillus subtilis, sen valmistus ja käyttö - Google Patents

Description

Λ Λ ~ ' f I I /.. 0 .;

Itiöimätön Bacillus subtilis, sen valmistus ja käyttö

Keksinnön ala

Keksintö koskee itiöimätöntä Bacillus subtilis-kantaa, menetelmää sen valmistamiseksi sekä sen käyttöä tuotanto-organismina. Lisäksi keksintö 5 koskee menetelmää biologisesti valmistettavan tuotteen valmistamiseksi itiöi-mättömällä bakteerilla.

Keksinnön tausta

Sac/7/us-suvun bakteereja käytetään runsaasti erilaisten teollisesti merkittävien entsyymien tuottajina. Merkittävimpiä tuottoisäntiä ovat B. amylo-10 liquefaciens- ja B. licheniformis-bakteerU, joita käytetään mm. proteaasien ja tärkkelystä hajottavien entsyymien tuottajina. Teollisissa prosesseissa syntyy merkittäviä määriä bakteerimassaa, joka täytyy inaktivoida ennen ympäristöön päästämistä, varsinkin, jos on kyseessä geneettisesti muokattu bakteeri. Itiöiksi muuttuneiden tuotantosolujen tuhoaminen vaatii kovempia käsittelyjä kuin 15 itiöttömien. Bacillus -bakteerien itiöt kestävät paremmin kuumuutta kuin vege-tatiiviset solut ja sen vuoksi kuumentamalla hävittäminen vaatii korkeita lämpötiloja ja pitkäaikaisia käsittelyjä. Tällaiset käsittelyt nostavat väistämättä tuotannon laite- ja käyttökustannuksia. Siksi onkin toivottavaa, että tuotantoon käytettävä Bacillus-kanta olisi itiöimätön. Esillä oleva keksintö tarjoaa itiöin-20 tiongelmaan ratkaisun, joka merkittävästi parantaa B. subtilis -bakteerin käyttöä tuotanto-organismina.

Itiöinti on monivaiheinen (l-VII) tapahtuma, joka käynnistyy tietyis-.' sä kasvatusolosuhteissa, jolloin emosolun sisälle syntyy ensin esi-itiö. Lopulta . :' emosolu kuolee ja valmis itiö vapautuu. Itiö kestää suurempaa kuivuutta ja ; : 25 kuumuutta kuin emosolu ja takaa näin bakteerin säilymisen epäedullisissa olo- : * : suhteissa. Sopivissa olosuhteissa itiö herää toimimaan ja bakteerisolun jakau- ,,, : tuminen alkaa uudestaan. Itiöinnin eri vaiheet on selvitetty itiöintiin vaikuttavien geenien mutaatioiden avulla ja itiöintiin vaikuttavia geenejä tunnetaan tällä ‘ · ‘ hetkellä yli 125 (Stragier ja Losick, 1996).

30 Proteiinin tuottoa itiöimättömällä Bacillus-bakteerilla on kuvattu ‘ : mm. julkaisussa WO97/03185, jossa ehdotetaan itiöinnin poistamista muta- toimalla itiöintigeenejä. Julkaisussa kuvataan itiöintigeenin spollAC deleetio Bacillus Ucheniformiksesta. Deleetio tehtiin käyttäen lämpötilaherkkää plasmi-dia, johon oli siirretty SOE-tekniikalla (splicing by overlap extension) koottu 35 PCR-tuote, jossa spollAC-geenin molemmilla puolilla olevat alueet oli liitetty . : . yhteen siten, että välissä oleva spollAC-geeni jäi pois. SOE-tekniikka on ku- 112666 2 vattu esim. US-patentissa 5,023,171. Plasmidin avulla tämä in vitro -deleetiorakenne saadaan bakteerisolun sisään ja nostamalla lämpötilaa voidaan estää vapaan plasmidin jakaantuminen ja saadaan esille ne rekombi-nanttibakteerit, joissa plasmidi on insertoitunut kromosomiin. Halutun geenin 5 deleetio tapahtuu, kun plasmidi irtoaa kromosomista tietyllä tavalla. Mainitussa WO-patenttijulkaisussa kuvatulla tekniikalla ei kuitenkaan onnistuttu poistamaan B. subtilis -bakteerin spollAC-geeriiä. Plasmidin irtoamisvaiheessa rekombinaatio tapahtui aina siten, että spo///\C-geeni jäi ennalleen.

Itiöimättömiä B. subtilis-kantoja on sen sijaan kuvattu muualla. EP 10 164 117 koskee B. subtilis-kantaa, jossa on mutaatio geenissä spollA, EP

492 274 koskee B. subf/7/s-kantaa, jossa on mutaatio geenissä spollD ja US 4 450 235 ja US 4 450 236 koskevat B. subtilis-kantaa, jossa on deleetio geenissä spoOA. Mainitut geenit liittyvät itiöintivaiheeseen II, tai sitä aikaisempiin itiöintivaiheisiin.

15 Seuraavan itiöintivaiheen (III) geeneistä tunnetaan mm. sigG- geeni (= spo///G-geeni), joka koodaa sigma-G -faktoria, joka sitoutuu RNA-polymeraasiin, joka puolestaan voi sitoutua tiettyjen itiöintigeenien promoottoriin esi-itiössä. Tämä sigma-G -faktori on välttämätön itiöinnin kolmannessa vaiheessa, ja sen tiedetään säätelevän ainakin 19 geenin transkriptiota (Ishii 20 et ai., 2001). Sigma-G -säätelysysteemiin liittyvien geenien tuotteet parantavat itiöiden henkiinjäämiskykyä ja uudelleen itämistä eli germinaatiota (Halden-: V wang, 1995).

Fougler ja Errington (1989) ovat kuvanneet B. subtilis 646 -·:*·: kannan, joka on spontaanisti syntynyt s/gG-mutantti. Mutaatiosta tiedetään 25 vain, että se on promoottorin ja 30 ensimmäisen kodonin ulkopuolella. Tämä

• I

tieto on saatu toimivasta spolllG-lacZ -fuusiosta, joka on siirretty kro-mosomiin. Tällaisten spontaanien tai aiheutettujen sattumanvaraisten mutant- • · tien tapauksissa, mutaation sijaintia tai tarkkaa vaikutustapaa ei yleensä tun-., . neta. Tällaisten kantojen takaisinmutaatiomahdollisuus eli itiöinnin palautumi- :30 nen ennalleen ei ole hallittavissa, ja lisäksi erilaisten suppressorimutaatioiden ' ‘ mahdollisuus on suuri. Kun ei tiedetä missä mutaatio on tapahtunut ei myös- : ’i : kään yleensä tiedetä syntyykö muuttunutta proteiinia. Lisäksi mutaatio toises- r" sa geenissä voi esimerkiksi suppressoida alkuperäisen mutaation vaikutuksen.

SigG-geeniä on myös pyritty inaktivoimaan mm. tekemällä insertioita. Esimer-35 kiksi tiling et ai. (1990) kloonasivat 320 emäsparin Hindlll-Pstl -palan sigG:stä : integraatioplasmidiin, ja he saivat integraation seurauksena itiöimättömän B.

3 112366 subtilis -kannan N15 (trpC2 spolllG::pSGMU422). Integraatioplasmidi kuitenkin irtosi kromosomista ilman selektiopainetta kloramfenikolilla, eikä tällainen kanta siksi sovellu tuotantoisännäksi.

Karmazyn-Campelli et ai. (1989) ovat kuvanneet s/gG-geenin 5 inaktivaation insertoimalla 1,5 kb kloramfenikoliresistenssikasetin (cat) kodoni-en 166 ja 167 väliin (spolllGv.cat). Tämä insertio on kuitenkin tehty sellaisella tavalla, että sigG-geeni on kokonaisuudessaan, vaikkakin katkaistuna, tallella kromosomissa. Näin ollen takaisinmutaatioriski on olemassa. Vaikka cat-insertiolla inaktivoitu kanta ei pysty rekombinoitumaan takaisin, niin deleetio 10 voisi palauttaa s/gG-geenin toiminnan ja kannan itiöinnin normaaliksi.

Karmazyn-Campelli et ai. (1989) ovat edelleen deletoineet palan SigG-geenistä, 70 emäsparia, kodonien 18 ja 42 välistä. Tämän deleetion (spolllGM) vaikutus itiöintiin jää kuitenkin epäselväksi, koska deleetiota toteutettaessa edellä mainittujen kodonien väliin tuli odottamatta ylimääräinen 18 15 emäsparin mittainen Haelll -pala kloonausvektorina käytetystä pUC8:sta. Tässä ylimääräisessä palassa on stop-kodoni heti alussa, joten ei voida olla varmoja, että 70 emäsparin deleetio olisi riittävä itiöinnin lopettamiseksi. Mikäli ylimääräistä palaa ei olisi, voisi kyseisen deleetion jälkeenkin syntyä ainakin osittain toimivaa sigma-faktoria, varsinkin kun deleetio ei kata alueita, joilla us-20 kotaan olevan merkitystä sitoutumisessa kohdepromoottoreihin. Toisin sanoen jäi epäselväksi johtuiko sigG-geenin inaktivaatio deleetiosta vai pelkästään ylimääräisestä stop-kodonista.

,, , Aikaisemmin julkaistuissa töissä on yleensä tutkittu itiöinnin eri • vaiheita ja tyydytty mutantteihin, joiden stabiilisuudelle ei ole asetettu suuria ..25 vaatimuksia. Näin ollen mikään esitetyistä S. subtilis-bakteerin s/gG-:": mutanteista ei sovellu tuotantokannaksi, jolta vaaditaan pysyvä eli palautuma- ton itiöimättömyys. Esillä oleva keksintö tarjoaakin nyt täysin itiöimättömän, stabiilin B. subtilis-kannan, joka soveltuu tuotantokannaksi. Itiöinti on lisäksi .···, onnistuttu poistamaan siten, ettei sillä ole epäsuotuisia vaikutuksia halutun • · 30 tuotteen tuottamiseen eikä tuotteen ominaisuuksiin.

Keksinnön lyhyt selostus

Keksintö kohdistuu itiöimättömään B. subf/7/s-kantaan, jolle on , tunnusomaista, että sen sigG-geenistä on deletoitu vähintään 150 nukleotidia.

J t Tässä esitetty uusi deleetio on ensimmäinen, jolla voidaan kiistatta osoittaa 35 juuri sigG-geenin deleetion vaikutus itiöinnin estämiseksi. Sitä paitsi geenide- ‘ ·; ‘ leetiossa on vaikeaa ennustaa, miten kyseinen deleetio vaikuttaa organismin 4 112,.66 muihin funktioihin tai ylipäätään sen elinkykyyn. Esillä olevassa keksinnössä voitiin kuitenkin todeta, että sigG-geenin deleetio ei vaikuttanut deletoidun bakteerin muihin oleellisiin toimintoihin, kuten sen kykyyn tuottaa rekombinanttipo-lypeptidiä.

5 Esillä oleva keksintö tarjoaa myös menetelmän itiöimättömän B.

subtilis-kannan valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että B. subtilis-kannan sigG-geenistä poistetaan vähintään 150 nukleotidia. Edelleen keksintö kohdistuu esitetyn itiöimättömän B. subtilis-kannan käyttöön tuotanto-organismina. Keksinnön piiriin kuuluu edelleen menetelmä biologisesti valmis-10 tettavan tuotteen valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että tuotetta valmistetaan keksinnön mukaisella itiöimättömällä B. subtilis-kannaWa.

Keksinnön edullisia suoritusmuotoja on esitetty epäitsenäisissä vaatimuksissa.

Kuvioiden lyhyt selostus 15 Kuva 1 esittää kaavakuvan sigG-geenin poistamisesta;

Kuva 2 esittää itiöimättömän B. subtilis-kannan RS303 deleetioalu-een nukleotidisekvenssin;

Kuva 3 esittää itiöivän (RS201) ja itiöimättömän (RS310) B. subtilis- kantojen kasvun (—) ja β-laktamaasin (BLP) tuoton (-) 100 ml:n ravistelu- 20 kasvatuksssa.

Keksinnön yksityiskohtainen selostus

Keksinnön mukainen B. subtilis on tehty itiöimättömäksi poistamalla . . . eli deletoimalla merkittävä osa sigG-geenistä, mikä tässä yhteydessä tarkoit- ' ; taa vähintään noin 150 ja edullisesti vähintään noin 300 nukleotidia. SigG- 25 geenissä on ainakin kaksi funktionaalista eli proteiinin toiminnalle tärkeää alu-’ ’ : että, joista toinen koodaa RNA-polymeraasin runko-osaan oletettavasti sitou- tuvaa domeenia, joka alkaa aminohaposta nro 67 ja päättyy aminohappoon -;>· 80. Tämä domeeni on määritetty rinnastamalla B. subtilis -bakteerin sigma - ,··, G-faktorin aminohapposekvenssi muiden tunnettujen sigmafaktorisekvenssien 30 kanssa. Toinen toiminnalle tärkeä alue on ns. H-T-H-motiivi (helix-turn-helix), joka esiintyy DNA.han sitoutuvissa proteiineissa, ja joka on myös määritetty samankaltaisuuteen perustuen ja kattaa SigG-proteiinin aminohapot 229-248. Deletoitava alue sijaitsee edullisesti SigG-proteiinin aminohappoja nro 67 ja , ·, 248 koodaavien nukleotidien välisellä alueella. Edullisemmin deleetio sijaitsee 35 niin, että se käsittää ainakin osan sigG-geenin jommastakummasta funktio-’ ; ’ naalisesta alueesta, jotka alueet koodaavat sigG-proteiinin aminohapot 67-80 112666 5 tai vastaavasti 229-248, ja erityisesti deleetio käsittää ainakin osan s/gG-geenin kummastakin mainituista funktionaalisista alueista. Vaihtoehtoisesti deleetio voi myös sijaita funktionaalisten alueiden välissä niin, että kumman tahansa funktionaalisen alueen esilletulo estyy ja/tai niiden natiivin sigma-G-5 faktorin kaltainen etäisyys toisistaan muuttuu niin, että sigma-G-faktorin sitoutuminen RNA-polymeraasiin ja DNA:han estyy. Erään suoritusmuodon mukaisesti sigG-geenistä deletoidaan vähintään 600 ja erityisesti vähintään 670 nukleotidia. Tarkoituksenmukaista on poistaa esimerkiksi nukleotidit 39 - 715. On myös mahdollista poistaa koko sigG-geeni ja sen lisäksi voidaan edelleen 10 poistaa kyseisen geenin promoottorialue.

SigG-geeni voidaan poistaa monella eri tavalla. Edullisesti valmistetaan ensin insertti SOE-tekniikalla (gene splicing by overlap extension), mikä tarkoittaa sitä, että inserttiin tarvittavat nukleotidifragmentit ensin monistetaan PCR-reaktiolla, jonka alukkeet on suunniteltu siten, että PCR-reaktiossa mo-15 nistetut fragmentit voidaan liittää yhteen toisella PCR-reaktiolla komplementaarisen sekvenssin eli overlap-alueen avulla. Tarkoituksenmukainen insertti sisältää deletoitavan geenin reuna-alueet sekä ainakin yhden selektiomarkke-rigeenin. Reuna-alueella tarkoitetaan tässä yhteydessä deletoitavasta geeni-alueesta ylä- ja alavirtaan olevat viereiset alueet, joita ei poisteta. Selek-20 tiomarkkerigeeni on geeni, joka koodaa mitä tahansa selektoitavissa olevaa ominaisuutta, kuten esim. entsyymiä, joka liittyy tietyn metaboliitin tai antibioottiresistenssin muodostumiseen.

,. . Valmistettava insertti voi olla joko plasmidi tai mieluummin lineaari- • ;* nen DNA, jolloin selektiomarkkerigeeni sijaitsee reuna-alueiden välissä. Tällä •. : 25 insertillä eli ’’vaihtokasetilla”, jonka päät ovat homologisia deletoitavan geenin :“· reuna-alueille, transformoidaan sitten B. subtilis. Kahden yhtäaikaisen homo- logisten alueiden välisen tekijäinvaihduntatapahtuman seurauksena insertti in-tegroituu bakteerin kromosomiin poistettavan sigG-geenin paikalle. Tällaisen ,*·*. homologisen kaksoisrekombinaation avulla suoritettava deleetio on kuvattu 30 esim. US-patentissa 4 963 487. Poistuvan s/'gG-geenialueen tilalle asettuu siis selektiomarkkerigeeni. Halutut transformantit, joista sigG-geeni on deletoitu voidaan sitten seuloa altistamalla bakteerit selektiomarkkerigeenin määrää-, · mälle selektiopaineelle. Keksinnön mukaiset itiöimättömät bakteerit ovat stabii- , , leja eivätkä pysty palauttamaan itiöintikykyään edes siinä tapauksessa, että 35 insertoitu selektiomarkkerigeeni deletoituisikin kromosomista.

112666 6

Edellä kuvattu s/gG-geenin deleetio on tarkemmin esitetty kuvassa 1, jota tässä nyt selostetaan lähemmin. Kolme DNA-tuotetta AB, CD ja EF valmistetaan PCR-reaktiolla käyttäen vastaavasti alukkeita A ja B, C ja D sekä E ja F. Tuotteet AB ja EF valmistetaan B. si/M//'s-bakteerin kromosomaalises-5 ta DNA:sta ja tuote CD esimerkiksi sopivasta plasmidista. AB käsittää sigG-geenistä ylävirtaan olevan reuna-alueen (loppuosa spollGA:sta ja sigE) ja EF käsittää s/gG-geenistä alavirtaan olevan reuna-alueen (alkuosan ylmA\sta). Tuote CD käsittää selektiomarkkerigeenin, joka tässä tapauksessa on kloram-fenikoliresistenssigeeni (cat), joka on saatavissa mm. plasmidista pHV14 (Ehr-10 lich, 1978) tai pC194 (Horinouchi ja Weisblum, 1982). PCRissä käytettävät alukkeet ovat sellaiset, että saadut PCR-tuotteet AB, CD ja EF, voidaan liittää toisiinsa osittain päällekkäisten komplementaaristen sekvenssien (overlap) avulla. Näin ollen alukkeet B ja C sekä vastaavasti alukkeet D ja E ovat osittain komplementaarisia. Kolme PCR-tuotetta voidaan liittää toisiinsa kahdessa 15 vaiheessa. Kuvan 1 mukaan yhdistetään ensin AB+CD ja CD+EF, minkä jälkeen saadut PCR-tuotteet AD ja CF liitetään yhteen käyttäen hyväksi tuotteiden CD mittaista homologista aluetta halutun insertin AF saamiseksi, joka siis sisältää (5’ -» 3’ järjestyksessä) sigG-geenin reuna-alueen (mm. sigE), kloram-fenikoliresistenssigeenin (cat) ja sigG-geenin toisen reuna-alueen (ylmA:n al-20 kuosan). Vastaavaa inserttiä voidaan vaihtoehtoisesti rakentaa valmistamalla ensin esim. AD ja yhdistämällä se tuotteeseen EF, tai valmistamalla ensin CF ja yhdistämällä se tuotteeseen AB. Saadulla insertillä AF transformoidaan sit-; ·_ ten S. subtilis bakteerit ja halutut transformantit seulotaan kloramfenikolin läs- * ; näollessa.

• ·: 25 Edellä kuvatut alukkeet voidaan vielä suunnitella niin, että ylävirtaan ’ ’ · selektiomarkkerigeenistä oleva overlap-alue on homologinen alavirtaan selek- tiomarkkerigeenistä olevan overlap-alueen kanssa. Tämä mahdollistaa inser-;·'· toituneen cat-geenin poistamisen myöhemmin deleetioalueelta. Cat-geenin

.···. poistaminen voi tapahtua siten, että PCR-reaktiolla liitetään tuotteet AB ja EF

30 ovarlap-alueen avulla tuotteeksi ABEF, jolla sitten transformoidaan edellä saatu SigG", Cat+ transformantti cat-geenin poistamiseksi transformantista. Maini-·* tut homologiset overlap-alueet mahdollistavat myös cat-geenin poiston homo- logisella rekombinaatiolla sekvenssissä esiintyvän toistuvan overlap-alueen , ; , avulla.

‘ , 35 SOE-tekniikassa käytettävien alukkeiden suunnittelussa noudate- ; ’ taan yleisiä sääntöjä, joista esimerkiksi Sambrook ja Russell (2001) ovat teh- 112666 7 neet yhteenvedon. Erityisesti on huomioitava, että DNA-palojen yhteenliittämi-seksi overlap-alueiden tulisi olla vähintään 20-25 nukleotidia pitkiä, jotta PCR:ssä voisi käyttää riittävän korkeita annealing -lämpötiloja spesifiteetin varmistamiseksi (McPherson ja Möller, 2000). Lyhyempiä overlap -alueita, 5 noin 15 nukleotidia, voidaan käyttää, jos templaattina käytetään kromosomaa-lisen DNA:n sijasta vähemmän kompleksista DNA:ta, esimerkiksi plasmidia. Käytettäessä synteettisiä alukkeita niiden pituuden yläraja voisi olla nykyisen tekniikan tasolla noin 100 nukleotidia. Alukkeina voi käyttää myös yksijuostei-seksi denaturoituja DNA-paloja, jotka on tehty PCR.IIä tai pilkottu restriktioent-10 syymeillä tai mekaanisesti suurimolekyylisestä DNA:sta, jolloin alukkeiden pituuden ylärajaa ei voi määritellä tarkasti, vaan se voi olla jopa useita kymmeniä tuhansia nukleotideja. Deleetioon käytettävien DNA-palojen yhteenliittämisen onnistumiseen vaikuttaa myös PCR-tuotteiden puhtaus. Esimerkiksi, kun halutaan deletoida geeni, tai sen osa, on tärkeää, että lopullisen SOE-tuotteen 15 PCR-reaktiossa ei ole enää mukana alussa käytettyä templaattia, jossa on täydellinen geeni tallella.

B. subtilis -bakteerissa rekombinaatio kromosomin ja plasmidissa olevan homologisen DNA-alueen kesken on tehokasta. On esitetty, että 150 emäsparia homologista DNA:ta plasmidissa, joka ei replikoidu B. subtilis -20 bakteerissa riittää integraatioon (Ferrari ja Hoch, 1989). Khasanov et ai. (1992) käyttivät lämpöherkän replikonin omaavaa plasmidia ja osoittivat, että 70 nukleotidia riitti homologisen rekombinaation avulla tapahtuvaan integraatioon. . Edellä mainitut plasmidit integroituivat kromosomiin yhden tekijäinvaihtotapah- ' ; tuman avulla toisin kuin lineaarinen DNA, jonka integraatio edellyttää, että ·' 25 homologinen rekombinaatio tapahtuu yhtäaikaa kahdesta kohdasta. Trans- : *' formoitaessa lineaarisella SOE-tekniikalla tehdyllä DNA:lla kannattaa käyttää 1 | pitempiä kuin 70-150 nukleotidin mittaisia homologisia alueita, jotta nykyteknii- •: · · · kan tason transformaatiomenetelmillä voitaisiin havaita SOE-palan integraatio .···, kromosomiin. Edullisesti lineaarisen DNA-insertin deletoitavan geenin reuna- 30 alueen kanssa homologinen alue käsittää kukin vähintään useita satoja emäs-paria tai vähintään jopa tuhat emäsparia.

Homologisen alueen pituuden yläraja määräytyy lähinnä PCR:ssä ,,,: käytetyn DNA-polymeraasin ominaisuuksista. Nykyisillä PCR-entsyymeillä pys- : . tytään amplifioimaan useiden kymmenien kiloemäsparin mittaisia DNA-paloja, 35 mutta samalla mutaatioiden todennäköisyys syntyneissä DNA-paloissa kas-vaa. Käytännöllinen yläraja homologisen alueen pituudelle on kuitenkin oletet- 112666 8 tavasti noin 5 kiloemästä (kb). Erityisen suositeltavaa on, että lineaarisen DNA-insertin deletoitavasta alueesta ylävirtaan oleva reuna-alue, selek-tiomarkkerigeeni ja deletoitavasta alueesta alavirtaan oleva reuna-alue ovat kaikki keskenään oleellisesti saman pituiset. Kaikkein edullisimmin homologi-5 nen alue on kukin noin 1 kb:n pituinen ja koko lineaarisen insertin pituus on erityisesti noin 3 kb.

Geenin deleetio voidaan toteuttaa myös kaksivaiheisen homologisen rekombinaation avulla. Menetelmä on kuvattu Lactococcus lactis -bakteerilla (Biswas et ai., 1993) ja samalla menetelmällä on deletoitu B. 10 licheniformis -bakteerin spollAC -geeni (WO 97/03185). Molemmissa tapauksissa hyödynnetään plasmidia, jonka replikaatio on lämmölle herkkä ja jossa on antibioottiresistenssimarkkeri. B. subf/7/s-bakteerille sopivaan plasmidiin esim. pE194:ään siirretään ensin deletoitavan alueen reuna-alueet peräkkäin samansuuntaisesti. Plasmidi transformoidaan kompetenttiin bakteeriin repli-15 kaation sallivassa 32°C lämpötilassa ja saatuja transformantteja kasvatetaan 45°C:ssa, jolloin vain ne bakteerit, joissa integraatio kromosomiin on tapahtunut pystyvät kasvamaan kloramfenikolialustalla. Integraation seurauksena kromosomiin muodostuu kaksi paria homologisia alueita, joiden välillä voi tapahtua toinen rekombinaatio, kun transformantteja kasvatetaan ilman kloram-20 fenikolia 32°C:ssa. Rekombinaatio toisen homologisen parin kesken johtaa sekä plasmidin irtoamiseen, että plasmidissa olleiden homologisten alueiden välisen alueen deleetioon kromosomissa. Käytettävien homologisten alueiden ; pituus voi olla 70 - 2500 emäsparia. Kuvatulla tavalla voi tehdä deleetioita ’ ' useita kertoja peräkkäin samaan kantaan, koska kromosomiin ei jää mitään * I · ·”·' 25 ylimääräistä, kuten antiboottiselektiomarkkeria.

: Edelleen haluttu deleetio voidaan tehdä plasmidissa olevan kahden homologisen alueen avulla. Tällöin deleetiorakennelma, joka käsittää deleetion ·;··· molemminpuoliset reuna-alueet ja selektiomarkkerin niiden keskellä, voidaan .··*, siirtää plasmidiin, joka ei replikoidu B. subtilis -bakteerissa (esim. pJH101) tai 30 jonka replikaatio riippuu lämpötilasta (pE194). Saatu plasmidi transformoidaan kompetenttiin bakteeriin ja seulotaan resistenttejä transformantteja. Näissä menetelmissä täytyy yleensä käyttää kahta selektiomarkkeria, joiden avulla voidaan erottaa transformantit, joissa rekombinaatio on tapahtunut vain toisen homologisen alueen eikä molempien kautta.

35 Itiöimätön S. subtilis-bakteeri, josta sigG-geeni on oleellisesti pois- : * ’ tettu, soveltuu erilaisten biologisesti valmistettavien tuotteiden tuotantokan- • t 112666 9 naksi. Biologisesti valmistettava tuote tarkoittaa yhdistettä, jota organismi pystyy muodostamaan. Yleensä se on jokin biologisesti aktiivinen yhdiste. Edullisesti tämä tuote on solun ulkopuolelle erittyvä tuote. Kyseinen tuote voi olla joko bakteerin luonnostaan tuottama tuote tai geeniteknisen muokkauksen seu-5 rauksena muodostuva tuote. Geenitekniikalla voidaan myös muokata aineen-vaihduntareittejä tai siirtää bakteeriin uusia entsyymejä, joilla saadaan kertymään jo olemassa olevia tai kokonaan uusia metaboliitteja sellaisia määriä, että niiden eristäminen kannattaa.

Valmistettavat tuotteet voivat olla esimerkiksi polypeptidejä, jotka 10 voivat olla lääkinnälliseen käyttöön tarkoitettuja polypeptidejä, esimerkiksi bakteeriperäiset β-laktamaasit, nisäkkäistä peräisin olevat välittäjäaineet kuten esimerkiksi peptidihormonit ja interferonit. Itiöimätön bakteeri soveltuu myös teollisesti merkittävien entsyymien tuotantoisännäksi, joita entsyymejä voivat olla esimerkiksi proteaasit, amylaasit, pullulanaasit, ksylanaasit, pektinaasit, β-15 laktamaasit, ksyloosi-isomeraasit ja beta-glukanaasit. Lisäksi voidaan tuottaa sokereita, nukleosideja, happoja, vitamiineja, aminohappoja ja surfaktiineja eli pintajännitystä alentavia lipopeptidejä tai rhamnoosilipidejä.

Erään suoritusmuodon mukaan itiöimättömään B. subtilis-kantaan siirretään haluttua polypeptidiä, esim. beta-laktamaasia, koodaavaa DNA.ta, 20 joka saatetaan ilmentymään solussa ja muodostunut rekombinanttipolypeptidi otetaan talteen solusta tai kasvatusalustasta. Halutun polypeptidin tai metabol-litin ilmentämiseksi tarvittavan DNA:n siirto voidaan suorittaa tekniikalla, joka . f voi olla esimerkiksi transformaatio luonnoisen kompentenssin avulla tai elek- ‘ : torporaatiolla, tai millä tahansa B. subtilis-bakteerille sopivalla tekniikalla.

25 Esimerkki ": Bakteerikannat ja plasmidit

Työssä käytettyjen bakteerikantojen ja plasmidien ominaisuudet -••f on lueteltuna taulukossa 1. Isäntäorganismin B. subtilis 168 s/grG-geenin, ja ,··, sen reuna-alueiden sekvenssi saatiin datapankista (Micado database, » · 30 http://locus/jouy.inra.fr). Caf-geeniä koodaava alue on peräisin plasmidista pSJ2739E ja se on sama kuin Staphylococcus aureus-bakteerin plasmidissa .* pC194 (GenBank accession no. V01277). Tuotantovektori pRSHIO on plas- ,: midi, joka koodaa Bacillus licheniformisln β-laktamaasia pen P. Siinä pen P on liitetty eritysvektoriin pKTH141 (Lundström, 1985) Hind\\\ -kloonauskohtiin. 35 Vektorin a-amylaasi promoottori ja signaalisekvenssiä koodaava fragmentti on peräisin bakteerista Bacillus amyloliquefaciens.

10 112 '66

Taulukko 1. Bakteerikannat ja plasmidit KAN- DELEETIO- OMINAI- SELEKTIO- PLASMIDI SELEK-

TA_ALUE SUUDET MARKKERI__TIO

168 B. subtilis 168 __villikanta3____ RS303 SigG_itiöimätön__cat__Cm RS310 SigG_itiöimätön__cat_pRSHIO Cm, Km RS201 B. subtilis 168 pRSHIO Km ^=====_villikanta3__________________ aRef. Kunst, F. et ai., 1997 5

Kasvuolosuhteet

Bakteerikannat kasvatettiin Luria Broth (LB) alustalla (Harwood ja Cutting, 1991), 5 g/l hiivauutetta (Difco), 10 g/l tryptonia (Oxoid) ja 10 g/l NaCI (Merck), ravistelukasvatuksessa, +37°C, 250 rpm. Seurattaessa proteiinin 10 tuottoa soluja kasvatettiin konsentroidussa LB-alustassa (10 g/l hiivauutetta, 20 g/l tryptonia sekä 10 g/l NaCI). Selektiona bakteerikasvatuksissa käytettiin kloramfenikolia (Cm) 5 pg/ml ja kanamysiinia (Km) 10 pg/ml.

DNA-tekniikat • t **· DNA-työt tehtiin tavanomaisia menetelmiä käyttäen (Sambrook et

* t f I

15 ai., 1989). Kromosomaalinen DNA eristettiin Marmur’in (1961) ohjeen mukaan.

: Plasmidi-DNA eristettiin bakteerisoluista ioninvaihtopylväällä (QIAGEN Plas- ' mid Midi Kit) valmistajan ohjeen mukaan (Qiagen Plasmid Purification Hand- > * ,., book July/1999). Ohjeista poikettiin lisäämällä peptidoglukaanikerroksen ha- joittamiseksi protokollaan lysotsyymikäsittely, jossa puskuriin P1 lisättiin lysot-20 syymiä 1 mg/ml, ja soluja inkuboitiin puskurissa +37°C 30 min. Puhdistettu .·’ plasmidi liuotettiin 30-100 pl steriloitua vettä. DNA-pitoisuus plasmidipreparaa-

< I I

,,,: teissä oli 50-500 ng/pl.

Itiöinnin testaus , · , SigG:n deleetion vaikutus itiöintiin testattiin kasvattamalla baktee- 25 risoluja itiöintimediumissa, ja antamalla soluille lämpökäsittely (+85°C, 10 V · min) (Harwood ja Cutting, 1991). Käytetty käsittely tappaa vegetatiiviset solut, muttei riitä tappamaan itiöitä. Kuumennuksen jälkeen kasvaneiden pesäkkeiden määrä kuvastaa itiöiden määrää.

11 112066

Logaritmisen vaiheen bakteerisoluja siirrostettiin 1:100 itiöintime-diumiin (Schaeffer’s sporulation Medium, SS: 8 g nutrient broth, 1 g KCI, 0,12 g MgS04x7H20, 0,5 ml 1M NaOH, 1 ml Ca(N03)2 x4H20, 1 ml 0,01 M MnCI2x4H20, 1 ml 0,0001 M FeS04 x7H20), ja kasvatettiin 24 h (+37°C, 250 5 rpm). Solutiheyden laskemiseksi bakteerikasvustosta tehtiin laimennossarja (10'1-10‘9) laimennospuskuriin (5 ml 0,1 M K-fosfaattipuskuria, pH 7,4, 2,5 ml 1 M KCI -liuosta, 5 ml 10 mM MgS04 -liuosta, 37,5 ml steriloitua vettä), ja laimennoksia 10'5-10'9maljattiin LB-maljoille (100 μΙ/malja). Maljoja inkuboitiin yli yön + 37°C lämpöhuoneessa, ja maljoilla kasvaneiden pesäkkeiden määrä 10 laskettiin, ja ilmoitettiin pesäkkeiden määrä millilitrassa.

Itiöiden määrittämiseksi soluille annettiin lämpökäsittely. Soluja kuumennettiin 10 min +85°C:ssa lämpöhauteessa. Lämpökäsittelyn jälkeen soluja maljattiin LB-maljoille. Maljoja inkuboitiin 17 h +37°C:ssa. Maljoilla kasvaneiden pesäkkeiden määrä laskettiin (pesäkkeiden määrä/ml). Itiöintikokeis-15 sa konrollikantana käytettiin villikantaa 168, jota käsiteltiin vastaavasti kuin testattuja kantoja.

S/gG-geenin deleetion valmistaminen

SigG-geenin deleetio toteutettiin transformoimalla villikanta B. subti-lis 168 lineaarisella rekombinantti-DNA-fragmentilla, joka oli rakennettu PCR:n 20 avulla SOE-tekniikkaa apuna käyttäen (Horton et ai,, 1989 sekä US 5 023 171). Kaavakuva suoritetusta deleetiosta on esitetty kuvassa 1. PCR-reaktioiden alukkeet oli suunniteltu siten, että PCR-tuotteet voitiin liittää toisella PCR-reaktiolla komplementaarisen sekvenssin avulla. Taulukossa 2 on luetel- ' ; tuna PCR-reaktioissa käytetyt alukkeet. Taulukossa alukkeissa keskenään ϊ * * 25 komplementaariset alueet on merkitty lihavoimalla ja alleviivauksella. Aluk-keissa käytetty komplementaarinen alue on 20 nukleotidin alue, joka alkaa •'/.f s/gG-geenin 19 nukleotidista. Aluke B koodaa tätä aluetta s/gG-geenin aloitus- • i * | kodonista alkaen. Alukkeet B ja D sekä vastaavasti C ja E ovat osittain homo- * *. logiset.

30 i t * 12 112066

Taulukko 2. SOE-reaktioissa käytetyt alukkeet A 5'CCGGAATTCGCTGTCGGCAGATGGAGAG3' (Sek. n:o. 1) B 5'GTATCCACCCCGCAGATTTCGACTTTATTTCTCGACAC3’ (Sek. n:o. 2) 5 C 5'GAAATCTGCGGGGTGGATACCCGGCAATAGTTACCCTT3' (Sek. n:o 3) D 5'GT AT CC ACCCCGC AG ATTT CCCTT CTT C AACTAACGGG3' (Sek. n:o 4) E 5'GAAATCTGCGGGGTGGATACCTCAAGCGCAGGTGTCCA3'(Sek. n:o 5) F 5'CCGGAATTCGCACCCCTAGGATGAATCT3' (Sek. n:o 6) 10 PCR-reaktioseoksessa (100 μΙ) käytettiin templaattna DNA:ta 20-50 ng, kutakin aluketta 30 pmol, 0,2 mM dNTP (Boehringer Mannheim GmbH, Saksa), 0,5 μΙ Expand entsyymiä (Boehringer Mannheim GmbH, Saksa) sekä 10 μΙ 10xExpand puskuria. Reaktioseoksen päälle pipetoitiin 50 μΙ mineraaliöljyä ja reaktiot tehtiin PTC-100 Programmable Thermal Controller -laitteella (MJ 15 Research, Inc.). PCR-reaktiot tehtiin seuraavalla perusohjelmalla, joka koostui denaturaatiovaiheesta (94°C, 4min) sekä sitä seuraavista kahdesta syklistä (94°C, Imin; 50°C, 45 s; 72°C, 4 min) sekä 25 syklistä (94°C, Imin; 70°C, 45 s; 72°C, 4 min), joita seurasi 10 min inkubaatio 72°C:ssa. Alukkeiden pariutu-mislämpötiloja optimoitiin kullekin reaktiolle sopivaksi. PCR-reaktioiden loppu-20 tuotteet on puhdistettu reaktioseoksesta (Qiagen Giaquick PCR purification kit, Qiagen Gmbh, Saksa) valmistajan ohjeen mukaan (QIAquick Spin Hand-book/April 2000) ja eluoitu veteen (50 μΙ). Puhdistetun tuotteen DNA-. ·. loppukonsentraatio oli 30-50 ng/μΙ. PCR-reaktion lopputuotteet on analysoitu 1 % agaroosigeelielektroforeesilla.

25 SigG-geenin deleetion valmistamisessa ensimmäisessä vaiheessa valmistettiin PCR:llä sigG:n reuna-alueita koodaavat tuotteet AB (1047 nukleo-, 1 tidia, nt) sekä EF (1069 nt), vastaavasti alukkeilla A ja B sekä E ja F. PCR- ; 1 reaktioissa käytettiin templaattina 20 ng puhdistettua villikannan 168 kro- ·, mosomaalista DNA:ta. Caf-geeniä koodaavan 1054 nukleotidin pituinen alue 30 CD monistettiin alukkeiden C ja D avulla. PCR-reaktiossa templaattina käytet-, . tiin 50 ng puhdistettua plasmidia pSJ2739E, johon caf-geeni oli siirretty ·’ pHV14:stä. Tässä keksinnössä käytetty pSJ2739E:stä amplifioitu PCR-tuote ,.: sisältää saman alueen caf-geenistä ja sen ympäristöstä kuin mitä on kuvattu sekvenssissä V01277 (GenBank), alkaen nukleotidista 973 ja päättyen nukleo-λ. 35 tidiin 1985. Tuotteet AB ja CD monistettiin perusohjelmalla. Reaktion EF tapa- ' ·; uksessa perusohjelman pariutumislämpötilaa alennettiin 45°C:eeksi.

» i I

1 » » i 13 112566

Seuraavissa vaiheissa valmistettiin 2,1 kiloemäksen pituiset PCR-tuotteet AD (2081 nt) sekä CF (2103 nt) kahdella eri reaktiolla. Reaktioseok-sesta puhdistetut PCR-tuotteet toimivat templaattina SOE-reaktioissa. PCR-tuotteet AB sekä CD liitettiin yhteen 20 nt pituisen komplementaarisen alueen 5 avulla. Reaktioseos sisälsi noin 30 ng molempia lopputuotteita, ja PCR-reaktio suoritettiin alukkeilla A ja D perusohjelman mukaisesti. Toisessa SOE-reaktiossa CD ja EF liitettiin yhteen komplementaarisen alueen avulla tuotteeksi CF. Tässä reaktioseoksessa molempia tuotteita CD ja EF oli templaattina noin 30 ng, sekä 30 pmol alukkeita C ja F. Tässä reaktiossa perusohjelman 10 25 sykliä suoritettiin eri olosuhteissa (94°C, Imin; 76°C, 45 s; 72°C, 4 min).

Rekombinantti-DNA AF (3130 nt) valmistettiin lopputuotteista AD ja CF, jotka liitettiin yhteen käyttäen hyväksi tuotteen CD mittaista cat-geeniä koodaava aluetta. Tämä 1 kiloemäksen pituinen alue on komplementaarinen tuotteissa AD ja CF. PCR-reaktiota varten valmistettiin reaktioseos, joka sisälsi 15 noin 100 ng yllä kuvattujen PCR-reaktioiden reaktioseoksesta puhdistettuja lopputuotteita AD ja CF, sekä 30 pmol alukkeita A ja F. Tuotetta AF monistettiin perusohjelmalla.

SigG-geenin deleetio valmistettiin transformoimalla villikannan kompetentit solut lineaarisella rekombinantti-DNA:lla AF. Kompetenttien solu- 20 jen valmistus (Gryczan et ai., 1978) aloitettiin suspendoimalla B. subtilis 168 soluja maljalta 600 pl:aan GMI-alustaa (modifioitu minimaalialusta: 0,5 ml 20 % glukoosia, 0,1 ml 10 % kasaminohappoja, 0,12 ml 10 % hiivauutetta, 2,0 ;ml 500 pg/ml tryptonia, 0,03 ml 1 M MgCI2, 17,25 ml SMS (Spizizen Minimal • *

Salts)), jolla siirrostettiin 10 ml GMI-alustaa niin, että optinen tiheys (Klett-’· * 25 Summerson-fotometri) oli noin 30. Soluja inkuboitiin ravistelukasvatuksessa * : aikaiseen stationäärivaiheeseen (37°C, 250 rpm). Kasvatus siirrettiin 100 : ml:aan minimaalialustaa GMII (modifioitu minimaalialusta: 0,5 ml 20 % glu- ;·'· koosia, 0,1 ml 10 % kasaminohappoja, 0,12 ml 10 % hiivauutetta, 1,875 ml 200 mM Ca(N03)2, 143,1 ml SMS), jota kasvatettiin samoissa olosuhteissa 90 30 minuuttia. Solut fuugattiin (7000xg, 5 min) ja suspendoitiin 7 mkaan superna-tanttia.

Villikannan B. subtilis 168 kompetentit solut transformoitiin lineaari-: sella PCR-tuotteella AF. PCR-reaktion tuotetta käytettiin transformaatioon 10 , μΙ (DNA>2 pg). Transformaatiossa 500 pl transformaatioliuosta (Gryczan et ai., 35 1 978) lisättiin 10 μΙ rekombinantti-DNA:ta AF sekä caf-geenin indusointiin ;' kloramfenikolia 0,05 pg/ml. Soluja inkuboitiin +37°C, 30 min (180 rpm), ja solut 14 112ύ66 maljattiin LB -maljoille, joissa selektiona oli 5pg/ml kloramfenikolia. Transformaatiossa saatiin kolme transformaatiopesäkettä. Itiöimätön s/gG-deletoitu kanta on nimetty kannaksi RS303.

S/gG-geenideleetion konstruktion tarkistus sekvensoinnilla 5 Deleetioalueen stabiilisuus varmistettiin sekvensoimalla bakteerin kromosomaalinen DNA deleetioalueelta sekä sen reuna-alueilta. Kro-mosomaalisesta DNA:sta valmistettiin PCR-tuotteet, jotka sekvensoitiin. Kylmäkuivatut alukkeet (Amersham Pharmacia Biotech) liuotettiin 100 μΙ-.aan vettä, ja PCR-reaktioita varten alukkeista valmistettiin 3 μΜ (3 pmol/μΙ) laimennos.

10 Sekvensointia varten alukkeista valmistettiin 5μΜ (5 pmol/μΙ) laimennos.

Itiöimättömien kantojen RS303 ja RS310 deleetioalueen stabii-lisuuden varmistaminen

Alla on esitetty alukkeet, joilla valmistettiin deleetioalueen sekven-soimiseksi tarvittavat PCR-reaktiot kantojen RS303 ja RS310 kromosomaali-15 sesta DNA:sta. Alukkeiden sijainti sekvenssissä selviää kuvasta 2.

SQ1-F 5TGCGTTAAACCGGATCACGT3' SQ2-R 5TGCACTGCACTCAGACCGA3' SQ3-F 5 ' GT AG CGGATAT G AT GGGGA3' SQ4-R 5'CCTGCTGTAATAATGGGTAGA3’ 20 SQ5-F 5'CATGGACTTCATTTACTGGG3 SQ6-F 5 ' GGTATCCTAGTTCGTACAAAG3 ' SQ7-R 5'GGAGT CCGAT GTACT CCGC3'

Itiöimättömien kantojen RS303 ja RS310 s/gG-deleetioalueen sek- t ; venssin stabiilisuus varmistettiin sekvensoimalla kolme alukkeiila SQ1-F- 25 SQ7-R monistettua PCR-tuotetta: SRS12, SRS34 sekä SRS567. Alla olevas-: sa taulukossa on PCR-tuotteiden koko sekä alukkeet, joilla PCR-reaktiot on sekvensoitu.

• » » » - ·, Sekvensoitava Koko (bp) Alukkeet Sekvensoitu * tuote alukkeella

SRS12 1024 SQ1-F/SQ2-R SQ1 -F/SQ2-R

SRS34 1070 SQ3-F/SQ4-R SQ3-F/SQ4-R

SRS567 1450 SQ5-F/SQ7-R SQ5-F/SQ6-F/SQ7-R

30 PCR-tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla (1% geeli).

Tuote SRS 12 puhdistettiin reaktioseoksesta (Qiagen Giaquick PCR purificati- 112666 15 on kit, Qiagen Gmbh, Germany) valmistajan ohjeen mukaan (QIAquick Spin Handbook/April 2000) ja eluoitiin veteen (50 μΙ). Tuotteet SRS34 ja SRS567 eristettiin agaroosigeeliltä tuotteessa olevien epäpuhtauksien takia. Geeliltä puhdistaminen suoritettiin kaupallisella pylväällä (Qiagen Gel Extraction kit) 5 valmistajan ohjeen mukaan (QIAquick Spin Handbook/April 2000), ja eluoitiin veteen (50 μΙ). Puhdistetun tuotteen DNA-loppukonsentraatio oli 30-50 ng/μΙ.

Itiöimättömien kantojen RS303 ja RS310 deleetioalueen nukleoti-disekvenssi on sek. n:o 9. Myös kuvassa 2 on esitetty itiöimättömän S. subtilis -kannan sekvenssi sigG-geenin alueelta. Kromosomista deletoitu alue vastaa 10 villikannan 168 sekvenssissä aluetta 1605063-1605739 (Micado database, http://locus.jouy.inra.fr). SigG-geenin koodaavan alueen 780 nukleotidista on deleetiolla poistettu 677 nukleotidia. Deleetioalueelle insertoitu caf-geenin sisältävä alue (korostettu harmaalla) vastaa nukleotideja 973-1985 plasmidin pC194 sekvenssissä (Genbank acc. no.V01277). Deleetion toteuttamiseksi 15 tehty SOE-pala sisälsi caf-alueen reunoilla 21 emäsparin mittaisen toistuvan sekvenssin (vahvennettu). Sekvensoitu alue alkaa nukleotidista 1603961 (4-)ja viimeinen sekvensoitu nukleotidi on 1606851( t ). RS303-kannan sekvensointiin käytettiin alukkeita SQ1-SQ7. Näillä alukkeilla valmistettiin PCR-tuotteet, jotka sekvensoitiin samoilla alukkeilla. PCR-tuotteiden monistamisessa käytet-20 tyjä alukkeita vastaava (F-alukkeet) tai komplementaarinen (R-alukkeet) sekvenssi on alleviivattu. SOE-reaktioissa käytetyt alukkeet A-F on merkitty rivin päällä olevin katkoviivoin. SigG- ja caf-geenin aloituskodonit on kursivoitu, sigG-geenin lopetuskodoni (*END) ja caf-geenin lopetuskodoni (*).Yksittäiset

* I

' ; nukleotidit, jotka eroavat geenipankin sekvensseistä on kaksoisalleviivattu. De- 25 leetion jälkeen sigG-geenistä on jäljellä alusta 38 nukleotidia ja lopusta 65 ’ nukleotidia. Insertoidun caf-geenin jälkeen toistuu 21 nukleotidin mittainen * · :, ’ · · overlap -alue, jossa on sama sekvenssi kuin s/gG-geenin alussa.

*: * * · Sekvensoinnissa löytyi eroja B. subtiliksen julkaistuun sekvenssiin .···. (Kunst et ai., 1997). Samat sekvenssierot saatiin, kun sekvensoitiin villikannan 30 168 kromosomista s/gG-geenin reuna-alueet. Eroavaisuudet sekvenssissä on ,, , merkittynä deleetioalueen sekvenssiin kuvassa 2 Integraatiossa käytetyt ho- • * ; ·’ mologiset alueet olivat kuitenkin identtiset villikannan B. subtilis 168 sekvenssi- ,tulosten kanssa.

* * t

' I

I · 112666 16 S/gG-geenideleetion vaikutus itiöimiseen S/gG:n deleetion vaikutus itiöintiin testattiin kasvattamalla sigG de-letoitua B. subtilis kantaa RS303 itiöintimediumissa, ja antamalla vegetatiivi-sille soluille lämpökäsittely +85°C:ssa. Deleetion stabiilisuutta haluttiin seura-5 ta kasvattamalla RS303 selektiopaineen alla (kloramfenikoli 5 pg/ml SS-liemessä) sekä ilman selektiota. Lämpökäsittelyn jälkeen soluja maljattiin LB-maljoille. Kontrollikantana käytettiin villikantaa 168, jota käsiteltiin vastaavasti. Villikannan 168 kasvatusliemessä oli 2,1x108 itiötä millilitrassa. RS303 ei tuottanut yhtään itiötä (taulukko 3). Myöskään kasvatettaessa RS303 solu-10 ja ilman selektiota SS-liemessä, itiöitä ei muodostunut kasvatuksen aikana. Tästä voidaan päätellä, että s/gG-geenin deleetio estää bakteerin itiöinnin, ja että s/gG:n deleetio on stabiili.

Taulukko 3. SigG-geenin vaikutus itiöintiin.

15 _B. subtilis 168 RS303_RS303_

Kasvualusta SS SS + Cm SS

Soluja/ml 3,9x108 1x108 8x107

Itiöitä/ml_2,1x108_0_0_ β-laktamaasin tuotantoplasmidin, pRSH10, rakentaminen * * ^ Vieraan proteiinin erittymistä kasvatusmediumiin testattiin siirtämäl- • · ·:, 20 Iä B. licheniformis 749/C -bakteerin (Izui et ai., 1980) β-laktamaasin geeni eri- ’ ' tysvektoriin pKTH141 (Lundström, 1985). Kyseisessä vektorissa vieraan prote- · iinin erittymistä ohjaavat B. amyloliquefaciens'\n a-amylaasin promoottori ja : signaalisekvenssi. /-//ncilll-kloonauskohtaan voidaan liittää haluttu osa vierasta proteiinia koodaavasta alueesta oikeaan lukukehykseen signaalisekvenssin 25 kanssa, jolloin proteiini saadaan erittymään kasvumediumiin. Siirto tehtiin ly-. . hyesti kuvattuna seuraavasti, Bacillus licheniformis -bakteerista 749/C eristet- ; ‘ tiin kromosomaalista DNA:ta (Marmur, 1961), jota käytettiin templaattina PCR- reaktiossa. Templaatista amplifioitiin PEL-141F (Sek. n:o 7) ja PEN-141R (Sek. n:o 8) -alukkeilla 817 emäsparin mittainen PCR-tuote, johon sisältyy ns. 30 pientä eksopenisillinaasia koodaava alue vastaten GenBank -sekvenssin V00093 nukleotideja 129-921 (ja aminohappoja 43 -307 Swiss-Prot - „ 112066 17 sekvenssissä P00808). 100 μΙ:η PCR-reaktioseoksessa käytettiin 10 ng temp-laatti-DNA:ta, 0,3 μΜ alukkeita, 0,2 mM dNTP, 10 μΙ entsyymin valmistajan puskuria, 1,5 μΙ Expand-entsyymiä (3,5 U/μΙ, Boehringer Mannheim) . PCR-ohjelmassa oli aluksi 4 min kuumennus 94°C, sitten 28 kertaa 40 s 94°C, 20 s 5 50°C, 1 min 72°C, ja lopuksi 5 min 72°C. Saatu PCR-tuote puhdistettiin ja alukkeisiin liitettyjen /f/ndlll-restriktiokohtien avulla siirrettiin pKTH141:een ja saatiin näin tuotantoplasmidi pRSH10. Plasmidin pRSH10 β-laktamaasia koo-daava alue sekvensoitiin, eikä sekvenssissä havaittu mitään eroavaisuuksia verrattuna geenipankin sekvensssiin. B. subtilis 168 ja RS303 transformoitiin 10 (Gryczan et ai., 1978) pRSH10:llä ja saatiin vastaavasti bakteerikannat RS201 ja RS310.

SigG-geenideleetion vaikutus itiöimättömyyteen sekä deleetion stabiilisuus β-laktamaasin ylituotantokannassa

Transformoimalla itiöimätön, kompetentti kanta RS303 tuotanto-15 vektorilla pRSH10:llä saatiin tuotantokanta RS310. S/'gG-geenin deleetio ei vaikuttanut bakteerin kompetenssiin. Uuden tuotantokannan itiöintiä ja SigG-geenin deleetion stabiilisuutta seurattiin kasvattamalla kantaa RS310 itiöinti-mediumissa ilman kloramfenikoliselektiota. Edelleen itiöinnin kehittymistä seurattiin useita kasvatuskertoja nuorentamalla 24 h jatkunutta kasvatusta SS-20 alustaan. Kasvatuskerralla tässä tarkoitetaan 24 h jatkunutta kasvatusta, jota siirrostettiin 1:100 uuteen itiöintialustaan. Itiöintiä seurattiin kolmen kasvatus-: kerran ajan. I-III kasvatuskerrasta otettiin soluja lämpökäsittelyyn. Lämpökäsit- ,.;: ‘ telyn jälkeen solut maljattiin LB-maljoille tai LB-kloramfenikolimaljoille.

Kasvatuksissa villikanta 168 muodosti keskimäärin 2,8 x 108itiötä. 25 Deleetiokanta RS310 ei tuottanut yhtään itiötä (taulukko 4). Stabiilisuuden in- dikaattorina pidettiin sitä, että itiöimättömyys säilyi kannassa RS310 kasvatet- .··*. taessa soluja SS-mediumissa ilman kloramfenikoli-selektiota. Myös vegetatii- visten solujen lukumäärä selektiivisillä LB-maljoilla (kloramfenikoli 5 pg/ml) pysyi samana kuin solujen määrä LB-maljoilla. Koe osoitti, että deleetion kon-30 struktio sekä caf-geenin insertio on stabiili.

112666 18

Taulukko 4. S/gG-geenideleetion vaikutus itiöintiin sekä deletion stabiilisuus RS310 tuotantokannassa.

_RS310_B.subtilis 168_ _Vegetatiivisia soluja/ml Itiöitä/ml Soluja/ml Itiöitä/ml

Kasvatuskerta LB LB+Cm LB LB LB

I 1,4x108 1,1 x108 0 6 x108 3,3x108 II 2,7x108 1,6x108 0 5,9x108 4,5x108 III 2,0 x108 6,0 x107 0 2,3 x108 7,1 x107 5 Taulukossa 5 on ilmoitettu vegetatiivisten solujen sekä itiöivien solu jen määrä toisessa vastaavanlaisessa kasvatuksessa, jossa seurattiin kannan RS310 itiöintiä. Nyt RS310 kasvatuksista määritettiin vegetatiivisten solujen määrä maljoilla, joissa oli pienempi kloramfenikolipitoisuus. Vähentämällä klo-ramfenikolin määrää alustassa haluttiin pienentää selektiopainetta, sillä käytet-10 täessä suurempaa kloramfenikoli-konsentraatiota maljoilla bakteerin kasvu oli hyvin hidasta. Pesäkkeet jäivät pieniksi, eikä mahdollisesti kaikkia vegetatiivisia soluja saatu esille. Joten vertailukelpoisemman tuloksen saamiseksi selektiota pienennettiin maljoilla 1 pg/ml:aan kloramfenikolia. Nyt vegetatiivisten solujen määrä kloramfenikoli-maljoilla pysyi samana kuin LB-maljoilla. Kontrolli-15 kantana käytetty villikanta 168 muodosti itiöitä keskimäärin 3,5 x 108 itiötä/ml. RS310 ei itiöinyt kasvatuksissa. Eli myös nämä tulokset osoittavat hyvin sigG-geenideleetion vaikutuksen. Tuotantokanta on täysin itiöimätön ja hyvin stabiili.

Taulukko 5. SigG-geenin deleetion vaikutus itiöintiin ja deleeti- ”: 20 on stabiilisuus RS310 tuotantokannassa.

• · » · ·: : _RS310 _B.subtilis 168_ _Vegetatiivisia soluja/ml_Itiöitä/ml Soluja/ml Itiöitä/ml

Kasvatuskerta LB LB+Chl LB LB LB

I 1,3 x 108 1,3 x 108 0 4 x 108 3,6x 10® II 1,6x10® 1,6x10® 0 4,7x10® 4,5x10® III 3,8x10® 5,6x10® 0 4,5x10® 2,4x10® 19 112,)66 β-laktamaasin tuotto itiöimättömällä kannalla

Uuden itiöimättömän bakteerikannan, RS310, β-laktamaasin (BLP) tuottoa verrattiin β-laktamaasin tuottotasoon villikannassa 168, joka oli transformoitu tuottoplasmidilla pRSHIO, eli kannassa RS201. β-laktamaasin tuottoa 5 seurattiin 100 ml:n ravistelukasvatuksessa. Kasvatusliuoksen β-laktamaasiaktiivisuus mitattiin spektrofotometrisesti O’Callaghan et ai., (1972) kehittämän menetelmän mukaisesti käyttäen kromogeenista substraattia, nit-rocefiinia. Absorbanssin muutos 486 nrrv.ssa muunnettiin aktiivisuusyksiköksi, BU: 1 μίτιοΙ hajonnutta benzylpenisilliiniä tunnissa, 30°C, kokeellisesti määrite-10 tyn kertoimen 26,3 avulla. Aktiivisuusyksiköt puolestaan muunnettiin pg β-laktamaasia/ml -yksiköiksi käyttäen β-laktamaasin spesifistä aktiivisuutta 340 BU/pg proteiinia (Simons et ai. 1978). Kasvualustana käytettiin konsentroitua LB-alustaa, jossa käytettiin selektiona kanamysiiniä 10 pg/ml. 100 ml:aan kas-vuliuosta siirrostettiin 0,1 ml logaritmisen vaiheen soluja, ja soluja kasvatettiin 15 2 l:n ravistelu pullossa (+37°C, 250 rpm). Kasvua seurattiin 25 h mittaamalla sameus (OD6oonm)· Tulokset on esitetty kuvassa 3. Bakteerikannoilla RS310 ja RS201 oli samanlainen kasvunopeus logaritmisessa kasvuvaiheessa ja korkein OD6oo-arvo saavutettiin 11 tunnin kohdalla. Tällöin β-laktamaasia oli molempien kantojen kasvatusliuoksessa noin 250 pg/ml. 11 tunnin kasvatuksen 20 jälkeen bakteeritiheys alkoi laskea ja kasvatuksen lopussa RS310-kannan OD6oo-arvo oli 7,6 ja RS201-kannan 8,1. β-laktamaasin määrä kasvatusliuoksessa kuitenkin kasvoi ja oli kasvatuksen loputtua uudella itiöimättömällä tuo-tantokannalla RS310 430 pg/ml ja RS201-kannalla 380 pg/ml. Lisäksi, sigG-geenin deleetion vaikutusta kasvatusliemeen erittyvien proteiinien profiiliin tut-25 kittiin SDS-PAGE-geeliajolla, eikä itiöimättömän ja villikannan välillä havaittu mitään eroa Coomassie-blue -värjätyissä geeleissä (15% akryyliamidi). Saatu-: /. \ jen tulosten perusteella s/gG-geenin deleetio ei näytä vaikuttavan häiritsevästi -•-j bakteerin kasvuun eikä erittyvien proteiinien tuottoon.

.*·*, Alan ammattilaiselle on ilmeistä, että tekniikan kehittyessä keksin- « > 30 nön perusajatus voidaan toteuttaa monin eri tavoin. Keksintö ja sen suoritusmuodot eivät siten rajoitu yllä kuvattuihin esimerkkeihin vaan ne voivat vaihdella patenttivaatimusten puitteissa.

2q 11 ϋ 6 6

Kirjallisuusviitteet

Biswas, 1., A. Gruss, S.D. Ehrlich, and E. Maguin. 1993. High-efficiency gene inactivation and replacement system for gram-positive bacteria. J. Bacte-5 riol. 175:3628-3635.

Ehrlich, S.D. 1978. DNA cloning in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Ssci. USA, 75:1433-6.

10 Ferrari, E. and J.A. Hoch. 1989. Genetics. In: Bacillus, Biotechnology handbooks; v. 2. C. Harwood (ed.). Plenum Press, New York. A Division of Plenum Publishing corporation. New York.) pp.57-72.

Fougler, D. ja J. Errington (1989) The role of the sporulation gene spolllE in 15 the regulation of prespore-specific gene expression in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 3:1247-1255.

Gryczan, TJ., S. Contente, D. Dubnau. 1978. Characterization of Staphylococcus aureus plasmids introduced by transformation into Bacillus subtilis. J. 20 Bact. 134:318-329.

Haldenwang, W. 1995. The sigma factors of Bacillus subtilis. Microbiol. Rev.

: 59:1-30.

: ( * <: 25 Harwood, C. R. ja S. M. Cutting (toim.), Molecular Biological Methods for • Bacillus. 1991. Wiley-lnterscience Publications.

» * * S » • "· Horinouchi S., and B. Weisbium. 1982. Nucleotide sequence and functional .· ·. map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance.

30 J. Bacteriol. 150:815-825.

Horton, Robert M., Henry D. Hunt, Steffan N. Ho, Jeffrey K. Pullen and Larry R. Pease. 1989. Engineering hybrid genes without the use of restric-. tion enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene, 77:61-68.

35 > 21 112666 llling N., Young M. & Errington J., 1990. Use of Integrational Plasmid Excision to Indentity Cellular Localization of Gene Expression during Sporulation in Bacilllus subtilis. J. Bactriol. 172:6937-6941.

5 Ishii, T, K. Yoshida, G. Terai, Y. Fujita, and K. Nakai. 2001 DBTBS: a database of Bacillus subtilis promoters and transcription factors. Nucleic Acids Res. 29: 278 - 280.

Izui, K., J.B.K. Nielsen, M.P. Gaulifield, and J.O. Lampen. 1980. Large exo-10 penicillinase, initial extracellular form detected in cultures of Bacillus licheni-formis. Biochemistry 19:1882-1886.

Karmazyn-Campbelli, C., Bonamy, C., Savelli, B., and Stragier, P. 1989. Tandem genes encoding σ-factors for consecutive steps of development in 15 Bacillus subtilis. Genes Dev. 3:150-157.

Khasanov, F.K., D.J. Zvingila, A.A. Zainullin, and A.A. Prozorov. 1992. Homologous recombination between plasmid and chromosomal DNA in Bacillus subtilis requires approximately 70 bp of homology. Mol. Gen. Genet. 20 234:494-497.

Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, Albertini AM, Aitoni G, Azevedo V, Bertero MG, Bessieres P, Bolotin A, Borchert S, Borriss R, Boursier L, Brans A, Braun M, Brignell SC, Bron S, Brouillet S, Bruschi CV, Caldwell 25 B, Capuano V, Carter NM, Choi SK, Codani JJ, Connerton IF, Danchin A, ; ; et al. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus . · . subtilis. Nature. 1997 Nov 20;390(6657):249-256.

.. . Lundström, K. 1985. Expression of viral membrane protein genes in Bacillus ',,;' 30 subtilis. Ph.D. Thesis, University of Helsinki, 1985.

' ♦ I t : Marmur, J. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from : : micro-organisms. J. Mol. Biol. 3:208-218.

» 35 McPherson, M.J., and S.G. Meller. 2000. PCR: the Basics. BIOS Scientific • : Publishers, Oxford.

22 112666 O'Callaghan C.H, A. Morris, S.M. Kirby, and A.H. Shingler. 1972. Novel method for detection of beta-lactamases by using a chromogenic cephalosporin substrate. Antimicrob. Agents Chemother. 1:283-288.

5 Pedraza-Reyes M., Gutierrez-Corona F. & Nicholoson W L. 1994. Temporal regulation and forespore-specific expression of the spore photoproduct lyase gene by sigma-G RNA polymerase during Bacillus subtilis sporulation. J. Bac-teriol. 176:3983-9193.

10 Sambrook, J. and D.W. Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York.

Sambrook, J., Fritch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning. A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15 New York.

Simons K., M. Sarvas, H. Garoff, and A. Helenius. 1978. Membrane-bound and secreted forms of penicillinase from Bacillus licheniformis. J. Mol. Biol. 126: 673-690.

20

Stragier, P., and Losick, R. 1996. Molecular genetics of sporulation in Bacillus subtilis. Annu. Rev. Genet. 30: 297-341.

Γ i

Claims (20)

112666

1. Itiöimätön Bacillus subtilis-kanta, tunnettu siitä, että sen s/gfG-geenistä on deletoitu vähintään 150 nukleotidia, ja että deleetio käsittää 5 ainakin osan sigG-geenin jommastakummasta funktionaalisesta alueesta, jotka alueet koodaavat sigG-proteiinin aminohapot 67-80 tai vastaavasti 229-248.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen B. subtilis-kanta, tunnettu siitä, että deleetio käsittää ainakin osan sigG-geenin kummastakin mainituista 10 funktionaalisista alueista.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen B. subtilis-kanta, tunnettu siitä, että koko sigG-geeni on deletoitu.

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen B. subtilis-kanta, tunnettu siitä, että deleetiokohtaan on insertoitu selektiomarkkeri- 15 geeni.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen B. subtilis-kanta, tunnettu siitä, että ylävirtaan selektiomarkkerigeenistä on vähintään 20 nukleotidin pituinen overlap-alue, joka on homologinen alavirtaan selektiomarkkerigeenistä olevan vähintään 20 nukleotidin pituisen overlap-alueen kanssa.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen B. subtilis-kanta, tunnettu i V siitä, että se sisältää sek. n:o:n 9. , , f

7. Menetelmä itiöimättömän Bacillus subtilis-kannan valmistamisek- si, tunnettu siitä, että Bacillus subtilis-kannan sigG-geenistä poistetaan '·,· vähintään 150 nukleotidia siten, että sigG-geenistä poistetaan ainakin osa 25 sigG-geenin jommastakummasta funktionaalisesta alueesta, jotka alueet koodaavat sigG-proteiinin aminohapot 67-80 tai vastaavasti 229-248.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, . . että sigG-geenistä poistetaaan ainakin osa sigG-geenin kummastakin maini- ,,;’ tuista funktionaalisista alueista.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, i että SOE-tekniikalla valmistetaan insertti, joka sisältää deletoitavan geenialu- Γ ”j een reuna-alueet sekä selektiomarkkerigeenin, insertillä transformoidaan dele- toitava B. subtilis-kanta ja sitten selektoidaan ne transformantit, joihin insertti ; ’ on integroitunut bakteerin kromosomiin niin, että haluttu geenialue on deletoi- ' · ; 35 tunut. 11206f

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että SOE-tekniikalla valmistetaan lineaarinen DNA-insertti, joka sisältää selek-tiomarkkerigeenin deletoitavan geenialueen reuna-alueiden välissä, transformoidaan deletoitava B. subtilis-kan\a insertillä, ja seulotaan ne transformantit, 5 joihin insertti on integroitunut kromosomiin homologisen kaksois-rekombinaation seurauksena, jolloin haluttu geenialue on deletoitunut.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että SOE-tekniikassa käytetään alukkeita, joissa on vähintään noin 20 nukleotidin pituiset overlap-alueet.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytetään lineaarista DNA-inserttiä, jossa ennen selektiomark-kerigeeniä on vähintään 20 nukleotidin pituinen overlap-alue, joka toistuu se-lektiomarkkerigeenin jälkeen.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen menetelmä, tun-15 nettu siitä, että siinä käytetään lineaarista DNA-inserttiä, jossa deletoita- vasta alueesta ylävirtaan oleva reuna-alue, selektiomarkkerigeeni ja deletoita-vasta alueesta alavirtaan oleva reuna-alue ovat kaikki keskenään oleellisesti saman pituiset.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu 20 siitä, että siinä käytetään lineaarista DNA-inserttiä, jonka pituus on noin 3 kb.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen itiöimättömän Bacil- ’.: lus subtilis-kannan käyttö tuotanto-organismina.

;·' 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että itiöimätöntä B. subtilis-kantaa käytetään tuottamaan rekombinanttipoly-·,: 25 peptidiä.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen käyttö, tunnettu siitä, • *, että itiöimätöntä B. subtilis-kantaa käytetään tuottamaan beta-laktamaasia.

18. Menetelmä biologisesti valmistettavan tuotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että tuotetta valmistetaan jonkin patenttivaatimuksen 1-6 » · ,,30 mukaisella itiöimättömällä Bacillus subtilis-kannaWa.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu : siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukainen Bacillus subtilis-kanta : transformoidaan haluttua polypeptidiä koodaavalla DNA:lla, joka ilmennetään siinä ja otetaan talteen muodostunut rekombinanttipolypeptidi. ’ 35

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu : siitä, että valmistetaan beta-laktamaasia. 25 112666