JPH01502398A - 原核微生物の染色体ｄｎａにおける安定した遺伝子増幅 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 原核微生物の染色体ＤＮＡにおける 安定した遺伝子増幅 〔技術分野〕 本発明は、原核細胞の染色体中に少なくとも２コピイの限定されたＤＮＡ配列を 拡大させ重複させずに組込むことにより、安定した遺伝子増幅が行なわれる原核 細胞に関する。

〔背景技術〕

バチルス属の菌はα−アミラーゼ、中性プロテアーゼ及びアルカリプロテアーゼ 又はセリンプロテアーゼ等の工業的に重要な酵素の生産に広く使用れてきている し文献（Ｄｅｂａｂｏｖ　’ＴｈｅＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ロｓｅ　ｏｆ　Ｂａ ｃｉｌｌｉ″　ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆＢ ａｃｉｌｌｉ、　Ａｃａｄ−Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２）参 照〕。バチルス属菌による酵素生産の改良は突然変異及び引きつづく淘汰等の古 典的遺伝子技術及び最近の分子生物学的技術の両方によって達成され得る。後者 においては遺伝子工学による原核及び真核微生物中の、同種源及び異種源遺伝子 の高度の発現レベルを得るためのいくつかの方法が実証されている。

成る遺伝子の高度の発現を達成する方法のひとつは効率的な制御配列をもつ遺伝 子を提供することである。該第１の方法と組合せてしばしば用いられる第２の別 法は、問題にしている遺伝子のコピー数を増加させることである。増幅は、プラ スミドのよう８なコピー数の多い染色体外ＤＮＡ分子の中にその遺伝子を挿入す ることによって主として達成される。しかし、遺伝情報を発現させ増幅するため のベクターとしてプラスミドを用いることの重大な欠点はそれらの不安定性にあ る。大規模な使用のために増幅した遺伝子の安定性は、その増幅遺伝子によりコ ードされている発現生成物の高度生産の維持のための必要条件となる。その理由 は、実質的な産生物取得の達成のために十分な量の生物塊（バイオマス）が形成 される以前に、多くの細胞分裂が起らなければならないからである。

不安定性は２つの形で現れる：即ち、培養中プラスミドの消失が起る分離的不安 定性（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ　１ｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）及びプラスミド の一部が欠失する構造的不安定。例えば分離的不安定性は、宿主細胞が過剰発現 される遺伝子をもつベクターを宿したときに起る。一般的に遺伝子の過剰発現は 、トランスホーメーション（形質転換）された宿主細胞にとって好ましくない性 質なので、遺伝子を過剰発現する能力を失った細胞に対して淘汰圧（ｓｅｌｅｃ −ｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）となるであろう。大量の代謝エネルギーが過剰 発現遺伝子産生物に費やされ、これは、過剰発現を行っていない宿主細胞との“ 細胞競争力（増殖速度）”に悪影響を与える。

分離不安定性に対して用いられる方法には、プラスミド含有細胞に有利な（例え ば、抗生物質耐性で、その発酵培地中に“関連する抗生物質”を添加するなど） 遺伝子をもつ“マルチコピー（コピー数の多い）プラスミドを含む細胞”の選択 法がある。しかし一般に抗生物質は、その発酵プロセス及びその産生物それ自体 に関する制御の点から、大規模の商業的生産プロセスにおける選択手段としては 有用ではない。

分離的不安定性によるプラスミドのロス（損失）を少なくするために用いられる 別法は、宿主細胞に機能的に本質的な遺伝子をベクター分子へ挿入することであ る［　Ｆｅｒｒａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３　 （１９８５）　１００３〜１００７３　、しかしこの方法はベクターの構造的安 定性をなにも保証していない。

プラスミドの構造的な不安定性の問題を解決するために用いられる技術には例え ば温度感受性の制御配列のような制御配列を用いることにより、及び宿主細胞染 色体への外来ＤＮＡの組込みにより、指数増殖期における、その一般の発現を回 避する技術が含まれる。他に使用される方法は、自己複製ベクター分子の使用の 回避と、それに代る宿主細胞染色体への導入ＤＮＡの組込みを起す技術の使用と を含んでいる。

宿主細胞染色体への外来ＤＮＡ組込みの方法には相同的組換え及び非正統的組換 えが含まれる。相同的組換えによる“染色体上の特異的部位へのＤＮＡ配列挿入 ”には２つの方法：即ち図ＩＡ及びＩＢに夫々示されたキャンベル型（ｃａｍｐ ｂｅｌ　ｌ−ｔｙｐｅ）相同的組換え及びダブルレシプロカル（ｄｏｕｂｌｅ　 ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）な組換えがある。染色体へＤＮＡ配列を導入する二段階 置換メカニズムによる第３の方法を図ＩＣに示した。原則的にはキャンベル型組 換えを用いるが、最終結果は“その染色体の組換え部分中に重複した配列を含ま ない、よって増幅可能ユニットを含まない染色体配置゛となる。従ってそれはダ ブルレシプロカル組換えに恨でいる。

染色体への外来ＤＮＡ組込みのための相同的組換えを用いることとは別に、非正 統的組換えによるＤＮＡ組込みも可能である。

組込まれたベクター分子は、非組込みベクター分子の自律的複製を阻害する条件 下で選択されることができる０組込みのための非正統的組換えの使用を図ＩＤに 示した。得られた染色体配列配置中にタンデムな（隣り合っている）重複がない ことは、図ＩＢ。

Ｃ及びＤ中に示した経路によるゲノムへのＤＮＡ配列の安定な導入を可能にする 。染色体に組込まれた遺伝子には、染色体に組込まれたＤＮＡの増幅が隣り合っ て起こっている同種起源及び異種起源の遺伝子の両方が含まれる。これらの染色 体中の増幅配列は、成る場合にだけその安定性が報じられているが、一般に不安 定であることが報告されている。従って染色体へ組込まれたＤＮＡが安定に維持 される方法の開発が望まれている。

〔背景技術〕

バチルススブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体への外来 ＤＮＡの相同的組換えによる組込みが文献［Ｄｕｎｃａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ｔｌｓＡ、７５　（１９７８）　、 ３６６４−３６６８）に、及びアナシスチスニデュランス　（Ａｎａｃｙｓｔｉ ｓｎｉｄｕｌａｎｓ）については文献［Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　５ｚａｌａ ｙ、　Ｇｅｎｅ　２４（１９８３）３７−５１］曲びに国際特許出願ＷＯ３４１ ００３８１号により報告されている。ペテロ遺伝子の微生物染色体への相同的組 換えによる“プラスミドベクター上に存在するとき安定に維持されない組込み” はＥＰ−Ａ−０１２７３２８号明細書に記載されている。

相同的又は非相同的な遺伝子であって染色体に組込まれた該遺伝子の増幅が実証 されている。例えば諸文献［５ａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ｓｉｍｐｏｓｉｕｏ＋　ｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒ ｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、　Ｋｙｏｔｏ、　Ｊａｐａｎ、　１９ ８２゜ｐｐ、　１２５１３０；　Ｙｏｕｎｇ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ、　１３０　（１９８４）　１６３１−１６２１；　Ｊａｎｎｉｅｒｅ　 ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ　４０　（１９８５）　４７−５５；　Ｓａｒｇｅｎ ｔ　ａｎｄＢｅｎｅｔｔ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６１　＜１９８５ ）　５８９−５９５；　Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄにｏｓｈｌａｎｄ、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　８０　（１９８３）　４ ８９４−４８９８；Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｗ、　４９　（１９８５）　５４５−５５０；Ｗｉｌｓｏｎ　ａｎ ｄ　Ｍｏｒｇａｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６３　（１９８５）　４ ４５−４５３；Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｉｏｎ　Ｎｏ、　 ８４−０６７０１；　ａｎｄ　ＥＰ−Ａ−０１３４０４８））を参照されたい。

原核細胞における自然増幅も報告されており、またそれについて選択することも できる。例えば文献［Ａｎｄｅｒｓｏｎａｎｄ　Ｒｏｔｈ、　ＡｎｎｌＭｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　３１　（１９７７）　４７３−５０５）を参照されたい。

上述の全ての場合において、染色体に組込まれたＤＮＡの増幅した配列は隣り合 って並んでいる。このタイプの染色体増幅配列は文献［Ｊａｎｎｉｅｒｅ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　４０　（１９８５）　４７−５５］により報告７　され ているように成る場合には安定であるが一般には不安定である。

これらの増幅した配列の間に、他の本質的遺伝子の存在による“原核生物の自然 に増幅した遺伝子の安定化”が報告されている。

例えば枯草菌染色体中に生じたリポソームＲＮＡ遺伝子のセット（複数）の９〜 １０コピーのうちで隣り合って並んでいる２つのセットは、ｔＲＮＡの一群（ｃ ｌｕｓｔｅｒ）の遺伝子で分離されている［Ｗａｗｒｏｕｓｅｋ　ａｎｄ　Ｈａ ｎｓｅｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８　（１９８３）　２９１−２ ９８３゜他の場合については該微生物の表現型の諸性質に影響することなく、大 腸菌及び枯草菌の両方において、天然の重複して繰返しているリポソームＲＮＡ オペロンが欠失されている［ＥＩＩｏｗｏｏｄ　ａｎｄＭｏｍｕｒａ、　Ｊ、　 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４３　（１９８０）　１０７７−１０８０；　ａｎｄ 　Ｌｏｕｇｈｎｅｙｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５４　（ １９８３）　５２９−５３２３゜ベクターＰＥ１９４で用いた“非正統的組換え による枯草菌の染色体へのプラスミドの組込み”が報告［）１ｏｆｅｍｅｉｓｔ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８９　（１９８３）　５８−６８　ａｎｄ　 Ｐｒｏｒｏｚｏｖ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｇｅｎｅ　３４　（１９８５）　３９−４６）されている。

Ｂ、アミロリクイファシェンス　（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） （Ｐａｌｖａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　１５　（１９８１）　４３−５１） 　、Ｂ、リヘニホルミス（Ｂ、ｌ１ｃｈｅｎｉｆｏｒ＋５ｉｓ）　［口ｒｔｌｅ ｐｐ、　Ｇｅｎｅ　２３　（１９８３）　２６７）　、Ｂ、ステアロテルモフィ ルス　（Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　［Ｍｉｅｌｅｎｚ　ｅ ｌ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＬＩＳＡ　８０　（１９８３）　５９７５ −５９７９；　ＥＰ−Ａ−００５７９７６）及び枯草菌（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　（１９８３）　２３７１ のα−アミラーゼ遺伝子；及び枯草菌のレバンシュクラーゼ遺伝子（Ｇａｙ　ｅ ｌ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３　（１９８３）　１４２４ ）　；　Ｂ、ステアロテルモフィルス（Ｆｕｊｉ　ｅｌ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ、　１５６　（１９８３）８３１）　、Ｂ、アミロリクイファシ ェンス（Ｈｏｎｊｏ　ｅｌ　ａｌｌＪ。

Ｂｉｏｔｅｃｈ、　１　（１９８４）　１６５：ｌ及び枯草菌（Ｙａｎｇ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６０　（１９８４）　１１５）のニュートラルプロテ アーゼをコードする遺伝子：枯草菌（Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、＋°Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８１　（１９８４）　１１８４）　、Ｂ、　リヘニホルミ ス（Ｊａｃｏｂｓ　ｅｔａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ ３　（１９８５）　８９３１）及びＢ、アミロリクイファシェンス０１ｅｌｌｓ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　（１９８３ ）７９１１）のセリン又はアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のようなバ チルスの細胞外酵素の遺伝子の数種のものが成功裡にクローニングされている。

何種かのグラム陽性微生物のプロトプラストのトランスホーメーションも報じら れている。枯草菌に関するプロトプラストトラＧｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６８ 　（１９７９）　１１１−１１５）されており、該技術は広く応用されている。

Ｂ、メガテリウムＣＢ、　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のプロトプラス　ト　（Ｖｏ ｒｏｂｊｅｖａ　ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｏｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔｅ ｒｓ　７　（１９８０）２６１−２６３）　、Ｂ、アミロリクイファシェンスの プロトプラスト（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｐｐｌ、ａｎｄ　Ｅｎｖ、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、５１　（１９８６）　６３４）　、Ｂ、セリンジエンシス（Ｂ 、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のプロトプラスト（Ｆｉｓｈｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、＋　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３９　（１９８１）　２１３− ２１７）　、Ｂ。

スフエリクス（Ｂ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）のプロトプラスト（ＭｃＤｏｎａ ｌｄ、　Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３０　（１９８４）　２０３　）　、及び Ｂ、ラルベ（Ｂ。

１ａｒｖａｅ）のプロトプラスト（Ｂａｋｈｉｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｐｐｌ 、　ａｎ＋Ｌ　Ｅｎｖ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４９　（１９８５）　５７？）のトランスホーメーシシ ンに関して同様に成功した操作法が報じられており；該最後文献にＢ、ボピレ（ Ｂ、　ｐｏｐｉｌｌａｅ）については不成功の結果が報告されている。Ｂ。

ポリミキサ（Ｂ、　ｐｏｌ）＋ｓ＋ｙｘａ）、Ｂ、リヘニホルミス、Ｂ、マセラ ンス（Ｂｏｍａｃｅｒａｎｓ）及びＢ、ラテロスボルス（Ｂ、　１ａｔｅｒｏｓ ｐｏｒｕｓ）についての操作法は成功し、Ｂ、コアグランス（Ｂ、　ｃｏａｇｕ ｌａｎｓ）、Ｂ、セレウス（Ｂ、　ｃｅｒｅｕｓ）及びＢ、プミルス（Ｂ、　ｐ ｕｍｉｌｕｓ）については良好なプロトプラストが得られたにもかかわらず実験 操作は不成功に柊っている（Ｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、　１３（１９８６）　１３１−１３５　）　。

プロトプラストにＤＮＡを導入する他方法にはＤＮＡを含むリポソームとの融合 （Ｆｌｏｌｕｂｏｖａ、　Ｆｏｌｉａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３０　（１９８ ５）　９７）又は中間宿主として容易にトランスホーメーシ四ンされ得る微生物 を用いるプロトプラスト融合が含まれる。

（発明の開示〕 本発明により宿主細胞染色体へ安定に組込まれる目的のポリペプチドをコードす るＤＮＡ配列を少なくとも２コピー含む原核性宿主細胞及びその製造方法が提供 される。外来ＤＮＡ配列の安定な維持は、その配列の２コピー又はそれ以上を、 宿主細胞染色体中に“内在する染色体ＤＮＡ配列”により離隔（又は分別）され るようにそれらのコピーを組込むことにより得られる。

〔図面の簡単な説明〕

図ＩＡ−Ｄは、原核微生物染色体への染色体外ＤＮＡ配列組込みの４つの方法を 示す。

Ｔは、目標配列即ち相同的組換えがそれらの間で起こりうる、染色体及びプラス ミド上に存在するＤＮＡ配列である。

Ｓは、染色体中に組込まれるべきＤＮＡ配列を示す。

Ｎは、組換え株の選択に用いるマーカー遺伝子配列を示す。

図２Ａ及び２Ｂは、原核染色体中における安定した遺伝子増幅を得る２つの方法 を模式的に示す。

１０４の培養物（複数）から由来する上滑について行なったヒスチジン／ＭＯＰ Ｓゲル電気泳動に関していくつかのズブチリシンと比較した結果を示す。

レーン１；カールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）ズブチリシンレーン２；バチ ルスＰＢ９２プロテアーゼレーン３；枯草菌ズブチリシン レーン４；枯草菌ＤＢＬＯ４（３Ｍ５８）レーン５；枯草菌ＤＢ１０４　（ｐＵ Ｂｌｌｏ）図４は、プラスミドｐＭ５８の制限地図を示す、さらに、図の上部に シクエンシング（配列化）に関する方策を示す、実線矢印はファージＭ１３ベク ター即ちｍｐｌｏ、ｍｐＨ及びｍｐｌＢ中にクローニングされた断片を示す０図 の下部にプロテアーゼ遺伝子上において一定距離毎に位置する１０個のオリゴヌ クレオチドを用いたシクエンシングの方策を示す。

図５は、バチルスＰＢ９２のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列と相関するコー ド鎖のヌクレオチド配列を示す、そのＤＮＡ配列のプロモーター＜　ｐ　ｒ、　 ｐ　ｚ）、リポソーム結合部位（ｒｂｓ　）及び終止領域（ｔｅｒｍ　）をも示 す、数字を付けた実線は、シクエンシングに用いる１０個のヌクレオチドの位置 を表す。

図６はプラスミドｐＥ　１９４−ｎｅｏの構築（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を 示す。

図６ＢはプラスミドｐＭＡＸ−４の構築を示す。

図７Ａは、ＰＢ９２．ＰＢＴ１０９及びＰＢＴＩ　０８株の夫々の染色体ＤＮＡ のＨｉｎｄｌｌＩによる消化物を、０．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、つ いでセリン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の記載のようにしてニトロセルロースに移しζ ３２Ｐでラベルされニックトランスレーション（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉ ｏｎ）された９Ｍ５８ＤＮＡをハイブリダイズ（交雑）させた結果のオートラジ オグラフを示す。

図７Ｂ及び図７０は、ｐＭＡＸ−４及びバチルスＰＢ９２染色体間の相同的（Ｂ ）な組換え及び非正統的（Ｃ）な組換えで起こる組込みを示す。

図８は、組込みベクターｐＥ　ＩａｔＢの構築を示す。

図９Ａは、Ｂ、リヘニホルミスＴ９株染色体へのプラスミドｐＥ　１ａｔＢの組 込みによるＢ、リヘニホルミスＴＢ１３株の生成を示す。

図９Ｂは、Ｂ、リヘニホルミスＴＢ１３株及びＢ、リヘニホルミスＴ５のプロト プラスト融合による染色体組換えにもとづ＜Ｂ。

リヘニホルミスＴｌ　ａＦ株の生成を示す。

図１０は、例１１記載のＴｌ　ａＦ株の発酵物から単離された９個の別々のコロ ニーの染色体分析を示す。単離された染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、０． ８％アガロースゲルで分離し、ニトロセルロース上にブロッティングした。この プロット　（ｂｌｏｔ）を、３２Ｆ”’Ｑ５ベルし、ニックトランスレーション されたｐＥ］ａｔＢＤＮＡでハイブリダイズさせた。この図はそのオートラジオ グラフを示す。上部の矢印は、約１５ｋｂのＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片が移動する 位置を示す。該断片は、図９Ａ中でＴＢ１３株について述べたように、本来のα −アミラーゼ遺伝子に隣接していない部位上でその染色体に組込まれたｐＥ］ａ ｔＢ配列の全部を有する。下部の矢印は、Ｂ、リヘニホルミスＴ５株中に本来存 在する全α−アミラーゼ遺伝子を含む約３３ｋｂのＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片が移 動する位置を示す（図９Ｂも参照）。下記のＤＮＡ試料を分析した。

レーン１；バチルス・リヘニホルミスＴ５ＤＮＡレーン２；バチルス・リヘニホ ルミスＴＢ　１３　ＤＮＡレーン３；バチルス・リヘニホルミスＴ３９０ＤＮＡ レーン４；発酵後に単離されたバチルス・リヘニホルミスＴ３９０のネオマイシ ン惑受性誘導株由来のＤＮＡ　（例１２に記載される） レーン５；バチルス・リヘニホルミス７１３ＦＤＮＡレーン６；Ｔ１３Ｆ株の発 酵後に単離された９個の別個のコロニー由来のＤＮＡ　（例１２に記ｉり 〔発明を実施するための最良の形態〕 本発明に従い、２つ以上のＤＮＡ配列コピーが原核細胞の染色体中に安定に組込 まれた咳原核細胞及びその調製法が堤供される。

目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞を、該ＤＮＡ配 列を含むＤＮＡ構築物を用いてトランスホーメーシッンさせた。“増幅されるべ き遺伝子から、内在性染色体配列により組込まれたＤＮＡ配列が離隔されている トランスホーメーションされた細胞”を選択する。内在性の介在配列はその宿主 細胞に対して一般的に重要なものである。相同的組換えによる増幅配列の損失は 宿主細胞に致命的なものとなろう、従って抗生物質の使用もしくは同様の選択手 段の必要なしに、その増幅配列をもつ細胞に対する淘汰圧となろう０組込みは相 同的組換えによっても、非正統的組換えによっても達成され得る。所望の細胞を 得るために用いる技術は図２Ａ及び２Ｂの夫々に示されている。

相同的組換えを用いたとき、特に１コピー又はそれ以上の増幅されるべき遺伝子 が既に宿主細胞中に導入されているときには、数個の伸長鎖（ストレンチ）のＤ ＮＡ配列が、宿主細胞染色体に相同的なベクター分子中に存在し得る。従ってベ クター分子は、目的のＤＮＡ配列；標的ＤＮＡ配列；及びマーカーＤＮＡ配列を 含みうる。

所望の組換え染色体配置のみが選択されるべきであることに注意して欲しい。こ れは、組換えに線状ＤＮＡ分子を用いることにより達成される０組込まれる環状 ベクター分子は標的配列に相同的な領域内で制限酵素の使用によって切断される 。このようにしてこの特異的部位における組換え及び組込みが選択的に起る。こ のベクター分子中に存在するのみならず、目的とするＤＮＡ配列もその宿主細胞 染色体上に存在しうる。このＤＮＡ配列は、増幅したい、いかなる構造遺伝子を コードするＤＮＡ配列であってもよい、このＤＮＡ配列は、その宿主微生物に対 して内在的なもので、あってもよく、また先のトランスホーメーションの段階で 宿主染色体内に挿入されたものであってもよい。

非タンデム（非重複の）遺伝子の増幅のための標的配列は、非本質的遺伝子、例 えば宿主としてバチルスを用いた場合に、細胞外酵素をコードする遺伝子又は胞 子形成に関係する遺伝子の中から選択されることが望ましい、一般に、これら遺 伝子中へのＤＮＡ配列の組込みはその遺伝子を失活させるであろう、それゆえ、 この遺伝子発現のロス（損失）をモニターし、望ましい組換え株の選択に利用す ることができる。

図ＩＤ及び２人に示すように、染色体遺伝子増幅に非正統的組換えを用いたとき に、組込み及び選択のための条件は、相同的組換えが非正統的組換えにより優位 でない条件が好ましい、相同的組換えを避ける好適手段としては、目的とする構 造遺伝子を欠いた第１及び第２の宿主細胞を、目的とするポリペプチドをコード するＤＮＡ配列及びマーカー遺伝子を含むベクターの使用でトランスホーメーシ ッンさせることである。異なる位置にそのＤＮＡ配列が存在する第１及び第２宿 主細胞を選択し、融合条件下で結合させ、第２の宿主ゲノム中の散在する位置に 目的とする構造遺伝子をコードするＤＮＡ配列の少なくとも２コピーを含む形質 転換細胞を生成させる。選択を容易にするために第１宿主は融合前にこれを死滅 させることができる。

目的とする遺伝子は原核性又は真核性のいずれの遺伝子でもよい。これらの遺伝 子には、細菌遺伝子、単細胞微生物遺伝子、哺乳類遺伝子又は類似遺伝子が含ま れる。この構造遺伝子は合成、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製又 はそれらの組合せを含む多くの方法で調製され得る。遺伝子の取扱いの種々の技 術はよく知られており、それには制限、消化、再切断、連結、インビトロでの突 然変異誘発、プライマー修復、リンカ−及びアダプターの使用及び類似技術が含 まれる。従って宿主から得られたＤＮＡ配列は、そのＤＮＡ構築の必要事項に依 存して、種々の方法で取扱われる。文献（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８２　）参照。

構造遺伝子で発現されるものは哺乳類、単細胞微生物、例えば細菌、真菌例えば イースト又は繊維状菌類、藻類、プロトシア、植物又は他のＤＮＡ源由来の酵素 、ホルモン、リンホカイン、表面タンパク質、血液タンパク質、構造タンパク質 、免疫グロブリン又はこれらの類似物のような種々のポリペプチド又はタンパク 質である。酵素、なかんずくプロテアーゼ及びアミラーゼが興味深い。それら酵 素の代表例は高アルカリ活性セリンプロテアーゼ、α−及びβ−アミラーゼ及び 類似酵素を含むセリンプロテアーゼ及び非セリンプロテアーゼである。セリンプ ロテアーゼの好ましい給源はバチルス新種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎｏｖｏ　５ｐ ｅｃｉｅｓ）　Ｐ　Ｂ　９２、α−アミラーゼの給源はＢ、リヘニホルミスＴ５ 株、並びにそれらの株の突然変異株及び変異株′である。

適当なベクターの一部を形成する遺伝子はこの分野で一般的に知られている方法 で得られる。一般にこの方法は高アルカリ活性プロテアーゼを発現する微生物由 来のゲノムライブラリ　（ｇｅｎｏｍｉｃｌｉｂｒａｒｙ）の調製を含む、この ゲノムライブラリは例えばドナー（供与）株（ｄｏｎｏｒ　５ｔｒａｉｎ）のＤ ＮＡ断片を適当なベクターに連結することにより簡単に調製され得る。

“適当なベクター”という用語は目的とするタンパク質又はポリペプチドをコー ドする構造遺伝子を含むＤＮＡ構築物（ＤＮＡｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を意味して いる。宿主細胞中で機能的な制御領域即ちプロモーター配列、リポソーム結合部 位を形成する配列及び構造遺伝子の転写及び翻訳の停止をコントロールする配列 等の制御領域に適した方向においてその構造遺伝子を結合させる。工業的なバチ ルス属菌株のようなプラスミド含有細胞について中間的単離を行うことなく組込 みを直接選択するには低すぎるトランスホーメーシッン及び組込み顯度しか有し ない宿主細胞の場合にはそのベクターは、その宿主細胞中での自立的複製を可能 とする複製オリジンを更に含まなければならない。

宿主原核性細胞株により認識される転写及び翻訳開始シグナル及び停止制御シグ ナルを有するドナー細胞から遺伝子を得た場合には、その構造遺伝子の本来の制 御配列を維持する方が、通常は便利であろう、さらに転写開始領域は、構成的な 或いは誘導可能な発現を提供するので、その結果適当な状態で宿主細胞は、目的 の構造遺伝子の高レベルな発現以前に、高密度に生育する。

構造遺伝子が、宿主細胞により認識されない制御シグナルをもつ遺伝子に由来す る場合には、その宿主細胞に認識される制御領域を得る必要があると共に、開始 制御シグナルと停止制御シグナルとの中間に該構造遺伝子が挿入される必要があ る。成る場合には、それ自身の終止コドンをもつ外来構造遺伝子を、本来の制御 シグナルをもつ内在構造遺伝子のＮ末端コドンの後に、読み枠を同じくして、挿 入することもできる。

発現した産生物は分泌されることが望ましい０発現産生物が自然に分泌され、リ ーダーシグナル及びプロセシングシグナルが宿主細胞に認識される場合にこのこ とは困難ではないであろう、しかし宿主細胞が分泌リーダーシグナル及び（又は ）プロセシングシグナルを認識しないか、或いはそのシグナルが宿主細胞中で満 足できる程の機能を示さないために、その産生物が分泌されない場合には、宿主 細胞ポリペプチドの分泌リーダーシグナル及びプロセシングシグナルをコードす るＤＮＡ配列を単離又は合成し、その構造遺伝子の５′末端に正しい読み枠でそ れらを結合させる必要がある。

さらにそのベクターは“宿主細胞が感受性を存する抗生物質”に耐性を示すマー カー遺伝子を存することができる。該ベクターを染色体組込みに用いた時にこの マーカー遺伝子はその宿主株中に１コピー又はわずかなコピー数で存在する場合 にも生存のための選択が可能であるという要求を満足するものでなければならな い、マーカーは宿主中での構造遺伝子の発現を可能にするためのものではなく、 その生存のための選択を可能にするものである。

“生存のための選択°という用語は栄養要求宿主への原栄養性の付与、毒物（抗 生物質）耐性又はウィルス耐性の付与を意味している。原栄養性についてはｌｅ ｕ、　ｈｉｓ、　ｔｒｐ又はそれに類する種々の遺伝子が使用される。毒物耐性 については例えばｎｅｏ、　ｃａｎ。

ｔｅｔ、　ｔｕｎ、　ｋａｎ又は類似の抗生物質耐性が含まれる。その他のマー カーには重金属に対する耐性、免疫及び類似のマーカーがある。

種々のＤＮＡ配列が多種の起源から誘導され、それらが結合することによって構 造遺伝子のその場所における又は欠失した断片の代りとなる挿入又は置換を可能 とする１つ又はそれ以上の便利で、好ましくは唯一の、制限部位を含むベクター が提供され、プラスミド構築物が作られる。

染色体組込みに対する選択は、“その宿主中で温度感受的に機能する突然変異を もつ複製オリジン”を含むプラスミドを用いて行なわれる〔例えば文献：　Ｅｈ ｒｌｉｃｈ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７５　（１９７８）　１４３３を参照されたい〕。

ひと度、このプラスミド構築物ができてしまえば、これは適当なりローニング宿 主にクローニングされ得る。簡便で、容易にト。

ランスホーメーシッンされ、プラスミド構築物の複製及び宿主細胞への転移が可 能なものならどんな宿主でも使用され得る。高いトランスホーメーシッン効率を もち、通常は栄養要求性であり及び（又は）抗生物質感受性の多数の菌株を使用 し得る。宿主細胞として工業用のバチルス株を用いる場合にはプラスミド構築物 のクローニングのために宿主として同じ微生物を使用するのは有利であるがそれ はクローニング宿主株及び宿主株の双方共に、生存のための選択に対し同じマー カーを使用し得ると共に単一の複製システムを使用し得るからである０例えば欧 州特許出１１ＥＰ−Ａ−１３４０４８号を参照されたく、その開示内容は本明細 書中にも引用されている。

プラスミド構築物は、カルシウム沈殿ＤＮＡ、接合又は他の簡便な技術を用いた トランスホーメーシッンのような従来技術に従い、クローニング用宿主中に導入 され得る０次にそのクローニング用宿主を、そのプラスミド構築物を含む宿主を 選択するための選択的条件下に、適当な普通培地中で生育させる。栄養要求性宿 主の場合にその普通培地は所要栄養素を欠いており、一方、毒物耐性例えば抗生 物質耐性の場合には死減量の毒物を普通培地に添加する。

種々の宿主を用いることができるがこれらには大腸菌、バチルス属の菌株特に枯 草菌、プソイドモナス属及びストレプトミセス属が含まれる。宿主細胞を選ぶに あたり増幅すべき遺伝子発現及び所望産生物の生産に影響する種々の因子を考慮 しなければならない。従って制御シグナルの認識；分泌の容易さ；所望産生物の 分解の低度及びその他が見込まれる宿主の使用が望ましい。好ましい宿主は、目 的とする産生物をすでに産生ずる宿主であることが望ましく、また野生型又は突 然変異株のいずれであってもよい。

またその宿主細胞はそれ自身が目的とするポリペプチドを産生ずる微生物の変異 株であっても非生産株であってもよい。目的のポリペプチドがプロテアーゼかア ミラーゼの場合には、バチルス新種ＰＢ９２及びバチルスリヘニホルミスＴ５株 の夫々並びにそれらの突然変異株及び変異株が好ましい。

加えて、工業的菌株の望ましい特性を有する工業用菌株を用いる事も可能である 。使用される株の例としてはＢ、リヘニホルミス、Ｂ、アミロリクイファシェン ス及びアルカリ親和性細菌のような酵素の工業的生産に用いられる株である。こ れらの工業用菌株は土壌から単離されるか或いは廃棄物又はその他の給源から入 手されるか又は該菌株を変改して得られる微生物から選択される。

これらの工業的株は非常に強くて安定である。さらに該株はファージ感染に対し 、従来のトランスホーメーション操作によるＤＮＡの導入である遺伝子交換（ｇ ｅｎｅｔｉｃ　ｅｘｃｈａＨｅ）に対しても耐性である。また従来の工業的株は 、普通培地中への高価なアミノ酸の添加を避けるために原栄養性である。工業的 株のその他の特性には、−週間程にもなる発酵の終りまで続く高い生産性、培地 消費の際の安定な細胞濃度及び特異的な分泌タンパク質の少なくとも通常は５ｇ ／ｌ（０，５％ｗ　／　ｖ　）にも及ぶ高い生産性が含まれる。

染色体中に隣り合って配置されるか又は散在する遺伝子を有するトランスホルマ ント（形質転換体）が得られる。一般に、上述の２つのタイプのトランスホルマ ントの混合物の中がら、個々のトランスホルマントの染色体ＤＮＡを単離し、つ づいて例えばサザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９ Ｂ　（１９７５）　５０３−５１７）又は当業者に周知の他の手段により上記遺 伝子の相対的位置について上記ＤＮＡを分析し、それにより上記遺伝子が散在し て組込まれているものを同定することにより、散在遺伝子を含むトランスホルマ ントを選択することができる。

タンデムな（重複の）組込みを避け、散在遺伝子トランスホルマントを得る手段 には図ＩＢ及び２Ｂで説明されているダブルレシプロカル組換えの使用、増幅す べきＤＮＡ配列、マーカー遺伝子及び組換えのための標的配列を含む線状のＤＮ Ａ構築物の使用が含まれる。

さらに、散在遺伝子トランスホルマントを得る特異的手段には図２Ａに示される 非正統的組換えの使用がある。該使用においてはマーカー遺伝子の発現の差を利 用する選択により、タンデムトランスホルマントの単離を避けることが可能であ る。マーカー遺伝子の例は“非タンデム組込みとは異なる遺伝子のタンデムな組 込みをもつ株における抗生物質感受性を示す抗生物質耐性”をコードする遺伝子 である。一般に、介在する内在ＤＮＡ配列の長さは１０ｋｂ、以下であろう。

さらに、タンデムな重複を避け、散在遺伝子を有するトランスホルマントを得る 手段には“受容株に関し、異なる位置の染色体中に組込まれた構造遺伝子″とマ ーカー遺伝子とを含むＤＮＡ構築物を有する相同的なドナー株の死滅したプロト プラストの使用がある。

宿主細胞のトランスホーメーションに当ってはその宿主株からドプラストは従来 法、例えばリゾチーム又はチモリアーゼ（ｚｙｍｏ−Ｉｙａｚｅ）処理等の従来 法に従って細胞から調製され、該プロトプラストはその完全性を維持するだめの 適正な浸透圧を有する適当な媒体の中に注意深く懸濁される。工業用バチルス属 菌株のプロトプラスト調製法はＥＰ−Ａ−０１３４０４８に報告され、該開示内 容は本明細書中に引用されている。宿主株がアルカリ親和性バチルス株である場 合にはプロトプラストは簡便にアルカリ性ｐＨ１好ましくは約ＰＨ８，０で調製 され得る。この操作は欧州出願ＥＰ−Ａ−８７２００３５８，７号に記載され、 その開示内容は本明細書中に引用されている。

宿主細胞は、プラスミド構築物又はクローニング宿主プロトプラストと宿主細胞 プロトプラストとを、適当なフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）〔例えばポリエチレン グリコール〕の存在下で結合させることによりトランスホームされ得る。望まし い程度の効率を有するフソゲンはいずれも使用され得るが、大抵の場合にポリエ チレングリコールは非常に簡便に高い融合効率をもつことが分っている。しばら くして、フソゲン混合物を適当な普通培地と置換し選択培地上、簡便には寒天培 地上に平板培養することで細胞群を再生させる。

宿主細胞と適当なりＮＡ構築物とを合併させることにより得られるトランスホル マントは、上記宿主中で機能する複製オリジンをそのＤＮＡ構築物が含むとき、 それら染色体に組込まれた部分として、もしくは遊離したベクター分子として、 上記ＤＮＡ構築物又はその一部分を含み得る。

ＤＮＡＩＩＩ築物が染色体に組込まれた場合のトランスホルマントを選択する方 法は、温度感受性の複製オリジンを含むプラスミドを使用する方法である。トラ ンスホルマントを許容される温度で選択培地を用いて生育させ、それから非許容 温度に変える０次に非許容温度でマーカー遺伝子を発現するコロニーを単離し、 さらに選択培地を用いて許容温度で培養する。プラスミドが存在しないことを実 証するには例えばコロニーからの全ＤＮＡ０単離及びアガロースゲル上での電気 泳動分析又はそのトランスホルマントがコンピテント（被感染性）の細胞をトラ ンスホームする能力がないことを示すのである。染色体への組込みが起る経緯を 示すには、例えばサザン法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９Ｂ　（１９７５） 　５０３−５１７）又は当業者に既知の他方法により、その染色体ＤＮＡを分析 することで可能である。

宿主ゲノム中にそのマーカー遺伝子が散在的に組込まれたものとは対照的にマー カー遺伝子のコピーをタンデムにもつトランスホルマント（複数）の間に選択試 薬に対する感受性の差が存在する場合には、適当な濃度の選択試薬を含む培地中 でトランスホルマントを生育させることにより、非タンデム組込みを有するトラ ンスホルマントと上記のトランスホルマントとを簡便に選択し得る。

目的とするＤＮＡ配列のいくつかのコピーを散在的に組込んだトランスホルマン トを得る他の手段は、受容細胞の染色体上の部位とは異なる部位に、目的とする ＤＮＡ配列の少なくとも１コピーを含む相同的ドナー細胞から調製されたプロト プラストを使用することである。相同的ドナー細胞を調製するには、例えば目的 とする構造遺伝子を含まない細胞を、その構造遺伝子を含むベクターを用いてト ランスホーメーションさせることによるのである。

ＤＮＡ配列をドナー細胞染色体へ組込むには、温度域受性の複製オリジンをもつ プラスミドを使用して遂行し、そのトランスホルマントをまず許容温度で選択条 件を用いて生育させ、次いで上述のように非許容温度で生育させてからそのマー カー遺伝子を発現するコロニーを単離するのである。

プラスミドＤＮＡの不存在を確かめた後に染色体ＤＮＡを単離し、上述のサザン 法に従い、例えば２Ｚｐ又はビオチン結合ヌクレオチドでラベルしたプローベ（ 探索子）とハイブリダイズさせることにより分析し得る。プローベとしては例え ば目的とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡ又はその断片並びにベクター等 の“目的のＤＮＡ配列を含むＤＮＡＩ築物或いはその断片２を用い得る。遺伝子 ドナー株のものとは別の位置に目的の遺伝子を含むトランスホルマントを相同的 ドナー細胞として用い得る。受容株宿主としては、目的とするＤＮＡ配列の供給 源として用いた菌株と同じ株が好ましく、又はトランスホーメーションされたド ナー細胞の領域とは異なる領域に目的のＤＮＡ配列が存在している株が好ましい 。

選択を良好に行なうためには、プロトプラスト形成前に、又は形成の際に、細胞 毒性試薬でドナー細胞を死滅させることが好ましい、ドナー細胞を死滅させるた めに抗生物質を含む種々の試薬を用い得るがヨードアセトアミドは簡便で効率的 でしかも次工程の融合を阻害しないことが知られている。死滅後のクローニング 宿主プロトプラストを用いたときに受容株宿主に対する死滅プロトプラストの比 は少なくとも約１：１であることが好ましく、また死滅プロトプラストを過剰に 用いることもできる。

死滅ドナー細胞プロトプラストと受容宿主細胞プロトプラストとの融合の後にそ のトランスホルマントをマーカー遺伝子によって選択し得る０次にＤＮＡを上述 のようにして車離し分析し、該トランスホルマント即ちｌコピー以上の目的遺伝 子をそのゲノム中に組込んでいると共に、目的遺伝子が内在的染色体配列によっ て分別即ち離隔されている該トランスホルマントを同定することができる。

次いで、目的とするポリペプチドを多く発現することを検出するために、散在す る２つの遺伝子をもつトランスホルマントを適当な方法によりてスクリーニング する０種々の技術が使用されるが特にその検定法が確立している酵素が使われる 。或いは酵素を使用しないか有用な検出システムがない場合にはバイオアッセイ 、抗体、又はＤＮＡあるいはＲＮＡハイプリダイゼーシッンがそのクローンのス クリーニングに使われ、プラスミド構築物の存在及び目的とする構造遺伝子の発 現が測定される。

次に、染色体に組込まれたプラスミド構築物又はその断片を含む宿主細胞を慣用 の発酵条件下に普通培地中で生育させる。その培地が消毒されるまで発酵を続け る。産生物が分泌される場合にはその産生物を従来法例えば抽出、クロマトグラ フィ、電気泳動又は類似技術によって培地から単離する。産生物が細胞質内に保 持される場合には細胞群を遠心処理、濾過等により収穫し、機械的破壊、界面活 性剤、リゾチーム又は他の技法で溶解させ、前述のようにして産生物を単離する ０本発明方法を用いることにより少なくとも２コピーのＤＮＡ配列の安定な組込 みが遺伝子増幅手段として達成され得る。

次に示す例は説明のためであり、制限を意味するものではない。

符表千１−５０２３９８　（８） 例１ アルカリ親和性バチルス新種（ｎｏｖｏ　ｓｐ、　）ＰＢ　９２からのゲノムＤ ＮＡライブラリの調製及びセリンプロテアーゼ遺伝子の単離サイト−等［Ｓａｉ ｔｏ−Ｍｉｕｖａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ？　２（１９ ６３）６１９−６３２３により報告されている操作に従い、バチルスｎｏｖｏ　 ｓｐ、Ｐ　Ｂ　９２　（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ　ｖｏｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｉｅ。

Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ口ｅｌｆｔ、　ｔｈｅ　Ｎ ｅｔｈｅｒｌａｎｄに受託番号０Ｒ−６０号の下に保管されている；米国特許第 Ｒｅ、　３０．６０２号参照）から単離した染色体ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａ で部分消化し、ついでプラスミドｐＵＢ１１ＯのＢａｍ旧部位に連結させた［　 Ｇｒｙｃｚａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３４　（１９７ ８）　３１８−３２９〕。ｐＵＢ１１０プラスミドＤＮＡを文献記載ＣＢｉｒｎ ｂｏｉｍ　ａｎｄ　ロｏｌｙ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７　（１９７９ ）　１５１３−１５２３）の方法で調製した。

その連結混合物を、コンピテント細胞群１＋ｎ１当り０．６〜１μｇＤＮＡの条 件を用い文献記載［５ｐｉｚｉｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ。

８１　（１９６１）？４ｌ−７４６）の方法に従い、枯草菌ＩＡ４０　（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｒｅ　）ヘトランスホーメ ーションさせた。トランスホーメーション混合物由来の細胞を、２．８％に、Ｈ ＰＯ，，１，２％にＨ，ＰＯ，，０，４％（ＮＩｌ、）２ＳＯ，，０，２％クエ ン酸三ナトリウム・２Ｈ２０，０，０４％ＭｇＳ口、・７Ｈ，口、０．００００ ５％Ｍｎ５Ｏ，・４　Ｈ，口、０．４％Ｌ−グルタミン酸、０．５％グルコース 、０．０２％カザミノ酸、５０μｇ／ｍＡ）リプトファン、２０μｇ／ｍｌ！メ チオニン、２０ｕｇ／＋ｎｌリジン、２０μｇ／ｒｎ１ネオマイシン、０．４％ カゼイン及び１．５％寒天を含む最小プレートにブレーティング（平板培養）す る。３７℃で１晩そのプレートをインキュベーションした後に５０，０００個の ネオマイシン耐性コロニーのうちの１つに、寒天プレート中のコロニーのまわり のカゼイン分解産物沈殿のハロー（円輪）の増加により測定されるように、プロ テアーゼ産生の増加が見られ・た。プラスミドＤＮＡを文献記載［Ｂｉｒｎｂｏ ｉｍ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７　（１９ ７９）１５１３−１５２３）の方法に従いこのコロニーから単離してｐＨ５ｇと 命名した。

例２ ＰＢ９２セリン・プロテアーゼ遺伝子の発現ｐＭ５８を含む枯草菌ｌＡ４０を０ ．０２％カザミノ酸、５０μｇ／１ＩＩｌトリプトファン、２０μｇ／＋ｅｊ！ メチオニン、２０μｇ／ｒｒｒｌｌリジン及び２０μｇ　／ｒｎ　１２ネオマイ シンを添加した最小培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ４４　（１９５８）１０７２−１０７８３ 中で生育させた。２４時間後に培養物を遠心し、基質としてジメチルカゼインを 用いて、その上清のプロテアーゼ活性を検定した［　Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２４４（１９６９）７８９−７９３）。コントロー ルとして用いた、プラスミドｐｕＢ１１０を含む枯草菌ｌＡ４０の培養物は９Ｍ ５８によるトランスホルマントの培養物が示すプロテアーゼ活性の６０分の１以 下の活性を示した。プロテアーゼ活性は１ｍＭフェニルスルホニルフルオライド （ＰＭＳＦ）による処理で完全に阻害されたが、２０ａｌＭのＥＤＴＡによる処 理によっては阻害されなレムリーの方法（Ｌａｅａ＋ｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ２ ２７　（１９７０＞　６８０）に従い、上述の上清の部分標本をタンパク質ゲル で分析した。ゲルでの分析のための試料は５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）による 上滑の処理により調製された。この試料の遠心後に沈殿タンパク質のペレットを ア七トンで２度洗浄し、次いで１０分間、４０μｌのサンプルバッファ（試料緩 衝液）（０，５Ｍ）リス−塩酸、ｐＨ７，５，１０％ｖ　／　ｖ　２−メルカプ トエタノール、５０％ｖ　／　ｖグリセリン及び０．０５％プロモフェノールプ ルウ）中で煮沸することにより溶解させた。電気泳動後のゲルをクマシイブリリ アントブルウで染色した０次いで培養上清試料を電気泳動により分析した。３つ の別個の枯草菌ｌＡ４０株（ｐＬＩＢ１１０含有；又はｐＨ５８含有；又はプラ スミドなしの３株）を使用し、コントロールとしてバチルスＰＢ９２のプロテア ーゼを使用した。を気泳動後にそのゲルをクマシイブリリアントブルウにより染 色してから脱色させた。９Ｍ５８を含む枯草菌ｌＡ４０株由来のサンプルはバチ ルスＰＢ９２のプロテアーゼと共に泳動する３１ＫＤのタンパク質を含んでいた 。このタンパク質はｐＵＢ１１０含有の枯草菌ｌＡ４０のコントロールレーンに は検出されなかった。

全てのセリンプロテアーゼは同じ分子量をもっている。それゆえバチルスＰＢ９ ２のクローニングされたセリンプロテアーゼは、従来のセリンプロテアーゼ（枯 草菌ズブチリシン；カールスバーグズブチリシン）と異なることが、プロテアー ゼを含まない枯草菌ＤＢ１０４へのｐＨ５８及びｐＵＢｌｌｏのトランスホーメ ーシッン（Ｒ，Ｄｏｉ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６０　（１９８４） 　４４２−４４４〕により判明すると共に、産生された細胞外プロテアーゼの分 析により判明した。得られたトランスホルマントを０．０２％カザミノ酸、５０ μｓ　／　ｍ　ｉヒスチジン及び２０μｇ　／　ｗｈ　ｌネオマイシンを含む最 小培地（５ｐｉｚｉｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、上掲文献〕中で生育させた。２４時 間後に試料をとり、遠心後に、前処理なしに７５ｍ　Ｍ　ＫＯＨ，４０ｍ　Ｍヒ スチジン、１００　ｍＭＭＯＰｓ　（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホ ンｆｉ）　、ｐ）１７．５及び５％ポリアクリルアミドを含むヒスチジン／ＭＯ ＰＳゲルで分析した。４０ｍＭヒスチジン、１００　ｍＭ　ＭＯＰＳ　’（ｐＨ ６，６）　（７）電気泳動用ハフ　７７を用いた。試料はカソード側に移動する 。プロテアーゼバンドをＡｇｆａＰａｎ１００プロフェッショナルフィルムで検 出した（　Ｚｕｉｄｗｅｇｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　ａｎｄ　 Ｂｉｏｅｎｇｉｎ、１４　（１９７２）　６８５−７１４）、これらの結果を図 ３に示した０図４に示したようにｐＭ５８はバチルスＰＢ９２のプロテアーゼを コードする遺伝子を宿している。

■−主 バチルスＰＢ９２のセリンプロテアーゼ遺伝子のシクエンシング（配列形成） ２Ｍ５８のＢａ１ｌ　−Ｈｐａｌ断片の全配列を、サンガー法（Ｓａｎｇｅｒ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４　（１９７７）　 ６４６３）により決定した。２Ｍ５８の制限断片をファージＭ１３ベクターｍｐ ｌｏ、ｍｐｌ　１、及びｍｐｌＢ中にクローニングした（　Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、。

ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、９　（１９８１）　３０９　３２１）、　ｐ Ｍ５８断片の挿入物はプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニング された。シェクエンシングの後にその遺伝子上に一定の距離を保った位置の１０ 個のオリゴヌクレオチドを作り、シクエンシングを繰り返し、図５に示した配列 を確定した。

■−生 セリンプロテアーゼ含存プラスミドｐＭＡＸ−４の構築ｐＵｃＮ７１０（図６Ａ ）を構築するためにｐＵＢＩＪＯをＴａｇｌ及びＰｖｕ　ＩＩで消化した。ネオ マイシン耐性を有する遺伝子を含む断片を低融点アガロースで精製し、タレナウ ボリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　）とＮＴＰとを用いてプ ラントエンド（平滑末端）とした（　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ；　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ？Ｉａｎｕａｌ＋　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１９８２　）　＊プラスミドｐＵｃ７ＣＶｉｅｉ ｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅｌ　９　（１９８２）　２５９−２６８１を５ ａｌＩで線状化し、上述のようにプラントエンドとした。両断片をＴ４リガーゼ ［Ｍａｎｉａｔｉｓ　］で連結させ、大腸菌ＪＭ１０３にトランスホーメーショ ンさせた。５０Ｍｇ　／　ｍ　Ｉ！アンピシリン及び１０Ｍｇ／ａｊ！のネオマ イシンを含む２ｘＴＹプレート（１，６％Ｖ／Ｖバクトドリプトン、１％Ｗ／Ｖ イーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｊりで選択を行った。該プラスミドを ｐＵＣＮ７１０と命名し、このプラスミドをＢａｍ旧で消化した。プラスミドｐ Ｅ１９４　［Ｊｏｒｄａｎｓｃｕ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　１　（１９７８）　４６ ８−４７９１を９ａｌｌで消化した。画情化物由来の断片をＴ４１Ｊガーゼで連 結し、枯草菌ｌＡ４０にトランスホーメーションさせた。２０Ｍｇ／１ｌｉｌネ オマイシンを含む最小プレート（例１参照）で選択を行なった。得られたプラス ミドｐＥ１９４−ｎｅｏ　（図６Ａ）はネオマイシン遺伝子と、温度感受性の複 製オリジンとを含んでいる。

組込みベクターｐＥ１９４−ｎｅｏへのプロテアーゼ遺伝子のサブクローニング （５ｕｂｃｌｏｎｉＢ　）は次のようにして行なわれた：ｐＭ５８（例１参照） をＨｐａｌ及びＢａ１Ｉ及びＢａ１ｌＩで消化する。プラスミドｐＥ１９４−ｎ ｅｏをＨｐａ　Ｉで消化する。これらの断片をＴ４リガーゼで連結し、枯草菌ｌ Ａ４０ヘトランスホーメーシヨンさせた。このトランスホルマントはネオマイシ ン耐性及びカゼイン分解産物沈殿によって判断されるプロテアーゼ産生の増加（ ハロー形成、例１参照）に基づいて選択された。プラスミドｐＭＡＸ−４が得ら れ、その構造は制限酵素分析によって確認された（図６Ｂ参照）。

例５ ｐＭＡＸ−４による枯草菌ＰＢ９２のブロトプラストトランスホーメーション ハｆ）ＬスＰ　Ｂ　９２株を１００ｍＡ！（７）ＮＢＳＧ−Ｘ培地中に一晩生育 させた［　Ｔｈｏｒｎｅｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、９１　（ １９６６）１０１２−１０２０１．この培養物をツルパル（５ｏｒｖａｌｌ　） モデのバチルスを、０．４　ｒｒｒｇ／ｌａ　１のリゾチームを加えられた滅菌 水中の０．５　Ｍシコクロース、０．０２Ｍ　ＭｇＣ１＊及び０．０２Ｍ）リス ／マレイン酸塩（ｐＨ８，０）を含む１０ａ＋ｆのアルカリ保持培地（ＡＨＭ） 中に３７℃で１時間インキュベーションすることによってプロトプラストを調製 した。プロトプラストをペレット化しく４．５０Ｏｒｐｍ、１０分間）、５ＩＩ ｌｌのＡＨＭ″″ｐＨ８，０バツフア〔３，５％Ｗ／Ｖバクトペナセイブロス及 び０．０４％Ｗ／Ｖアルブミン・メリュウ（Ａｌｂｕｓｉｎｅ　Ｍｅｒｉｅｕｘ 　）を添加したＡＨＭバッファ〕に懸濁させ、混合してから再び上述のようにし てペレット化した。

５、Ｏｎ＋４！のアルカリ保持培地に再懸濁した後にこのプロトプラスト懸濁液 ０．５ｍｊ２を、１ＩｇのプラスミドＤＮＡを含む５μｇの脱イオン水と混合し 、３０％Ｗ／Ｖポリエチレングリコール８、　ＯＯＯ（ｐＨ８，０）の存在下に ２分間インキュベートした。Ａ）１１４”（ｐＨ８，０）培地を用いて１：３に 希釈し、次いで遠心した後にそのペレットを少量（ｌａｆ）のＡＨＭ’−に懸濁 させ、さらに２〜３時間インキュベートした。１００マイクロリツトルの部分標 本を、０．５Ｍコハク酸ナトリウム／ＨＣ１（ｐＨ８，０）　、１．５％ｗ／ｖ 寒天、０．５％Ｗ／Ｖカザミノ酸、０．５％Ｗ／Ｖイースト・エクストラクト、 ０．０３１Ｍリン酸バッフｙ　（ｐＨ８，０）　、０．５％Ｗ／ｖグルコース、 ０．０２　ＭＭｇＣｆ　＊及び０．０２％ｗ　／　ｖアルブミン・メリニウを含 む新規調製の再生プレートにブレーティングした。

また、これらのプレートを選択に用いる場合には１０００μｇ／−ｌのネオマイ シンを添加する。３７℃で、少なくとも７２２時間インキュベーションた後にそ のコロニーについて２０Ｍｇ／ｍｌプレートを用い、レプリカ−プレーティジグ （ｒｅｐｒｉｃａ−ｐｌａｔｅｄ　）バチルスＰ８９２株染色体へのｐＭＡＸ− ４の組込みプラスミドｐＭＡＸ−４を含む“バチルスＰＢ９２のトランスホルマ ント１を、１Ｉｇ／ｓ＋４！又は２０Ｍｇ／霧ｌのネオマイシンを含むトリプト ンソーヤブロス（ＴＳＢ）中で３７℃に２４時間インキユベーシヲンする。この 細胞サスペンションの２−ｌを夫々１μｇ又は２０Ｍｇ／ｍｌのネオマイシンを 含むＴＳＢ　１００−ｌで希釈し、５０℃で２４時間インキュベートする。２４ 時間後に両塔養液の各５請ｌを上述のように再び希釈し、それぞれｌμｇ　／ｗ ＩＩｔ又は２０Ｍｇ　／　ｍ　ｐのネオマイシンの存在下で再び５０℃で２４４ 時間インキュベーションる。この最後の操作をもう１度繰返す０次にこの細胞サ スペンションを１００倍に希釈し、１Ｉｇ／ｓｊ！ネオマイシンを含むフラスコ 由来の試料については１Ｉｇ　／　ｍ　ｌネオマイシンを含むハートインフュー ジョン（Ｈｌ）寒天プレートに、他方において２０Ｍｇ　／　ｍ　１ネオマイシ ンを含むフラスコ由来の試料については、２０Ｍｇ　／−１ネオマイシンを含む プレートにブレーティングした。これらのプレートを５０℃で１６時間、インキ ュベートする。ネオマイシン耐性コロニーを単離し、１Ｉｇ　／　＠　１ネオマ イシンを含む１０−ｌのＴＳＢ培地中、３７℃で１６時間培養した。これらの培 養物から全ＤＮＡを単離した（　Ｈｏ１ｓｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、１１４　（１９８１）１９３−１９７）、プラスミドの不存在は アガロース・ゲルでのＤＮＡの電気泳動で確められた。プラスミドＤＮＡが検出 されなかった試料にプラ不ミドＤＮＡが不存在であることは、全ＤＮＡを枯草菌 ｌＡ４０にトランスホーメシヨンすることによって確認された。枯草菌ｌＡ４０ をトランスホーメシヨンさせ得ない試料はプラスミド不含有であると考えられた 。

染色体中へのｐＭＡＸ−４の組込みの有無及びその経緯をチェックするために、 染色体ＤＮＡを単離し、旧ｎｄＩ［［で消化させた後に０．５％ＤＮＡアガロー スゲルで電気泳動させ、ニトロセルロースにブ０７テイング（５ｏｕｔｈｅｒｎ 、　Ｊ、　Ｍａｔ、Ｒｉａｌ、９８　（１９７５）５０３−５１７）してから３ ２ｐラベルを付し、ニックトランスレーションを行なったｐＭ５８　［Ｍａｎｉ ａｔｉｓ、　１９８２］を用いてハイブリダイゼーションさせた。この分析結果 を図７Ａに示した。

１μｇ　／　ｒａ　１ネオマイシンでの選択を行ない、相同的組換えの結果（カ ンベル型メカニズム）として“染色体中にタンデムに配置され、かつプラスミド 配列（ＰＢＴ１０９株）で分離されたプロテアーゼ遺伝子”が得られた。３０個 の個別に単離された組込み体について、選択は１μｇ　／　ｍ　１ネオマイシン を用いて行なわれた。非正統的組換えの結果、染色体中にランダムに位置するプ ラスミドｐＭＡＸ−４を含むひとつの組込み体が得られた。２０μｇ　／ｒａ　 ｊ！ネオマイシンによる選択で非正統的組換えを行なった結果染色体上にランダ ムに位置するプラスミドｐＭＡＸ−４の１コピーが生じた。後者の株はＰＢＴ１ ０８と命名された。ＰＢＴ１０９及び１０８の遺伝子構成を図７Ｂ及び７Ｃに示 した。染色体分析の結果により、ＰＢＴ１２２及びＰＢＴ１０８における組込み は染色体中の異なる位置に生じていることが示された。

例７ ＰＢＴ１０８及びＰＢＴ１０９における複製されたプロテアーゼ遺伝子の安定性 ５００ｍＡの振盪フラスコ中のネオマイシン不含有の１００ｍｊ！の産生用培地 （１％デンプン、４％ラクトース、０．８７％に、１ＩＰＯ，，０，５％イース トエキストラクト、０．５％（ＮＩｌ、）ＪＰＯ４，０，２％クエン酸トリナト リウム・２Ｈ７０，０，０５％Ｍｇ５Ｏｓ・７■２０．０．０７％ＣａＣｊ！２ ．０．０６８％Ｆｅ５Ｏ−・７ＬＯ及び消泡剤ｌｌｌ１ｌｌ／１を含む）をＰＢ Ｔ１０８またはＰＢＴ１０９のＴＳＢの一晩培養物（３７℃）の０．２ｍＡ中で インキュベートした。一定通気の下、３７℃で４４時間のインキュベーションの 後にその培養物についてネオマイシン耐性コロニー及びプロテアーゼ活性のテス トをした。

ＰＢＴ１０８及びＰＢＴ１０９の両株を１０１の大量製造の効果をチェックする ため、同じ産生培地を含むエシュワイラ−（Ｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ　）発酵器を 用いるテストをも行なった。この発酵実験の結果を表１に示す。

表１ （注）＊リン等（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２４ ４　（１９６９）７８９−７９３）の記載に従い、基質としてジメチルカゼイン を用いてプロテアーゼ活性を検定した。

２日間の培養後にＰＢＴ１０９のエシュワイラー発酵由来のコロニー分析を行な ったところ、それらコロニーの３〜２５％が唯一のプロテアーゼ遺伝子を含む株 のレベルの産生を行なうことを示した。これらの同じコロニーは、相同的組換え によるｐＭＡＸ−４配列の切除にもとづき、ネオマイシン感受性であることが分 った。しかしＰＢＴ１０８発酵実験由来のコロニーの分析では、これら細胞全て がネオマイシン耐性であることが示された。１００個のこれらネオマイシン耐性 コロニーをランダムに取り、それらがもつ生産的プロテアーゼ遺伝子が１つか２ つかを決めるため、プロテアーゼ産生能を個々にテストした。テストされた個々 の１００個のコロニーの全ては２個の遺伝子を含む株と同じレベルの産生を行な ったがこのことは、ＰＢ７１０８中にランダムに組込まれた２つの遺伝子はこの 発酵条件下で安定に維持されていることを示している。

勇−主 組込みベクターｐＥ１ａｔＢの構築 ＥＰＡＯ１３４０４８号明細書記載のプラスミドｐＧＢ３４を、制限酵素Ｂｃｌ 　Ｉ　、　Ｂｇｌ　１及びＢｇｌ　ＩＩの使用によって消化した。得られる制限 断片を、タレナウボリメラーゼでプラントエンドとし、次にｐＥ１９４−ｎｅｏ （例６参照）のＨｐａ　１部位に連結させた。

プラスミドｐＥ１９４−ｎｅｏＤＮＡＯ単離はバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉ− ）及びドリー（Ｄｏｌｙ　）の方法（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　７ （１９７９）１５１３−１５２３３に従って遂行された。

この連結混合物を、コンピテント細胞のｌ驕ｌ当り０．５〜１μｇＤＮＡを用い 、スピチゼン（５ｐｉｚｉｚｅｎ　）法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８１（ １９６１）７４１−７４６）に従って枯草菌ｌＡ４０にトランスホーメーシッン させた。このトランスホーメーション混合物由来の細胞群を２．８％に！ＨＰＯ い１．２％ＫＨｔＰＯａ、０．４％（ＮＨ４）ＩＳＯ３，０，２％クエン酸トリ ナトリウム・２Ｈ２０，０，０４％Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ１０、ｏ、　ｏ　ｏ　ｏ　 ｏ　ｓ％Ｍｎ５Ｏａ　・４ＨｚＯ１０，４％グルタミン酸、０．５％グルコース 、０．０２％カザミノ酸、５０μｇ／ｍＡ！）リブトファン、２０μｓ／ｓｊ！ メチオニン、２０　ｔｔ　ｇ／ｍ、Ｉｌリジン、２０μｇ／ｍ１１ネオマイシン 、０．４％カゼイン、０．５％デンプン及び１．５％寒天を含む最小プレートに ブレーティングした。バーンボイムードリー法に従って、α−アミラーゼ産生コ ロニーのＤＮＡを単離し、制限酵素でチェックした。これらのトランスホルマン トの１つからプラスミドｐＥ１ａｔＢ　（図８参照）を単離した。

例９ α−アミラーゼ不含有のバチルスリへニホルミスＴ９株のｐＥｌａｔＢによるト ランスホーメーション全操作を３７℃の代りに３０℃で行うことの他は、ＥＰ− Ａ−０２５３４５５号明細書記載の方法に従って、バチルスリへニホルミスＴ９ 株のトランスホーメーションを行なった。トランスホルマントの選択は２０μｇ 　／　ｍ　ｊ’ネオマイシンを含む最小プレートで行なわれた。全てのトランス ホルマントは、アミラーゼを産生じた。バーンボイムードリー法によって調製さ れたＤＮＡについて行なった制限酵素分析は全てのトランスホルマントがｐＥｌ ａｔＢを含むことを示した。

例１０ Ｂ、リヘニホルミスＴ９染色体へのｐ　Ｅ　１ａｔＢの組込みプラスミドｐＥ１ ａｔＢを含むバチルスリヘニホルミスＴ９株を、２０μｇ　／ｒｎ　１２ネオマ イシンを含むトリプトンソーヤブロス（ＴＳＢ）に接種し、３０℃で１６時間イ ンキュベーションした。この細胞サスペンション５ｔｎｌを、同培地１００ｇ＋ ｆで希釈し、５０℃で２４時間インキュベーションした。

１００倍に希釈し、１０μｇ　／　ｍ　Ｉｌネオマイシンを含むハートインフュ ージョン寒天プレートにブレーティングした。５０℃、４０時間のインキュベー ションの後にネオマイシン耐性コロニーを単離し、ネオマイシン１０μｇ／ｍｌ を含む１（１＋４！（ＤＴＳＢ培地中、３０℃で１６時間培養した。これら培養 物の全ＤＮＡを単離した（　Ｈｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、；　Ａｎａｌ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　１１４　（１９８１）１９３−１９７）、これらの細胞群はプラ スミドを有していないことがアガロースゲルを用いたＤＮＡ電気泳動で確められ た。低分子量のＤＮＡを事実上音まない試料については、枯草菌１−Ａ４０への ＤＮＡ　）ランスホーメーションにより（５ｐｉｚｉｚｅｎ　ｅｔａｌ、、　１ ９６１）プラスミドＤＮＡの不存在を再チェックした。枯草菌１−Ａ４０をネオ マイシン耐性菌ヘトランスホーメーションさせ得ない試料はプラスミドを含まな いものと考えられた。

ｐＥＩａｔＢの組込みが起きたかどうか、及びそれがどのように起きたかをチェ ックするため、染色体ＤＮＡをトランスホルマントから単離しく　Ｓａｉｔｏ− Ｍｉｎｗａ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ７２（１９６３ ）６１９　６３２）、ＥｃｏＲＩで消化し、０．５％アガロースゲルで分画した 後にニトロセルロースにプロンティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、９８　（１９７５）　５０３−５１７）としてから３！Ｐでラベル され、ニックトランスレーションされたｐＧＢ３３を用いてハイブリダイゼーシ ョンさせた（ＥＰ−Ａ−０１３４０４８参照〕、この分析結果を図９Ａに示した 。このデータは、ｐ　ＥｌａｔＢの非正統的組換えが起こり、本来のバチルスリ ヘニホルミスＴ５アミラーゼ株と比べ、そのゲノムの異なる位置に唯一のアミラ ーゼ遺伝子を含む株が生成したことを示している。このｐＥｌａｔＢを含む株を ＴＥ０１と命名した。

貫−１上 内在性染色体配列によって分離された２つのアミラーゼ遺伝子を含むＴ１３Ｆ株 の構築 内在性の染色体ＤＮＡ配列によって分離された２つのアミラーゼ遺伝子を含む株 を開発するため、バチルス・リヘニホルミスＴ５株（本来のアミラーゼ遺伝子を 含むアミラーゼ株；ＥＰ−Ａ−０１３４０４８参照）と、Ｔ８１３株（ランダム に組込まれたアミラーゼ遺伝子を含む株）との間で融合を行なわせた。プロトプ ラスト融合はＥＰ−Ａ−０１３４０４８号の方法に従って行なわれたが該方法は 本明細書中に引用されている。プロトプラスト形成前にＴＢ１３菌株をヨードア セトアミドで死滅させた。１５株（ネオマイシン感受性）はこれを死滅させなか った。融合体の選択は、１０μｇ　／　ｍ　１２のネオマイシンを含む再生プレ ートの使用で行なわれた。

潜在的融合体をチェックし及び同定するために、染色体ＤＮＡを単離し、Ｅｃｏ ＲＩで消化し、０．５％アガロースゲルによる分画後、ニトロセルロースフィル ターにプロンティンｆ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ。

ＪｌＭｏｌ、Ｂｉｏｌ　９８　（１９７５）　５０３−５１７）、Ｌ、た後に″ ２ＰラベルのニックトランスレーションしたｐＧＢ３３を用いてハイブリダイゼ ーションさせた（ＥＰ−Ａ−０１３４０４８参照）。

この分析結果を図９Ｂに示す。得られた融合体のひとつ、即ちＴ１３Ｆは、内在 性染色体配列で分離された２個のアミラーゼ遺伝子を含んでいた。

例１２ ＴＳＢ０及びＴｌ　ａＦ株中の重複したアミラーゼ遺伝子の安定性 “本質的な染色体配列によって分離された２つの染色体アミラーゼ遺伝子を含む Ｔ１３Ｆ株”の安定性を、タンデムに位置する２つの染色体アミラーゼ遺伝子を もつ１３９０株の安定性と比較した。１３９０株の調製法はＢ、リヘニホルミス Ｔ５　（ｐＧＢ３３）を記載しているＢＰ−Ａ−１３４０４８号明細書（第１７ 頁第１表）に開示されている。Ｔｌ３Ｆ及び７３９０株を発酵条件下でテストし た。すなわち０．２ｍｊのＴＳＢの１晩培養物（３７℃）を、ネオマイシンを含 まない１００ｍｌの産生用培地（例７参照；滅菌後にｐＨをＮａＯＨでｐｏｓ、 ｓに調整）を有する５００園！振盪フラスコに接種した。定常通気を行ない、４ ０℃で６日間のインキュベーションの後にこの培養物についてネオマイシン耐性 コロニー形成及びアミラーゼ活性のテストを行なった。この発酵実験の結果を表 ２にまとめた。

注＊１菌株当り１０００個以上のコロニーについてテストした。

ＴＩ　３Ｆ株中のネオマイシン遺伝子の付随的なロスを伴うことなく、ひとつの アミラーゼ遺伝子の切除の可能性を排除するため、Ｔｌ３Ｆ発酵由来の２０個の コロニーを分析した。ランダムに選択された２０個のコロニーから由来する染色 体ＤＮＡを阜離し、た、これらの分析対象のうちの９個についての結果を図１０ に示した。テストされた全ての株は２個のアミラーゼ遺伝子を含んでいたがこの ことはそれら染色体ＤＮＡ中で２個のα−アミラーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断 片の存在によって判明するのである。

Ｔ１３Ｆ株の遺伝的安定性とは対照的に、１３９０株は発酵に際し不安定であり 、１２％のネオマイシン感受性コロニーを生じた。これらのコロニーのひとつを 分析するとひとつのα−アミラーゼ遺伝子しか含んでいないことが分った（図１ ０、レーン４）。

このことは即ち、ランダムに組込末れたアミラーゼ遺伝子は発酵条件下で、タン デムに組込まれた遺伝子よりも安定であることを示している。

上記の結果から“増幅されるべき構造遺伝子の少なくとも２コピーの非タンデム 組込みが細胞内で起ったトランスホーメーションされた該細胞”を選ぶことで“ 安定な遺伝子増幅が達成される原核細胞”が得られることが明らかになった０組 込みは相同的組換え又は非正続的組換えで達成される。

本明細書で述べられている全ての刊行物及び特許出願書類は、本発明が関係する 分野の技術者のレベルで示されている。全刊行物及び特許出願書類は、個々の刊 行物又は特許出願が特別に個々に参考として引用しているのと同じ程度にここで も参考として引用されている。

本発明は本明細書中に十分に記述されているので、本発明の精神又は範囲を逸脱 することなしに、これに変化及び修正を施し得ることは通常の知識をもつ当業者 にとって明らかであろう。

ＦＩＣＵＲｔ　１ ん　キャンベル型組換え Ｄ・　非正統的組換えによる組込み ＦＩＣＵＲｔ　ｌ　（ｃｏｎｔｎ’ｄ）Ｆ工ＧＵＲＥ　２ ＦＩＣＵＲｔ　２　（ｃｏｎｔｎ’ｄ）１．２．３．４．５゜ Ｆ工ＧＵＲＥ ＦＩＧＵＲＥ　７Ａ ＦＩＧＵＲＥ　７Ｂ 特表千１−５０２３９８　（１５） 組込みベクター　ｐＥｌａｔＢ　の　構　築Ｂ、枯草菌　１−Ａ、４０への形質 転換と、ＮＥＯ’　ＡＭＹ’による選択Ｆ工ＧＵＲＥ 国際調査報告 −−＾、、に、ｍ、、　ＰＣＴ／ＮＬ　８８１００００６国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の少なくとも２コピーを 染色体中に含み、核少なくとも２コピーのＤＮＡ配列は内在性染色体ＤＮＡ配列 によって離隔されているものである形質転換された原核性宿主細胞。 （２）目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の少なくとも２コピーを 染色体中に含み、該少なくとも２コピーのＤＮＡ配列は内在性染色体ＤＮＡ配列 によって離隔されているものである形質転換された原核性宿主細胞であって、該 細胞が下記諸工程： （ｉ）目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の少なくとも１コピーを 染色体中に組込んで有している受容宿主細胞と、（ａ）上記ＤＮＡ配列の少なく とも１コピー及び少なくとも１個のマーカー遺伝子並びに温度感受性複製オリジ ンを含むＤＮＡ構築物又は（ｂ）上記ＤＮＡ構築物を含むドナー宿主細胞とを形 質転換を行なわせる条件下で結合させ；（ｉｉ）上記ＤＮＡ構築物が形質転換体 の染色体に組込まれた核形質転換体を選択し； （ｉｉｉ）内在性ＤＮＡ配列によって離隔されている上記ＤＮＡ配列の少なくと も２コピーを含む形質転換された原核性宿主細胞を上記形質転換体の中から単離 する 各工程を含む方法によって製造された細胞であることを特徴とする前記の形質転 換された原核性宿主細胞。 （３）原核性細胞がバチルス属菌株である請求の範囲（１）又は（２）記載の形 質転換された原核性宿主細胞。 （４）バチルス属菌株がアルカリ親和性バチルス属菌株又はバチルスリヘニホル ミス宿主株である請求の範囲（３）記載の形質転換された原核性宿主細胞。 （５）アルカリ親和性バチルス属菌株がバチルス新種ＰＢ９２又はその突然変異 株もしくは変異株である請求の範囲（４）記載の形質転換された原核性宿主細胞 。 （６）バチルスリヘニホルミス宿主株がバチルスリヘニホルミスＴ５株又はその 変異株である請求の範囲（４）記載の形質転換された原核性宿主細胞。 （７）目的とするポリペプチドが酵素である請求の範囲（１）又は（２）記載の 形質転換された原核性宿主細胞。 （８）酵素がタンパク質分解酵素或いはデンプン分解酵素である請求の範囲（７ ）記載の形質転換された原核性宿主細胞。 （９）タンパク質分解酵素がセリンプロテアーゼである請求の範囲（８）記載の 形質転換された原核性宿主細胞。 （１０）セリンプロテアーゼが実質的に次に示すアミノ酸配列：【配列がありま す】 を含む請求の範囲（９）記載の形質転換された原核性宿主細胞。 （１１）デンプン分解酵素がα−アミラーゼである請求の範囲（８）記載の形質 転換された原核性宿主細胞。 （１２）バチルス新種ＰＢ９２又はその突然変異株或いは変異株の染色体が上記 ＤＮＡ配列を含む請求の範囲（１）又は（２）記載の形質転換された原核性宿主 細胞。 （１３）バチルスリヘニホルミスＴ５株又はその突然変異株或いは変異株が上記 ＤＮＡ配列を含む請求の範囲（１）又は（２）記載の形質転換された原核性宿主 細胞。 （１４）形質転換された原核性宿主細胞の染色体中で内在性染色体配列によって 離隔された少なくとも２コピーの目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を 含む該形質転換された原核性宿主細胞を製造する方法において、 （ｉ）目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の少なくとも１コピーを 染色体中に組込んで有している受容宿主細胞と、（ａ）上記ＤＮＡ配列の少なく とも１コピー及び少なくとも１個のマーカー遺伝子並びに温度感受性複製オリジ ンを含むＤＮＡ構築物又は（ｂ）上記ＤＮＡ構築物を含むドナー宿主細胞とを形 質転換を行なわせる条件下で結合させ；（ｉｉ）上記ＤＮＡ構築物が形質転換体 の染色体に組込まれた該形質転換体を選択し； （ｉｉｉ）内在性ＤＮＡ配列によって離隔されている上記ＤＮＡ配列の少なくと も２コピーを含む形質転換された原核性宿主細胞を上記形質転換体の中から単離 する各工程を含むことを特徴とする上記の方法。 （１５）選択が下記工程： （ｉ）マーカー遺伝子を含むＤＮＡ構築物を有する形質転換体を、上記マーカー 遺伝子によって対毒物耐性が与えられる該毒物の存在下で生育させ； （ｉｉ）上記形質転換体からプラスミド不含有の形質転換体を同定し、単離する 各工程を含む請求の範囲（１４）記載の方法。 （１６）選択が下記工程： （ｉ）マーカー遺伝子及び温度感受性複製オリジンを含むＤＮＡ構築物を有する 形質転換体を非許容温度で毒物存在下に生育させ； （ｉｉ）該形質転換体の中からプラスミド不含有の形質転換体を選択する 各工程を含む請求の範囲（１４）記載の方法。 （１７）単離が下記工程： （ｉ）形質転換体から染色体ＤＮＡを単離し；（ｉｉ）該染色体ＤＮＡを、上記 ＤＮＡ構築物又はその断片を含むラベル付きのプローブと交雑させ、かようにし て、ラベルを検出することによって形質転換された原核性宿主細胞を選択する； 各工程を含む請求の範囲（１４）記載の方法。 （１８）ドナー宿主細胞を調製する操作が下記工程：（ｉ）目的とするポリペプ チドをコードするＤＮＡ配列を欠く原核性細胞と上記ＤＮＡ構築物とを融合条件 下で結合させ；（ｂ）形質転換細胞を単離し； （ｃ）形質転換細胞を非許容温度下で生育させ；（ｄ）ＤＮＡ構築物が受容宿主 細胞の染色体上で異なる位置に組込まれている形質転換細胞を同定し、単離する 各工程を含む請求の範囲（１４）記載の方法。 （１９）原核性細胞がバチルス属の細胞である請求の範囲（１４）〜（１８）の いずれか１項記載の方法。 （２０）バチルス属の細胞がアルカリ親和性バチルス属菌株もしくはＢ．リヘニ ホルミス株である請求の範囲（１９）記載の方法。 （２１）アルカリ親和性バチルス属菌株がバチルス新種ＰＢ９２であり、Ｂ．リ ヘニホルミス株がＢ．リヘニホルミスＴ５株である請求の範囲（２０）記載の方 法。 （２２）目的とするポリペプチドが酵素である請求の範囲（１４）〜（２１）の いずれか１項記載の方法。 （２３）酵素がセリンプロテアーゼ又はアミラーゼである請求の範囲（２２）記 載の方法。 （２４）セリンプロテアーゼがバチルス新種ＰＢ９２由来のタンパク質分解酸素 をコードする遺伝子にもとづく酵素と、ヌクレオチド配列において少なくとも７ ０％の相同性を有する請求の範囲（２３）記載の方法。 （２５）セリンプロテアーゼが実質的に次に示すアミノ酸配列：【配列がありま す】 を有する請求の範囲（２３）又は（２４）記載の方法。 （２６）ＤＮＡ構築物がｐＭＡＸ−４又はｐＥｌａｔＢである請求の範囲（１４ ）〜（２５）のいずれか１項記載の方法。 （２７）ＤＮＡ配列が非正統的組換えによって組込まれる請求の範囲（１４）〜 （２６）のいずれか１項記載の方法。 （２８）ＤＮＡ配列が相同的組換えによって組込まれる請求の範囲（１４）〜（ ２６）のいずれか１項記載の方法。 （２９）ＤＮＡ構築物が温度感受性の複製オリジンをさらに含む請求の範囲（１ ４）〜（２６）のいずれか１項記載の方法。 （３０）温度感受性ブラスミドがプラスミドｐＥ１９４からみちびかれる請求の 範囲（２９）記載の方法。 （３１）バチルスＰＢＴ１０８、ＰＥＴ１２２又はＴ１３Ｆ。