JPS6070075A - 真核生物のカルボニル水解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、適当な宿主中での組換え技術を用いた蛋白質
の生産およびその処置に関するものである。さらに詳し
くは、本発明はサブチリシンおよび中性プロテアーゼの
ような原核生物の（原核性）プロテアーゼを組換え微生
物宿主を用いて生産する方法、微生物宿主により外来性
蛋白質を合成させる方法、および酵素類の特性を改良す
るための、該酵素の方向づけられた変異誘発法に関する
ものである。

水流」しＬ調ｌ− 多くの細菌類は、そのライフサイクルのある時期におい
てプロテアーゼを分泌することは知られＣいる。桿菌類
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）は２つの主要な細胞外プロテア
ーゼ、中性プロテアーゼ（ＥＤＴＡによりｌ止されるメ
タロ（金属）プロテアーゼ）１３− およびアルカリ性プロテアーゼ（即ちサブチリシン、セ
リン・エンドプロテアーゼ）を生産する。

この両者は、その培養物が指数増殖期を過ぎ、定常期に
入って胞子形成を開始すると、最も多最に生産される。

これらの２つのプロテアーゼの生理学的役割は明らかで
ない。それらは、胞子形成において役割を果している（
Ｊ、Ｈｏｃｈ、１９７６゜”Ａｄｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　
”　１８　：　６９−９８　：　Ｐ、　ＰｉｑｇＯｔ　
ラ１９７６、”Ｂａｃｔ、Ｒｅｖ、　”　４０　：　９
０８−９６２；およびＦ、Ｐｒ１ｅｓｔ、１９７７．　
”Ｂａｃｔ、Ｒｅｖ、　”　４上ニア１ｌ−７５３）、
細胞壁の改変にＭ与しＴいる（Ｌ、ＪｏｌｌｉＨｅら１
９８０゜”Ｊ、Ｂａｃｔ、”　１４１　：１１９９−１
２０８）、および捕捉酵素である（　ｐ　ｒｉｅｓｔ、
同上）などと推測されてきた。プロテアーゼ遺伝子の発
現の調整は複雑である。胞子形成の初期の段階でブロッ
クされたミュータントはアルカリ性および中性プロテア
ーゼ両者の生産量が少ないので、それらは胞子形成と関
連して協調的に調整されていると思われる。さらに、プ
ロテアーゼおよびその伯の分泌１４− される遺伝子生産物、例えばアミラーゼおよびレバンザ
ッカラーゼ（ｐｒｉｅｓｔ、前記）の発現レベルに影響
をうえる多数の多形質発現ミューチージョンが存在して
いる。

サブヂリシンは工業および商業的な応用範囲が非常に広
い（米国特許第３６２３９５７およびＪ。

Ｍ　１ｌｌｅｔ、１９７０　、”　Ｊ　、　Ａｌ１ｐ１
．Ｂａｃｔ、”　ＩＬ’２０７）。例えばサブヂリシン
およびその他のプロテアーゼは通常洗剤として使用され
、蛋白質に基づくじみを除去することができる。これら
はまた、食品加工にも使用され、食品材料中に存在する
蛋白質用物質を組成物中、所望の形にすることができる
。

Ｌ１炎順 照ＩＪｊｌおよび化学物質などの試剤および手段によっ
て細菌を変異誘発させる典型的な方法により、プロテア
ーゼの分泌が起る増殖期、そのタイミングおよび分泌さ
れたプロテアーゼの活性レベルについて異なった性質を
示す多血症のミコータント株が生産される。しかし、そ
の変異誘発過程が基本的に不規則であり、所望の性質に
近付いた微生物を同定するのに必要な選択およびスクリ
ーニング法が冗長であるため、これらの株はその究極的
な潜在能力に近付いていない。ざらにこれらのミコータ
ントはその親株、即ち野生型株に復帰することができる
。このような場合には所望の性質は失われてしまう。不
規則な変異誘発によって処理した場合、ミューチージョ
ンのタイプや部位は解らないか、あるいはほとんど特性
化できないので、復帰の可能性も解らない。このことは
酵素合成■１菌に基づく工業的生産に著しい不安定を付
与することになる。最少に、古典的な変異誘発法は、過
度の未熟溶菌のような望ましくない性質を、例えばプロ
テアーゼレベルの低下のような望ましい表現形質と共に
表わすことが多い。

桿菌類によって分泌されるプロテアーゼに関しては特別
の問題が存在している。その１つは、そのようなプロテ
アーゼは少なくども２種存在しているので一方のみの欠
落をスクリーニングすることが難しいことである。さら
に、胞子形成おにびプ［］テアーゼ生産の両者に影響を
与える多数の多形質発現ミューデージョンは、真のプロ
テアーゼミューチー・ジョンの分離を困難にする。

中性プロテアーゼ遺伝子の温度感受性ミュータントが通
常の変異誘発技術により得られており、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓのクロモシーム（染色体）中の調
節および構造遺伝子の位置を決めるのに使用されティる
（　Ｈ、Ｕ　ｅｈａｒａら１９７９．”Ｊ。

Ｂａｃｔ、”　１３９　：　５８３−５９０）、さらに
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の推定のナンセンスミュ
ーチージョンが報告されている（　Ｃ、Ｒｏｉｔｓｃｈ
ら１９８３．　”Ｊ、　Ｂａｃｔ、”　１５５　：　１
４５−１５２）。

不活性なセリンプロテア−げまたは非常に減少した濃度
のセリンプロテアーゼを生産する桿菌の温度感受性ミュ
ータントが単離されている。しかしこれらのミュータン
トは無胞子性であり、約１０−７〜１０−８の野生型へ
の復帰頻度を示す（Ｆ　、　Ｐ　ｒｉｅｓｔ同上７１同
頁７１９頁らのミュータントは外来性蛋白質の組換体に
よる生産には不１７− 適当である。と言うのは、無胞子性ミュータントは胞子
形成ミュータントより最少培地中でのその増殖サイクル
の初期の段階において溶菌する傾向があり、そのため細
胞内容物（細胞内プロテアーゼを含む）が培養上清中に
未成熟で放出されるからである。野生型復帰体は培養上
清を、それが分泌したプロテアーゼで汚染するので、復
帰の可能性を有することも望ましくない。

桿菌類（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）は外来ｆ！ｌ−
蛋白質の発現用として提案されたが、分泌されたプロテ
アーゼが存在し、所望の生産物がそれによって強力に加
水分解されるため、外来性蛋白質発現のための宿主とし
て桿菌類を商業的に受入れることがばれてきた。胞子形
成をすることができ、増殖期に胞子形成に関連してプロ
テアーゼを発現しないＢａＣ１１１ｕｓ　ｍｅｇａｔｅ
ｒ＋ｕｍミュータントが報告されている。

しかし採用された分析法は伯のプロテアーゼ類の存在を
除外しなかったし、問題のプロテアーゼは胞子形成期に
は発現される（　Ｃ、Ｌ　ｏｓｈｏｎら１９８２　、”
Ｊ　、　Ｂａｃｔ、”上５０　：　３０３−３１１　＞
。

１８− 勿論これは、外来性蛋白質が培養中に蓄積し、傷つぎや
すい時期である。

ＬＬＬ列１Ｌ 本発明の目的は、増殖サイクルのあらゆる時点において
細胞外中性およびアルカリ性プロテアーゼを実質的に含
んでおらず、実質的に正常な胞子形成特性を示す桿菌株
を組立てることである。外来性（ヘアロローガス）また
は内性〈ホモローガス）の蛋白質を発現するためのコピ
ー数の高いプラスミドで形質転換し得る復帰不能の微生
物、さもなくば正常なプロテア−ぜを含んでいない微生
物が要求されている。

入手し得るス１ヘツクのものとは異なる性質を持った酵
素類が要求されている。特に、強力な酸化安定性を有す
る酵素類は、洗濯物に使用されるプロテアーゼの漂白適
合性および貯蔵寿命を延ずのに有用であろう。同様に、
酸化安定性の低いものは、酵素活性の迅速なかつ効率的
な消滅を必要とする工業的生産において有用であろう。

酵素のＩ］ｌ−１活性プロフイルを改良することは、そ
の酵素を各種のプロセスにおいて」：り有効にするのに
役立つであろう。例えばプロテア−げのＤＨ活性プロフ
ィルを拡げれば、アルカリｆ１および中性の洗濯物の両
者に適した酵素が得られるであろう。このプロフィルを
狭くすると、特に修正した基質特異性と一緒にすると、
酵素は混合物中でより適合性のあるものとなるであろう
（後述）。

原核生物のカルボニル氷解酵素（原核性カルボニル水解
酵素）（基本的にはプロテア−げであるがリパーゼも含
む）を突然変異させると、多種多様の氷解酵素、特にＫ
ｍ　、　Ｋｃａｔ　ＸＫｍ　／Ｋｃａｔ比および基質特
異性に於いて改良された特性を持ったものが得られる。

これらの酵素は、例えばペプチド製造あるいは洗濯に使
用するなどの加水分解■稈において存在すると予測され
る特定の基質用に修正することができる。

酵素の科学的な改変は知られている。例えば■。

５ｃｉｎｄｓｅｎ、１９７６、”Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　
Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、”ＬＬ＜５）：２３７−２９
１参照。しかしこれらの方法は、都合のよいアミノ酸残
基が存在していることに依存しており、共通の側鎖を持
った全ての感受性の残渣を改良するという点において非
特異的であることが多く、さらに、加工、例えば変性ざ
ぜることなく（これは一般に活性を再設立する上におい
て完全に復帰不能である）、非感受性のアミノ酸残塁に
達することができないという欠点を有している。このよ
うな方法は１つのアミノ酸残基側鎖を他の側鎖または等
価の機能体で置換えることを目的としているので、その
限りにおいては変異誘発法がこのような方法にとって代
わることができる。

ｃｙｓ　ＴＡＮをセリンに変換することからなる、ｔｌ
ＲＮＡ合成酵素の予定された、部位指定性の変異誘発法
が報告されている（Ｇ、　Ｗｉｎｔｅｒら１９８２、”
Ｎａｔｕｒｅ　”　ム史史：　７５６−７５８　；Ａ。

Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら１９８４．　”Ｎａｔｕｒｅ　”
　３０７　：　１８７−１８８）。この方法は大規模な
変異誘発には実際的ではない。本発明は飽和変異誘発（
５ａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｍ１ｌｔａｑｅｎｅｓｉｓ）に
よりＤＮＡを変異させるための簡便、迅速な方法を提供
するものである。

〜２１一 本発明の要約 本明細書には、組換え宿主細胞中でサブチリシンおよび
中性プロテアーゼのような原核生物のカルボニル氷解酵
素（カルボニルヒドロラーゼ）を生産する方法が記載さ
れており、この方法はプロ、プレ、またはプレプロ型の
これらの酵素を含む所望のサブチリシンまたは中性プロ
テアーゼを暗号化している配列を含んだ発現ベクターを
使って宿主を形質転換し、その宿主を培養し、所望の酵
素を回収するものである。この暗号配列は後に詳述する
ように、天然のものと正確に対応している場合もあり、
生産される蛋白質に望ましい性質を付与する改良部分を
含んでいる場合もある。

次いでこの新規な株を、このような操作をしなければそ
の宿主株中で発現されないポリペプチドを暗号化してい
る少なくとも１つのＤＮＡ部分で形質転換し、その形質
転換された株を培養し、ポリペプチドをその培養物から
回収する。このＤＮＡ部分は、真核生物（酵母または哺
乳動物）の蛋白質を暗号化しているＤＮＡであってもよ
いが、２２− 通常は宿主桿菌遺伝子の方向づけられたミュータン１へ
である。この新規な株はまた、その宿主ゲノノ＼以外の
起源由来の細菌性遺伝子から発現される蛋白質、あるい
はこれらの外来性遺伝子またはその宿主ゲノムからのホ
モローガス遺伝子を発現するベクターのための宿主とし
ても役立つ。後者の場合、中性プロテアーゼまたはサブ
チリシンを含んでいないアミラーゼのような酵素が得ら
れる。

さらに、酵素的に活性なサブチリシンを含んでいない中
性プロテアーゼを培養で得ることができ、またその逆も
可能である。

原核生物のカルボニル氷解酵素のためのクローンした遺
伝子をコピー数の高いプラスミドに結合させ、親細胞に
比べてはるかに高い収率でこの酵素を合成することがで
きる。本明Ｉ書においてはまた、氷解酵素の改変型を開
示しており、これにはプロおよびプレプロチモーゲン型
の酵素、そのプレ型、おにび方向づけられたそのミュー
チージョンが含まれている。

蛋白質の暗号領域内のあらゆる部位において多数のミュ
ーチージョンを迅速かつ効率的に生成させ得る飽和変異
誘発のための好適な方法は以下の工程からなる： （ａ　）前駆体くプレカーサー）蛋白質の少なくとも一
部を暗号化しているＤＮＡ部分を得、（ｂ　）その部分
内の領域を同定し、 （Ｃ）その領域内にすでに存在しているヌクレオチドを
ヌクレオチドで置換えてその部分に特殊な少なくとも１
種の制限酵素部位を作り、これにより、発現されたとき
にその領域ににつて暗号化されているアミノ酸を変える
ことなく、その同定された領域に対する特殊な制限部位
を５′および３′に利用できる様にし、 （ｄ　）　５’および３′末端に工程くＣ）で導入され
た制限酵素部位とアニーリングすることができる配列を
含んでおり、該ＤＮＡ部分に結合させた場合、該前駆体
蛋白質が、その内部にお（）る少なくとも１個のアミノ
酸が置換、欠落（切除）および／または挿入された形で
発現されるような複数のオリゴヌクレオチドを合成し、 （ｅ　）その特異な部位を開裂し得る制限酵素で工程（
Ｃ）のＤＮＡ部分を消化し、そして、（ｆ）工程（ｄ　
）のオリゴヌクレオチドのそれぞれを工程（ｅ）の消化
した部分に結合させ、複数のミューラントＤＮＡ部分を
得る。

上記の方法またはその伯の既知の方法により、原核生物
のカルボニル氷解酵素を暗号化している分離したＤＮＡ
にミューチージョンを導入すると、そのＤＮＡを発現し
た場合、氷解酵素の予定された部位に少なくとも１個の
アミノ酸の置換、欠落（切除）または挿入が起る。この
方法は野生型蛋白質のミュータン１へを作成するのに（
この場合、「前駆体」蛋白質は野生型である）またはミ
ュータントを野生型に返すのに（この場合「前駆体」は
ミコータントである）有用である。

前駆体酵素と異なる酸化安定性および／または１）Ｈ活
性プロフィルを示すミュータント酵素を回収する。この
ようにして種々のＫｍ　、　Ｋｃａｔ　。

１（ｃａｔ／Ｋｍ比を持ち、基質特異性を有する原核生
物カルボニル氷解酵素が得られる。

２５一 本発明方法によって得られるミュータント酵素を、常法
により界面活性剤や洗浄剤と混合し、洗剤工業あるいは
その他の洗浄技術分野において有用な新規な組成物を得
ることができる。

１乱匹１１ 第１図は機能的Ｂ、　ａｍｙｌｊｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓサブヂリシン遺伝子の配列を示す模式図である。

第１図のＡにおいてはＢ　、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆ
ａｃｉｅｎｓゲノムの１，５ｋｂフラグメント上に、プ
ロモーターおよびリポソーム結合部位を含んだＢ、　８
ｍ１７＋０１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのための全機能配
列が存在している。

第１図のＢはその暗号鎖のヌクレオチド配列を、蛋白質
のアミノ酸配列と関連させて示している。

そのＤＮＡ配列のプロモーター（ｐ）、リポソーム結合
部位（ｒｂｓ）および終止（ｔｅｒｍ）領域も示されて
いる。

第２図はプール１　（パネルＡ）およびプール２（パネ
ルＢ）でそれぞれプローブした純化陽性クローンのレプ
リカ・ニトロセルロース・フィルターの結果を示すグラ
フである。

２６一 第３図は→ノブヂリシン発現プラスミド（ｐｓ４）の制
限分析を示している。ρＢ５４２ベクター配列（４゜５
旧））は実線で、挿入配列（４、４，ｋｂ）は点線で示
しである。

第４図（まＩ］ＢＳ／１２および１１ｓ４で形質転換し
た培養物からの上清について行なった５ＤＳ−ＰＡＧト
の結果を示すグラフである。

第５図はシャ１〜ルベクターｐｓ　Ｓ　４２の構成を示
している。

第６図はＢ、　５ｔｂｔｉｌｉｓザブチリシン遺伝子を
含む配列の制限地図を示す模式図である。

第７図は機能的な１３．５ｕｂｔｉｌｉｓザブチリシン
遺伝子の配列を示す模式図である。

第８図は３．５ＵＩ）ｔｉｌｉｓザブヂリシン遺伝子の
欠失ミコータントを得るための組立法を示す模式図であ
る。

第９図は３．５ｕｂｔｔｌｉｓ中性プロテアーゼ遺伝子
の制限地図を示す模式図である。

第１０図はＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ遺
伝子のヌクレオチド配列を示す模式図である第１１図は
３．５ｕｂｔｉｌｉＳ中竹プロＴ　７一セＭ　伝子を含
んでいるベクターの組立を示ず模式図である。

第１２．１３および１６図は本発明方法にＪ：る変異誘
発技術の具体例を示す模式図である。第１２図中、１は
野生型のＤＮＡ配列、２は△ｐ２２２ＤＮＡ配列、３は
Ｋｒ１ｎＩおよびＰｓｔＩで切断された△１１２２２．
４はオリゴヌクレオ”ヂドプールと結合した切断Δｐ２
２２を示ず。第１３図中、１は野生型ＤＮＡ配列、２は
Δｐ１６６．３はＳａＣ工およびＸｍａｌｌで切断した
八〇１６６．４はオリゴヌクレオヂドプールに結合させ
た切断△ｐ１６６を示ず。第１６図はＧ−１６９飽和変
異誘発を示しており、１は野生型ＤＮＡ配列、２は△ｐ
　１６９ＤＮＡ配列、３はＫｐｎＩおよびＥＣ０ＲＶで
切断した△ｐ１６９．４はオリゴヌクレオチドプールに
結合させた切断Δρ１６９を示づ。

第１４図はザブチリシンミコータントの強化された酸化
安定性を示すグラフである。図中、ＡはＡ　ｌａ−２２
２ミユータント、ＣはＣｙｓ−２２２ミユータン１〜、
・はＭｅｔ−２２２（ＷＴ）を示す第１５図は野生型酵
素と比較した場合のサブチリシンミコータントのｐｌ−
１活性プロフイルの変化を承りグラフである。○はＣ−
２２２、・はＷＴである。

［Ｌ１支」 原核生物のカルボニル氷解酵素は、０＝Ｃ−Ｘ結合（×
は酸素または窒素）を含んでいる化合物を加水分解重る
酵素である。これらには、基本的に加水分解酵素例えば
リパーゼ、およびペプヂド加水分解醇索例えばサブチリ
シンまたはメタロプロテアーゼなどが含まれる。ペプチ
ド加水分ｉｐ索には、α−アミノアシルペプチドヒドロ
ラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミ
ノヒドロラーゼ、レリンカルポキシペプヂダーゼ、メタ
ロカルボキシペプヂダーゼ、チオールプロテイナーげ、
カルボキシルプロテイナーゼおよびメタロプロテアーゼ
などが含まれる。セリン、メタロ、チオ−−ルおよび酸
プロテアーゼも、エンドおよびエキソプロプアーゼと同
様に含まれる。

２９− サブチリシンは通常、蛋白質またはペプチドの内部ペプ
チド結合を開裂させるセリンプ【コテイブーゼである。

メタロプロプアーゼは活性を現わすのに金属イオンのコ
ファクター（副因子）が必要なエキソまたはエンドプロ
テアーゼであるザブチリシンや中性プロテアーゼには多
数の天然のミュータントが存在しており、これらは全て
出発遺伝子材料のソースとして同等の効果で使用するこ
とができる。

これらの酵素およびその遺伝子は多くの原核生物から入
手できる。好適な例はグラム陰性の微生物、例えばＥ、
ｃｏｌｉまたはシコードモナスおよびダラム陽性菌、例
えばマイクロコツカスまたは桿菌（バチルス）である。

カルボニル氷解酵素を暗号化している遺伝子は本明細書
の一般的な方法に従って得ることができる。実施例から
明らかなように、この方法は、問題の氷解酵素領域を暗
号化している■１定配列を持った標識したプローブを合
成し、この水解酵素を発現する微生物からゲノムライブ
ラリーを調製し、３０− そしてプローブに対するハイブリダイゼーションにより
、問題の遺伝子についてこのライブラリーをスクリーニ
ングすることからなる。次いで陽１４゜のハイブリダイ
ズしたクローンを位置づけ、配列を決定する。クローン
した遺伝子を、宿主中での複製に必要な領域を持った発
現ベクター（これもクローニングベクターであってにい
）に結合させ、そのプラスミドを宿主にトランスフェク
トして酵素を合成させ、その組換え宿主細胞を酵素合成
に有利な条件下で、通常抗生物質の存在により与えられ
る選択圧の下で（これに対する耐性はベクターにより暗
号化されている）で培養する。このような条件下で培養
すると、形質転換されるのが親の微生物であっても、そ
の野生型の親の微生物の酵素合成よりも遥かに高い効率
で酵素が生産される。

１発現ベクター」とは、適当な宿主中でＤＮＡを発現さ
せ得る適当なコントロール（調節）配列ニＰＭ能的ニ結
合シＴイル（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ　）　Ｄ
Ｎ　Ａ配列を含有しているＤＮＡ構成物を意味する。

このようなコントロール配列には転写を司るプロモータ
、このような転写を調ｍ′？ｌる、場合により存在する
オペレータ配列、適当なｍＲＮΔリポソーム結合サイト
を暗号化している配列おＪ、び転写および翻訳の終了を
支配する配列などが含まれる。

ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単に潜在的
なゲノム挿入物であってよい。ベクターを適当な宿主に
導入すると、このベクターは複製することができ、宿主
ゲノムとは独立に機能し、またある場合にはそのゲノム
自体に組み込まれることもある。本明細書において［プ
ラスミド１ど「ベクター」とは交換可能に使用すること
がある。

それはプラスミドは現在において最も普通に使用される
ベクターの形態であるからである。しかし本発明は同等
の機能を営む現在知られている、あるいは将来用られる
であろう発現ベクターのあらゆる形をも包含するもので
ある。

「組換え宿主細胞」とは、絹換えＤＮＡ技術を使って組
立てられたベクターで形質転換または１〜ランスフエク
トされた細胞を意味する。本発明においては、絹換え宿
主細胞は、原核生物のカルボニル氷解酵素を暗号化して
いる発現ベクターによって形質転換されたものであるの
で、その氷解酵素を種々の形で生産するものを意味する
。この組換え宿主細胞は形質転換前に１つの形のカルボ
ニル水解酵素を生産したものであってもよく、また生産
しなかったものであってもよい。

１機能的に結合」という用語を２つのＤＮＡ領域の関係
について用いる場合、それらが互いに機能的に関連し合
っていることを意味する。例えば１つのプレ配列を、も
しそれが信号配列として機能するならば、ペプチドと機
能的に結合させると、これは蛋白質の成熟型の分泌に関
与しほとんどの場合信号配列の開裂に関係する。プロモ
ーターを暗号配列に機能的に結合させると、それはその
暗号配列の転写を支配する。リポソーム結合サイトは、
それを翻訳可能なように位置づけると、それは暗号配列
と機能的に結合されたことになる。

［プロヒドロラーゼ−１とは、酵素を不活性化する追加
のＮ末端アミノ酸残基を含んでいる水解酵３３− 素であって、その残基が除去されたとき酵素となる氷解
酵素を意味する。多くの蛋白質分解酵素は変換性プロ酵
素産物として天然に存在し、ボスト−翻訳産物が存在し
ないとこの形で発現される。

「プレ配列」とは、氷解酵素の分泌に関与する、氷解酵
素のＮ末端部分に結合したアミノ酸の信号配列を意味す
る。プレ配列も、本明細書に記載した同じ方法で改変し
てもよく、これには予定したミューチージョンを導入す
ることが含まれる。氷解酵素と結合すると、目的とする
蛋白質は「プレヒドロラーゼ」になる。従って、本発明
の目的に叶うプレヒドロラーゼはプレサブヂリシンおよ
びプレプロサブチリシンである。プレヒドロラーゼは、
プレプロ暗号領域から、「プロ」配列（あるいは酵素を
不活性な状態に維持する、そのプロ配列の少なくともそ
の部分）を削除し、次いでそのプレヒドロラーゼを発現
さけることにより生産される。このようにすると生物は
プロ酵素ではなく活性酵素を分泌する。

このクローンしたカルボニルヒトロラーげを使３４− って、イの氷解酵素を発現さゼるために宿主細胞を形質
転換する。既述したように、洗濯物におけるザブチリシ
ンのように、氷解酵素がその改変されない形で工業的に
使用し得る場合には、このことは興味ある事実である。

好ましい実施態様では、ヒドロラーゼ遺伝子は］ビー数
の高いプラスミドに結合さける。このプラスミドは宿主
中で、それが以下に述べるようなプラスミドの複製に必
要なよく知られた要素を含んでいるという意味において
複製される；問題の遺伝子に機能的に結合したプロモー
ター（これは、もしそれが認識されるならば、すなわち
宿主細胞によって転写されるならば、その遺伝子自身の
小モロ−ガスプロモーターどして供給されてもよい）、
転写終了およびポリアデニル化領域（宿主細胞によって
転写されたｍＲＮＡの、そのヒドロラーゼ遺伝子に対す
る安定性のために必要である）（これは外来性であるか
またはそのヒドロラーゼ遺伝子の内性終止領域によって
供給される）および望ましくは抗生物質含有培地中で、
プラスミドで感染された宿主細胞の増殖を連続的に維持
し得る抗生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子。コピー
数の多いプラスミドは、また宿主のための複製起源を含
んでおり、これにＪこり染色体の制限を受（プることな
く細胞質内で多数のプラスミドが生成する。しかしヒド
ロラーゼ遺伝子の複数のコピーを宿主ゲノムに組込むこ
とも本発明の範囲に含まれる。これはホモローガスな組
換えに特に感受性のある細菌株によって促進される。得
られた宿主細胞は組換え宿主細胞と呼ばれる。

カルボニルヒドロラーゼ遺伝子をクローンしたら、その
遺伝子の用途を野生型または前駆体酵素の合成を凌駕し
て強化するために種々の改変を行なう。前駆体酵素は、
本明細書に記載した方法で改変する前の酵素である。通
常この前駆体は、この方法に従って改変されｌ〔Ｄ　Ｎ
八をイ」与（〕だ微生物によって発現される酵素である
。本発明でいう「前駆体」とは、前駆体酵素それ自体を
操作することにより生成酵素を作る時の前駆体を意味り
るものではないと解すべきである。

この改変の最初のステップとして、ホモローガス逍伝子
を含／υでいる絹換え陽性（ｒｅｃ＋）微生物からぞの
遺伝子を削除してもよい。これはクローンした遺伝子の
イン１１〜口欠失ミコーチージョンを微生物のゲノムと
絹換えることにＪ：り達成することができる。ト、ｃｏ
ｌｉや桿菌のＪ、うに多くの微生物株が組換え可能であ
ることが知られている。

必要なのは、畝補宿１−のホモローガス領域と組換えら
れる欠失ミュータン１〜からの残りのＤＮＡの領域でｄ
〉る。この欠失は暗号領域内であってもにく（酵素的に
不活性イ１ポリペプチドを残す）あるいはまた小モロ−
カスな境界領域（例えばプロモーターまたは終止領域）
が宿主に存在する限りは仝暗弓領域を含んでいてもＪ：
い。宿主が欠失ミュータントとの組換えを受り入れたか
どうかは、形質ＩＩＩ／ｉ換された表現形質の欠失につ
いてスクリーニングすることにより決定される。これは
、カルボニルヒトロラーげの場合には、本来氷解酵素に
よつ【加水分解される染色体性の基質を開裂する能力を
失っているかどうかを宿主培養物について分３７− 析することにより容易に達成することができる。

プロテアーゼ欠失ミコータン１〜を含んだ形質転換宿主
は、蛋白質分解酵素と適合しない生産物を合成するのに
有用である。このような宿主は、ここに記載した欠失プ
ロテアーゼを分泌することはできないが事実上正常に胞
子形成を行なう。さらに、この形質転換体のその他の増
殖特性は親の微生物と実質的に同じである。このような
微生物はその親細胞よりも外来性蛋白質の不活性化にお
いて活性が低く、そしてこれらの宿主は、既知のプロテ
アーゼ欠失微生物よりも優れた増殖時ｆしを持っている
という点で有用である。しかし本発明方法に従って中性
プロテア−げおよびザブチリシンを欠失させるというこ
とは、桿菌のすべての蛋白質分解活性を除去するという
ことではない。通常細胞外には分泌されない細胞内プロ
テアーゼは培養の後期には「？１れ」たりまたはその細
胞から拡散すると考えられている。これらの分子内プロ
テア−げは、それらの酵素がここで定義されているよう
に、ザブチリシンまたは中性プロテア−げで３８− あってもよく、ぞうでないかもしれない。従って本発明
の新規な桿菌株は、通常その親株において細胞外に分泌
されるサブチリシンおよび／または申スＩ［プロテア−
げ酵素を分泌することができない。

（−できない」とは野牛型に復帰しないことを意味Ｊる
。復帰は従来知られているプロテア−げを欠落した天然
林に関して存在している有限の可能性である。というの
は、このような株の表現形質は容易に復帰し得るミュー
チージョン、例えば点変異の関数ではないという保証は
ないからである。

これを本発明で提供する極めて大きな欠失と比較リベぎ
である。

本発明に係る欠失ミュータントー形質転換宿主細胞は、
第１図、第７図または第１０図に示した遺伝子ど実質的
に相同であると定義される遺伝子であって、酵素的に活
性な中性プロテアーゼまたはサブチリシンを暗号化して
いる遺伝子を含んでいない。［相同−１な遺伝子は、第
１，７または１０図に示した遺伝子と、極めて厳密な条
件下でハイブリダイズし百る暗号領域を含んでいる。

カルボニルヒドロラーゼ欠失ミコータントを含んでいる
微生物株は２つの基本的なプロセスにおいて有用である
。１つの態様では、通常宿主によって発現される、その
欠失遺伝子によって１８号化された蛋白質で汚染されて
いないことが望ｊニジい生産物を発酵生産するのに好都
合である。１つの例はアミラーゼの発酵合成であり、こ
の場合不純物どしてのプロテアーゼがアミラーゼの工業
的使用において各種の妨害をする。本発明に係る新規な
株は、このような生産物から夾雑カルボニルヒドロラー
ゼを除去するという負担を軽減させるものである。

２番目の重要な実施態様では、ザブチリシンおよび中性
プロテアーゼ欠失−ミュータン１〜株は、本来その株に
よって暗号化されていない蛋白質を合成するのに有用で
ある。これらの蛋白質は２つのクラスの何れかである。

最初のクラスは宿主のそれと実質的な形質転換前の相同
性を示さない遺伝子によって暗号化されている蛋白質か
らなる。

これらはぞの他の原核生物からの蛋白質であってもよい
が、しかし通常は、酵母または高等な頁核生物、特に１
ｌｉｌｉ乳類からの真核性蛋白質である。発現されたホ
モローガスでない蛋白質を原核生物が分解Ｊる可能性が
減少覆るので、本発明に係る新規な株は、そのにうな蛋
白質を暗号化している遺伝子を含有している発現可能な
ベクターのための有用な宿主として役立つのである。

第２のグループは、宿主のそれと実質的に形質転換的相
同性を示すミコータント宿主遺伝子からなる。これには
微生物のものくレンニン例えばムコール属からのレンニ
ン）と同様、サブチリシンお」ζび中性プロテアーゼの
ような原核生物の７Ｊルボニルヒドロラーゼのミューチ
ージョンが含まれる。これらのミコータントは、工業的
に使用するだめの前駆体酵素の性質を改善するために’
ｒＷ択される。

本発明方法はこのようなミュータン１〜の組立ておよび
同定を行なう新規な方法を提供するものである。２Ｌず
ヒドロラーゼを略号化している遺伝子を得、その全部あ
るいは一部の配列決定を行なう。

４１− 次いでその配列を精査、して、発現される酵素の１もし
くはそれ以上のアミノ酸のミコーチージョン（ｈ１１除
、挿入または置換）を作成づるのに望ましい場所を決定
する。この点に接している配列に、発現されたとぎに各
種のミュータントを］−ドすることになるオリゴヌクレ
オチドプールでそのｉＷ仏子の短いセグメント（断片）
を置換するための制限サイ１〜が存在しているかどうか
を評価する。

選択された点から好適な距離（１０〜１５ヌクレオチド
）内の場所に特異な制限部位は通常存在しないので、そ
の遺伝子のヌクレオチドを、最終的な組み立て物におい
て解読枠もＩｎ＠化されているアミノ酸も変化しないよ
うに、買換することによってそのような部位を生成させ
る。好適な隣接領域の位置づけ、および必要な変化を評
価して２つの特異な制限部位配列に到達するだめの仕事
は、遺伝暗号の銀剰性、ぞの遺伝子の制限酵素地図およ
び多数の異なった制限Ｗ９素によって常法通り行なう。

もし偶然に１つの隣接する特異な制限部位が利用できる
ような場合には、上の方法はその部４２− 位を含有してない隣接領域に関してのみ使用する。

その配列を変化させ所望の配列にするだめの遺伝子のミ
ューチージョンは、常套の方法に従ってＭ１３プライマ
ーエクステンション（延長）によって行なう。この遺伝
子をクローンしたら、それを特異な制限酵素で消化し、
多数の最終的な末端相補↑１１オリゴヌクレオチドカセ
ットをその特異な部位に結合させる。オリゴヌクレオヂ
ドは全て同じ制限部位を持つように合成することができ
、かつ、制限部位を作成するのに合成リンカ−が必要で
ないので、この方法にＪ：って変異誘発が極めて単純化
される。

問題の遺伝子中に存在していない部位を持った市販の制
限酵素の数は非常に多い。適当なりＮＡ配列：コンピュ
ーターサーヂ・プログラムを使用すれば潜在的な５′お
よび３′特異隣接部位を見出でのが曲中になる。基本的
な制約は、制限部位の作成で導入されるミューチージョ
ンは全て最終的に組立てられたアミノ酸暗号配列に対し
てサイレン１〜でな（）ればならないということである
。標的コドンに対して５′の候補制限部位については、
配列は、その候補酵素の切断に対して５′の認識配列中
に少なくとも、１つを除く全てのヌクレΔチドを含んで
いる遺伝子内に存在しでいな（）ればならない。例えば
、もし近くの５′配列がＮ　ＣＣ１ＣＮＣまたはＣＣＮ
を含んでいるならば、平滑切断酵素Ｓ　ｍａＩ　（ＣＣ
Ｃ／　Ｇ　Ｇ　Ｇ　）が５′候補どなるだろう。さらに
、もしＮをＣに変えな（）ればならない場合、この変換
はアミノ酸暗号配列を無傷にしておかなければならない
。制限部位を導入するのに永久的なサイレンミルミュー
ブージョンが必要は場合、滅多に使用しない］トンの導
入を避ｃノだいと考えるであろう。３ｍａ■についての
同様の状況が、配列ＮＧＧ、ＧＮＧ、またはＧＧＮが存
在しなければならないことを除いて３′隣接部位に適用
される。候補酵素を位置づ（プるためのこの制限は、平
滑切断酵素については最も緩和であり、４塩基突き出し
酵素については最も厳格である。

一般に多くの候補部位を利用することができる。

ここに述べたコドン−２２２標的については、Ｋ１］ｎ
Ｉ部位から１塩基対５′に１３ａｌＩ部位（ＴＧＧｌｏ
ＣＡ）を手術することができた。３’Ｅｃ。

ＲＶ部位（ＧΔＴ’／ＡＴＣ）はｐｓｔ■部位に向って
１１塩基対５′を使用することができた。平滑末端から
４ｊＭ基突ぎ出しに渡る末端を持ったカセットは容易に
機能するであろう。回顧すると、この仮定のｌＴ、ｃｏ
ＲＶ部位は使用したオリゴヌクレオチドカセットを極め
て短くしく９および１３塩基対）、かくして純度を上げ
プールバイアスの問題を低くしたことであろう。オリゴ
ヌクレオチドカセットの結合が一方向に保証され得るよ
うに隣接部位はそれ自体が結合できないものを選択すべ
きである。

ミコーチージョン自体は予め決定する必要はない。（列
えばオリゴヌクレオチド力セッ１へまたはフラグメント
は二１〜［１ソグアニジンあるいはその他の突然変異誘
発物質で無秩序に変異誘発させ、それを予め決められた
場所でヒトロラーＱＭ伝子に結合させる。

適当４Ｔ宿主に形質転換することによって発現さ４５− れたミコータント力ルポニルヒドロラーゼは、所望の特
性、例えば基質特異性、酸化安定性、Ｉ）Ｈ活性プロフ
ィルなどを示す酵素についてスクリーニング（選択）す
る。

基質特異性の変化は、前駆体酵素の１（ｃａｔ／１（ｍ
比とそのミュータントのそれとの違いによって決められ
る。１（ｃａｔ／Ｋ１１ｌ比は触媒効率の大きさを現わ
している。Ｋｃａｔ／Ｋｍ比が増加または減少した真核
生物のカルボニルヒドロラーゼについては実施例に記載
しである。一般に目的とするところは、与えられた基質
に対して大きな１＜ｃａｔ／Ｋｍ比（数字で言えば大ぎ
な比）を持ったミュータントを確保することであり、こ
れによって標的基質に対して酵素をより効率よく使用す
ることができるのである。ある基質に対してＫｃａｔ／
１（ｍ比が増加すると別の基質に対するＫｃａｔ／Ｋｍ
比が減少するということがある。これは基質特異性のシ
フトであり、このようなシフｌ〜を示すミュータントは
、前駆体が望ましくない場合に利用価値があり、例えば
基質混合物中の特定の基質４６− の望ましくない加水分解を防止することができる。

ＫＣａｔおよび＋＜ｍは既知の方法あるいは実施例１８
に記載の方法に従って測定する。

酸化安定性は、実施例に記載したミュータントによって
達成されるもう１つの目標である。この安定性は各種の
使用目的に応じて強化したり減少したりすることができ
る。安定竹は１もしくはそれ以上のメチオニン、トリプ
トファン、システィンまたはりジン残基を削除し、場合
によりメチオニン、トリア１〜フアン、シスディンまた
はリジンの１つではない他のアミノ酸残基でＭ換えるこ
とにより強化される。その反対の置換を行なうと酸化安
定性が減少する。置換された残基は好ましくはアラニル
であるが中性残基も好適である。

改変されたｐＨ活性プロフィルを示すミコータン１〜も
１ｑられる。１１Ｈ活性プロフイルは酵素活性に対する
ｐＨのプ［１ツトであり、実施例１９に例示しＩＣよう
に、あるいは既知の方法で作成ザることができる。より
広いプロフィルを持ったミュータント、すなわちあるｐ
ｌ−１においてその前駆体よりも強い活性を有で−るが
、如何なるｐｌ−１においても顕著に強い活性を示さな
いミュータントあるいはより鋭いプロフィルを持ったミ
ュータント、覆なわちある一定のｐＨではその前駆体と
比べて強い活性を有するがその他のＩＩＨではＪ：り低
い活性を持ったミュータントを得るのが好ましい。

上記のミコータントは好ましくはその酵素の活性部位内
で調製する。と言うのはこれらのミューチージョンは活
性に最も影響を与えそうであるからである。しかし酵素
の安定竹または形態にとって重要なその他の部位でのミ
コータントも有用である。桿菌のサブチリシンまたはそ
のプレ、プレプロおよびプロ型の場合、チロシン−１、
アスパラギン−１〜＋３２、アスパラギン＋１５５、チ
ロシン＋１０４、メチオニン＋２２２、グリシン＋１６
６、ヒスチジン＋６４、グリシン＋１６９、フェニルア
ラニン＋１８９、セリン＋３３、セリン＋２２１、チロ
シン＋２１７、クルタメート＋１５６および／またはア
ラニン＋１５２におけるミコーチージョンによって」ニ
記の特性またはその酵素のプロセシングにおいて変化し
たミコータントが得られる。これらのアミノ酸の位置番
号は第７図から明らかなようにＢ。

ａｍｙｌｏｌ　１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのサブチリシン
に対して決められたものである。削除または挿入を行な
うと与えられた位置からＮ末端方向において対応するア
ミノ酸の位置がシフトし、残部はその元の位置すなわち
野生型の位置番号を取らなくなることは理解されるであ
ろう。また、対立遺伝子の違いおよび各種の原核生物種
の中での変動によって位置のシフ１〜が起り、従ってそ
のようなサブチリシンの位置１６９はグリシンでは占め
られなくなるであろう。このような場合グリシンの新し
い位置は、グリシン＋１６９という定義であられされ、
その範囲に包含される。グリシン＋１６９に対する新し
い位置は第７図のグリシン＋１６９に相同な領域につい
て問題のサブチリシンを精査することにより容易に同定
される。

１もしくはそれ以上のアミノ酸残基、通常約１０個まで
のアミノ酸残塁を変異させ得る。しかし商業的な実際ｆ
１を除りばミコーチージョンの数に４９− 制限はない。

本発明の酵素は塩の形で得ることもできる。蛋白質のイ
オン化状態は、もしそれが溶液中にある場合は、その周
囲の媒質のｒｌＨに依存し、もしイれが固状の形である
場合はそれが調製された溶液のｐＨに依存することは明
らかである。酸性の蛋白質は通常、例えばアンモニウム
塩、ナトリウム塩またはカリウム塩として調製され、塩
基性蛋白質は塩酸塩、硫酸塩または燐酸塩として調製さ
れる。従って、本発明は、カルボニルヒドロラーゼの電
気的に中性のもの、および塩の形のものの両者を含み、
カルボニルヒドロラーゼという用語はイオン化状態に関
係なく有機化学の基本的な構造を指すものとする。

本発明のミュータントは特に食品加工および洗浄技術に
おいて有用である。ミュータントを包含するこのカルボ
ニルヒドロラーゼは本明細書に記載した発酵法により製
造され適当な技術で回収される（例えばＫ　、　Ａｎｓ
ｔｒｕｐ、　１９’７４．　、ｌ　ｎｄｕｓｔｒｉａｌ
　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　３’ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、ｅｒ１．　Ｂ　、　５ｐｅｎｃ５０− ０ｒ２３−４６頁参照）。これらは自体既知の方法で洗
剤または他の界面活性剤とともに製剤化され、工業的過
程、特に洗剤技術において使用される。

後者の場合、この酵素は蛋白質分解酵素の分野でよく知
られているにうに洗剤、ビルダー、漂白剤および／また
は螢光漂白剤と混合する。好適な洗剤には直鎖状アルキ
ルベンゼンスルホネート、アルキルエトキシ化サルフェ
ート、硫酸化直鎖状アルコールまたは工１〜キシ化直鎖
状アル］−ルなどが含まれる。この組成物は粒状または
液状に製剤化することができる（例えば米国特許３６２
３９５７号、４４０４．１２８号、４３８１２４−７号
、−１４０４１１５号４３１８８１８号、４２６１８６
８号、４２４．２２１９号、４１４２９９９号、４１１
１８５５号、４０１１１６９号、４０９０９７３号、３
９８５６８６号、３７９０４８２号、３７／１９６７１
号、３５６０３９２号、３５５８４９８号および３５５
７００２号参照）。

以下に本発明の実施態様を記載するが本発明はこれにＪ
：って限定されるものと解釈してはならない。

験操＝における　団の　１ 実施例を簡単にするために、度々使用する方法は曲中な
用語によって表わす。

プラスミドは大文字および／または数値を前および／ま
たは後に付けた小文字のρで表わす。本発明で使用する
出発プラスミドは市販されているか、無制限に利用可能
であるか、あるいはそのような入手可能なプラスミドか
ら既知の方法に従って組立てることができる。

「Ｋ　ｌｅｎｏｗ処置」とは、２本鎖ＤＮＡの凹んだ３
′末端を、ヌクレオチドに相補的なデオキシリボヌクレ
オチドで満たして、そのＤＮＡ鎖の突出した５′末端を
作成する過程を言う。この方法は通常ＤＮＡの制限酵素
開裂にＪ：っで生成した凹んだ末端を満たすのに使われ
る。これによってその後の結合に必要な平滑末端が作ら
れる。ｌ（ｌｅｎｏｗ処置は、触媒的に活性な量の（通
常１０単位）Ｆ。

ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼ■のＫ　ｌｅｎｏｗフラ
グメント（１Ｎ（ｌｅｎｏｗ　Ｊ　）の存在下、満たす
べきＤＮＡと適当な相補的デオキシリボヌクレオチドと
反応させることにより（通常１５℃で１５分間）達成さ
れる。Ｋｌｅｎｏｗおよびその他の必要な試薬は市販さ
れている。この方法については多数の報告がある（例え
ばＴ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら１９８２　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　ＣＩｏｎｉＨｌ　０７−１０８頁参照）。

ＤＮＡの「消化」とは、そのＤＮＡのある部位だ（プに
作用する酵素によってそのＤＮＡを触媒的に開裂するこ
とを言う。このような酵素は制限酵素と呼ばれ、それぞ
れの酵素に特異な部位を制限部位と呼ぶ。「部分的」消
化とは制限酵素による不完全な消化を意味し、ＤＮＡ基
質中の、与えられた制限エンドヌクレアーゼの開裂部位
の幾つかが開裂されるが全てが開裂されないような条件
を選んで行なわれる。本発明で使用した各種の制限酵素
は市販されており、その反応条件、コファクターおよび
その他の必要な事項は、その酵素の供給者によって確立
されたものを使用した。制限酵素は通常、大文字および
それにつづくその他の文字および通常その制限酵素が初
めて得られた微生５３− 物を表わす番号で構成される略号によって表わされる。

通常的１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメン１へ
は、約２０７の緩衝液中約１単位の酵素とともに使用さ
れる。個々の制限酵素に対する適当な緩衝液および基質
の吊は製造業者によって指示されている。通常インキュ
ベーション時間は３７℃で約１時間であるが、製造業者
の指示に従いそれを変えることもできる。インキュベー
ションの後、蛋白質をフェノールおよびクロロボルムに
よる抽出で除き、消化した核酸をエタノールを用いた沈
澱によって水性フラクションから回収する。制限酵素で
消化した場合ＤＮＡフラグメントの２つの制限開裂末端
が「環化」、すなわち１″Ａじた環を形成するのを防ぐ
ために、細菌性アルカリホスファターゼで末端の５′燐
酸を加水分解する操作を行なう。環化が起るとその制限
部位に別のＤＮＡフラグメントが挿入するのが妨げられ
る。

特に指摘しない限り、プラスミドの消化は５′末端の脱
燐酸化を伴なって゛いないと解釈すべきである。脱燐酸
化の方法および試薬は通常のものであ５４− る（Ｔ、　Ｍｎ１ａｔｉｓら前記１３３−１３４頁参照
）。

制限消化物から、！’）ＮＡのある特定のフラグメン１
〜を１回収」または「分離」するとは、消化物を６％の
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、分子
量によって所望のフラグメントを同定しくマーカーとし
て分子量の解っているＤＮＡフラグメントを使用する）
、所望のフラグメントを含んでいるゲル断片を切り取り
、ＤＮＡからゲルを分離することを言う。この方法は一
般に知られている（例えばＲ，Ｉａｗｎら１９８１゜”
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　”　９　：　
６１０３−６１１４およびり、　Ｇｏｅｄｄｅｌら（１
９８０）”Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅｓ、　
”　８　：　４０５７参照）。

［サザーン分析−１とは、消化物またはＤＮＡ含有組成
物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の標識化（ラベル）し
たオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとハイ
ブリダイズさせることにより確認する方法を言う。本発
明においてはサザーン分析とはＧ、Ｗａｈｌら１９７９
．　”ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　”　７６　：
　３６８３−３６８７に記載された方法により１％アガ
ロース上で間化物を分離して脱プリン化（ｄｅｐｕｒｉ
ｎａｔｉｏｎ）し、Ｅ、　３ｏｕｔｈｅｒｎ　、　１９
７５．　”Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、”　９８　：　５０３−５１７の方法でニト
ロセルロースに転移させ、そして王、　Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら１９７８、”Ｃｅ１ｌ　”　１５：６８７−７０１
に記載の方法でハイブリダイゼーションを行なうことを
意味する。

「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外要素または染色体
組込体として複製可能なように、ＤＮＡを生物に導入す
ることを意味する。特に指摘しない限り、本発明で使用
した方法は、Ｆ、ｃｏｌｔの形質転換ニツイてはＭａｎ
ｄｅｌ　ら１９７０．”Ｊ。

ＭＯｌ、　Ｂ　ｉｏｌ、”　５３　：　１５４のＣａ　
０ｇ２法であり、桿菌については、Ａ　ｎａｇｎｏｓｔ
ｏｐｌｏｕｓら１９６１、”Ｊ、Ｂａｃｔ、”　８１　
：　７９１−７４６の方法による。

「結合（ライゲーション）」とは、２本鎖核酸フラグメ
ントの間にホスホジエステル結合を形成サセルコとを言
う（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら前記１４６頁）。特に指
摘しない限り、結合は既知の緩衝液および条件を使って
、はぼ当モル量の結合すべきＤＮＡフラグメント０．５
μＱ当たり１０単位のＴ４　ＤＮΔリガーゼ（「リガー
ゼ」）を用いて行なう。形質転換体からプラスミドを調
製し、制限地図を作成して分析し、そして／またはＭｅ
ｓｓｉｎｇら１９８１　、”Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　”　、　９　：３０９の方法により配列
決定する。

形質転換体からのＤＮＡの１調製」とは、微生物培養液
からプラスミドＤＮＡを分離することを言う。特に指摘
しない限りＭａｎｉａｔｉｓら（前記、９０頁）のアル
カリ／ＳＤＳ法を使用した。

「オリゴヌクレオチド」とは、Ｃｒｅａらの方法（１９
８０，“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａａｉｄｓ　Ｒｅｓ、　”　
３　：２３３１−２３４８　＞によって化学的に合成し
く但し縮合剤どしてメシチレンニトロトリアゾールを使
用した）、次いでポリアクリルアミドゲルで精製した短
い１本鎖または２本鎖ポリデオキシヌクレオチドを言う
。

全ての文献を参考として明細書に記載した。

５７− 実施例Ｉ　Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕＨａｃｉｅｎｓから
ゲノムＤＮＡライブラリーの調製およびサブチリシン遺
伝子の分離 細胞外Ｂ、ａｎ＋ｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの既
知のアミノ酸配列により適当なプローブ混合物の組立が
可能である。成熟サブチリシンの配列が第１図に記載さ
れており、これには本発明者らにより見出されたその他
の情報も含まれている。１１７位から１２１位までのア
ミノ酸の配列に対する全てのコドンの多義性は以下の配
列の８つのオリゴヌクレオチドのプールでカバーされる
： Ｊ、　Ｍａｒｍｕｒ　、”Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、
”、Ｌ：２０８により記載されているＢ、　ａｍｙｌｏ
ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣＮｏ、２３８４４
）から分離した染色体ＤＮＡを５ａＵ３Ａで部分消化し
、フラグメントを大きさで選択し、脱燐酸化したＩ）Ｂ
　Ｓ　４２のＢａｍＨ１部位に結合させた（１１８３４
２は、Ｅ、ｃｏｌｉお５８− よび桿菌の両者で機能的な複製起源を含んでいるシャト
ルベクターである。これは実施例４に記載の方法で調製
する）。コンピテント細胞２５０μ当り８０〜４００ｎ
ｇ（ナノグラム）のライブラリーＤＮＡを用い、Ｍ、　
Ｍａｎｄｅｌら１９７０．”Ｊ。

Ｍ　ｏｆ、Ｒｉｏ、　”　Ｌｌ：　１５４の方法に従っ
て、ベクターを含有するこの３ａｕ３Ａフラグメントを
Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｋ１２株２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４
．６）に導入した。

形質転換混合物からの細胞を、ＬＢ培地＋１２．５μｇ
／ｍのクロラムフェニコールを含有するプレート１５０
ｍｍ当り１〜５Ｘ１０３形質転換体の密度になるように
置き、肉眼で観察できるコロニーが現われるまで３７℃
で一夜増殖させた。次いでこのプレートを、ＬＢ／クロ
ラムフェニコールプレート上に積層したＢＡ８５二１〜
ロセルロースフィルター平板反復法でプリントした。こ
の平板反復プレートを３７℃で１０〜１２時間増殖させ
、フィルターをＬ　Ｂおよび１５０μｇ／７Ｉβのスペ
クチノマイシンを含有している新しいプレートに移し、
プラスミドプールを増幅させた。

３７℃で一夜インキユベートした後、Ｇ　ｒｕｎｓｔｅ
ｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓの方法（１９７５，”Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ｔＪｓＡ）”　ＬＬ：
　３９６１　）によりフィルターを処理した。成功した
形質転換体的２０．０００の内、陽性コロニーは２５個
であった。これらの陽性コロニーの内８個を画線し、個
々のクローンを純化した。各画線から２４のコロニーを
マイクロタイターウェル中で増殖させ２枚の反復フィル
ター上にスタンプし、１個のヌクレオチドだけが異なっ
ている以下のもの：の何れかを用いて上記した方法でプ
ローブした。

第２図に示したように、プール１はプール２よりも追か
に高い割合で全ての陽性クローンとハイブリダイズし、
特異なハイブリダイゼイションを暗示した。

ＩＷ　４４１クローンからのミニプラスミド標品（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、前記）５個の内４個は、５ａｕ３Ａま
たはｌ−１ｉｎｃＨで消化すると同一の制限消化物パタ
ーンを示した。Ｍ　ａｎｉａｔｉｓら（前記）の方法に
より、これらの４つの同一のコロニーの１つから分離し
たプラスミドは全て正しい遺伝子配列を持っており、こ
れを１１８４と命名した。制限分析により決定したこの
プラスミドの特徴を第３図にボす。

ｆｆｉ　サブチリシン遺伝子の発現 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｔ　−１６８（
カタログＮｏ、１−Ａ　１．　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ　）をｏｓＡで形
質転換し、１個のクロ７ムフ工ニコール耐性形質転換体
を最少培地で増殖さゼた。２４時間後培養物を遠沈し、
上清（１０〜２００．−’）およびペレットを、０．１
Ｍ燐酸す１−リウム（ｐｔ−１８，０）中２５℃で染色
体基質サクシニル−Ｌ−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ　−ｐ
ｈｅ　−ｐ　−二トロアニリド（０，２μＭ）ｌｆｆｊ
？を使って４１２６１− ｎｍにおける１分当りの吸収の変化を測定することによ
り、蛋白質分解活性を分析した。対照（コントロール）
として使用したＩ）Ｂ　Ｓ　’１２で形質転換した３、
　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｒ　−１６８培養物は、ｐｓ４で
・形質転換した培養物の活性の１／２００以下の活性を
示した。ｐＳ４培養物のプロテアーゼ活性の９５％以上
が上清に存在しており、これはフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ）で処理すると完全に阻害さ
れたがＥＤＴＡでは阻害を受けなかった。

上清の一部をＰ　Ｍ　Ｓ　ＦおよびＥＤＴＡぐ処理し、
全てのプロテアーゼ活性を阻害し、Ｌ　ａｅｍｍｌｉ、
　Ｕ　。

Ｋ、、１９７０　”Ｎａｔｌｌｒｅ　”　、　２２７　
：　６８０の方法に従って、１２％５ＤＳ−ＰＡ’ＧＥ
により分析した。この上清を調製するために、１６／の
上清を１　１ＴＩＭＰＭｓＦ、１０　ｍＭＥＤＴＡｒ１
０分間処理し、４〆の５ＸｌｌＩｉＳＤＳ試料１１衝液
マイナスβ−メルカプトエタノールとともに煮沸した。

ＤＳ４、ｐＢ　Ｓ　４２で形質転換した細胞および形質
転換しなかったＢ、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓの上清を６２− 使った泳り１」−のＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色の結果を第
４図に示η−。レーン３は１３．　ａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓからの（１）準品としてのザブヂリシ
ンを示している。ｐＢＳ　４２Ｆ形質転換したＲ、　５
ｕｂｔｉｌｉｓからの−に清である２レーンには、Ｏ８
４形質転換宿主からのレーン１によって示される勺ブチ
リシンに伴っている３１、ＯＯＯＭＷ　（分子＠）帯（
バンド）がなかった。ザブヂリシンについての約３１．
ＯＯＯＭＷのバンドは、一般に既知の分子１２７，５０
０のり゛ブヂリシン標準品によって示される遅い移動率
の特徴である。

工１」支）３．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサ
ブチリシン遺伝子の配列決定 ｐｓ４のＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ７７グメント（ここで
［ａｏＲ丁部位はｌ−１ｉｎｃｌＴ部位の変換により組
立てられた）の全配列を、Ｆ、Ｓａｎｇｅｒの方法（１
９７７、”　Ｐｒｏｃ、Ｂａ１ｌ、△ｃａｄ、３ｃｉ　
（ＵＳＡ　）゛、Ｌ上：　５７１６３）により決定した
。第３図の制限地図を参照すると、Ｂ　ａｌｌｌＨＩ−
Ｐ　ＶＩＪＨフラグメントはサザーン分析によりプール
１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることが解
った。

このフラグメントの配列決定により得られたデータから
残りのフラグメントの配列が決定されたく例えばＰｖｕ
ＩＩ　−＠　ｉｎｃ　ＩＩおよびＡｖａＩ−ＡｖａＩ）
。この結果を第１図に示す。

この配列を調べることにより、Ｂ、　ａｍｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓによって分泌されたものに相当する
成熟サブチリシンのためのコドンが存在することが確認
された。

この配列のすぐ上流に一１０７位のＧＴＧ開始コドンか
ら始まる一連の１０７個のコドンが存在する。−１０７
のコドンから約−７５のコドンまでが既知の信号配列の
それに相当する特徴を持ったアミノ酸配列を暗号化して
いる（大部分のこのような信号配列は長さ１８〜３０の
アミノ酸であり、疎水性中心部を持っており、僅かな疎
水性アミノ酸で終っている）。従って配列決定のデータ
の結果は−１０７から約−７５のコドンが信号配列を暗
号化しており、−７５から−１までの残りの介在コドン
はたぶんプロ配列を暗号化していると思われる。

実」亜」生Ａ　ｐＢｓ４２の組立 １）Ｂ　Ｓ　４２は、ｐＵ　Ｂ　１１０　ＳｐＣ１９４
およびＩ）ＢＲ３２２から導かれたフラグメントの三方
向ライゲーションにより調製する（第５図）。ＩＩＩＵ
　Ｂ　１１０からのフラグメン１−は、１９００位のＨ
ｐａＩＩ部位と４５００位のＢａｍＨＩ部位との間の約
２６００塩基対フラグメントであり、１１３ａｃｉｌｌ
ｕｓ　（桿菌）中で機能する複製起源を含んでいる（Ｔ
、Ｇｌ’ＶＣＺｔａｎらｉ　９７８”　Ｊ　、　３　ａ
ｃｔｅｒｔｏ＋、”　、上１上：３１８　（１９７８）
：Ａ、Ｊａｌａｎｋｏら１９８１”　Ｑ　ｅｎｅ”　、
上４：３２５）。こ（７）　Ｂ　ａｍＨＩ部位はＫｌｅ
ｎｏｗで試験した。ｌ）Ｂ　Ｒ３２２部分は、２０６７
位のＰＶＩＪＩＴ部位ど３２２３位の５ａｕ３Ａ部位と
の間の１１００塩基対のフラグメントであり、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ複製起源を含んティる（Ｆ、　Ｂｏｌｉｖａｒら１
９７７、”Ｇｅｎｅ　”　、　２　：９５　：Ｊ、　５
ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　１９７８　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ
ａ　Ｇａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ４３：１．７７
）ｏ　ｐＣ１９４フラグメントは９７３位のＨｐａＩＩ
部位と２００６位の３ａｕ３八部位と６５− の間の１２００１１対フラグメントでありＥ。

ｃｏｌｉおよびＢ、　５ｕｂｔｉｌｔｓの両方で発現し
得るクロラムフェニコール耐性のための遺伝子を含んで
いる（Ｓ、　Ｅｈｒｌｉｃｈ、　”Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）　”　、　ＬＬ：　１６８０　：　Ｓ、Ｈｏ
ｒｙｎｕｃｈｉら１９８２　、”　Ｊ　、　Ｂ　ａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、　”上５０：８１５）。

このようにｐＢｓ４２はＥ、ｃｏ＋＋および桿菌の両者
で機能する複製起源およびクロラムフェニコール耐性の
ための発現し得る遺伝子を含んでいる。

支ｉ匠５　Ｂ、５ｕｂｌｊｌｔｓサブチリシン遺伝子の
分離および配列決定 ３、５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｉ　１６８染色体ＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで消化し、そのフラグメントをゲル電気泳動にか
けた。１個の６ｋｂフラグメントが「α−３２ｐ」ＣＴ
Ｐニック・トランスレーション−上記のｐＳ４のサブチ
リシン構造遺伝子のＣ末端から得られた標識フラグメン
ト−にハイブリダイズした。この６ｋｂフラグメントを
電気溶出し、ＥｃｏＲＩで消化し細菌性アルカリホスフ
ァターゼで処理した６６一 ｐＢ　Ｓ　４２に結合させた。この結合混合物でＥ。

ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ３１／１４６を形質転換し、形質転
換体を、１２．５μｇのクロラムフエニコ゛−ル／７１
βを含有している１−１３寒天上で増殖させて選択した
。、５０００個の形質転換コロニーのプールした懸濁液
からプラスミドＤＮＡを調製した。このＤＮＡを、プロ
テアーゼ欠落株である３、５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＧ８４
（この調製法は実施例８に記載しである）に導入した。

プロテアーゼを生産するコロニーを、Ｌ　Ｂ寒天プラス
１．５％（Ｗ／Ｗ　）カーネーション粉末ｎＩ２脂スキ
ムミルクおよび５μｇクロラムフエニ］−ル／鱈（以降
スキムミルク選択プレートと言う）上に置き、蛋白分解
活性を示す澄明な部分を観察することによりスクリーニ
ングし７、：。

プラスミドＤＮＡをプロテアーゼ生産コロニーから調製
し、ＥＣ０ＲＩで消化し、Ｂ、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎｓからの１ナブチリシン構造遺伝子の３２
ｐ−標識Ｃ末端フラグメン１〜にハイブリダイズさせる
ことにより、サザーン分析にｊ；って６ｋｌ〕Ｅ　ｃｏ
ＲＩ挿入体の存在についてしらべた。陽性クローンを同
定し、このプラスミドをｐｓ　１６８．１と命名した。

ｐＳ　１６８．１で形質転換したＢ、ｓｕｌ＋ｔｉｌｉ
ｓ　１３Ｇ８４は、Ｂ　、　５ｕｂＮｌｉｓ　Ｉ　１６
８によって生産されるものよりも５＠の濃度でセリンプ
ロテアーゼを分泌した。ＦＤＴＡを上清に加えても分析
の結果は変らなかったがＰＭＳＦ（フェニルメチルスル
ボニルフルオライド）を上清に加えると、３０８４株に
ついて実施例８で述べた分析において検出できない濃度
まで、プロテアーゼ活性が減少した。

６．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ挿入体の制限地図を第６図に示
した。種々の制限酵素消化物をザブクローンし、そして
Ｂ、　５ｕｂＮｌｉｓ　３Ｇ８４中でサブチリシンの発
現を試験することにより、サブチリシン遺伝子を２．５
ｋｂ　ＫｐｎＩ　−ＦｃｏＲＩ７ラグメン１〜の内部に
位置せしめた。Ｂ、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓサブヂリシン遺伝子のＣ末端からの標識フラグメン
トをプローブとして用いたサザーン分析により、Ｂ、５
ｂｔｉｌｉｓ遺伝子のＣ末端をこのサブクローンの中央
の６３１　ｂｐ　Ｈｉｎｃ　ＴＩフラグメントＢの内部
またはその一部に位置・づけた。縦列のｌ−１ｉｎｃＴ
Ｉノラクメン１〜［３、Ｃ１およびＤ並びにｌ−ｌ　ｉ
ｎｃ　ｆＪ　−ＦｃｏＲＴフラグメントＥ（第６図）を
Ｍ１３ベクターｍｐ８またはｍｐ９に結含させ、ジデオ
キシ読み終り法（Ｆ　、　Ｓ　ａｎｇｅｒら１９７７　
、”　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

△　ｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｌ）　、Ｓ、Ａ、”　二Ｑ：５
／１６３−５４６７）を用いて既知の方法で（Ｊ　、　
Ｍ　ｅｓｓｉｎｇら１９８２　”Ｇｅｎｅ　”上９：２
０９−２７６）で配列化した。この領域の配列を第７図
に示した。最初の２３アミノ酸は信号ペプチドであると
考えられる。信号配列と成熟暗号配列の間の残りの８３
アミノ酸は、１（を定−にのしプロ」配列を構成してい
る。この遺伝子の３′未喘のオーバーラインドヌクレオ
チドは転写終了領域であるど思われる。成熟開始コドン
から上流の２つの３　ｈｉｎｅ−１）　ａ１ｇａｒｎＯ
配列としての可能性のある配列には下線を付しＩこ　。

割」１化Ｂ、　５ｕｂＮＩｉｓサブチリシン遺伝子の不
活性化ミコーチージョンの製造 桿菌の染色体に組込まれる欠落遺伝子を持った６９− プラスミドを組立てるには、二段階の結合が必要であっ
た（第８図参照）。最初の工程で、実施例５で述べたＢ
、　５ｕｂｔｉｌｉｓゲノムライブラリーから回収した
６、５ｋｂ挿入体を含んでいるｐＳ１６８．１をＥＣ０
ＲＩで消化し、この反応生成物をＫ　ｌｅｎｏｗで処理
し、そのＤＮＡをＨｉｎｃｌＴで消化し、その一部に３
．Ｓｕｂロ１ｉｓザブチリシン遺伝子の５′末端を含ん
でいる８００　ｂｐ　ＦＣＯＲＩ−１−１ｉｎｃＩＩフ
ラグメントＥ（第６図参照）を回収した。このフラグメ
ントを、ｌ−１ｉｎＯＩＩで消化し細菌性アルカリホス
ファターゼで処理したｒｌＪ　ｌ−１１０１に結含させ
た（ｐＪＨｌｏｌはＪ　、ｌ−１ｏｃｈ　（３ｃｒｉＯ
ｐＳ）カラ入手テキ、Ｆ、　Ａ、　Ｆｅｒｒａｒｉら１
９８３゜”Ｊ、Ｂａｃｔ、”　１３４　：３１８−３２
９に記載されている）。得られたプラスミド、ｐＴＤＶ
ｌは、第８図に示した方向にフラグメントＥを含有して
いた。第２の工程ではｐ３１６８．１をＨｉｎｃ［で消
化し、サブチリシン遺伝子の３′末端を含んでいる７０
０　ｂｐ　Ｈｉｎｃ　ＩＩフラグメントＢを回収した。

ｐＴ　ＤＶＩをその特異なＨｉｎｃＵ部位で消化し、７
０− フラグメン１〜Ｂをこの線状化しＩＣプラスミドに結合
させ、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ３１４４６に形質転換し
、そし’Ｃ１２，５ｔｌ（Ｊのフロラｌ＼）■二］−ル
／鱈または２０μｑのアンピシリン／戴を含有している
ｌ　１３プレー１〜Ｌで選択１ノだ。ｐｌＤＶｌ、４と
命名された１つの得られたプラスミドはフラグメン１〜
Ｆに関して正しい方向にフラングメン１−　Ｂを含有し
ていｌこ。第８図に示したこのプラスミドＩ）ＩＤＶｌ
、４は、５′お」：び３′隣隣接列の部分をも含んで′
いるサブチリシン薄伝子の欠失誘導体である。

後記実施例８で調製した部分的プロテアーゼ欠落（欠失
）ミ１−タンｈ　（Ｐｒｔ＋／　）　、Ｂ、　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ　ＲＧ７７をｒｌｌＤＶｌ、４で形質転換した
。２つのクラスのり［ｌラムフェニコール耐性（Ｃｍ　
”　）形質転換体が得られた。Ｌ　１３寒天プラススキ
ムミルクを含イーしているブ１ノー１−　Ｌの相当する
位置のンσ明さをＷＱ察りることにＪ：す、７５％がＢ
Ｇ７７（Ｐｒｌ″−／−）と同じレベルのブ「１テアー
ゼ活性を示したが２５％はほとんど完全にプロテアーゼ
を欠失していた（Ｐｒｔ−）。Ｃｍ’ｐｒｔ−形質転換
体は、そのプラスミドのフラグメントＦまたはＢのため
の相同領域にお（プる１回の交叉組込みによるものとは
考えられない。というのは、このような場合その遺伝子
は中断されずそして発規形質はｐｒｔ＋／−となるであ
ろうから。事実、フラグメントＥまたはＢのいずれかを
独立してＩＩＪＩ−１１０１に結合させ、次いで３．５
ｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＧ７７に導入するとプロテアーゼ欠
落表現形質は観察されなかった。Ｃｍ　’　Ｐｒｔ−ｐ
Ｉ　ＤＶ　１，４形質転換体）Ｃｍｒの表現形質は、ｃ
ｍ”ｐｒｔ−誘導体がＣｍ’Ｐｒｔ−培養物から、抗生
物質選択の非存在下に最少培地で１０世代増殖さけた後
、約０．１％の頻度でＣｍ’Ｐｒｔ−培養物から分離す
ることができたという点で不安定であった。このような
誘導体の１つを、３Ｇ２０１８と命名した。この欠失を
、ＰＢＳＩ形質導入によりｌＡ３４（→Ｊ−ブヂリシン
遺伝子に隣接する（両端に位置する）２個の栄養要求ミ
ューチージョンを持ったＢＧＳＣ株）に導入した。この
誘導体微生物をＢ　Ｇ　２０１９と命名した。

実］１外７　Ｆ３．５ｕｂｔｉｌｉｓからゲノムＤＮＡ
ライブラリーの調製および中性プロテア−げ遺伝子の分
離 Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓの中ｆ［プロプアーゼの部分的な
アミノ酸配列はＰ、Ｌｅｖｙら１　’３７５．　”Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎ　ａｔ、Δｃａｄ、３ｃｉ、　ＵＳＡ”　ｌＪＬ：　
４３　／Ｉ　１−４３４５に記載されている。発表され
ているこの配列から、ぞの領域内のアミノ酸に対する潜
在的な］トンの重剰性が最も少ない酵素の領域（ＡＳＩ
）Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｔ　ｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ）を選択
した。下に示づＪ：うに、この潜在的な全ての暗号配列
をカバーするのに２４の組み合せが必要である。

ＡＳｐＧｌｎ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　ＧＩＶそれぞ
れ６通りの組み合じを含む４つのプールを実施例１に記
載したようにして調製した。この７３− プールを［γ−３２ＩＩ　Ｊ　ＡＴＰを用いて燐酸化に
より標識した。

Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ（ｌＡ７２、Ｂ　ａｃｉｌｌｕ
ｓ　Ｇ　１ｎｅｔｉｃ３ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　）　
ＤＮＡを各種の制限酵素で消化し、消化物を電気泳動ゲ
ルで分離し、その４つのプローブプールのそれぞれを、
プロットした消化物のそれぞれに、条件を徐々に厳格に
しながら１個のバンドがハイブリダイズするのが確認さ
れるまで、ハイブリダイゼーションを行なうことにより
３．５ｕｂＮｌｔｓゲノム中の特異な配列に最も合致す
る配列を含んだ標識プールを選択した。徐々に条件を厳
格にするということは、ハイブリダイゼーションを起し
にくい条件にすることを言い、例えばホルムアミド濃度
を増大させること、塩濃度を減少させることおよび温度
を上げることである。５ｘｌ）ｅｎｈａｒｄｔ　’　ｓ
　、　５ＸＳＳＣ，５０ｍＭＮａ　ＰＯａ　（１）８６
．８）および２０％ホルムアミドの溶液中、３７℃でプ
ール４だけがプロットした消化物とハイブリダイズした
。これらを中性プロテアーゼ遺伝子のために使用する適
当なバイア４− ブリダイゼーション条件として選択し、プール４をプ［
１−ブとして使用した。

桿菌のゲノムＤＮＡを３ａｕ３Ａで部分開化し、その部
分消化物を電気泳動ゲル上で分子量により分離し、１５
〜２０ｋｂフラグメン］〜を溶出しくＲ。

Ｌａｗｎら１ｇＢ１．　”ＮＵＣＩｅ＋ＣＡｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　＋＋Ｌ：　６１０３−６１１４　＞　、Ｐｒ
ｏｍｅｇａ　Ｂｉｐｔｅｃ。

提供のｐ　ａｃｋａｇｅｎｅキットを使って、そのフラ
グメントを、Ｂａｍ１−ＩＩで消化したチャロン３０フ
アージに結合させることにより、常法に従って３．５ｕ
ｂｔｉｌｉｓａ　Ｂ　Ｇ　Ｓ　Ｃ１−Ａ　７２のラムダ
−ライブラリーを調製した。

ヂャロンラムダーファージのための全ての既知の宿主を
使用することができるが、このファージライブラリーの
宿主としてはＥ、ｃｏｌｉ　ＤＰ５０ｓｕｐ　Ｆを使用
した。このＥ、ｃｏ！ｉ宿主をライブラリーファージと
ともにプレートして培養し、その後プラークを、ニトロ
セルロースに転移させ、プローブプール４でスクリーニ
ングする（　Ｂ　ｅｎｔｏｎおよびＤａＶｉＳｌ　９７
７　、”５ｃｉｅｎｃｅ”　１９５　：　１８０−１８
２）ことにより中性プロテアーゼ遺伝子の存在について
分析した。陽性プラークを、プラーク純化を２回行なっ
て精製し、さらに調査するために２つのプラークを選ん
だ。これらをλＮＰＲＧ１およびλＮＧＲＧ２と命名し
た。各ファージから制限酵素加水分解および電気泳動ゲ
ル」−の分離によりＤＮＡを調製した。分離したフラグ
メントをプロットし、標識したプール４オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせた。これにより、λＮＰＲＧ
１は２４００ｂｐＨｉｎｄ　Ｉ［ｌハイブリダイジング
フラグメントを含んでいたが、４３００＋）Ｉ）ＥＣＯ
ＲＩフラグメントは含んでおらず、一方λＮＰＲＧ２は
４．３００ｂｌ）ＥｃｏＲＩフラグメントを含んでいる
が、２４００ｂｐＨｔｎｄ　Ｉｌｌフラグメントは含ん
でいないことが解った。

この２４００ｂｐλＮＰＲＧ１フラグメントを１）Ｊ　
Ｈ１０１のＨｉｎｄＨ１部位に、以下の方法でザブクロ
ーンした。λＮＰＲＧ１をＨｉｎｄＩ［［で消化し、消
化物を電気泳動により分画し、そして２４００ｂｐフラ
グメントをゲルから回収した。このフラグメントをアル
カリホスファターゼで処理したＨｔｎｄｌｌｌ演化ｐＪ
　Ｉ−Ｉ　１０１に結合させ、この結合混合物を使い、
Ｖ　、Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら１９７４　、”Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔ、Δｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）　
”　ＬＬ：　３４５５−３４５９の塩化カルシウムショ
ック法により「、ｃｏｌｉＡＴｃｃ　３１４４６を形質
転換した。形質転換体を、Ｌ　Ｂ　＠　坤プラス１２．
５μｇのクロラムフＴ・ニコール／　ｙｚｅを含有して
いるプレート上での増殖可能なコロニーを選択すること
により同定した。

形質転換コロニーから数個のプラスミドを得た。

各プラスミド中の２４００ｂｐフラグメントの方向性は
通常の制限分析により決定した（方向性とは、結合させ
た発現ベクターの読み取り方向に関して遺伝子フラグメ
ントの読み取り方向または転写方向を意味する）。向い
合った２つのプラスミドが得られ、これらを１ｌＮＰＲ
ｓｕｂＨ６およびｐＮＰＲ３１１１１１−（１と命名し
た。

λＮＰＲＧ２をＥＣ０ＲＩで消化することおよびプラス
ミドがアルカリホスファターゼで処理した７７− ＥＣ０ＲＩ潤化ＩＩＢ　Ｒ３２５であることを除いて、
２４００ｂｐフラグメントについて上記した方法と同様
にしてλＮＰＲ，Ｇ２の４３００ｂｐＥｃｏＲＩフラグ
メントをｐＢ　Ｒ３２５にサブクローンした。ｐｆ３Ｒ
３２５はＦ　、　Ｂｏｌｉｖａｒ、　１９７８　、”Ｇ
ｅｎｅ　”±：１２１−１３６に記載されている。４３
００　ｂｐ挿八人体異なった方法で存在している２つの
プラスミドを同定した。これら２つのプラスミドをｐＮ
ＰＲｓｕｂＲＩおよび１）ＮＰＲｓｕｂＲＩｂと命名し
た。

丸１１ＬＢ　−５ｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ遺伝
子の特性化 ＋１ＮＰＲｓｕｂｆ−１１挿入体を種々の制限エンドヌ
クレアーゼで順次消化し、標識化したプール４とプロッ
トハイブリダイズさせ、その挿入体の制限地図を作成し
たく一般的な制限地図の作成法についてはＴ、　Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら前記３７７頁参照）。プローブプール４と
ハイブリダイズした最も小さなフラグメントは４３０ｂ
ｐ　ＲｓａＩフラグメントであった。このＲｓａＩフラ
グメントをＭ１３ｍｐ８７８− （Ｍ、Ｍｃｓｓｉｎｑら１９８２．　”Ｇｅｎｅ　”　
１９　：　２６９−２７６およびＭ、　Ｍｅｓｓｉｎｑ
　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
、　１９８３．　Ｒ，ＷｕらＥｄｓ、。

上止上：　２Ｏ−７８）のＳｍａ：［部位に結合すせ、
その配列を読み取り終りジデオキシ法（Ｆ、Ｓａｎｇｅ
ｒら１９７７　、”　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、
ＳｃＬ　Ｕ　。

Ｓ、Ａ、”１上：　５４６３−５４６７＞により決定し
た。ＩＩＮＰＲｓｕｂＨ１挿入体からの他の制限フラグ
メントをＭ１３　ｍｐ　８またはＭ１３ｍ１１９ベクタ
ーの適当な部位に挿入し、その配列を決定した。

必要に応じ、圧縮人造構造（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ　
ａｒｔＮａＣｔ）　（Ｄ、Ｍｉｌｌｓら１９７９　、”
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Δｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）”　７６　：　２
２３２−２２３５）を減少させるためにｄＴＴＰを使用
した。ｐＮＰＲｓｕｂＨ１フラグメントの制限地図を第
９図に示す。制限酵素消化物からの種々の７ラグメント
の配列を比較し、プロテアーゼのアミノ末端および）ｙ
ルボキシ末端に翻訳されるコドン配列を含んでいるオー
プンリーディングフレーム（Ｐ、Ｌｅｖｙら前記）を決
定した。オープンリーディングフレームは、既知の１か
ら始まる、リーディングフレーム（全ての３つのヌクレ
オチド）中に如何なる終止コドンをも内部に含んでいな
いＤＮＡ配列である。このオープンリーディングフレー
ムは、アミン末端から２４００ｂｌ）　ｌ−１ｉｎｄｌ
ｌフラグメントの末端にまで拡がっていた。１３００ｂ
ｐ　Ｂ（ＩＩＩＩ−Ｈｉｎｄ　Ｉ［［フラグメン１−を
ｐＮＰＲｓｕｂ　ＲＩ部位（これはλＮＰＲＧ２の４．
３００ｂｐＥＯＯＲＩフラグメントを含んでいた）から
調製し、Ｍ１３ｍｐ８にクローンした。ＩＩＮＰＲｓｕ
ｂ　Ｈｌ　（ｆ）２４００ｂｌｌフラグメントによって
暗号化されていない中性プロテアーゼリーダー領域の部
分を含んでいるこのフラグメントの配列を、ｌ−１ｉｎ
ｄｌｌｒ部位から上流へ４００ヌクレオチドについて決
定した。

この中性プロテアーゼ遺伝子のために決定された、推定
上の分泌リーダーおよびプレプロ配列を含む全ヌクレオ
チド配列を第１０図に示す。列の上の数値はアミノ酸番
号を示している。第１０図において下線を引いたヌクレ
オチドはリポソーム結合部位（Ｓ　ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａ
ｌｏａｒｎｏ　）を構成しティると考えられ、一方上に
線を引いたヌクレオチドはターミネータ−であると推定
される潜在的なヘアピン構造を構成している。最初の２
７〜２８の推定アミノ酸は中性プロテアーゼのための信
号であると考えられ、開裂点はａｌａ　−２７またはａ
ｌａ　−２８にある。プロ酵素構造の１プロ」配列は成
熟、活性酵素のアミン末端アミノ酸（ａｌａ　−２２２
）に至っている。

１９００ｂｐを含んでいるｐＮＰＲｓｕｂＲｌのＢ（Ｉ
ＩＩＴフラグメント（第９図）を１４００ｂｐを含／ｖ
　Ｔ”　イルＩＩＮ　Ｐ　Ｒ５ｌｌｌｌ　ｌ−１１のＰ
　ｖｕｌＴ　−１−１ｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントと結
合させることにより、全ての中性プ［］テアーゼ遺伝子
を持ったコピー数の高いプラスミドを組立てたく第１１
図）。実施例４からの１１Ｂ　Ｓ　４２をＢａｍ１−Ｉ
Ｉで消化し、細菌性アルカリホスファターゼで処理して
プラスミドの再環化を防止した。Ｉ）ＮＰＲｓｕｂＲｌ
をＢｑｌｌＩで消化し、１９００　ｂｐフラグメントを
ゲル電気泳動法で分離し、ｐＢ　Ｓ　４２の開いたＢａ
ｌｌｌＨＩ部位に結合させた。この結合させたプラスミ
ドを使ってＦ、ｃｏｌｉＡ丁８ｌ− ＣＣ３１４４６を、塩化カルシウムショック法（Ｖ　、
　Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら前記）により形質転換し、形
質転換された細胞を、１２．５μＱ／ｍのり「１ラムフ
エニコールを含有するＬＢ培地を含んだプレート上で増
殖させることにょ選択した。第１１図に示した方向にＢ
ａ１ＩＩフラグメン１〜を持ったプラスミドを形質転換
体から分離し、ｌ’ｌＮ　Ｐ　Ｒ５ｕｂＢ１と命名した
。ｐＮＰＲ８ｕｂＢ１をＥ（ＯＲＩｒ消化（線状化）し
、Ｋ　Ｉｅｎｏｗ処理により修復して平滑末端とし、次
いでＨｉｎｄｌ［［で消化した。ＨｉｎｄＩ［［消化に
より得られる大きい方のフラグメント（アミン末端およ
び上流領域を暗号化している配列を含んでいる）を回収
した。

この遺伝子のカルボキシ末端領域は、ｐＮＰＲｓｕｂＨ
ｉをＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し１４００
ｂｐフラグメントを回収することによって得た＋１ＮＰ
ＲｓｕｂＨ１からのフラグメントで供給した。

この１４００ｂｐフラグメントの平滑末端ＰＶｉおよび
Ｈｉｎｄ１部位をそれぞれ、ＦＩＮＰＲｓｕｂＢｌの平
滑なＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌ［Ｉ部位と結合させ８
２− た（第１１図参照）。この組立物を、後記の分析法で、
本来蛋白分解活性物を分泌しないＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ
株ＢＧ８４に導入した。この形質転換体を、ＬＢＦｔＪ
ｌ！！プラス１．５％カーネーション粉末脱脂ミルクお
にび５１１Ｑ／ｙＥのクロラムフェニコールを含有して
いるプレート上で選択した。大きながさくｈａｌｏ）を
清澄にしたコロニーからのプラスミドを分析した。構造
遺伝子および中性プロテアーゼ遺伝子の隣接領域を挿入
しているプラスミド−ｐＮＰ　Ｒ１０を制限分析によっ
て知らべたところ第１１図に示す構造を持っていた。

Ａｄｅｌｂｅｒｇらの一般的な方法（１９６５゜“Ｂ　
ｔｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ
ｍｍｕｎ、”　１８　ニア８８−７９５）に従い、３．
５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｉ　１６８のＮ　−）（チルーＮ′
−二トローＮ−二１へロソグアニジン（ＮＴＧ）による
変異誘発によってＢ。

５ｕｂｔｉｌｉＳ株ＢＧ８４を作った。変異誘発させた
株１１６８をスキムミルクプレート（抗生物質を含まず
）においた。小さいかさを形成するコロニーを拾い上げ
ざらに分析した。各コロニーにつきスキムミルクプレー
ト上でプロテアーゼ生産を、デンプンプレート上でアミ
ラー生産を調べた。部分的にプロテアーゼ欠失であり、
アミラーゼ陽性であり、そして胞子形成し得る１つの単
離物をＢ　Ｇ　７７と命名した。プロプアーゼ欠失ミュ
ーチージョンはｐｒｔ−７７と命名した。このｐｒｔ　
−７７対立遺伝子を下に述べる会合によって５Ｉ１００
Ａバツクグラウンドに移動させて、胞子形成欠落株であ
るＢＧ８／１株を作った。

１１６８　ｔｒｌｌｃ２ Ｊ　Ｈ２Ｏ２」」■バー、　」加ＪＪ業Ｔｒｏｕｓｄａ
　ｌ　＋ら＊−汁立ＱＪＬＮ旦Ｕ− ８Ｇ１６　ユ旺１虹、」蛙正５　ｐ　ｂ１６６５ｓａｃ
Ａ３２１ ８Ｇ７７　ユ皿ｍＬ、［Ｌ琵　ＮＴＧＸＴ１６８８Ｇ８
１　ｍ肚圧り、肚ヒフ７　Ｂ　Ｇ　１６Ｄ、Ｎ　Ａ　Ｘ
Ｇ７７ ＢＧ８４　ｓ　ｏ　Δ６７７　ｒｔ−７７Ｊ　ｌ−１７
０３Ｄ　Ｎ　Ａ×８１ ＊”Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　”二１７３　
：　６１　（１９７９）１３Ｇ８４はスキムミルクプレ
ート上でプロテア−げ活性を完全に失っており、０．１
Ｍの燐酸ナリトウム（Ｉｌｌ−１８）中、２５℃で０．
２μｇ／π℃のサクシニル（−１−ａｌａ　−Ｌ−ａｌ
ａ　−Ｌ−ｐｒｏ　−ｌ　−ｐｌ）ｅ　）　１１−ニト
ロアニリド（Ｖｅｇａ）とインキュベーションし、１分
当りの４１２ｍｎにおける吸収の変化を測定して分析し
た結果、検出可能な濃度のサブチリシンも中性プロテア
ーゼも生産しなかった。８Ｇ８４は１９８３年７月２１
日にＡＴＣＣに寄託された（寄託番号３９３８２）。サ
ブチリシン分析のための試料は、改良３　ｃｈａｅｆｆ
ｅｒの培地（Ｔ　、　Ｌ　ｅｉｇｈｔｏｎら１９７１　
、”Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、”２４６：３１８９−３１９５）で増殖させ
た培養の後期対数増殖期の上清から採取した。

ｆｆｉ　中性プロテアーゼ遺伝子の発現ｒ）Ｎ　Ｐ　Ｒ
１０で形質転換したＢＧ８４を、０．１％８５− のカゼイン加水分解物および１０μｇのクロラムフェニ
コールを添加した最少培地に接種し、１６時間培養した
。培養上清０．１πβを採取し、１０ｍＭｔ−リス−Ｈ
Ｃｊｉ、１００　ｍＭ　Ｎａ　Ｃ１（ｐＨ６，８）中に
１　、４　ｍｕ／　ｙＡのＡｚｏｃｏｌｌ蛋自分解基質
（Ｓ　ｉｇｍａ）を入れた懸濁液に加え、撹拌下にイン
キュベートした。消化されなかった基質を遠心分離によ
り除き、５０５　ｎｍにおける光学密度を測定した。Ａ
　ｚｏｃｏｌ　＋基質懸濁液のバックグラウンド値を減
じた。標準的なプロテアーゼ発現株であるＢＧ１６によ
って分泌されるプロテアーゼの量を任意に１００と定め
た。ＢＧ１６、および対照並びに中性プロテアーゼ遺伝
子含有プラスミドで形質転換したＢＧ８４についての結
果を後記実施例１２の表Ｂに示す。分泌されるプロテア
ーゼ−欠落Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ株ＢＧ８４を形質転
換したものは、野生株であるＢＧＩ６よりも遥かに高い
濃度でプロテアーゼ活性体を分泌することが解る。

［中性プロテアーゼ遺伝子の不活性 化ミューチージョンの製造 ８６− １）Ｎ　Ｐ　Ｒ５ＩＪＩ）　ｌ−１１の２４００ｂｐ挿
人体の２つのＲｓａ’、［に囲まれた領域、全５２７ｂ
１１、を削除し、不完全な構造遺伝子を作ることができ
る。この遺伝子の翻訳産物は酵素的に不活性である。こ
の欠失のあるプラスミドを以下の如くして組立てた。

ρＪ　）−１１０１をｌ−１ｉｎｄＩ［［Ｆ消化シテ聞
’ＪＪ　サセ、ｅ菌性アルカリホスファターゼで処理し
た。線状化したＩ）Ｊｌ−１１０１に挿入すべき中性プ
ロテアーゼ遺伝子ノ７ラクメントハ、ｐＮ　Ｐ　Ｒ５Ｕ
ＩＴ　＋−１１をト１ｉｎｄ■およびＲ３ａＴで消化し
ゲル電気泳動ににつて１２００＋１１１のｌ−１ｉｎｄ
　ｍ　−Ｒｓａ■および６８０ｂｐのＲｓａ　’Ｉ　−
ｌ−ｌ　ｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントを回収することに
より得た。これらのフラグメントを線状化した１）Ｊ　
Ｈ１０１ニ結合すｔ！、　Ｆ、　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ３
１／Ｉ／１６の形質転換に使用した。形質転換体をＬＢ
ｊａ地おＪ：び２０μｇのアンピシリン／戴含有プレー
ト上で選択した。この形質転換体からプラスミドを回収
し、制限酵素分析によって分析し、ｐＮＰ　Ｒｓｕｂ　
＠　１出発プラスミドと同じ方向性に２つのフラグメン
１〜を持ったプラスミドを同定した。

内部のＲｓａエフラグメントを失ったこのプラスミドを
１ｌＮＰＲｓｕｂＨ１Δと命名した。

実ＩＪＬ上」−中性プロテアーゼ遺伝子の欠失ミュータ
ントによる置換 プラスミド１ＩＮＰＲｓｕｂＨ１ΔをＢ、　５Ｌｌｂｔ
ｉｌｉＳ株Ｂ　Ｇ　２０１９　（実施例６のサブチリシ
ン欠除ミュータント）に導入し、染色体組込み体をスキ
ムミルクプレート上で選択した。コロニーの周囲に親株
と同レベルの蛋白分解を示すものと、蛋白分解ゾーンの
ほとんどないものとの２つのタイプのＣｍｒ’形質転換
体が観察された。蛋白分解ゾーンのないものを選択し、
再画線して個々のコロニーを純化し、それらのプロテア
ーゼ欠失特性をスキムミルクプレート上で確認した。Ｃ
ｍ’である蛋白分解欠失コロニーの１つを選んでこれを
さらに研究した（このコロニーを３　Ｑ　２０３４と命
名した）。

Ｂ　Ｇ　２０３４の偶発ＣｍＳ復帰突然変巽体を、Ｃｍ
含有Ｌ　Ｂ培地で一夜増殖させて分囚［シ、個々のコロ
ニーをプレートし、Ｃｍを含んだ、および含まない培地
上に反復プレートした。３個のＣｍＳ復帰突然変巽休を
体離したところ、その内の２つはプロテア−げ能があり
、残りの１はプロテアーゼ能がなかったくこれをＢ　Ｇ
　２０３Ｇと命名した）。ＢＧ２０３６のハイブリダイ
ゼーション分析の結果、このプラスミドは、たぶん組換
えによって、この株から欠落し、リブチリシンおよび中
性プロテアーゼの欠失フラグメン１〜だりが残ったこと
を確認した。

支ｉ九二１　機能的サブチリシンおよび中性プロテアー
ゼを欠く株の表現形質 中性またはアルカリ竹のプロテアーゼあるいはその両者
の機能的遺伝子を欠く株についてその増殖、胞子形成お
よびプロテアーゼの発現について試験した。プロテアー
ゼの発現はスキムミルクプレート上のコロニーの周りの
澄明化バンドおよび液体培養土清中のプロテアーゼ濃度
の測定によって調べたく表口）。ザブチリシン遺伝子欠
失株（Ｂ　Ｇ　２０３５）はプロテアーゼ活性の３０％
の減少およびミルクプレー１〜上の正常ながさくｈａｌ
ｏ）を示した。削除された中性プロテアーゼ遺伝子およ
び活性サブチリシン遺伝子を持ち、Ｂ　Ｇ　２０３６　
（実８９− 前例１１）のＤＮＡでＢＧ１６（実施例８）を形質転換
することにより組立てられたＢ　Ｇ　２０４３株は、プ
ロテアーゼ活性の８０％の減少およびミルクプレート上
の小さいかさを示した。上記の両遺伝子における削除を
有する点でＢ　Ｇ　２０３６　（実施例１１）と等価で
あると考えられる８０２０５４株は、検出可能なプロテ
アーゼ活性を示さず、ミルクプレート上の検出し得るか
さも示さなかった。

プロテアーゼ遺伝子群の片方または両方を削除しても増
殖または胞子形成に明らかな影響を与えなかった。これ
らの削除（欠失）を有する株は最少グルコース培地およ
びＬＢ培地の両者において正常な増殖速度を示した。こ
れらの株は親株ＢＧ１６に匹敵する頻度の胞子形成を示
した。これらの株を形態学的に調べたところ欠失を含ま
ない株と明らかな違いを示さなかった。

９０− 去」Ｌ プロテアーゼ発現および胞子形成に及ぼすプロテアーゼ
欠失の影響 遺伝子型１　プロテ　胞子形成 アーゼ　（％） −；２ ＢＧ１６　野生型　１００　４０ ８　Ｇ　２０３５　ａｐｒΔ６８４　７０　２０Ｂ　Ｇ
　２０４３　ｎ１ｌｒＥΔ５２２　２０　２０Ｂ　Ｇ　
２０５４　ａｐｒΔ６８４．　Ｎ［）　４５ｎｐｒＦΔ
５２２ ８　Ｇ　８４　５ｔ）００　ＡＡ　ＮＤ　・・・（ｎＢ
ｓ４２）　６７７、ｐｒｔ−７７Ｂ　Ｇ　８４　５ｐｏ
ｏ　ＡＡ　３０００　・・・１０　６７７　ｒｔ−７７ １プロプア一ゼ表現形質に関連する座だけを示した。

２プロテア−Ｕ活性はＢＧ１６を１００とする任意の単
位で表わしである。ＮＤはプロテアーゼ活性が検出され
なかったことを示寸。

Ｊ　２２２位における３　、Ａ　ｍｙｌｏｌｉＱｔｌｅ
ｆａｃｔｅｎｓザブチリシン遺伝子の部位特異性飽和変
異誘発、カセット挿入のための遺伝子の調製Ｗｅｆｔ　
らの方法（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　Ａ　ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、
１９Ｂ３，１１　ニアＣＮ１−７９２４．）に従って調
製した１１８４の誘導体であるｐｓ　４−５をＥＯＯＲ
ＩおよびＢａｍＨＩで消化し、１．５ｋｂＦｃｏＲＩ　
−ＢａｍＨＩフラグメントを回収した。このフラグメン
トをＥＯＯＲＩおよびＢａ１ｌｌＨＩで消化した複製型
のＭ−１３ｍｐ９に結合させた（　Ｓ　ａｎｇｅｒら、
１９８０　”Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、”　１４３．
１６１−１７８　：Ｍｅｓｓｔｎｇら、１９８１．　“
Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　Ａ　ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　”
　９．３０４−３２１　：Ｍｅｓｓｉｒ＋ｏ、　Ｊ。

およびＶｉｅｉｒａ　、Ｊ、（１９８２）Ｇｅｎｅ　１
９゜２６９−２７６）、Ｍ−１３ｍｐ９ＳＵＢＴと命名
したこのＭ−１３ｍｐ９ファージ結合体をつかってＥ。

ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１を形質転換し、２πａの終夜培養
物から１本鎖ファージＤＮＡを調製した。以下の配列を
持ったオリゴヌクレオチドプライマーを合成した： ５’　−ＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴΔＣＣＴＣＡＣ−ＧＣΔ
ＣＧ　ＣＴ’　Ｇ　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　ＣＧ　Ｇ　
ＣＴ　Ｇ　Ｃ−３′ このプライマーは２２２−２２５位のアミノ酸に対する
１０ｂｐのコドンが削除されており、ｍｅｔ　−２２２
コドンにＫｐｎＩ部位（５′）を、ｍｅｔ＋２２２コド
ンにｐｓｔＩ部位（３′）を導入するためにアミノ酸２
２０．２２７および２２８に対するコドンが変異されて
いることを除（）ば、アミノ酸２１６−２３２を暗号化
しているサブチリス遺伝子フラグメントの配列に符合し
ている（第１２図参照）。置換したヌクレオチドは星印
で示してあり、ライン２の下線を引いたコドンは新しい
制限部位を示しており、ライン４の線を引いた部分は挿
入されたオリゴヌクレオチドを表わしている。

このプライマー（約１５μＭ）を以下の如くしてし３２
１′ｌ」でラベルした：　ｒ　ｒ３２ＤＪ−ＡＴＰ（２
０，’のの反応液中１０／’）　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　
５０００Ｃｉ　／ｍｍｏ１．１０２１８　）およびＴ４
ボリヌクレオヂドキナーゼ（１０単位）、次いで非放射
９３− 性ＡＴＰ（１００μＭ）とともにインキコベ−１〜しこ
の変異誘発プライマーを完全に燐酸化した。

この燐酸化混合物を６８℃で１５分間加熱してキナーゼ
を不活性化した。

Ｎ　ｏｒｒｔｓらの改良法（１９８３、”Ｎｕｃｌｅｔ
ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　”　１１．５１０３−５１１
２）に従い、５パのラベルした変異誘発プライマーく〜
３μＭ）、約１　μｇＭ−１３ｍ１１９ｓＵＢＴ鋳型、
１μの１μＭ　Ｍ−１３塩基配列プライマー（１７−ｍ
ｅｒ　）および２．５〆の緩衝液（０，３Ｍトリス（ｐ
Ｈ８）　、４０１１１Ｍ　ＭＱ　Ｃ１１２，１２ｍＭＥ
ＤＴＡ、　１０　ＩＩＩＭ　ＤＴＴ、　０．５１１１ｇ
／πｇ　ＢＳＡ）を混合することにより、このプライマ
ーをＭ−１３ＩＩｌｐ９ＳＵＢＴにハイブリダイズした
。この混合物を６８℃で１０分間加熱し、室温で１０分
間冷却した。このアニリング混合物に３．６メの０゜２
５　ｍＭ　ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよヒｄＴＴ
Ｐ、１．２５／’の１０ｍＭＡＴＰ、１〆のリガーゼ（
４単位）および１／のＫＩｅｎＯＷ（５単位）を添加し
た。このプライマーの延長およびラ９４− ィゲーション反応（全量２５〆）は１４℃で２時間行な
った。６８℃で２０分間加熱して　Ｋ　ｌｅｎ。

Ｗおよびリガーゼを不活性化した。この加熱した反応混
合物をＢａｍＨＩおよびＥＣ０ＲＩで消化し、その潤化
物の一部を６％ポリアクリルアミドゲルに適用し、放射
活性フラグメン］・をオートラジオグラフィーにより検
出した。その結果　「３２ｐ」変異誘発プライマーが、
今や変異したサブチリシン遺伝子を含んでいるＥｃＯＲ
：［−ＢａｍＨＩフラグメン１−に挿入されたことが解
った。

消化した反応混合物の残りを、１ｍＭＥＤＴΔを含有す
る１０ｍＭトリス（ｐｌ−１８）で２００パに希釈し、
フェノール／クロロホルム混合物（１：１　（ｖ：ｖ　
））で１回、次いでクロロホルムで１回抽出し、水相を
回収した。５Ｍ酢酸アンモニウム（１）Ｉ−１８＞１５
．”を２倍容量のエタノールとともに加え、水相からＤ
ＮＡを沈澱させた。

マイクロフユージ中、５分間遠心分離してＤＮＡをペレ
ット化し、上清を捨てた。７０％エタノール３００／’
を加えてＤＮＡペレットを洗浄し、洗液を捨てペレット
を凍結乾燥した。

実施例４のｐＢ３４２を３ａｍｌ−ＩＩおよびＥｃｏＲ
Ｉで消化し、アクリルアミドゲル上で精製してベクター
を回収した。この消化したベクター０．５μｑ１５０μ
Ｍ　ＡＴＰおよび６単位のりガーゼをライゲーション緩
衝液２０／Ａに溶解した。ライゲーション（結合）を１
４℃で終夜性なった。このＤＮＡをＥ　、　ｃｏｌｉ２
９４　ｒｅｃ＋　ニ導入し、形質転換体を１２．５μｇ
／π２のクロラムフェニコール含有ＬＢ培地４鱈中で増
殖させた。この培養物からプラスミドＤＮＡを調製し、
ＫｐｎＩ、ＥＣＯＲ■およびＢａｍＨＩで消化した。こ
の制限フラグメン（・を分析した結果、分子の３０〜５
０％が変異誘発プライマーによってプログラムされた所
望のＫｐｎＩ部位を含んでいることが解った。Ｋｒ＋ｎ
Ｉ部位を含んでいないプラスミドは、変異誘発部位の細
菌による修復前にＭ−１３複製により生成したと思われ
、このようにして、ある形質転換体において、ＫｐｎＩ
＋およびＫｐｎＩ−プラスミドのへテロジ−ナス体が生
成したと考えられる。Ｋｒ１ｎＩ＋プラミドの純粋な培
養を得るために、このＤＮＡをもう１度Ｅ、ｃｏｌｉに
導入し、新しいＫｌ）ｒｌＩ部位を含有するプラスミド
をクローンした。このような形質転換体１６個からＤＮ
Ａを調製し、その内６個が予想したＫｐｎＩ部位を含ん
でいることが解った。

これらの６個の形質転換体の内の１つ（ｐΔ２２２と命
名）からプレパラティブな量のＤＮＡを作り、制限分析
により予想されたＫｐｎＩおよびＰＳｔ１部位が存在す
ること、およびその位置を確認した。４０１１のｐΔ２
２２を３００μのＫｌ）ｒｌＩ緩衝液プラス３０〆のＫ
ｐｎＩ（３００単位）中３７℃で１．５時間消化した。

ＤＮＡをエタノール沈澱させ、７０％エタノールで洗浄
し凍結乾燥した。ＤＮＡベレットを２００．’のｌ−１
ｉｎｄｌｌ緩衝液にとり、２０．’（５００単位）のＰ
ＳｔＩで３７℃で１．５時間消化した。水相をフェノー
ル／ＣＨＣｌ１３で抽出し、ＤＮＡをエタノール沈澱さ
せた。

このＤＮＡを水に溶解し、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により精製した。ベクターバンド９７− （帯）を電気溶出（１２０ν、２時間、０℃、０゜１倍
のＴ　Ｂ　Ｅ　（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前記）中）した
後、ＤＮＡをフェノール／　ＣＨＣｅ　３抽出により精
製し、エタノール沈澱し、エタノールで洗浄した。

ｐΔ２２２はＫｎｐＩまたはＰｓｔＩによりそれぞれ別
々に完全に消化することができたが（〉９８％）、徹底
的な二重消化は不完全であった（〈〈５０％）。これら
の部位が非常に近くにあるため（１０ｂｐ）　、Ｋｎｐ
Ｉによる消化によッテそのｐｓｔ１部位の近くのＤＮＡ
が「ブリージング」、すなわち鎖の分離、すなわちほつ
れを起したために、このような結果になったものと考え
られる。ｐｓｔ王は２本鎖ＤＮＡだけを開裂させるので
鎖の分離によってその後のｐｓｔ：［の消化がｌ害され
るのであろう。

支ｉ九上Ｌ　オリゴヌクレオチドカセットのザブチリシ
ン遺伝子への結合 ５′が燐酸化されていない４つの相補性オリゴヌクレオ
チドプール（Ａ−Ｄ、表１参照）１０ｐＭを、２０〆の
リガーゼ緩衝液中で５分間６８９８− ℃で加熱し、次いで室温で１５分間冷却することにより
アニーリングした。各アニーリングしたオリゴヌクレオ
チドプール１μＭ１〜０．２μ０のＫＩ］ｎＩおＪζび
ｐｓｔＩで消化した実施例１３で得たｐ△２２２．０．
５　ｍＭ　ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液および６単位のＴａ
ＤＮＡリガーゼ、の全量２０〆を１４℃で終夜反応さゼ
、プールしたカレン１へをベクターに結合させた。大過
剰のカセット（ｐΔ２２２末端を越えること〜３００Ｘ
）をこの結合に使用して分子内Ｋ　ｐｎＩ　−Ｋ　ｐｎ
：［結合を防止した。１　ｍＭ　Ｅ、ＤＴＡを含有して
いる１０ｍＭ１〜リス（ｐｆ−１８＞２５．ｄを加えて
反応物を希釈した。この混合物を６８℃で５分間加熱し
、室温で１５分間冷却することにより■びアニーリング
してカレン１〜のフンカテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ
）形成を防止した。各プールからのこの結合混合物を別
々にＥ　、　ｃｏｌｉ２９４　ｒｅｃ十細胞に形質転換
した。

各形質転換混合物の一部をプレートし、それぞれの形質
転換体の数を測定した。多数の形質転換体が多変異誘発
性の高い可能性を示した。形質転換体の残り（〜２００
−４００形質転換体）を１−［３培地プラス１２．５μ
０のクロラムフェニコール／７７βの４戴中で培養した
。各形質転換プール（Ａ−Ｄ）からＤＮＡを分離した。

このＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、その〜０．１１１ｇを
使って再びＦ。

ｃｏｌｉ　ｒｅｃ＋を形質転換し、その混合物をプレー
トして各プールから個々のコロニーを分離した。遺伝子
へのカセットの結合および形質転換時の細菌性修復によ
りＫｐｎＩおよびｐｓｔ：ｒ部位が破壊された。このよ
うにして形質転換体ＤＮＡをＫｒ１ｎＩで消化したとき
ρ△２２２だけが切断された。この切断プラスミドはＥ
、ｃｏｌｉを形質転換しないであろう。個々の形質転換
体を培養して増殖させ、直接的なプラスミドの塩基配列
決定のためにプール当り２４〜２６の形質転換体からＤ
ＮＡを調製した。５’　−ＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡ
ＴＧＧＣ−３′の配列を持った合成オリゴヌクレオチド
プライマーを使ってジデオキシ配列決定反応をプライム
した。得られたミュータントを以下の表Ｃに示す。

記載したスクリーニングの後２個のコドン＋２２２ミコ
ータン１へ（すなわちｇｌｎおよびｉｌｅ　）は見出さ
れなかった。これらを得る目的で、第１２図の上のオリ
ゴヌクレオチド鎖に相当する各ミュータン１へのための
１本鎖２５ｍａｒ（２５量体）オリゴヌクレオチドを構
成した。それぞれを燐酸化し、そのぞれぞれの非燐酸化
オリゴヌクレオチドプール（すなわちｇｌｎに対しては
プールＡ１１ｌｅに対してはプールＤ）の下の鎖にアニ
ーリングした。これをＫｐｎＩおよびｐｓｔ（消化ｐΔ
２２２に結合させ、もとのオリゴヌクレオチドプールに
ついて記載したようにプロレッシングした。このように
して得られたシングルミュータントの出現率はｑｌｌｌ
に対して２／８　、ｉｌｅに対してはＯ／７Ｆあった。

この明らかなかたよりを避けるため、上の鎖を燐酸化し
、その非燐酸化相補性プールにアニーリングした。ヘテ
ロ燐酸化カセットを切断ｐΔ２２２に結合させ、前と同
様にしてプロヒシングした。ｇｌｎおよびｉｌｅミュー
タントの出現牢はそれぞれ７／７および７／７となった
。

１０１− 表Ｃのデータはこのプールから得られたミコータントの
出現におけるかたよりを表わしている。

これは、プールにおいてオリゴヌクレオチドを等価に表
わしていないことから起ったものと考えられる。これは
特定のポリマーがプールの変異誘発コドンを越えて非等
価にカップリングすることにより惹起されたものかもし
れない。このようなかたよりの問題は、合成中にトリマ
ーレベルの適当な調節により（同じ反応を行なう）なお
すことができた。いずれの場合も、第１次スクリーニン
グで単離されなかったミュータントは所望のミューチー
ジョンを表わしている１本鎖オリゴヌクレオチドを合成
し、両末端を燐酸化し、非燐酸化相補鎖のプールにアニ
ーリングし、カセット部位に結合させることにより得る
ことができた。完全に非燐酸化したカセットについて観
察されたかたよったヘテロデュプレックス修復は、２２
２位は下の鎖の５′末端よりも上の鎖５′末端により近
いという事実から起ったものと思われる（第１２図参照
）。非燐酸化５′末端にはギャップが存在し、１０２− ２木鎖ＤＮΔにはミスマツヂバブル（ｂｕｂｂｌｅ）が
２２２位にあるので、上の鎖のギャップの切除修復はよ
り容易に複製可能な環状にハイブリダイズしたデコプレ
ックスを維持することになる。上の鎖は選択的５′燐酸
化により完全に保持し１ｑるという事実はこの仮説に合
致している。この場合、下の鎖だりが切除修復を促進し
得る５′ギヤツプを含んでいる。この方法は、変異誘発
Ａリゴヌクレオヂドカセットを使った場合、合成オリゴ
ヌクレオチド鎖のかたよった挿入を方向づけるのに有用
である。

：！１ｍニ１５　１６６位にお（ブるサブチリシン遺伝
子の部位特異付変異誘発 変異誘発プライマーが異なっていること（第１３図の３
７ｍａｒを使用した）、２つの制限酵素がＰｓｔＩおよ
びＫｐｎＩではなくてＳａＣ■およヒｘｍａＩｔである
こと、および得られた組立て物が異なっていることを除
りば実施例１３〜１４に示した操作を忠実に繰返したく
第１３図参照）。

１６６位のミュータン１−サブチリシンを分泌する桿菌
株を後記実施例１６に記載した方法で得た。

野生型残基のａｌａ　、　ａｓｐ　、　ｇｌｎ　、　ｐ
ｈｅ　、　ｈｉｓ　。

ｌｙｓ　５ａｓｎ　、　ａｒｇ　、およびｖａｌが置換
されているミュータントサブチリシンを回収した。

１１糺１止　ミュータントサブチリシン酵素の調製 実施例１１の方法で得たＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ株ｒ３
Ｇ２０３６を実施例１４．．１５ま゛たは２０のプラス
ミドおよび対照としてｐｓ４−５により形質転換した。

形質転換体をプレートまたは振盪フラスコ中１６〜４８
時間３７℃でＬＢ培地プラス１２．５μｑ／戴のクロラ
ムフェニコール中で培養した。酵素的に活性なミコータ
ントサブチリシンを、細胞ブロスをｐＨ６，２のＯ，０
１Ｍ燐酸ナトリウムに対して透析することにより回収し
た。透析したブロスをＩＮ　ＨＣ／でｐＨ６，２に調節
し、０Ｍセルロース（ＣＭ　−５２ワツ１〜マン）の２
．５Ｘ２ｃｍのカラムに充填した。０．０１Ｍ燐酸ナト
リウム（ＤＨ６，２）で洗浄した後、Ｊブチリシン（＋
２２２におけるミュータントを除く）をＮａ０℃につい
て０．０８Ｎとして同じ緩衝液で溶出した。＋２２２の
ミュータントザブヂリシンは０゜１Ｍ燐酸ナトリウム（
ｐｆ−１７，０＞で溶出した。

この精製したミコータン１〜および野生型酵素を使って
酸化安定性、Ｋｍ　、　Ｋｃａｔ　、　Ｋｃａｔ　／Ｋ
ｍ比、至適ｐ１−１おＪ：び基質特異性における変化を
調べた。

九仁　（ オリゴヌクレオチドプール編成おＪ：び得られたミュー
タントの頻度 一ル　雫〕　コ゛’　−２２２１２ △　ａｓＤ　ＧＡＴ　２／２５ ｍｅｊ　ＡＴＧ　３／２５ ＣＶＳ　ＴＧＴ　１３／２５ ａｒ（Ｉ　ＡＣＡ　２／２５ ｇ１ｎ　ＧＡＡ　Ｏ／２５０ 予想外　５／２５ ミユータント３ Ｂ　１ｅｕＣＴＴ　１／２５ ｐｒＯＣＣＴ　３／２５ １０５− １）ｔＴｅ　ＴＴＣ６／２５ ｔＶｒ　ＴＡＣ５／２５ ｈｉｓ　ＣＡＣ１／２５ 予想外　９／２５ ミコータント ｏｌｕ　ＧＡＡ　３／１７ ａｌａ　ＧＣＴ　３／１７ ｔｈｒ　ＡＣＡ　１／１７ １ｙｓ　ＡＡＡ　１／１７ ａｓｎ　ＡΔＣ１／１７ 予想外　８／１７ ミユータント （ＩＩＶ　ＧＧＣ１／２３ ｔｒｉ）　ＴＧＧ　８／２３ ｉｌｅ　ＡＴＣＯ／２３ Ｓｅｒ　ＡＧＣ１／２３ ｖａｌ　ＧＴＴ　４／２３ 予想外　９／２３ １０６− ミュータント １コドンは、クローンしたサブチリシンｔｎ　Ｗ配列の
多使用性に基づいて選んだ（Ｗｅｌｌｓら１９８３、前
記） ２傾度は、直接プラスミド塩基配列決定によりシングル
トラック分析から決定した。

３予想外ミユータン１〜は、一般に２２２の隣りのコド
ンまたは結合点、において変化しているダブルミュータ
ントからなっていた。これらは、副すゴヌクレオヂドプ
ールにおける不純物／またはギャップ末端の誤った修復
の結果得られたちのど考えられる。

丸Ｉ」■Ｌ　改良された酸化安定性を示すミュータント
ナブチリシン 野生型のメチオニンの代りに、２２２において置換した
システィンおよびアラニンを有するサブチリシン（実施
例１６）を各種の濃度の次亜塩素酸す１〜リウｌｘ　（
Ｃ１ｏｒｏｘ　Ｂ　１ｅａｃｈ　）とともニインキコベ
ートすることにより酸化に対する抵抗性を分析した。

全量４００．’のＯ，ＩＭ　ＮａＰＯａ緩衝液（ｐＨ７
、第１４図に示した濃度の上記の漂白剤含有）４００．
ｄに、終濃度が０　、０１６ｍ（］／ｚ６（酵素）とな
るように充分な酵素を加えノＣＱこの溶液を２５℃で１
０分間インキュベートし、以下の如くし酵素活性を分析
した：１２０．−’のａｌａ＋２２２または野生型、あ
るいは１００．−’のｃｙｓ＋２２２インキコベーショ
ン混合物を８９０μの０、　１Ｍ１−リス緩衝液（１）
Ｈ８，６）および１０〆のＳＡΔＰＦｐＮＣ実施例１８
）基質溶液（２０ｍｇ／７ＩＩ２、ＤＭＳＯ中）と混合
した。ｐ−ニトロアニリンの遊離に基づ＜４１０ｎｍに
おける吸光度の増加率をモニターした（［）ｅｌ　Ｍａ
ｒ、　Ｅ、　Ｇ。

ら１９７９　”Ａｎａｌ　、３ｉｏｃｈｅｍ、”　ｇｇ
、　３１６−３２０）。この結果を第１４図に示す。メ
チオニンの代りに不安定なシスティン残基が置換したミ
ュータントあるいは野生型酵素の何れと比較しても、よ
り安定な酵素をアラニン置換体が生産した。驚くべきこ
とに、このアラニン置換は、アッセイ基質に対する酵素
活性を実質的に■害することなく、かつ、この酵素にか
なりの酸化安定性を付与した。セリン＋２２２ミユータ
ンｉ〜も改良された酸化安定性を示した。

支ｉに圧　改良された動力学および基質特異性を示すミ
コータントサブヂリジン グリシン＋１６６の各種のミコータントを、改良された
Ｋｃａｔ　、　Ｋｍおよび１（ｃａｔ／Ｋｍ比について
スクリーニングした。速度的パラメータは反応の進行カ
ーブを分析することにより得た。反応速度は基質濃度の
関数として計算した。データはＭ　ａｒｑｕａｒｄｔの
非線形回帰アルゴリズム（Ｍ　ａｒｑｕａｒｄｊ、Ｄ、
Ｗ、１９６３　”Ｊ、Ｓｏｃ、ｒｎｄ、Δｐｐｌ　。

Ｍａｔｈ、１１，４３１−４１）を使って、Ｍｉｃｈａ
ｅｌ　１５−Ｍ　ｃｎｔｏｎの方程式に合わせて分析し
た。ずべての反応は、初期濃度０．００２５Ｍ〜０．０
００２６Ｍ（問題の酵素のＫ　ｍ比に依存する。濃度は
各測定毎にＫｍ比を越えるように調節した。）のベンゾ
イル−し−バリル（Ｖａｌｙｌ）−グリシル（Ｇ　１ｙ
ｃｙｌ　）　−１−−フルギニル（Ａ　ｒｏｉｎｙｌ　
）　−１１−ニトロアニリド（ＢＶＧＲｐＮ　；　Ｖｅ
ｇａ　Ｂ　１ｏｃｈ１０９− ｅｍｉｃａｌｓ　）を含有しているか、または初期濃度
０゜００１０Ｍ〜Ｏ，０００２８Ｍ　（ＢＶＧＲｐＮに
ついての場合と同様に変化する）のサクシニル−Ｌ−ア
ラニル（Ａｌａｎｙｌ　＞−Ｌ−７ラニル（Ａｈａｎｙ
＋＞−ｉ−プロリル（Ｐｒｏｌｙｌ　）　−Ｌ−フェニ
ルアラニル（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ　）　−ｐ−ニ
トロアニリド（ｓＡ　Ａ　Ｐ　Ｆ　Ｉ）Ｎ　：　Ｖｅｏ
ａ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）を含有させ０．１
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，６）中、２５℃で行なった。

これらの実験の結果を以下に示す。

１１０− 人Ｊ［ 基質　酵素　Ｋｃａｔ　Ｋｍ　１（ｃａｔ／Ｓ−１ｍ ＳＡ　Ａ　Ｐ−（ＩＩＶ−１６６３７１，４Ｘ　１０４
　３Ｘ　１０５ＦｐＮ（野生型） ａｌａ　＋１６６　１９　２，７ｘｌＯ−５７×１０５
ａＳｐ　＋　１６６　３　５，８ｘ　１０′４５Ｘ　１
０３＋１１１１　＋１６６１１　３．４ｘ　１０−４　
３ｘ　１０４ｐｈｅ　＋　１６６　３　１．４ｘ　１０
″５２ｘ　１０５ｈｙｓ　−ト　１６６　１５　１．Ｉ
Ｘ　１０′４　１Ｘ　１０５１ｙｓ　＋　１６６　１５
　３．４ｘ　１０シ　４Ｘ　１０５ａＳｎ　＋１６６２
６　１，４ｘ　１Ｏ−４２Ｘ　１０”ａｒＯ＋１６６　
１９　６．２Ｘ１０−５　３Ｘ１０５ｖａｔ　＋１６６
　１　１．４Ｘ１０−’　ｌＸ１０５ＢＶＧ−野生型　
２　１，１ｘ　１０−３　２ｘ　１０３　ｐＮ ａｓｏ　−＋１６６　２　４．１ｘ１０−５　５ｘ１０
４！１＋１１１　＋１６６　２　２，７Ｘ１０−５７Ｘ
１０４ａＳｎ　＋１６６　１　１２Ｘ１０’　ｇｘｉｏ
３各ミュータントのＫｃａｔ／Ｋｍ比は野生型酵素のも
のと異なっていた。触媒効率の測定の結果、これらの比
率は、本発明方法に従って、与えられた基質に対して追
かに高い活性を有する酵素を容易に設計することができ
、かつスクリーニングによって選択することができると
いうことを示している。例えばＡ１６６は、５ＡＡＰＦ
ｐＮにおける野生型の活性の２倍以上の活性を示す。

このデータはまた、野生型酵素のミューチージョンによ
る基質特異性の変化をも示している。例えばＤ１６６お
よびＥ１６６ミユータントの１（ｃａｔ／１（ｍ比は、
ＢＶＧＩ）Ｎ基質に対しては野生型より高いが、５ＡＡ
ＰＦｐＮについては質的に逆の結果が得られている。従
ってＤ１６６およびＥ１６６ミユータントは、５ＡＡＰ
ＦｐＮよりもＢＶＧＲｐＮに対してより特異性がある。

支ｉ九上１　改良されたｐＨ活性プロフィルを示すミュ
ータントサブチリシン 実施例１６で得られたＣｙＳ＋２２２ミユータントのｐ
Ｈプロフィルを野生型酵素のそれと比較した。ＤＭＳＯ
中の１０μの６０ｍ（Ｊ／ｙｘＲｓＡＡ　Ｐ　ＦｐＮ、
１０％のＣｙｓ＋２２２（０゜１８ｍｏ／飯）か野生型
（０，５１１１（＋／戯）および９８０〆の緩衝液（ｐ
Ｈ６，６，７，０および７．６の場合の測定ニツイテは
０．１Ｍ　ＮａＰＯａ緩衝液；ｐＨ８，２，８，６およ
び９．２の場合はＯ，１Ｍトリス緩衝液：およびｐｆ−
１９，６および１０．０の場合はＯ，１Ｍグリシン緩衝
液）を混合した後、１分当りの４１０ｎｍにおける吸光
度の初期変化率を各ｐｌ−１について測定し、そのデー
タを第１５図に示した。ＣＶＳ＋２２２ミコータントは
野生型酵素よりも狭い至適ｐ＋−＋を示した。

ＬＬＬＩΩ−１６９位におけるサブチリシン遺伝子の部
位特異性変異誘発 変異誘発プライマーが異なっていること（第１６図に示
したプライマーを使用）、２つの制限酵素がＰｓｔＩお
よびＫｐｎＩの代りにＫ１１ｎＩとＥＣ０ＲＶであるこ
と、および得られた組立物が異なっていること（第１６
図に示した）を除けば実施例１３〜１４と同じ操作を行
なった。

１６９位におけるミュータントサブチリシンを１１３− 分泌する桿菌株は実施例１６に記載したようにして得た
。野生型の残基の代りにａｌａおよびｓｅｒの置換を示
すミュータントサブチリシンを回収し、速度論的特徴の
変化を調べるために分析した。この分析には１）ｌ（８
，６で５ＡＡＰＦ　ｐＮを実施例１８に示したものと同
様にして使用した。結果を以下に示す。

１口 酵素　Ｋｃａｔ　Ｋｍ　（Ｍ）　Ｋｃａｔ　／ＫｍＳ司 ａｌａ　＋１６９　５８　７．５Ｘ　１０’　８Ｘ　１
０５化 実施例１５および１６で得た１６６位のミュータントを
、天然の蛋白質基質に対する特異活性の変化について分
析した。これらのミコータンドブロチアーゼは、変化し
た比活性とともに変化した特異性をも示すことがあるの
で、１つのタイプの特異性を持ったプロテアーゼの方向
に分析がかだ１１４− よらないために、基質は十分な最の種々の開裂部位、す
なわち酸性、塩基性、中性おにび疎水性の部位を含んで
いなＩづればならない。基質はある配列部位をマスキン
グすることになるデリビタイズド残基を含んでいてはな
らない。ヘモグロビン、アゾ］ローゲン（ａｚｏｃｏｌ
ｌｏｇｅｎ　）　、アゾカゼイン、ジメチルカゼインな
どの広く用いられている基質は、この理由で使用できな
い。牛カゼイン、αおよびα２カゼインが好適な基質て
して選ばれた。

１００ｍＭ１−リス緩衝液（ｐｌ−１８，０）　、１０
ｍＭ　ＥＤＴＡ中で１％カゼイン溶液（Ｗ／Ｖ）を調製
した。分析のプロトコールは次の通りであるニ ア９０〆の５０１１ＩＭトリス（ｐｌ−１８，２）ｉｏ
ｏ、−ｉ＋の１％カゼイン（ＳｉＯｍａ）溶液１０μの
試験酵素（１０−２００／ｇ）。

このアッセイ混合物を混合し、室温で２０分間インキコ
ベー１〜した。１００／の１００％トリクロロ酢酸を添
加し、次いで室温で１５分間インキコベートすることに
より反応を終結させた。沈澱した蛋白質を遠心分離によ
りペレット化し、上清の２８０　ｎｍにＪ３ける光学密
度を分光光度計を用いて測定した。光学密度は、反応混
合物中の沈澱しなかった、すなわち加水分解されたカゼ
インの間を表わしている。それぞれのミュータンドブロ
チアーゼによって加水分解されたカゼインの量を、種々
の量の野生型プロテアーゼを含んでいる一連の標準物と
比較し、その活性を野生型の活性に対するパーセンテー
ジで表わした。酵素活性を、分析に使用した酵素溶液の
２８０　ｎｍにおける吸光度でカゼイン加水分解活性を
割ることにより比活性に変換した。

Ａ　ｓｎ＋１６６を除き、分析した全てのミュータント
は野生型のものよりカゼインに対する比活性が低かった
。Ａ　Ｓｎ＋１６６は野生型よりカゼインに対する活性
が２６％高かった。最も低い比活性を示したミュータン
トはｉｌｅ＋Ｒ１＋６であり、野生型の活性の０．１８
４であった。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａは機能的Ｂ、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓサブチリシン遺伝子の配列を示す模式図、第１図
Ｂはその暗号鎖のヌクレオチド配列を、蛋白質のアミノ
酸配列と関連させて示している模式図、第２図はプール
１　（パネルＡ）およびプール２　（パネルＢ）でそれ
ぞれプローブした純化陽性クローンのし７１Ｊ力・ニト
ロセルロース・フィルターの結果を示すグラフ、第３図
はサブチリシン発現プラスミド（ｐｓ４）の制限分析を
示す模式図、第４図はＩＩＢ　Ｓ　４２およびｐＳ４で
形質転換した培養物からの上清について行なった５ＤＳ
−ＰＡＧＥの結果を示すグラフ、第５図はシャトルベク
ターｐＢＳ４２の構成を示す模式図、第６図は３．５ｔ
ｂＮＩｉｓサブチリシン遺伝子を含む配列の制限地図を
示す模式図、第７図は機能的なり、　５ｕｂｔｉｌｉｓ
サブチリシン遺伝子の配列を示す模式図、第８図はＢ。 ５ｕｂｔｉｌｉｓサブチリシン遺伝子の欠失ミュータン
トを得るための組立法を示す模式図、第９図はＢ。 ５ｕｂｔＮｔｓ中性プロテアーゼ遺伝子の制限地図を示
す模式図、第１０図はＢ、　５ｕｂｔｔｌｉｓ中性プロ
テアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図、第一
１１７− １１図はＢ、　５ｕｂｔｉｌｉＳ中性プロテアーゼ遺伝
子を含んでいるベクターの組立を示す模式図、第１２゜
１３および１６図は本発明方法による変異誘発技術の具
体例を示す模式図、第１４図はサブチリシンミコータン
トの強化された酸化安定性を示すグラフ、第１５図は野
生型酵素と比較した場合のサブチリシンミュータントの
ｐＨ活性プロフィルの変化を示すグラフである。 特　許　出　願　人　ジエネンテク。 インコーホレイテッド 代　理　人　弁理士　青白　葆　ばか１名１１８− Ｎ　− 球　走 図面の浄書（内容に変更なし） 第４図 １２３４ Σ＜　（ＣＪ　＜ＣＤ　）−）− ｒ−＋　ｒＮ　Ｃｏ　ζｎ　０ ＞　ＬＪ　−ｗ　句’ｅｃ　＞ｔＪ −ロ　〜←　−Ｌ）　１＋−ロ ロロ　〉ロ　噌Φ　ロΦ ２ば　駄；　シ冨　Ｅ８ −く　−←　Ｉ：ｙ１Φ　ｅＬｔＪ のＩ−Ｆ’−ＣＪ　−ロ　−く ｋｕ　ｏ　■　ａＩ　Ｑ　Ｉ−Ｑ ■Φ　μＱＪ：　ト＞　’ｆ− ψ４　ＣＬリ　ｅＬ　ｌ−Ｊｕ　ｌ− ＣＣＪ　Ｌ　ｌ−＋　（Ｃ：　ｌ− ψく　■Ｑ　弓Ｉ−ψく 弓く　φヒ　〉ロ　勺く ■＜　４１　ＣＪ　ＣＬ　（Ｊ　１１５　（Ｊ（Φ　：
Ｉ−ψ＜−０ 弓Ｌ）　ｅＬｌ−市Φ　旬口 ψく　φｔＪ　Ｉ−ヒ　（Ｑ 菖く　；）−ｏＪＱ　＞く −く　αヒ　ψトート Ｏａｌ＋−０Ｌ、＜　０４１Ｌｌ　０ＣＩ−＝舌ロ　粗
ぶ？　詔台ロ　＝右耳 Ｃ：Ｑ＞ヒ　レヒ　αＱ ψく　−ロ　ｄｌ　（Ｊ　ｌ／ｌ　（ 旬く　■ロ　φヒ　旬口 （く　α０　コＣ！ｌ　Ｏ）− φＵ　ψ＜−＜　−○ Ｌ　＋＞ｔＪ　ｅ　Ｌ）　Ｃ（ｊ 為く　−Φ　ψ＜−＜ 一ト　σｃＤ　〜く　σＯ ａｌ＋−（Ｌｌ　〕＜　（ｌｊ ＝ト　φく　ωト　ψく αト　句０　−Ｈ勺く 駄＜　：　’；ｒ　２３　弧画 −ヒ　■ＣでΦ　−ト 計１　駄画　シ曹　ス＝ の■　−Ｉ−■（ｊ、−（ μＵ　ω＋　Ｑ　（Ｌ　（ 為（−１−１−’、Ｊ　Ｊ：　ＣＪ −ヒ　−く　ｃＬＯ−く ＋−口　ＡＪ　Ｃり　（（り　Ｑ　ｌ−弓Ｉ−Φトー＋
ｌ：　Ｌ　ＬＪ ＞　ｃＤ　Ｅ　（ひり　αＱ ψ（ＣＣ！５　Ｃ＋−（Ｌｌ ≧＜−＜　φく　ψく −（Ｃ＋７１　ｔＪ　’Ｏ”Ｃ’ＩＩ　＜（）　＞　←
Ｏａｈ　Ｌｌ　Ｏフ＋ｌ：　ＯＬ　ＬＪＯ＋−■　寸ψ
く　ψ−く　〜ａｌｌｌＪ１＋１ｃ７１０　ｎつロ　Ｍ
■ロ　寸ψトフＬｌ　＞　（Ｌ　ｌ−コ０ ６Ｊ＋−＋　ｃａ　＞　＜　ａＪｔ− Ｃｕ　Ｌ　（Φト　−リ ｖ＜　Ｊ：ＯＰト　ωＣ 勺＜　ＪＪ　（＋　＜　ψく 臥＝　巳８　：汗　ビ８ ＡＪ　トＪＪ　ｌ−＋１−　旬Ｑ φＱ　旬く　ＣＵ　コト 一＜Ｐ−リ　ψく　Φト ：Ｑ　勺Φ　勺＜−〇 α（Ｊ　Ｃｕ　Ｌ　（Ｏｌ− 勺Φ　つ（ＡＪ　（ｃＬＩＪ −−トＣｌ−フ（ＣＣ５ 弓←　φ＜　−（−（ 〉Ｃ勺く　■■　■Ｕ ２と　弧画　５＝　払藁 勺く　Ｃ（臂ＬＪ　＋＋ −ＣＪ　−（Ｊ：　（Ｊ　弓← ０■■　０し←　０１＋ＬＩ　ＯＬ■ ■（Φ　円＝リ　ト勺＋　ｆｆ！Ｌｊ 〜つＬ）　Ｍａａ（Ｍ＞Ｃ寸−く ｅΦ　＞ＣＪ　＞　Ｌｌ　Φト ーく　−ロ　−Φ　−ト ■Ｑ　＠Φ　■Ｃ・−く 巳３　風足　、ご胃　λ画 Ｉ／ＩＩ−ａＪ　ｌ−Ｊ：　Ｌｌ　つ口Ｌ　（１／ｌ　
ＬＩ　Ｌ　（］く ＧＪ　Ｑ−＋　（ｊ：　Ｌｌ　−（ ＋ａ　ｉ−Ｊ：（Ｊ　４Ｊ＜　ｅｌｌ　Ｌ）Ｌ　ｌ−＋
　ｌ−ＪＪＣ為ト ：ば　；Ｆ　＆（”；沼 ）３　馳８　：３　βば ａｕＩ−ｋＩ−ψトｅＬＯ ｊ　ｈ　ＯＪ　ｔｗ　−ｐ−（φく Ｌ　（Ｆ−＋　ｌｌ１ｃ５　αΦ Ｊ：Ｌｊ　句ヒ　−０（ロ ー＜〉Φ　−ロ　−Ｈ 風詮　、！ｌ′μ　）３　針謔 −＜−（４＝　”Ｃ句口 （口　ｖく　−Φ　コく Ｊ：Ｌ）　＞　＜　弓トー＜ ｙ　（Ｆ−（＞　Ｌ）　■Ｃ Ｏ＆−（０ＬＩ−０ｃＬｌ−０ｌ−（ Ｑ）Ｊ：Ｌｌ　へＵ（５ｔｏψ＜Ｑ：Ｑ〜−（Ｆ′ｌ１
７１（Ｆ’ｌ〜ロ　寸−くコ　ド゛　ン　：　１６２ 野ＩＴミＪｉ１ＭＪＩＪ　：　５ｅｒ ｊ　：　５’−ＴＣＡ ：　３’−ＡＧＴ ２　：　５’−ＴＣＡ ３１−八ＧＴ ３　：　５’−ＴＡＣ ３’　−ＡＧＴ ４　：　５’−ＴＡＣ ３′−八ＧＴ ６１６ｇのなめの 塩４鰻哀か肩５ブラインー：　５’−ＡＡＧ１６９　１
７３ ｓｅｒ　ｔｈｒ　ｖａｌ　ｇｌｙ　ｔｙｒ　ｐｒｏ　ｇ
ｌｙ　ｌｙｓ　ｔｙｒ　ｐｒｏ　ｓｅｒ八Ｇへ　ＡＣＡ
　ＧＴＧ　ＧＧＣＴＡＣＣＣＴ　’ＧＧＴ　へへＡＴへ
ＣＣＣＴ　ＴＣＴ−３’ＴＣＧ　ＴＧＴ　ＣＡＣＣＣＧ
　ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＣＣＡ　ＴＴＴ　ＡＴＧ　ＧＧＡ　
ＡＧＡ−５’＊　＊　女 ＡＧＣ八ＣＡ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＴＡＣＣＣＴ−−−−
−ＧＡ　ＴＡＴ　ＣＣＴ　ＴＣＴ−３’ＴＣＧ　ＴＧＴ
　ＣＡＣＣＣＣＡＴＧ　ＧＧＡ−−−−−ＣＴ　ＡＴＡ
　ＧＧＡ　ＡＧＡ−５’Ｋｐｎ　Ｉ　ＥｃｏＲＶ ★　★ ＡＧＣＡＣＡ　ＧＴＣＧＧＧ　ＴＡＣｐＡＴ　ＣＣＴ　
ＴＣＴ−３’ＴＣＧ　ＴＧＴ　ＣＡＣＣＣｐ　Ｔ八　Ｇ
ＧＡ　八ＧＡ−５’★　★ ＡＧＣＡＣＡ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＴＡＣｍゴｆｆＡＴ　
ＣＣＴ　ＴＧＴ−５’ＴＣＧ　ＴＧＴ　ＣＡＣＣＣＣＡ
ＴＧ　ＧＧＡ　ＮＮＦＪ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＧＧＡ　Ａ
ＧＡ−３’ＣＡＣＡＧＴ　ＧＧＧ　ＧＴＡ　ＣＣＣＴＧ
Ａ　ＴＡＴ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＧＴＣＡ−３’手続補正
書動式） １事件の表示 昭和５９年特許願第　１２９９２８　号２発明の名称 真核生物のカルボニル氷解酵素 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国カリフォルニア９４．０８０、サ
ウス・サン・７ランシスコ、ポイント・サン・ブルーノ
φブールバード４６０番 名称　ンエネンテク、インコーポレイテッド４、代理人 住所　大阪府大阪市東区本町２−１０　本町ビル内６補
正の対象二図面 ７、補正の内容 濃墨を用いて適正な用紙に鮮明に描いた第２図および第
４図を提出する。 〉スニ ２−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）原核生物のカルボニル氷解酵素の調製法であって
   、該氷解酵素を暗号化しているＤＮＡ配列を含んでいる
   発現ベクターで形質転換した絹換え宿主細胞を培養し、
   細胞培養物から該氷解酵素を回収することを特徴とする
   方法。 （２）該氷解酵素がプロテアーゼである第１項に記載の
   方法。 （３）該プロテアーゼがサブチリシンまたはメタロプロ
   テアーゼである第２項に記載の方法。 （４）該プロテアーゼがサブチリシンである第２項に記
   載の方法。 （５）ＤＮＡ配列がプロサブチリシンの形でザブチリシ
   ンを暗号化している第４項に記載の方法。 （６）ＤＮＡ配列がプレプロ１ノブチリシンの形でサブ
   チリシンを暗号化している第５項に記載の方法。 （７）組換え宿主細胞が桿菌株である第１項に記載の方
   法。 （８）桿菌が３ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂＮｌｉｓである
   第７項に記載の方法。 （９）サブチリシンを暗号化してるＤＮＡ配列が、その
   固有のプロモータ、その固有のプロモータ以外の宿主に
   ホモローガスなプロモータ、または宿主にヘテロローガ
   スなプロモータに機能的に結合している第４項に記載の
   方法。 （１０）組換え宿主細胞が、その信号配列に機能的に結
   合した原核性プロテアーゼを暗号化しているＤＮＡ配列
   にとって有効な発現ベクターにより形質転換されたもの
   である第３項に記載の方法。 （１１）原核性カルボニル水解酵素および該氷解酵素を
   発現し得るように形質転換された宿主微生物からなる組
   成物。 （１２）氷解酵素が桿菌の氷解酵素である第１１項に記
   載の組成物。 （１３）プレプロー、プレー、またはプロカルボニル氷
   解酵素を発現する細胞を実質的に含んでいない該プレプ
   ロー、プレー、またはプロカルボニル氷解酵素からなる
   組成物。 ＜　１　／Ｉ−）プロカルボニル水ｗ１醇素がプロサブ
   ヂリシンである第１３項に記載の組成物。 （１５）　Ｂ　、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ
   ｓ　サ７チｌ）　シン［含んでいる液状洗浄組成物。 （１６）適当な宿主細胞と適合し得るプロモーターに機
   能的に結合した氷解酵素を暗号化している１）　Ｎ　Ａ
   配列を含有する、原核性カルボニル氷解酵素のための発
   現ベクター。 （１７）適当な宿主細胞と適合し得るプロモータと機能
   的に結合したプレブロー、またはプロカルボニル水解酵
   素を暗号化しているＤＮＡ配列を含有する引換え発現ベ
   クター。 （１８）ＤＮＡ配列がサブチリシンを暗号化している第
   １７項に記載のベクター。 （１９）第１６項に記載のベクターにより形質転換され
   た細胞。 （２０）細＋１１Ｑが桿菌株である第１９項に記載の細
   胞。 （２１）（ａ）原核性カルボニル氷解酵素を暗号化して
   いるＤＮＡ部分を分離し、そして（ｂ）そのＤＮＡを発
   現するとき、該氷解酵素の定められた部位において少な
   くとも１個のアミノ酸の置換、切除または挿入をもたら
   すミコーチージョンをそのＤＮＡの定められた領域に導
   入刃ることからなる方法。 （２２）ミューチージョンが予め定められている第２１
   項に記載の方法。 （２３）ＤＮＡが、カルボニル氷解酵素を発現する微生
   物からゲノムＤＮＡのフラグメン１〜として分離さたれ
   ものである第２１項に記載の方法。 〈２４）基本的に氷解酵素のための構造遺伝子のみを含
   んでいる第２３項に記載のフラグメン１〜。 （２５）第２１項に記載の工程（ｂ）で得られる変異し
   たＤＮＡで適当な宿主細胞を形質転換し、その変異した
   ＤＮＡの発現産物を回収する工程をさらに含有してなる
   第２１項に記載の方法。 （２６）氷解酵素が蛋白質氷解酵素またはリパーゼであ
   る第２１項に記載の方法。 （２７）蛋白質氷解酵素が桿菌サブチリシンである第２
   ６頂に記載の方法。 （２８）氷解酵素がプロザブヂリシンまたはプレプロサ
   ブチリシンである第２１項に記載の方法。 （２９）ミューチージョンを、アスパラギン−１〜＋３
   ２、アスパラギン＋１５５、チロシン＋１０４、メヂオ
   ニン→−２２２、グリシン＋１６６、ヒスチジン＋６４
   、セリン＋２２１、グリシン＋１６９、グルタメ−１〜
   ＋１５６、セリン＋３３、フェニルアラニン＋１８９、
   チロシン＋２１７Ｊ’；よび／またはアラニン＋１５２
   において、サブチリシンに導入する第２７項に記載の方
   法。 （３０）蛋白質氷解酵素がメタロプロテアーゼである第
   ２６項に記載の方法。 （３１）ミコーチージョンが、ｔｙｒｏｓｉｎｅ　−１
   においてプレサブヂリシンまたはプレプロサブチリシン
   に導入される第２８項に記載の方法。 （３２）ミューデージョンが、氷解酵素の酸化安定性、
   Ｋｍ　、　Ｋｃａｔ　、Ｋｃａｔ　／Ｋｍ比、基質特異
   性、比活性または至適ｐＨの１つまたはそれ以上５− におＣづる変化を表わすミュータント力ルボニル水解酵
   素として発現される第２１項に記載の方法。 （３３）カルボニル氷解酵素がペプチド氷解酵素である
   第２１項に記載の方法。 （３４）ペプヂド氷解酵素がα−アミノアシルペプチド
   水解酵酵素ペプヂジルアミノ酸氷解酵素、アシルアミノ
   氷解酵素、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカル
   ポキシペプヂダーゼ、ヂオールプロテイナーゼ、カルボ
   キシルプロテイナーゼまたはメタロプロテアーゼである
   第３３項に記載の方法。 （３５）ミューチージョンが１個のアミノ酸の置換また
   は挿入として発現される第２１項に記載の方法。 （３６）原核性カルボニル氷解酵素の予め定められたミ
   ュータントを暗号化しているＤＮＡ。 （３７）ミューラント細菌性カルボニル氷解酵素を生産
   するために宿主細胞を形質転換し得るベクターであって
   、該宿主細胞を形質転換することによりミュータント氷
   解酵素を発現する第３６項に６− 記載のＤＮＡからなるベクター。 （３８）第３７項のベクターで形質転換された宿主細胞
   。 （３９）第２５項の方法で得られたミコータン１〜カル
   ボニル氷解酵素。 （／ＩＱ）洗浄剤との絹合わせて第３９項の氷解酵素を
   含有してなる組成物。 （４１）洗浄剤が液状洗浄剤である第４０項に記載の組
   成物。 （／１２）洗浄剤が顆粒状である第４０項に記載の組成
   物、 （／Ｉ３）ビルダー、漂白剤または螢光漂白剤をさらに
   含有してなる第４０項に記載の組成物。 （／ｌ／Ｉ）洗浄剤が直鎖状アルキルベンゼンスルホネ
   −１〜、アルキルエトキシ化（ｊルフエート、硫酸化直
   鎖状アル］−ルシ１、たは工１ヘキシ化直鎖状アル二１
   −ルである第４０項に記載の組成物。 （４５）異なった基質特異性を示すミュータン１−を回
   収する第３２項に記載の方法。 く４６）ミコーチージョンが酵素活性部位内にある第２
   １項に記載の方法。 ＜４７）ＤＮＡが原核生物または真核生物である宿主細
   胞中で発現される第２１項に記載の方法。 （４８）宿主細胞が細菌である第４７項に記載の方法。 （４９）細菌が桿菌類である第４８項に記載の方法。 （５０）メチオニン、トリア１〜フアン、システィンま
   たはリジンの１つではない置換アミノ酸残塁により、１
   もしくはそれ以上のメチオニン、１−リブトファン、シ
   スティンまたはリジンが置換された形として、ミューチ
   ージョンが発現される第２１項に記載の方法。 （５１）置換アミノ酸残基がアラニンまたはセリンであ
   る第５０項に記載の方法。 （５２）ミコーチージョンによりミュータント酵素が前
   駆体酵素より酸化安定性に劣るようになる第３２項に記
   載の方法。 （５３）ミコーチージョンによりミュータン１〜酵素が
   前駆体酵素よりより酸化安定性になる第３２項に記載の
   方法。 （５４）前駆体の原核性カルボニル氷解酵素の予定され
   ＩＳ酵素的に活性なミュータン１へであって、イの前駆
   体酵素とは巽なった基質特異性、酸化安定性および／　
   Ｊｊたはｐｌ−１活竹プロフイルを示づミュータントを
   暗号化しているＤＮＡ。 （５５）ミュータン１〜酵素を生産するために宿主細胞
   を形質転換し得るベクターであって、宿主細胞の形質転
   換によりそのミュータント酵素を発現ηる第５４項に記
   載のＤＮＡを含有するベクター。 （５６）第５５項に記載のベクターにより形質転換され
   た宿主細胞。 （５７）第５６項に記載の細胞を培養し、そこからミコ
   ータンミル酵素を回収覆る方法。 （５８）サブチリシンまたは中性プロプアーゼを分泌−
   ！Ｊ’′ることができない実質的に正常な胞子形成を行
   なう桿菌。 （５９）ポリペプチドを発現しないかあるいは発現して
   も酵素的に不活性なポリペプチドを発現する、欠失を含
   有するミューラント中性プロテア−９− ゼ遺伝子を含有する第５８項に記載の桿菌。 （６０）サブチリシンまたは中性プロテアーゼを分泌し
   得る桿菌株を含まない第５８項に記載の桿菌。 （６１）ミュータントウ性プロテアーゼ遺伝子が復帰不
   能のものである第５９頂に記載の桿菌。 （６２）中性プロテアーゼを実質的に含んでいない増殖
   期の桿菌培養物。 （６３）実質的にサブチリシンを含んでいない増殖期の
   桿菌培養物。 （６４）Ｗ９素的に活性な中性プロテアーゼを発現し得
   る遺伝子を含んでいない桿菌培養物。 （６５）酵素的に活性なサブチリシンを分泌し得る遺伝
   子を含んでいない桿菌培養物。 （６６）欠失変異させた中性プロテアーゼ遺伝子を含有
   しているベクター。 （６７）欠失変異させたサブチリシン遺伝子を含有して
   いるベクター。 （６８）サブチリシンまたは中性プロテアーゼでない蛋
   白質が培養物中に蓄積するまで第５８項に１０− 記載の桿菌を培養し、その蛋白質を回収する方法。 （６９）蛋白質がアミラーぜである第６８項に記載の方
   法。 （７０）（ａ　）中性プロテアーゼ分泌能がなく、（ｂ
   　）桿菌によって本来発現されないポリペプチドを暗号
   化している少なくとも１種のＤＮＡ部分で形質転換され
   た第５８項に記載の桿菌。 （７１）ポリペプチドがザブチリシンミコータン１〜で
   ある第５８項に記載の桿菌。 （７２）ポリペプチドが真核性蛋白質である第５８項に
   記載の桿菌。 （７３）（ａ　）前駆体蛋白質の少なくとも一部を暗号
   化しているＤＮＡ部分を得、 （Ｉ］）その部分内の領域を同定し、 （Ｃ）発現の際、その領域によって暗号化されているア
   ミノ酸を変えることのないように、その同定された領域
   の５′および３′に特異な制限部位が利用できるように
   該部分に特異な少なくとも１つの制限酵素部位を作るた
   めに、その領域内に既に存在しているヌクレオチドを、
   ヌクレオチドで置換し、 （ｄ）５’おＪ：び３′末端に、工程（Ｃ）で導入され
   た制限酵素部位にアニーリングし得る配列を含んでおり
   、該部分に結合されたとき、該前駆体蛋白質中の少なく
   とも１個のアミノ酸の置換、切除および／または挿入と
   いう形で発現される複数のオリゴヌクレオチドを合成し
   、 （ｅ　）工程（Ｃ）の該部分を、その特異な部位を開裂
   し得る制限酵素で消化し、そして、（ｆ　）工程（ｄ　
   ）のオリゴヌクレオチドのそれぞれを工程（ｅ）の消化
   した部分に結合さ１！、複数のミューラントＤＮＡ部分
   を得る方法。 （７４，）（０）該部分のそれぞれを適当な宿主中でミ
   ュータント蛋白質として発現させ、（ｈ）工程（ａ　）
   のミュータント蛋白質を回収し、そして （ｉ）工程（ｈ）のミュータント蛋白質を所望の特性に
   ついてスクリーニングする、 ことからなる工程をさらに含有してなる第７３項に記載
   方法。 （７５）制限酵素部位が異なっている第７３項に記載の
   方法。 （７６）オリゴヌクレオチドが約５０ｂｐ以下である第
   ７２項に記載の方法。