JP2637532B2 - 原核微生物の染色体ｄｎａにおける安定した遺伝子増幅 - Google Patents

原核微生物の染色体ｄｎａにおける安定した遺伝子増幅

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Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、原核細胞の染色体中に少なくとも２コピイ
の限定されたDNA配列を拡大させ重複させずに組込むこ
とにより、安定した遺伝子増幅が行なわれる原核細胞に
関する。
〔背景技術〕
バチルス属の菌はα−アミラーゼ、中性プロテアーゼ
及びアルカリプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼ等の
工業的に重要な酵素の生産に広く使用せてきている〔文
献（Debabov“The Industrial Use of Bacilli"in:The
Molecular Biology of Bacilli,Acad.Press,New York,1
982）参照〕。バチルス属菌による酵素生産の改良は突
然変異及び引きつづく淘汰等の古典的遺伝子技術及び最
近の分子生物学的技術の両方によって達成され得る。後
者においては遺伝子工学による原核及び真核微生物中
の、同種源及び異種源遺伝子の高度の発現レベルを得る
ためのいくつかの方法が実証されている。
或る遺伝子の高度の発現を達成する方法のひとつは効
率的な制御配列をもつ遺伝子を提供することである。該
第１の方法と組合せてしばしば用いられる第２の別法
は、問題にしている遺伝子のコピー数を増加させること
である。増幅は、プラスミドのようなコピー数の多い染
色体外DNA分子の中にその遺伝子を挿入することによっ
て主として達成される。しかし、遺伝情報を発現させ増
幅するためのベクターとしてプラスミドを用いることの
重大な欠点はそれらの不安定性にある。大規模な使用の
ために増幅した遺伝子の安定性は、その増幅遺伝子によ
りコードされている発現生成物の高度生産の維持のため
の必要条件となる。その理由は、実質的な産生物取得の
達成のために十分な量の生物塊（バイオマス）が形成さ
れる以前に、多くの細胞分裂が起らなければならないか
らである。
不安定性は２つの形で現れる：即ち、培養中プラスミ
ドの消失が起る分離的不安定性（segregational instab
ility）及びプラスミドの一部が欠失する構造的不安
定。例えば分離的不安定性は、宿主細胞が過剰発現され
る遺伝子をもつベクターを宿したときに起る。一般的に
遺伝子の過剰発現は、トランスホーメーション（形質転
換）された宿主細胞にとって好ましくない性質なので、
遺伝子過剰発現する能力を失った細胞に対して淘汰圧
（selective pressure）となるであろう。大量の代謝エ
ネルギーが過剰発現遺伝子産生物に費やされ、これは、
過剰発現を行っていない宿主細胞との“細胞競争力（増
殖速度）”悪影響を与える。
分離不安定性に対して用いられる方法には、プラスミ
ド含有細胞に有利な（例えば、抗生物質耐性で、その発
酵培地中に“関連する抗生物質”を添加するなど）遺伝
子をもつ“マルチコピー（コピー数の多い）プラスミド
を含む細胞”の選択法がある。しかし一般に抗生物質
は、その発酵プロセス及びその産生物それ自体に関する
制御の点から、大規模の商業的生産プロセスにおける選
択手段としては有用ではない。
分離的不安定性によるプラスミドのロス（損失）を少
なくするために用いられる別法は、宿主細胞に機能的に
本質的な遺伝子をベクター分子で挿入することである
〔Ferrari et al.,Biotechnology,3（1985）1003〜100
7〕。しかしこの方法はベクターの構造的安定性をなに
も保証していない。
プラスミドの構造的な不安定性の問題を解決するため
に用いられる技術には例えば温度感受性の制御配列のよ
うな制御配列を用いることにより、及び宿主細胞染色体
への外来DNAの組込みにより、指数増殖期における、そ
の一般の発現を回避する技術が含まれる。他に使用され
る方法は、自己複製ベクター分子の使用の回避と、それ
に代る宿主細胞染色体への導入DNAの組込みを起す技術
の使用とを含んでいる。
宿主細胞染色体への外来DNA組込みの方法には相同的
組換え及び非正統的組換えが含まれる。相同的組換えに
よる“染色体上の特異的部位へのDNA配列挿入”には２
つの方法：即ち図1A及び1Bに夫々示されたキャンベル型
（campbell−type）相同的組換え及びダブルレシプロカ
ル（double reciprocal）な組換えがある。染色体へDNA
配列を導入する二段階置換メカニズムによる第３の方法
を図1Cに示した。原則的にはキャンベル型組換えを用い
るが、最終結果は“その染色体の組換え部分中に重複し
た配列を含まない、よって増幅可能ユニットを含まない
染色体配置”となる。従ってそれはダブルレシプロカル
組換えに似ている。
染色体への外来DNA組込みのための相同的組換えを用
いることとは別に、非正統的組換えによるDNA組込みも
可能である。組込まれたベクター分子は、非組込みベク
ター分子の自律的複製を阻害する条件下で選択されるこ
とができる。組込みのための非正統的組換えの使用を図
1Dに示した。得られた染色体配列配置中にタンデムな
（隣り合っている）重複がないことは、図1B,C及びＤ中
に示した経路によるゲノムへのDNA配列の安定な導入を
可能にする。染色体に組込まれた遺伝子には、染色体に
組込まれたDNAの増幅が隣り合って起こっている同種起
源及び異種起源の遺伝子の両方が含まれる。これらの染
色体中の増幅配列は、或る場合にだけその安定性が報じ
られているが、一般に不安定であることが報告されてい
る。従って染色体へ組込まれたDNAが安定に維持される
方法の開発が望まれている。
〔背景技術〕
バチルススブチルス（Bacillus subtilis）の染色体
への外来DNAの相同的組換えによる組込みが文献〔Dunca
n et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75（1978）,3664−3
668〕に、及びアナシスチスニデュランス（Anacystis n
idulans）については文献〔Williams and Szalay,Gene
24（1983）37−51〕並びに国際特許出願WO84/00381号に
より報告されている。ヘテロ遺伝子の微生物染色体への
相同的組換えによる“プラスミドベクター上に存在する
とき安定に維持されない組込み”はEP−Ａ−0127328号
明細書に記載されている。
相同的又は非相同的な遺伝子であって染色体に組込ま
れた該遺伝子の増幅が実証されている。例えば諸文献
〔Saito et al.,Proceedings of the Fourth Internati
onal Simposium on Genetics of Industrial Microorga
nisms,Kyoto,Japan,1982,pp.125130;Young,J.Gen.Micro
biol.130（1984）1631−1621;Janniere et al.,Gene 40
（1985）47−55;Sargent and Benett,J.Bacteriol.161
（1985）589−595;Gutterson and Koshland,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 80（1983）4894−4898;Hashiguchi et a
l.,Agric.Biol.Chem.49（1985）545−550;Wilson and M
organ,J.Bacteriol.163（1985）445−453;French Paten
t Applicaion No.84・06701;and EP−Ａ−0134048）〕
を参照されたい。原核細胞における自然増幅も報告され
ており、またそれについて選択することもできる。例え
ば文献〔Anderson and Roth,Ann.Microbiol.31（1977）
473−505〕を参照されたい。
上述の全ての場合において、染色体に組込まれたDNA
の増幅した配列は隣り合って並んでいる。このタイプの
染色体増幅配列は文献〔Janniere et al.,Gene 40（198
5）47−55〕により報告されているように或る場合には
安定であるが一般には不安定である。
これらの増幅した配列の間に、他の本質的遺伝子の存
在による“原核生物の自然に増幅した遺伝子の安定化”
が報告されている。例えば枯草菌染色体中に生じたリボ
ソームRNA遺伝子のセット（複数）の９〜10コピーのう
ちで隣り合って並んでいる２つのセットは、tRNAの一群
（cluster）の遺伝子で分離されている〔Wawrousek and
Hansen,J.Biol.Chem.258（1983）291−298〕。他の場
合については該微生物の表現型の諸性質に影響すること
なく、大腸菌及び枯草菌の両方において、天然の重複し
て繰返しているリボソームRNAオペロンが欠失されてい
る〔Ellowood and Momura,J.Bacteriol.143（1980）107
7−1080;and Loughney et al.,J.Bacteriol.154（198
3）529−532〕。
ベクターPE194で用いた“非正統的組換えによる枯草
菌の染色体へのプラスミドの組込み”が報告〔Hofemeis
ter et al.,Mol.Gen.Genet.189（1983）58−68 and Pro
rozov et al.,Gene 34（1985）39−46〕されている。
B.アミロリクィファシエンス（B.amyloliquefacien
s）〔Palva et al.,Gene 15（1981）43−51〕、B.リヘ
ニホルミス（B.licheniformis）〔Ortlepp,Gene 23（19
83）267〕、B.ステアロテルモフィルス（B.stearotherm
ophilus）〔Mielenz el al.,Proc.Acad.Sci.,USA 80（1
983）5975−5979;EP−Ａ−0057976）及び枯草菌〔Yang
et al.,Nucleic Acids Res.11（1983）237〕のα−アミ
ラーゼ遺伝子；及び枯草菌のレバンシュクラーゼ遺伝子
〔Gay el al.,J.Bacteriol.153（1983）1424〕;B.ステ
アロテルモフィルス〔Fuji el al.,J.Bacteriol.156（1
983）831〕、B.アミロリクィファシエンス〔Honjo el a
l.,J.Biotech.1（1984）165〕及び枯草菌〔Yang et a
l.,J.Bacteriol.160（1984）115〕のニュートラルプロ
テアーゼをコードする遺伝子；枯草菌〔Wong et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,USA 81（1984）1184〕、B.リヘニホ
ルミス〔Jacobs et al.,Nucleic Acids Res.13（1985）
8931〕及びB.アミロリクィファシエンス〔Wells et a
l.,Nucleic Acids Res.11（1983）7911〕のセリン又は
アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のようなバチ
ルスの細胞外酵素の遺伝子の数種のものが成功裡にクロ
ーニングされている。
何種かのグラム陽性微生物のプロトプラストのトラン
スホーメーションも報じられている。枯草菌に関するプ
ロトプラストトランスホーメーションの操作法が記載
〔Chang and Cohen,Mol.Gen.Genet.168（1979）111−11
5〕されており、該技術は広く応用されている。B.メガ
テリウム（B.megaterium）のプロトプラスト〔Vorobjev
a et al.,FEMS Micorobiol.Letters 7（1980）261−26
3〕、B.アミロリクィファシエンスのプロトプラスト〔S
mith et al.,Appl.and Env.Microbiol.51（1986）63
4〕、B.サリンジェンシス（B.thuringiensis）のプロト
プラスト〔Fisher et al.,Arch.Microbiol.139（1981）
213−217〕、B.スフェリクス（B.sphaericus）のプロト
プラスト〔McDonald,J.Gen.Microbiol.130（1984）20
3〕、及びB.ラルベ（B.larvae）のプロトプラスト〔Bak
hiet et al.,Appl.and Env.Microbiol.49（1985）577〕
のトランスホーメーションに関して同様に成功した操作
法が報じられており；該最後文献にB.ポピレ（B.popill
ae）については不成功の結果が報告されている。B.ポリ
ミキサ（B.polymyxa）、B.リヘニホルミス、B.マセラン
ス（B.macerans）及びB.ラテロスポルス（B.laterospor
us）についての操作法は成功し、B.コアグランス（B.co
agulans）、B.セレウス（B.cereus）及びB.プミルス
（B.pumilus）については良好なプロトプラストが得ら
れたにもかかわらず実験操作は不成功に終っている〔Ma
nn et al.,Current Microbiol.13（1986）131−135〕。
プロトプラストにDNAを導入する他方法にはDNAを含む
リポソームとの融合〔Holubova,Folia Micrbiol.30（19
85）97〕又は中間宿主として容易にトランスホーメーシ
ョンされ得る微生物を用いるプロトプラスト融合が含ま
れる。
〔発明の開示〕
本発明により宿主細胞染色体へ安定に組込まれる目的
のポリペプチドをコードするDNA配列を少なくとも２コ
ピー含む原核性宿主細胞及びその製造方法が提供され
る。外来DNA配列の安定な維持は、その配列の２コピー
又はそれ以上を、宿主細胞染色体中に“内在する染色体
DNA配列”により離隔（又は分別）されるようにそれら
のコピーを組込むことにより得られる。
〔図面の簡単な説明〕
図1A〜Ｄは、原核微生物染色体への染色体外DNA配列
組込みの４つの方法を示す。
Ｔは、目標配列即ち相同的組換えがそれらの間で起こ
りうる、染色体及びプラスミド上に存在するDNA配列で
ある。
Ｓは、染色体中に組込まれるべきDNA配列を示す。
Ｎは、組換え株の選択に用いるマーカー遺伝子配列を
示す。
図2A及び2Bは、原核染色体中における安定した遺伝子
増幅を得る２つの方法を模式的に示す。
図３は、pUB110及びpM58の夫々を含む枯草菌DB104の
培養物（複数）から由来する上清について行なったヒス
チジン/MOPSゲル電気泳動に関していくつかのズブチリ
シンと比較した結果を示す。
レーン1;カールスバーグ（Carlsberg）ズブチリシン レーン2;バチルスPB92プロテアーゼ レーン3;枯草菌ズブチリシン レーン4;枯草菌DB104（pM58） レーン5;枯草菌DB104（pUB110） 図４は、プラスミドpM58の制限地図を示す。さらに、
図の上部にシクエンシング（配列化）に関する方策を示
す。実線矢印はファージM13ベクター即ちmp10、mp11及
びmp18中にクローニングされた断片を示す。図の下部に
プロテアーゼ遺伝子上において一定距離毎に位置する10
個のオリゴヌクレオチドを用いたシクエンシングの方策
を示す。
図５は、バチルスPB92のセリンプロテアーゼのアミノ
酸配列と相関するコード鎖のヌクレオチド配列を示す。
そのDNA配列のプロモーター（P1,P2）、リボソーム結合
部位（rbs）及び終止領域（term）をも示す。数字を付
けた実線は、シクエンシングに用いる10個のヌクレオチ
ドの位置を表す。
図６はプラスミドpE194−neoの構築（construction）
を示す。
図6BはプラスミドpMAX−４の構築を示す。
図7Aは、PB92,PBT109及びPBT108株の夫々の染色体DNA
のHind IIIによる消化物を、0.5％アガロースゲル電気
泳動にかけ、ついでサザン（Southern）の記載のように
してニトロセルロースに移し、32Pでラベルされニック
トランスレーション（nick−translation）されたpM58D
NAをハイブリダイズ（交雑）させた結果のオートラジオ
グラフを示す。
図7B及び図7Cは、pMAX−４及びバチルスPB92染色体間
の相同的（Ｂ）な組換え及び非正統的（Ｃ）な組換えで
起こる組込みを示す。
図８は、組込みベクターpElatBの構築を示す。
図9Aは、B.リヘニホルミスT9株染色体へのプラスミド
pElatBの組込みによるB.リヘニホルミスTB13株の生成を
示す。
図9Bは、B.リヘニホルミスTB13株及びB.リヘニホルミ
スT5のプロトプラスト融合による染色体組換えにもとづ
くB.リヘニホルミスT13F株の生成を示す。
図10は、例11記載のT13F株の発酵物から単離された９
個の別々のコロニーの染色体分析を示す。単離された染
色体DNAをEcoR Iで消化し、0.8％アガロースゲルで分離
し、ニトロセルロース上にブロッティングした。このブ
ロット（blot）を、32Pでラベルし、ニックトランスレ
ーションされたpElatB DNAでハイブリダイズさせた。こ
の図はそのオートラジオグラムを示す。上部の矢印は、
約15kbのEcoR IのDNA断片が移動する位置を示す。該断
片は、図9A中でTB13株について述べたように、本来のα
−アミラーゼ遺伝子に隣接していない部位上でその染色
体に組込まれたpElatB配列の全部を有する。下部の矢印
は、B.リヘニホルミスT5株中に本来存在する全α−アミ
ラーゼ遺伝子を含む約33kbのEcoR I DNA断片が移動する
位置を示す（図9Bも参照）。下記のDNA試料を分析し
た。
レーン1;バチルス・リヘニホルミスT5DNA レーン2;バチルス・リヘニホルミスTB13DNA レーン3;バチルス・リヘニホルミスT390DNA レーン4;発酵後に単離されたバチルス・リヘニホルミス
T390のネオマイシン感受性誘導株由来のDNA（例12に記
載される） レーン5;バチルス・リヘニホルミスT13F DNA レーン6;T13F株の発酵後に単離された９個の別個のコロ
ニー由来のDNA（例12に記載） 〔発明を実施するための最良の形態〕 本発明に従い、２つ以上のDNA配列コピーが原核細胞
の染色体中に安定に組込まれた該原核細胞及びその調製
法が提供される。目的とするポリペプチドをコードする
DNA配列を含む宿主細胞を、該DNA配列を含むDNA構築物
を用いてトランスホーメーションさせた。“増幅される
べき遺伝子から、内在性染色体配列により組込まれたDN
A配列が離隔されているトランスホーメーションされた
細胞”を選択する。内在性の介在配列はその宿主細胞に
対して一般的に重要なものである。相同的組換えによる
増幅配列の損失は宿主細胞に致命的なものとなろう。従
って抗生物質の使用もしくは同様の選択手段の必要なし
に、その増幅配列をもつ細胞に対する淘汰圧となろう。
組込みは相同的組換えによっても、非正統的組換えによ
っても達成され得る。所望の細胞を得るために用いる技
術は図2A及び2Bの夫々に示されている。
相同的組換えを用いたとき、特に１コピー又はそれ以
上の増幅されるべき遺伝子が既に宿主細胞中に導入され
ているときには、数個の伸長鎖（ストレッチ）のDNA配
列が、宿主細胞染色体に相同的なベクター分子中に存在
し得る。従ってベクター分子は、目的のDNA配列；標的D
NA配列；及びマーカーDNA配列を含みうる。
所望の組換え染色体配置のみが選択されるべきである
ことに注意して欲しい。これは、組換えに線状DNA分子
を用いることにより達成される。組込まれる環状ベクタ
ー分子は標的配列に相同的な領域内で制限酵素の使用に
よって切断される。このようにしてこの特異的部位にお
ける組換え及び組込みが選択的に起る。このベクター分
子中に存在するのみならず、目的とするDNA配列もその
宿主細胞染色体上に存在しうる。このDNA配列は、増幅
したい、いかなる構造遺伝子をコードするDNA配列であ
ってもよい。このDNA配列は、その宿主微生物に対して
内在的なものであってもよく、また先のトランスホーメ
ーションの段階で宿主染色体内に挿入されたものであっ
てもよい。
非タンデム（非重複の）遺伝子の増幅のための標的配
列は、非本質的遺伝子、例えば宿主としてバチルスを用
いた場合に、細胞外酵素をコードする遺伝子又は胞子形
成に関係する遺伝子の中から選択されることが望まし
い。一般に、これら遺伝子中へのDNA配列の組込みはそ
の遺伝子を失活させるであろう。それゆえ、この遺伝子
発現のロス（損失）をモニターし、望ましい組換え株の
選択に利用することができる。
図1D及び2Aに示すように、染色体遺伝子増幅に非正統
的組換えを用いたときに、組込み及び選択のための条件
は、相同的組換えが非正統的組換えにより優位でない条
件が好ましい。相同的組換えを避ける好適手段として
は、目的とする構造遺伝子を欠いた第１及び第２の宿主
細胞を、目的とするポリペプチドをコードするDNA配列
及びマーカー遺伝子を含むベクターの使用でトランスホ
ーメーションさせることである。異なる位置にそのDNA
配列が存在する第１及び第２宿主細胞を選択し、融合条
件下で結合させ、第２の宿主ゲノム中の散在する位置に
目的とする構造遺伝子をコードするDNA配列の少なくと
も２コピーを含む形質転換細胞を生成させる。選択を容
易にするために第１宿主は融合前にこれを死滅させるこ
とができる。
目的とする遺伝子は原核性又は真核性のいずれの遺伝
子でもよい。これらの遺伝子には、細菌遺伝子、単細胞
微生物遺伝子、哺乳類遺伝子又は類似遺伝子が含まれ
る。この構造遺伝子は合成、ゲノムDNAからの単離、cDN
Aからの調製又はそれらの組合せを含む多くの方法で調
製され得る。遺伝子の取扱いの種々の技術はよく知られ
ており、それには制限、消化、再切断、連結、インビト
ロでの突然変異誘発、プライマー修復、リンカー及びア
ダプターの使用及び類似技術が含まれる。従って宿主か
ら得られたDNA配列は、そのDNA構築の必要事項に依存し
て、種々の方法で取扱われる。文献〔Maniatis et al.,
Molecular Cloning,Cold Spring Harbor,NY,1982〕参
照。
構造遺伝子で発現されるものは哺乳類、単細胞微生
物、例えば細菌、真菌例えばイースト又は繊維状菌類、
藻類、プロトゾア、植物又は他のDNA源由来の酵素、ホ
ルモン、リンホカイン、表面タンパク質、血液タンパク
質、構造タンパク質、免疫グロブリン又はこれらの類似
物のような種々のポリペプチド又はタンパク質である。
酵素、なかんずくプロテアーゼ及びアミラーゼが興味深
い。それら酵素の代表例は高アルカリ活性セリンプロテ
アーゼ、α−及びβ−アミラーゼ及び類似酵素を含むセ
リンプロテアーゼ及び非セリンプロテアーゼである。セ
リンプロテアーゼの好ましい給源はバチルス新種（Baci
llus novo species）PB92、α−アミラーゼの給源はB.
リヘニホルミスT5株、並びにそれらの株の突然変異株及
び変異株である。
適当なベクターの一部を形成する遺伝子はこの分野で
一般的に知られている方法で得られる。一般にこの方法
は高アルカリ活性プロテアーゼを発現する微生物由来の
ゲノムライブラリ（genomiclibrary）の調製を含む。こ
のゲノムライブラリは例えばドナー（供与）株（donor
strain）のDNA断片を適当なベクターに連結することに
より簡単に調製され得る。
“適当なベクター”という用語は目的とするタンパク
質又はポリペプチドをコードする構造遺伝子を含むDNA
構築物（DNA construct）を意味している。宿主細胞中
で機能的な制御領域即ちプロモーター配列、リボソーム
結合部位を形成する配列及び構造遺伝子の転写及び翻訳
の停止をコントロールする配列等の制御領域に適した方
向においてその構造遺伝子を結合させる。工業的なバチ
ルス属菌株のようなプラスミド含有細胞について中間的
単離を行うことなく組込みを直接選択するには低すぎる
トランスホーメーション及び組込み頻度しか有しない宿
主細胞の場合にはそのベクターは、その宿主細胞中での
自立的複製を可能とする複製オリジンを更に含まなけれ
ばならない。
宿主原核性細胞株により認識される転写及び翻訳開始
シグナル及び停止制御シグナルを有するドナー細胞から
遺伝子を得た場合には、その構造遺伝子の本来の制御配
列を維持する方が、通常は便利であろう。さらに転写開
始領域は、構成的な或いは誘導可能な発現を提供するの
で、その結果適当な状態で宿主細胞は、目的の構造遺伝
子の高レベルな発現以前に、高密度に生育する。
構造遺伝子が、宿主細胞により認識されない制御シグ
ナルをもつ遺伝子に由来する場合には、その宿主細胞に
認識される制御領域を得る必要があると共に、開始制御
シグナルと停止制御シグナルとの中間に該構造遺伝子が
挿入される必要がある。或る場合には、それ自身の終止
コドンをもつ外来構造遺伝子を、本来の制御シグナルを
もつ内在構造遺伝子のＮ末端コドンの後に、読み枠を同
じくして、挿入することもできる。
発現した産生物は分泌されることが望ましい。発現産
生物が自然に分泌され、リーダーシグナル及びプロセシ
ングシグナルが宿主細胞に認識される場合にこのことは
困難ではないであろう。しかし宿主細胞が分泌リーダー
シグナル及び（又は）プロセシングシグナルを認識しな
いか、或いはそのシグナルが宿主細胞中で満足できる程
の機能を示さないために、その産生物が分泌されない場
合には、宿主細胞ポリペプチドの分泌リーダーシグナル
及びプロセシングシグナルをコードするDNA配列を単離
又は合成し、その構造遺伝子の５′末端に正しい読み枠
でそれらを結合させる必要がある。
さらにそのベクターは“宿主細胞が感受性を有する抗
生物質”に耐性を示すマーカー遺伝子を有することがで
きる。該ベクターを染色体組込みに用いた時にこのマー
カー遺伝子はその宿主株中に１コピー又はわずかなコピ
ー数で存在する場合にも生存のための選択が可能である
という要求を満足するものでなければならない。マーカ
ーは宿主中での構造遺伝子の発現を可能にするためのも
のではなく、その生存のための選択を可能にするもので
ある。“生存のための選択”という用語は栄養要求宿主
への原栄養性の付与、毒物（抗生物質）耐性又はウィル
ス耐性の付与を意味している。原栄養性についてはleu,
his,trp又はそれに類する種々の遺伝子が使用される。
毒物耐性については例えばneo,cam,tet,tun,kan又は類
似の抗生物質耐性が含まれる。その他のマーカーには重
金属に対する耐性、免疫及び類似のマーカーがある。種
々のDNA配列が多種の起源から誘導され、それらが結合
することによって構造遺伝子のその場所における又は欠
失した断片の代りとなる挿入又は置換を可能とする１つ
又はそれ以上の便利で、好ましくは唯一の、制限部位を
含むベクターが提供され、プラスミド構築物が作られ
る。
染色体組込みに対する選択は、“その宿主中で温度感
受的に機能する突然変異をもつ複製オリジン”を含むプ
ラスミドを用いて行なわれる〔例えば文献:Ehrlich,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,75（1978）1433を参照された
い〕。
ひと度、このプラスミド構築物ができてしまえば、こ
れは適当なクローニング宿主にクローニングされ得る。
簡便で、容易にトランスホーメーションされ、プラスミ
ド構築物の複製及び宿主細胞への転移が可能なものなら
どんな宿主でも使用され得る。高いトランスホーメーシ
ョン効率をもち、通常は栄養要求性であり及び（又は）
抗生物質感受性の多数の菌株を使用し得る。宿主細胞と
して工業用のバチルス株を用いる場合にはプラスミド構
築物のクローニングのために宿主として同じ微生物を使
用するのは有利であるがそれはクローニング宿主株及び
宿主株の双方共に、生存のための選択に対し同じマーカ
ーを使用し得ると共に単一の複製システムを使用し得る
からである。例えば欧州特許出願EP−Ａ−134048号を参
照されたく、その開示内容は本明細書中にも引用されて
いる。
プラスミド構築物は、カルシウム沈殿DNA、接合又は
他の簡便な技術を用いたトランスホーメーションのよう
な従来技術に従い、クローニング用宿主中に導入され得
る。次にそのクローニング用宿主を、そのプラスミド構
築物を含む宿主を選択するための選択的条件下に、適当
な普通培地中で生育させる。栄養要求性宿主の場合にそ
の普通培地は所要栄養素を欠いており、一方、毒物耐性
例えば抗生物質耐性の場合には死滅量の毒物を普通培地
に添加する。
種々の宿主を用いることができるがこれらには大腸
菌、バチルス属の菌株特に枯草菌、プソイドモナス属及
びストレプトミセス属が含まれる。宿主細胞に選ぶにあ
たり増幅すべき遺伝子発現及び所望産生物の生産に影響
する種々の因子を考慮しなければならない。従って制御
シグナルの認識；分泌の容易さ；所望産生物の分解の低
度及びその他が見込まれる宿主の使用が望ましい。好ま
しい宿主は、目的とする産生物をすでに産生する宿主で
あることが望ましく、また野生型又は突然変異株のいず
れであってもよい。またその宿主細胞はそれ自身が目的
とするポリペプチドを産生する微生物の変異株であって
も非生産株であってもよい。目的のポリペプチドがプロ
テアーゼかアミラーゼの場合には、バチルス新種PB92及
びバチルスリヘニホルミスT5株の夫々並びにそれらの突
然変異株及び変異株が好ましい。
加えて、工業的菌株の望ましい特性を有する工業用菌
株を用いる事も可能である。使用される株の例としては
B.リヘニホルミス、B.アミロリクィファシエンス及びア
ルカリ親和性細菌のような酵素の工業的生産に用いられ
る株である。これらの工業用菌株は土壌から単離される
か或いは廃棄物又はその他の給源から入手されるか又は
該菌株を変改して得られる微生物から選択される。これ
らの工業的株は非常に強くて安定である。さらに該株は
ファージ感染に対し、従来のトランスホーメーション操
作によるDNAの導入である遺伝子交換（genetic exchang
e）に対しても耐性である。また従来の工業的株は、普
通培地中への高価なアミノ酸の添加を避けるために原栄
養性である。工業的株のその他の特性には、一週間程に
もなる発酵の終りまで続く高い生産性、培地消費の際の
安定な細胞濃度及び特異的な分泌タンパク質の少なくと
も通常は5g/（0.5％w/v）にも及ぶ高い生産性が含ま
れる。
染色体中に隣り合って配置されるか又は散在する遺伝
子を有するトランスホルマント（形質転換体）が得られ
る。一般に、上述の２つのタイプのトランスホルマント
の混合物の中から、個々のトランスホルマントの染色体
DNAを単離し、つづいて例えばサザン法〔Southern,J.Mo
l.Biol.98（1975）503−517〕又は当業者に周知の他の
手段により上記遺伝子の相対的位置について上記DNAを
分析し、それにより上記遺伝子が散在して組込まれてい
るものを同定することにより、散在遺伝子を含むトラン
スホルマントを選択することができる。
タンデムな（重複の）組込みを避け、散在遺伝子トラ
ンスホルマントを得る手段には図1B及び2Bで説明されて
いるダブルレシプロカル組換えの使用、増幅すべきDNA
配列、マーカー遺伝子及び組換えのための標的配列を含
む線状のDNA構築物の使用が含まれる。
さらに、散在遺伝子トランスホルマントを得る特異的
手段には図2Aに示される非正統的組換えの使用がある。
該使用においてはマーカー遺伝子の発現の差を利用する
選択により、タンデムトランスホルマントの単離を避け
ることが可能である。マーカー遺伝子の例は“非タンデ
ム組込みとは異なる遺伝子のタンデムな組込みをもつ株
における抗生物質感受性を示す抗生物質耐性”をコード
する遺伝子である。一般に、介在する内在DNA配列の長
さは10kbp以下であろう。
さらに、タンデムな重複を避け、散在遺伝子を有する
トランスホルマントを得る手段には“受容株に関し、異
なる位置の染色体中に組込まれた構造遺伝子”とマーカ
ー遺伝子とを含むDNA構築物を有する相同的なドナー株
の死滅したプロトプラストの使用がある。
宿主細胞のトランスホーメーションに当ってはその宿
主株から調製されたプロトプラストを用いることが好ま
しい。一般にプロトプラストは従来法、例えばリゾチー
ム又はチモリアーゼ（zymolyaze）処理等の従来法に従
って細胞から調製され、該プロトプラストはその完全生
を維持するための適正な浸透圧を有する適当な媒体の中
に注意深く懸濁される。工業用バチルス属菌株のプロト
プラスト調製法はEP−Ａ−0134048に報告され、該開示
内容は本明細書中に引用されている。宿主株がアルカリ
親和性バチルス株である場合にはプロトプラストは簡便
にアルカリ性pH、好ましくは約pH8.0で調製され得る。
この操作は欧州出願EP−Ａ−87200358.7号に記載され、
その開示内容は本明細書中に引用されている。
宿主細胞は、プラスミド構築物又はクローニング宿主
プロトプラストと宿主細胞プロトプラストとを、適当な
フソゲン（fusogen）〔例えばポリエチレングリコー
ル〕の存在下で結合させることによりトランスホームさ
れ得る。望ましい程度の効率を有するフソゲンはいずれ
も使用され得るが、大抵の場合にポリエチレングリコー
ルは非常に簡便に高い融合効率をもつことが分ってい
る。しばらくして、フソゲン混合物を適当な普通培地と
置換し選択培地上、簡便には寒天培地上に平板培養する
ことで細胞群を再生させる。
宿主細胞と適当なDNA構築物とを合併させることによ
り得られるトランスホルマントは、上記宿主中で機能す
る複製オリジンをそのDNA構築物が含むとき、それら染
色体に組込まれた部分として、もしくは遊離したベクタ
ー分子として、上記DNA構築物又はその一部分を含み得
る。
DNA構築物が染色体に組込まれた場合のトランスホル
マントを選択する方法は、温度感受性の複製オリジンを
含むプラスミドを使用する方法である。トランスホルマ
ントを許容される温度で選択培地を用いて生育させ、そ
れから非許容温度に変える。次に非許容温度でマーカー
遺伝子を発現するコロニーを単離し、さらに選択培地を
用いて許容温度で培養する。プラスミドが存在しないこ
とを実証するには例えばコロニーからの全DNAの単離及
びアガロースゲル上での電気泳動分析又はそのトランス
ホルマントがコンピテント（被感染性）の細胞をトラン
スホームする能力がないことを示すのである。染色体へ
の組込みが起る経緯を示すには、例えばサザン法〔J.Mo
l.Biol.98（1975）503−517〕又は当業者に既知の他方
法により、その染色体DNAを分析することで可能であ
る。
宿主ゲノム中にそのマーカー遺伝子が散在的に組込ま
れたものとは対照的にマーカー遺伝子のコピーをタンデ
ムにもつトランスホルマント（複数）の間に選択試薬に
対する感受性の差が存在する場合には、適当な濃度の選
択試薬を含む培地中でトランスホルマントを生育させる
ことにより、非タンデム組込みを有するトランスホルマ
ントと上記のトランスホルマントとを簡便に選択し得
る。
目的とするDNA配列のいくつかのコピーを散在的に組
込んだトランスホルマントを得る他の手段は、受容細胞
の染色体上の部位とは異なる部位に、目的とするDNA配
列の少なくとも１コピーを含む相同的ドナー細胞から調
製されたプロトプラストを使用することである。相同的
ドナー細胞を調製するには、例えば目的とする構造遺伝
子を含まない細胞を、その構造遺伝子を含ベクターを用
いてトランスホーメーションさせることによるのであ
る。DNA配列をドナー細胞染色体へ組込むには、温度感
受性の複製オリジンをもつプラスミドを使用して遂行
し、そのトランスホルマントをまず許容温度で選択条件
を用いて生育させ、次いで上述のように非許容温度で生
育させてからそのマーカー遺伝子を発現するコロニーを
単離するのである。
プラスミドDNAの不存在を確かめた後に染色体DNAを単
離し、上述のサザン法に従い、例えば32P又はビオチン
結合ヌクレオチドでラベルしたプローベ（探索子）とハ
イブリダイズさせることにより分析し得る。プローベと
しては例えば目的とするポリペプチドをコードするcDNA
又はその断片並びにベクター等の“目的のDNA配列を含
むDNA構築物或いはその断片”を用い得る。遺伝子ドナ
ー株のものとは別の位置に目的の遺伝子を含むトランス
ホルマントを相同的ドナー細胞として用い得る。受容株
宿主としては、目的とするDNA配列の供給源として用い
た菌株と同じ株が好ましく、又はトランスホーメーショ
ンされたドナー細胞の領域とは異なる領域に目的のDNA
配列が存在している株が好ましい。
選択を良好に行なうためには、プロトプラスト形成前
に、又は形成の際に、細胞毒性試薬でドナー細胞を死滅
させることが好ましい。ドナー細胞を死滅させるために
抗生物質を含む種々の試薬を用い得るがヨードアセトア
ミドは簡便で効率的でしかも次工程の融合を阻害しない
ことが知られている。死滅後のクローニング宿主プロト
プラストを用いたときに受容株宿主に対する死滅プロト
プラストの比は少なくとも約1:1であることが好まし
く、また死滅プロトプラストを過剰に用いることもでき
る。
死滅ドナー細胞プロトプラストと受容宿主細胞プロト
プラストとの融合の後にそのトランスホルマントをマー
カー遺伝子によって選択し得る。次にDNAを上述のよう
にして単離し分析し、該トランスホルマント即ち１コピ
ー以上の目的遺伝子をそのゲノム中に組込んでいると共
に、目的遺伝子が内在的染色体配列によって分別即ち離
隔されている該トランスホルマントを同定することがで
きる。
次いで、目的とするポリペプリドを多く発現すること
を検出するために、散在する２つの遺伝子をもつトラン
スホルマントを適当な方法によってスクリーニングす
る。種々の技術が使用されるが特にその検定法が確立し
ている酵素が使われる。或いは酵素を使用しないか有用
な検出システムがない場合にはバイオアッセイ、抗体、
又はDNAあるいはRNAハイブリダイゼーションがそのクロ
ーンのスクリーニングに使われ、プラスミド構築物の存
在及び目的とする構造遺伝子の発現が測定される。
次に、染色体に組込まれたプラスミド構築物又はその
断片を含む宿主細胞を慣用の発酵条件下に普通培地中で
生育させる。その培地が消毒されるまで発酵を続ける。
産生物が分泌される場合にはその産生物を従来法例えば
抽出、クロマトグラフィ、電気泳動又は類似技術によっ
て培地から単離する。産生物が細胞質内に保持される場
合には細胞群を遠心処理、濾過等により収穫し、機械的
破壊、界面活性剤、リゾチーム又は他の技法で溶解さ
せ、前述のようにして産生物を単離する。本発明方法を
用いることにより少なくとも２コピーのDNA配列の安定
な組込みが遺伝子増幅手段として達成され得る。
次に示す例は説明のためであり、制限を意味するもの
ではない。
例 １ アルカリ親和性バチルス新種（novo sp.）PB92からのゲ
ノムDNAライブラリの調製及びセリンプロテアーゼ遺伝
子の単離 サイトー等〔Saito−Miuva.Biochim.Biophys.Acta72
（1963）619−632〕により報告されている操作に従い、
バチルス novo sp.PB92（Laboratorium voor Microbiol
ogie,Technical University of Delft,the Netherland
に受託番号OR−60号の下に保管されている；米国特許R
e.30,602号参照）から単離した染色体DNAを制限酵素Sau
3Aで部分消化し、ついでプラスミドpUB110のBamH I部位
に連結させた〔Gryczan et al.,J.Bacteriol.134（197
8）318−329〕。pUB110プラスミドDNAを文献記載〔Birn
boim and Doly.Nucl.Acids Res.7（1979）1513−1523〕
の方法で調製した。
その連結混合物を、コンピテント細胞群1ml当り0.6〜
１μgDNAの条件を用い文献記載〔Spizizen et al.,J.Ba
cteriol.81（1961）741−746〕の方法に従い、枯草菌1A
40（Bacillus Genetic Stock Centre）へトランスホー
メーションさせた。トランスホーメーション混合物由来
の細胞を、2.8％K2HPO4、1.2％KH2PO4、0.4％（NH4）2S
O4、0.2％クエン酸三ナトリウム・2H2O、0.04％MgSO4・
7H2O、0.00005％MnSO4・4H2O、0.4％Ｌ−グルタミン
酸、0.5％グルコース、0.02％カザミノ酸、50μg/mlト
リプトファン、20μg/mlメチオニン、20μg/mlリジン、
20μg/mlネオマイシン、0.4％カゼイン及び1.5％寒天を
含む最小プレートにプレーティング（平板培養）する。
37℃で１晩そのプレートをインキュベーションした後に
50,000個のネオマイシン耐性コロニーのうちの１つに、
寒天プレート中のコロニーのまわりのカゼイン分解産物
沈殿のハロー（円輪）の増加により測定されるように、
プロテアーゼ産生の増加が見られた。プラスミドDNAを
文献記載〔Birnboim and Doly,Nucleic Acids Res.7（1
979）1513−1523〕の方法に従いこのコロニーから単離
してpM58と命名した。
例 ２ PB92セリン・プロテアーゼ遺伝子の発現 pM58を含む枯草菌1A40を0.02％カザミノ酸、50μg/ml
トリプトファン、20μg/mlメチオニン、20μg/mlリジン
及び20μg/mlネオマイシンを添加した最小培地〔Spiziz
en et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA44（1958）1072−10
78〕中で生育させた。24時間後に培養物を遠心し、基質
としてジメチルカゼインを用いて、その上清のプロテア
ーゼ活性を検定した〔Lin et al.,J.Biol.Chem.244（19
69）789−793〕。コントロールとして用いた、プラスミ
ドpUB110を含む枯草菌1A40の培養物はpM58によるトラン
スホルマントの培養物が示すプロテアーゼ活性の60分の
１以下の活性を示した。プロテアーゼ活性は1mMフェニ
ルスルホニルフルオライド（PMSF）による処理で完全に
阻害されたが、20mMのEDTAによる処理によっては阻害さ
れなかった。
レムリーの方法〔Laemmli,Nature227（1970）680〕に
従い、上述の上清の部分標本をタンパク質ゲルで分析し
た。ゲルでの分析のための試料は５％トリクロロ酢酸
（TCA）による上清の処理により調製された。この試料
の遠心後に沈殿タンパク質のペレットをアセトンで２度
洗浄し、次いで10分間、40μのサンプルバッファ（試
料緩衝液）（0.5Mトリス−塩酸、pH7.5、10％v/v2−メ
ルカプトエタノール、50％v/vグリセリン及び0.05％ブ
ロモフェノールブルウ）中で煮沸することにより溶解さ
せた。電気泳動後のゲルをクマシイブリリアントブルウ
で染色した。次いで培養上清試料を電気泳動により分析
した。３つの別個の枯草菌1A40株（pUB110含有；又はpM
58含有；又はプラスミドなしの３株）を使用し、コント
ロールとしてバチルスPB92のプロテアーゼを使用した。
電気泳動後にそのゲルをクマシイブリリアントブルウに
より染色してから脱色させた。pM58を含む枯草菌1A40株
由来のサンプルはバチルスPB92のプロテアーゼと共に泳
動する31KDのタンパク質を含んでいた。このタンパク質
はpUB110含有の枯草菌1A40のコントロールレーンには検
出されなかった。
全てのセリンプロテアーゼは同じ分子量をもってい
る。それゆえバチルスPB92のクローニングされたセリン
プロテアーゼは、従来のセリンプロテアーゼ（枯草菌ズ
ブチリシン；カールスバーグズブチリシン）と異なるこ
とが、プロテアーゼを含まない枯草菌DB104へのpM58及
びpUB110のトランスホーメーション〔R.Doi,J.Bacterio
l.160（1984）442−444〕により判明すると共に、産生
された細胞外プロテアーゼの分析により判明した。得ら
れたトランスホルマントを0.02％カザミノ酸、50μg/ml
ヒスチジン及び20μg/mlネオマイシンを含む最小培地
〔Spizizen et al.,上掲文献〕中で生育させた。24時間
後に試料をとり、遠心後に、前処理なしに75mM KOH、40
mMヒスチジン、100mM MOPS〔３−（Ｎ−モルホリノ）−
プロパンスルホン酸〕、pH7.5及び５％ポリアクリルア
ミドを含むヒスチジン/MOPSゲルで分析した。40mMヒス
チジン、100mM MOPS（pH6.6）の電気泳動用バッファを
用いた。試料はカソード側に移動する。プロテアーゼバ
ンドをAgfa Pan100プロフェッショナルフィルムで検出
した〔Zuidweg et al.,Biotechnol.and Bioengin.14（1
972）685−714〕。これらの結果を図３に示した。図４
に示したようにpM58はバチルスPB92のプロテアーゼをコ
ードする遺伝子を宿している。
例 ３ バチルスPB92のセリンプロテアーゼ遺伝子のシクエンシ
ング（配列形成） pM58のBal I−Hpa I断片の全配列を、サンガー法〔Sa
nger,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74（1977）6463〕により
決定した。pM58の制限断片をファージM13ベクターmp1
0、mp11、及びmp18中にクローニングした〔Messing et
al.,Nucleic Acids Res.9（1981）309−321〕。pM58断
片の挿入物はプラークハイブリダイゼーションによって
スクリーニングされた。シエクエンシングの後にその遺
伝子上に一定の距離を保った位置の10個のオリゴヌクレ
オチドを作り、シクエンシングを繰り返し、図５に示し
た配列を確定した。
例 ４ セリンプロテアーゼ含有プラスミドpMAX−４の構築 pUCN710（図6A）を構築するためにpUB110をTag I及び
Pvu IIで消化した。ネオマイシン耐性を有する遺伝子を
含む断片を低融点アガロースで精製し、クレナウポリメ
ラーゼ（Klenow polymerase）とNTPとを用いてブラント
エンド（平滑末端）とした〔Maniatis,Molecular Cloni
ng;A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor1982〕。
プラスミドpUC7〔Vieira et al.,Gene19（1982）259−2
68〕をSal Iで線状化し、上述のようにブラントエンド
とした。両断片をT4リガーゼ〔Maniatis〕で連結させ、
大腸菌JM103にトランスホーメーションさせた。50μg/m
lアンピシリン及び10μg/mlのネオマイシンを含む2xTY
プレート（1.6％v/vバクトトリプトン、１％w/vイース
トエキストラクト、0.5％NaCl）で選択を行った。該プ
ラスミドをpUCN710と命名し、このプラスミドをBamH I
で消化した。プラスミドpE194〔Jordanscu,Plasmid 1
（1978）468−479〕をBcl Iで消化した。両消化物由来
の断片をT4リガーゼで連結し、枯草菌1A40にトランスホ
ーメーションさせた。20μg/mlネオマイシンを含む最小
プレート（例１参照）で選択を行なった。得られたプラ
スミドpE194−neo（図6A）はネオマイシン遺伝子と、温
度感受性の複製オリジンとを含んでいる。
組込みベクターpE194−neoへのプロテアーゼ遺伝子の
サブクローニング（subcloning）は次のようにして行な
われた:pM58（例１参照）をHpa I及びBal I及びBal II
で消化する。プラスミドpE194−neoをHpa Iで消化す
る。これらの断片をT4リガーゼで連結し、枯草菌1A40へ
トランスホーメーションさせた。このトランスホルマン
トはネオマイシン耐性及びカゼイン分解産物沈殿によっ
て判断されるプロテアーゼ産生の増加（ハロー形成、例
１参照）に基づいて選択された。プラスミドpMAX−４が
得られ、その構造は制限酵素分析によって確認された
（図6B参照）。
例 ５ pMAX−４による枯草菌PB92のプロトプラストトランスホ
ーメーション バチルスPB92株を100mlのNBSG−Ｘ培地中に一晩生育
させた〔Thorne et al.,J.Bacteriol.91（1966）1012−
1020〕。この培養物をソルバル（Sorvall）モデルGSAロ
ーターを用い、4,500rpmで10分間遠心した。このバチル
スを、0.4mg/mlのリゾチームを加えられた滅菌水中の0.
5Mシュクロース、0.02M MgCl2及び0.02Mトリス／マレイ
ン酸塩（pH8.0）を含む10mlのアルカリ保持培地（AHM）
中に37℃で１時間インキュベーションすることによって
プロトプラストを調製した。プロトプラストをペレット
化し（4,500rpm、10分間）、5mlのAHM+ pH8.0バッファ
〔3.5％w/vバクトペナセイブロス及び0.04％w/vアルブ
ミン・メリュウ（Albumine Merieux）を添加したAHMバ
ッファ〕に懸濁させ、混合してから再び上述のようにし
てペレット化した。5.0mlのアルカリ保持培地に再懸濁
した後にこのプロトプラスト懸濁液0.5mlを、１μｇの
プラスミドDNAを含む５μｇの脱イオン水と混合し、30
％w/vポリエチレングリコール8,000（pH8.0）の存在下
に２分間インキュベートした。AHM+（pH8.0）培地を用
いて1:3に希釈し、次いで遠心した後にそのペレットを
少量（1ml）のAHM+に懸濁させ、さらに２〜３時間イン
キュベートした。100マイクロリットルの部分標本を、
0.5Mコハク酸ナトリウム/HCl（pH8.0）、1.5％w/v寒
天、0.5％w/vカザミノ酸、0.5％w/vイースト・エクスト
ラクト、0.031Mリン酸バッファ（pH8.0）、0.5％w/vグ
ルコース、0.02M MgCl2及び0.02％w/vアルブミン・メリ
ュウを含む新規調製の再生プレートにプレーティングし
た。また、これらのプレートを選択に用いる場合には10
00μg/mlのネオマイシンを添加する。37℃で、少なくと
も72時間インキュベーションした後にそのコロニーにつ
いて20μg/mlのネオマイシンを含むハートインフュージ
ョン（心臓浸出）寒天プレートを用い、レプリカ−プレ
ーティング（reprica−plated）を行なった。
例 ６ バチルスPB92株染色体へのpMAX−４の組込み プラスミドpMAX−４を含む“バチルスPB92のトランス
ホルマント”を、１μg/ml又は20μg/mlのネオマイシン
を含むトリプトンソーヤブロス（TSB）中で37℃に24時
間インキュベーションする。この細胞サスペンションの
2mlを夫々１μｇ又は20μg/mlのネオマイシンを含むTSB
100mlで希釈し、50℃で24時間インキュベートする。24
時間後に両培養液の各5mlを上述のように再び希釈し、
それぞれ１μg/ml又は20μg/mlのネオマイシンの存在下
で再び50℃で24時間インキュベーションする。この最後
の操作をもう１度繰返す。次にこの細胞サスペンション
を100倍に希釈し、１μg/mlネオマイシンを含むフラス
コ由来の試料については１μg/mlネオマイシンを含むハ
ートインフュージョン（HI）寒天プレートに、他方にお
いて20μg/mlネオマイシンを含むフラスコ由来の試料に
ついては、20μg/mlネオマイシンを含むプレートにプレ
ーティングした。これらのプレートを50℃で16時間、イ
ンキュベートする。ネオマイシン耐性コロニーを単離
し、１μg/mlネオマイシンを含む10mlのTSB培地中、37
℃で16時間培養した。これらの培養物から全DNAを単離
した〔Holmes et al.,Anal.Biochem.114（1981）193−1
97〕。プラスミドの不存在はアガロース・ゲルでのDNA
の電気泳動で確められた。プラスミドDNAの検出されな
かった試料にプラスミドDNAが不存在であることは、全D
NAを枯草菌1A40にトランスホーメーションすることによ
って確認された。枯草菌1A40をトランスホーメーション
させ得ない試料はプラスミド不含有であると考えられ
た。
染色体中へのpMAX−４の組込みの有無及びその経緯を
チェックするために、染色体DNAを単離し、Hind IIIで
消化させた後に0.5％DNAアガロースゲルで電気泳動さ
せ、ニトロセルロースにブロッティング〔Southern,J.M
ol.Biol.98（1975）503−517〕してから32Pラベルを付
し、ニックトランスレーションを行なったpM58〔Maniat
is,1982〕を用いてハイブリダイゼーションさせた。こ
の分析結果を図7Aに示した。
１μg/mlネオマイシンでの選択を行ない、相同的組換
えの結果（カンベル型メカニズム）として“染色体中に
タンデムに配置され、かつプラスミド配列（PBT109株）
で分離されたプロテアーゼ遺伝子”が得られた。30個の
個別に単離された組込み体について、選択は１μg/mlネ
オマイシンを用いて行なわれた。非正統的組換えの結
果、染色体中にランダムに位置するプラスミドpMAX−４
を含むひとつの組込み体が得られた。20μg/mlネオマイ
シンによる選択で非正統的組換えを行なった結果染色体
上にランダムに位置するプラスミドpMAX−４の１コピー
が生じた。後者の株はPBT108と命名された。PBT109及び
108の遺伝子構成を図7B及び7Cに示した。染色体分析の
結果により、PBT122及びPBT108における組込みは染色体
中の異なる位置に生じていることが示された。
例 ７ PBT108及びPBT109における複製されたプロテアーゼ遺伝
子の安定性 500mlの振盪フラスコ中のネオマイシン不含有の100ml
の産生用培地（１％デンプン、４％ラクトース、0.87％
K2HPO4、0.5％イーストエキストラクト、0.5％（NH4）2
HPO4、0.2％クエン酸ナトリウム・2H2O、0.05％MgSO4・
7H2O、0.07％CaCl2、0.068％FeSO4・7H2O及び消泡剤1ml
/を含む）をPBT108またはPBT109のTSBの一晩培養物
（37℃）の0.2ml中でインキュベートした。一定通気の
下、37℃で44時間のインキュベーションの後にその培養
物についてネオマイシン耐性コロニー及びプロテアーゼ
活性のテストをした。
PBT108及びPBT109の両株を10の大量製造の効果をチ
ェックするため、同じ産生培地を含むエシュワイラー
（Eschweiler）発酵器を用いるテストをも行なった。こ
の発酵実験の結果を表１に示す。
２日間の培養後にPBT109のエシュワイラー発酵由来の
コロニー分析を行なったところ、それらコロニーの３〜
25％が唯一のプロテアーゼ遺伝子を含む株のレベルの産
生を行なうことを示した。これらの同じコロニーは、相
同的組換えによるpMAX−４配列の切除にもとづき、ネオ
マイシン感受性であることが分った。しかしPBT108発酵
実験由来のコロニーの分析では、これら細胞全てがネオ
マイシン耐性であることが示された。100個のこれらネ
オマイシン耐性コロニーをランダムに取り、それらがも
つ生産的プロテアーゼ遺伝子が１つか２つかを決めるた
め、プロテアーゼ産生能を個々にテストした。テストさ
れた個々の100個のコロニーの全ては２個の遺伝子を含
む株と同じレベルの産生を行なったがこのことは、PBT1
08中にランダムに組込まれた２つの遺伝子はこの発酵条
件下で安定に維持されていることを示している。
例 ８ 組込みベクターpElatBの構築 EPA0134048号明細書記載のプラスミドpGB34を、制限
酵素Bcl I、Bgl I及びBgl IIの使用によって消化した。
得られる制限断片を、クレナウポリメラーゼでブラント
エンドとし、次にpE194−neo（例６参照）のHpa I部位
に連結させた。プラスミドpE194−neo DNAの単離はバー
ンボイム（Birnboim）及びドリー（Doly）の方法〔Nuc
l.Acids.Res.7（1979）1513−1523〕に従って遂行され
た。
この連結混合物を、コンピテント細胞の1ml当り0.5〜
１μgDNAを用い、スピチゼン（Spizizen）法〔J.Bacter
iol.81（1961）741−746〕に従って枯草菌1A40にトラン
スホーメーションさせた。このトランスホーメーション
混合物由来の細胞群を2.8％K2HPO4、1.2％KH2PO4、0.4
％（NH4）2SO4、0.2％クエン酸トリナトリウム・2H2O、
0.04％MgSO4・7H2O、0.00005％MnSO4・4H2O、0.4％グル
タミン酸、0.5％グルコース、0.02％カザミノ酸、50μg
/mlトリプトファン、20μg/mlメチオニン、20μg/mlリ
ジン、20μg/mlネオマイシン、0.4％カゼイン、0.5％デ
ンプン及び1.5％寒天を含む最小プレートにプレーティ
ングした。バーンボイム−ドリー法に従って、α−アミ
ラーゼ産生コロニーのDNAを単離し、制限酵素でチェッ
クした。これらのトランスホルマントの１つからプラズ
ミドpElatB（図８参照）を単離した。
例 ９ α−アミラーゼ不含有のバチルスリヘニホルミスT9株の
pElatBによるトランスホーメーション 全操作を37℃の代りに30℃で行うことの他は、EP−Ａ
−0253455号明細書記載の方法に従って、バチルスリヘ
ニホルミスT9株のトランスホーメーションを行なった。
トランスホルマントの選択は20μg/mlネオマイシンを含
む最小プレートで行なわれた。全てのトランスホルマン
トは、アミラーゼを産生した。バーンボイム−ドリー法
によって調製されたDNAについて行なった制限酵素分析
は全てのトランスホルマントがpElatBを含むことを示し
た。
例 10 B.リヘニホルミスT9染色体へのpElatBの組込み プラスミドpElatBを含むバチルスリヘニホルミスT9株
を、20μg/mlネオマイシンを含むトリプトソーヤブロス
（TSB）に接種し、30℃で16時間インキェベーションし
た。この細胞サスペンジョン5mlを、同培地100mlで希釈
し、50℃で24時間インキュベーションした。
この操作をもう一度繰返す。次にこの細胞サスペンジ
ョンを100倍に希釈し、10μg/mlネオマイシンを含むハ
ートインフュージョン寒天プレートにプレーティングし
た。50℃、40時間のインキュベーションの後にネオマイ
シン耐性コロニーを単離し、ネオマイシン10μg/mlを含
む10mlのTSB培地中、30℃で16時間培養した。これら培
養物の全DNAを単離した〔Holmes et al.,Anal.Biochem.
114（1981）193−197〕。これらの細胞群はプラスミド
を有していないことがアガロースゲルを用いたDNA電気
泳動で確められた。低分子量のDNAを事実上含まない試
料については、枯草菌１−A40へのDNAトランスホーメー
ションにより〔Spizizen et al.,1961〕プラスミドDNA
の不存在を再チェックした。枯草菌１−A40をネオマイ
シン耐性菌へトランスホーメーションさせ得ない試料は
プラスミドを含まないものと考えられた。
pElatBの組込みが起きたかどうか、及びそれがどのよ
うに起きたかをチェックするため、染色体DNAをトラン
スホルマントから単離し〔Saito−Minwa,Biochem.Bioph
ys.Acta72（1963）619−632〕、EcoR Iで消化し、0.5％
アガロースゲルで分画した後にニトロセルロースにブロ
ッティング〔Southern,J.Mol.Biol.98（1975）503−51
7〕としてから32Pでラベルされ、ニックトランスレーシ
ョンされたpGB33を用いてハイブリダイゼーションさせ
た〔EP−Ａ−0134048参照〕。この分析結果を図9Aに示
した。このデータは、pElatBの非正統的組換えが起こ
り、本来のバチルスリヘニホルミスT5アミラーゼ株と比
べ、そのゲノムの異なる位置に唯一のアミラーゼ遺伝子
を含む株が生成したことを示している。このpElatBを含
む株をTB13と命名した。
例 11 内在性染色体配列によって分離された２つのアミラーゼ
遺伝子を含むT13F株の構築 内在性の染色体DNA配列によって分離された２つのア
ミラーゼ遺伝子を含む株を開発するため、バチルス・リ
ヘニホルミスT5株（本来のアミラーゼ遺伝子を含むアミ
ラーゼ株;EP−Ａ−0134048参照）と、TB13株（ランダム
に組込まれたアミラーゼ遺伝子を含む株）との間で融合
を行なわせた。プロトプラスト融合はEP−Ａ−0134048
号の方法に従って行なわれたが該方法は本明細書中に引
用されている。プロトプラスト形成前にTB13菌株をヨー
ドアセトアミドで死滅させた。T5株（ネオマイシン感受
性）はこれを死滅させなかった。融合体の選択は、10μ
g/mlのネオマイシンを含む再生プレートの使用で行なわ
れた。
潜在的融合体をチェックし及び同定するために、染色
体DNAを単離し、EcoI Rで消化し、0.5％アガロースゲル
による分画後、ニトロセルロースフィルターにブロッテ
ィング〔Southern,J.Mol.Biol 98（1975）503−517〕し
た後に32PラベルのニックトランスレーションしたpGB33
を用いてハイブリダイゼーションさせた（EP−Ａ−0134
048参照）。この分析結果を図9Bに示す。得られた融合
体のひとつ、即ちT13Fは、内在性染色体配列で分離され
た２個のアミラーゼ遺伝子を含んでいた。
例 12 T390及びT13F株中の重複したアミラーゼ遺伝子の安定性 “本質的な染色体配列によって分離された２つの染色
体アミラーゼ遺伝子を含むT13F株”の安定性を、タンデ
ムに位置する２つの染色体アミラーゼ遺伝子をもつT390
株の安定性と比較した。T390株の調製法はB.リヘニホル
ミスT5（pGB33）を記載しているEP−Ａ−134048号明細
書（第17頁第１表）に開示されている。T13F及びT390株
を発酵条件下でテストした。すなわち0.2mlのTSBの１晩
培養物（37℃）を、ネオマイシンを含まない100mlの産
生用培地（例７参照；滅菌後にpHをNaOHでpH6.9に調
整）を有する500ml振盪フラスコに接種した。定常通気
を行ない、40℃で６日間のインキュベーションの後にこ
の培養物についてネオマイシン耐性コロニー形成及びア
ミラーゼ活性のテストを行なった。この発酵実験の結果
を表２にまとめた。
T13F株中のネオマイシン遺伝子の付随的なロスを伴う
ことなく、ひとつのアミラーゼ遺伝子の切除の可能性を
排除するため、T13F発酵由来の20個のコロニーを分析し
た。ランダムに選択された20個のコロニーから由来する
染色体DNAを単離し、先に述べたようにしてハイブリダ
イゼーション実験で特徴を調べた。これらの分析対象の
うちの９個についての結果を図10に示した。テストされ
た全ての株は２個のアミラーゼ遺伝子を含んでいたがこ
のことはそれら染色体DNA中で２個のα−アミラーゼ遺
伝子を含むEcoR I断片の存在によって判明するのであ
る。
T13F株の遺伝的安定性とは対照的に、T390株は発酵に
際し不安定であり、12％のネオマイシン感受性コロニー
を生じた。これらのコロニーのひとつを分析するとひと
つのα−アミラーゼ遺伝子しか含んでいないことが分っ
た（図10、レーン４）。このことは即ち、ランダムに組
込まれたアミラーゼ遺伝子は発酵条件下で、タンデムに
組込まれた遺伝子よりも安定であることを示している。
上記の結果から“増幅されるべき構造遺伝子の少なく
とも２コピーの非タンデム組込みが細胞内で起ったトラ
ンスホーメーションされた該細胞”を選ぶことで“安定
な遺伝子増幅が達成される原核細胞”が得られることが
明らかになった。組込みは相同的組換え又は非正統的組
換えで達成される。
本明細書で述べられている全ての刊行物及び特許出願
書類は、本発明が関係する分野の技術者のレベルで示さ
れている。全刊行物及び特許出願書類は、個々の刊行物
又は特許出願が特別に個々に参考として引用しているの
と同じ程度にここでも参考として引用されている。
本発明は本明細書中に十分に記述されているので、本
発明の精神又は範囲を逸脱することなしに、これに変化
及び修正を施し得ることは通常の知識をもつ当業者にと
って明らかであろう。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 ファン デル ラーン ヨハネス コル ネリス オランダ国 エヌエル―1062 セーペー アムステルダム イェー ヨングキン トストラート 81―１ (72)発明者 ミュレネルス レオナルデュス ヨハネ ス ソフィー マリー オランダ国 エヌエル―5121 エスヴェ ー レイエン エクゼストラート 42

Claims (35)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】目的とするポリペプチドをコードするDNA
    配列の少なくとも２コピーを染色体中に含み、該コピー
    は宿主細胞に対して生命維持に必須である内在性染色体
    DNAによって離隔されており、かつ該コピーが安定に維
    持されることを特徴とする、形質転換された原核性宿主
    細胞。
  2. 【請求項２】目的とするポリペプチドをコードするDNA
    配列の少なくとも２コピーを含み、該コピーは宿主細胞
    に対して生命維持に必須である内在性染色体DNAによっ
    て離隔されており、かつ該コピーは安定に維持される、
    形質転換された原核性宿主細胞であって、 該細胞が下記の各工程を含む方法によって製造される細
    胞であることを特徴とする上記原核性宿主細胞： 該DNA配列の少なくとも１コピーを染色体中に組込んで
    有している受容宿主細胞と、（ａ）該DNA配列の少なく
    とも１コピー及び少なくとも１個のマーカー遺伝子並び
    に温度感受性複製オリジンを含むDNA構築物又は（ｂ）
    該DNA構築物を含むドナー宿主細胞とを、形質転換を行
    なわせる条件下で結合させ； 該DNA構築物が形質転換体の染色体に組込まれた該形質
    転換体を選択し； 宿主細胞に対して生命維持に必須である内在性DNAによ
    って離隔されており、かつ該コピーが安定に維持される
    ことを特徴とする、該DNA配列の少なくとも２コピーを
    含む形質転換された原核性宿主細胞を、該形質転換体の
    中から単離する。
  3. 【請求項３】該原核性細胞がバチルス属菌株である請求
    の範囲（１）又は（２）記載の形質転換された原核性宿
    主細胞。
  4. 【請求項４】該バチルス属菌株がアルカリ親和性バチル
    ス属菌株又はバチルスリヘニホルミス宿主株である請求
    の範囲（３）記載の形質転換された原核性宿主細胞。
  5. 【請求項５】該アルカリ親和性バチルス属菌株がバチル
    ス新種PB92又はその突然変異株もしくは変異株である請
    求の範囲（４）記載の形質転換された原核性宿主細胞。
  6. 【請求項６】該バチルスリヘニホルミス宿主株がバチル
    スリヘニホルミスT5株又はその突然変異株もしくは変異
    株である請求の範囲（４）記載の形質転換された原核性
    宿主細胞。
  7. 【請求項７】目的とする該ポリペプチドが酵素である請
    求の範囲（１）又は（２）記載の形質転換された原核性
    宿主細胞。
  8. 【請求項８】該酵素がタンパク質分解酵素又はデンプン
    分解酵素である請求の範囲（７）記載の形質転換された
    原核性宿主細胞。
  9. 【請求項９】該タンパク質分解酵素がセリンプロテアー
    ゼである請求の範囲（８）記載の形質転換された原核性
    宿主細胞。
  10. 【請求項１０】該セリンプロテアーゼが実質的に次に示
    すアミノ酸配列を含む請求の範囲（９）記載の形質転換
    された原核性宿主細胞： H2N−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｒ−Ｖ−
    Ｑ−Ａ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｈ−Ｎ−Ｒ−Ｇ−Ｌ−Ｔ−Ｇ−Ｓ
    −Ｇ−Ｖ− Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｔ−Ｈ−Ｐ
    −Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｉ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｖ−Ｐ−
    Ｇ−Ｅ−Ｐ− Ｓ−Ｔ−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−Ａ
    −Ｇ−Ｔ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｎ−Ｎ−Ｓ−Ｉ−Ｇ−Ｖ−
    Ｌ−Ｇ−Ｖ− Ａ−Ｐ−Ｎ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｇ
    −Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｉ−Ａ−Ｑ−
    Ｇ−Ｌ−Ｅ− Ｗ−Ａ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｇ−Ｍ−Ｈ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｌ−Ｓ
    −Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−
    Ａ−Ｖ−Ｎ− Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｓ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｓ
    −Ｇ−Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｉ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ａ−
    Ｒ−Ｙ−Ａ− Ｎ−Ａ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｎ−Ｎ
    −Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｓ−Ｑ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−
    Ｉ−Ｖ−Ａ− Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−Ｔ
    −Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｓ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−
    Ｈ−Ｖ−Ａ− Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｑ−Ｋ−Ｎ−Ｐ−Ｓ−Ｗ
    −Ｓ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−Ｉ−Ｒ−Ｎ−Ｈ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｔ−
    Ａ−Ｔ−Ｓ− Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｎ
    −Ａ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｒ−COOH
  11. 【請求項１１】該デンプン分解酵素がα−アミラーゼで
    ある請求の範囲（８）記載の形質転換された原核性宿主
    細胞。
  12. 【請求項１２】バチルス新種PB92又はその突然変異株或
    いは変異株の染色体が該DNA配列を含む請求の範囲
    （１）又は（２）記載の形質転換された原核性宿主細
    胞。
  13. 【請求項１３】バチルスリヘニホルミスT5株又はその突
    然変異株或いは変異株が該DNA配列を含む請求の範囲
    （１）又は（２）記載の形質転換された原核性宿主細
    胞。
  14. 【請求項１４】目的とするポリペプチドをコードするDN
    A配列の少なくとも２コピーを染色体中に含み、該コピ
    ーは宿主細胞に対して生命維持に必須である内在性染色
    体DNAによって離隔されており、かつ該コピーが安定に
    維持されることを特徴とする、形質転換された原核性宿
    主細胞の製造方法であって、下記の各工程を含む上記方
    法： 該DNA配列の少なくとも１コピーを染色体中に組込んで
    有している受容宿主細胞と、（ａ）該DNA配列の少なく
    とも１コピー及び少なくとも個のマーカー遺伝子並びに
    温度感受性複製オリジンを含むDNA構築物又は（ｂ）該D
    NA構築物を含むドナー宿主細胞とを、形質転換を行なわ
    せる条件下で結合させ； 該DNA構築物が形質転換体の染色体に組込まれた該形質
    転換体を選択し；及び 宿主細胞に対して生命維持に必須である内在性DNAによ
    って離隔されている、該DNA配列の少なくとも２コピー
    を含む形質転換された原核性宿主細胞を、該形質転換体
    の中から単離する。
  15. 【請求項１５】該選択が下記の各工程を含む請求の範囲
    （14）記載の方法： マーカー遺伝子を含むDNA構築物を有する該形質転換体
    を、該マーカー遺伝子によって対毒物耐性が与えられる
    該毒物の存在下で生育させ； 該形質転換体からプラスミド不含有の形質転換体を同定
    し、単離する。
  16. 【請求項１６】該選択が下記の各工程を含む請求の範囲
    （14）記載の方法： マーカー遺伝子及び温度感受性複数オリジンを含むDNA
    構築物を有する該形質転換体を非許容温度で毒物存在下
    に生育させ； 該形質転換体の中からプラスミド不含有の形質転換体を
    選択する。
  17. 【請求項１７】該単離が下記の各工程を含む請求の範囲
    （14）記載の方法： 該形質転換体から染色体DNAを単離し； 該染色体DNAを、該DNA構築物又はその断片を含むラベル
    付きのプローブとハイブリダイズさせ、かようにして、
    ラベルを検出することによって該形質転換された原核性
    宿主細胞を選択する。
  18. 【請求項１８】該ドナー宿主細胞を調製する操作が下記
    の各工程を含む請求の範囲（14）記載の方法： 目的とするポリペプチドをコードするDNA配列を欠く原
    核性細胞と該DNA構築物とを融合条件下で結合させ； 形質転換細胞を単離し； 該形質転換細胞を非許容温度下で生育させ；及び 該DNA構築物が該受容宿主細胞の染色体上で異なる位置
    に組込まれている形質転換細胞を同定し、単離する。
  19. 【請求項１９】該原核性細胞がバチルス属の細胞である
    請求の範囲（14）〜（18）のいずれか１項に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】該バチルス属の細胞がアルカリ親和性バ
    チルス属菌株もしくはB.リヘニホルミス株である請求の
    範囲（19）記載の方法。
  21. 【請求項２１】該アルカリ親和性バチルス属菌株がバチ
    ルス新種PB92であり、該B.リヘニホルミス株がB.リヘニ
    ホルミスT5株である請求の範囲（20）記載の方法。
  22. 【請求項２２】目的とする該ポリペプチドが酵素である
    請求の範囲（14）〜（21）のいずれか１項に記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】該酵素がセリンプロテアーゼ又はアミラ
    ーゼである請求の範囲（22）記載の方法。
  24. 【請求項２４】該セリンプロテアーゼがバチルス新種PB
    92由来のセリンプロテアーゼをコードする遺伝子と、ヌ
    クレオチド配列において少なくとも70％の相同性を有す
    る請求の範囲（23）記載の方法。
  25. 【請求項２５】該セリンプロテアーゼが実質的に次に示
    すアミノ酸配列を有する請求の範囲（23）又は（24）記
    載の方法： H2N−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｐ−Ｗ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｒ−Ｖ−
    Ｑ−Ａ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｈ−Ｎ−Ｒ−Ｇ−Ｌ−Ｔ−Ｇ−Ｓ
    −Ｇ−Ｖ− Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｔ−Ｈ−Ｐ
    −Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｉ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｖ−Ｐ−
    Ｇ−Ｅ−Ｐ− Ｓ−Ｔ−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｈ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−Ａ
    −Ｇ−Ｔ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｎ−Ｎ−Ｓ−Ｉ−Ｇ−Ｖ−
    Ｌ−Ｇ−Ｖ− Ａ−Ｐ−Ｎ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｇ
    −Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｉ−Ａ−Ｑ−
    Ｇ−Ｌ−Ｅ− Ｗ−Ａ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｇ−Ｍ−Ｈ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｌ−Ｓ
    −Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−
    Ａ−Ｖ−Ｎ− Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｓ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｓ
    −Ｇ−Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｉ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ａ−
    Ｒ−Ｙ−Ａ− Ｎ−Ａ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｎ−Ｎ
    −Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｆ−Ｓ−Ｑ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−
    Ｉ−Ｖ−Ａ− Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−Ｔ
    −Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｓ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−
    Ｈ−Ｖ−Ａ− Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｑ−Ｋ−Ｎ−Ｐ−Ｓ−Ｗ
    −Ｓ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−Ｉ−Ｒ−Ｎ−Ｈ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｔ−
    Ａ−Ｔ−Ｓ− Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｎ
    −Ａ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｒ−COOH
  26. 【請求項２６】該DNA構築物が組み換えプラスミドpMax
    −４又は組み換えプラスミドpElatBから選択され、 該プラスミドpMax−４は、バチルス新種PB92内に包含さ
    れるバチルスPB92プロテアーゼをコードする遺伝子、プ
    ラスミドpE194から誘導される温度感受性複製オリジ
    ン、及びネオマイシン耐性遺伝子を含有し、 該組み換えプラスミドpElatBは、プラスミドpGB34（バ
    チルスサブチルス1S−5S（CBS467.83）の名において寄
    託されている）内に包含される、α−アミラーゼをコー
    ドする遺伝子、プラスミドpE194から誘導される温度感
    受性複製オリジン、及びネオマイシン耐性遺伝子を含有
    する、請求の範囲（14）〜（25）のいずれか１項に記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】該DNA配列が非正統的組換えによって組
    込まれる請求の範囲（14）〜（26）のいずれか１項に記
    載の方法。
  28. 【請求項２８】該DNA配列が相同的組換えによって組込
    まれる請求の範囲（14）〜（26）のいずれか１項に記載
    の方法。
  29. 【請求項２９】該DNA構築物が温度感受性の複数オリジ
    ンをさらに含む請求の範囲（14）〜（26）のいずれか１
    項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】該温度感受性プラスミドがプラスミドpE
    194から導かれる請求の範囲（29）記載の方法。
  31. 【請求項３１】請求の範囲（26）の方法により、プラス
    ミドpMax−４を、バチルス新種PB92内に組み込み、20μ
    g/mlのネオマイシンの分泌を行うことにより得られるバ
    チルス株PBT108であって、該株に対して生命維持に必須
    である内在性染色体DNA配列により離隔されているアル
    カリプロテアーゼをコードする二種類の遺伝子を含有す
    る、上記バチルス株PBT108。
  32. 【請求項３２】請求の範囲（26）の方法により、プラス
    ミドpMax−４を、バチルス新種PB92内に組み込み、１μ
    g/mlのネオマイシンの分泌を行うことにより得られるバ
    チルス株PBT122であって、該株に対して生命維持に必須
    である内在性染色体DNA配列により離隔されているアル
    カリプロテアーゼをコードする二種類の遺伝子を含有す
    る、上記バチルス株PBT122
  33. 【請求項３３】請求項（26）の方法により、ゲノムプラ
    スミドpElatB内に組み込まれた、B.リヘニホルミス株T5
    及びB.リヘニホルミス株T5のα−アミラーゼ変異株であ
    るB.リヘニホルミス株T9のプロトプラストをプロトプラ
    スト融合することにより得られるバチルス株T13Fであっ
    て、該株に対して生命維持に必須である内在性染色体DN
    A配列により離隔されているα−アミラーゼをコードす
    る二種類の遺伝子を含有する、バチルス株T13F。
  34. 【請求項３４】請求項（１）〜（13）のいずれか１項に
    記載の形質転換された原核宿主細胞を、慣用的な培養条
    件下において培養し、目的のポリペプチドを単離するこ
    とを含む、目的のポリペプチドを製造する方法。
  35. 【請求項３５】請求項（14）〜（30）のいずれか１項に
    記載の方法により得られる、目的のポリペプチドをコー
    ドする形質転換された原核宿主細胞を、慣用的な培養条
    件において培養し、目的の該ポリペプチドを単離するこ
    とを含む、目的のポリペプチドを製造する方法。
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