FI104326B - Transformoidut prokaryoottiset isäntäsolut - Google Patents

Description

104326

Transformoidut prokaryoottiset isäntäsolut -Transformerade prokaryota värdceller Tämän keksinnön aiheena ovat prokaryoottiset solut, joissa aikaansaadaan stabiilin geenin vahvistuminen siten, että vähintään kaksi kopiota määrätystä DNA-sekvenssistä integroituu sanotun prokaryoottisen solun kromosomiin "hajautetun toisiinsa liittymättömän integraation" avulla (scattered non-tandem integration).

Bacillus-lajeja on käytetty laajalti teollisesti tärkeiden entsyymien kuten alfa-amylaasin, neutraalin proteaasin ja alkalisten proteaasien tai seriiniproteaasien tuotannossa (vrt. Debabov, "The Industrial Use of Bacilli"; kirjassa "The Molecular Biology of Bacilli", Academic Press, New York, 1982). Bacillus-lajien entsyymituotannossa voidaan aikaansaada parannuksia sekä perinteisten geeniteknologisten menettelytapojen kuten mutatoinnin ja sitä seuraavan valikoinnin tai sitten nykyaikaisten molekyylibiologian piiriin kuuluvien menettelytapojen avulla. Viimemainittuun liittyen on dokumentoitu perusteellisesti useita tapoja homologisten ja heterologisten geenien korkeiden ilmentymistasojen saavuttamiseksi geenimanipuloinnin avulla tietyissä prokaryoot-tisissa ja eukaryoottisissa mikro-organismeissa.

— Eräs lähestymistapa jonkin geenin korkean ilmentymistason saavuttamiseksi on geenin varustaminen tehokkailla säätösek-vensseillä. Toisen lähestysmistavan mukaan, jota käytetään usein ensimmäiseen lähestymistapaan liittyen, kyseisen geenin kopiolukua nostetaan. Vahvistuminen aikaansaadaan pääasiassa insertoimalla kyseinen geeni monikopioituvaan kromosomin ulkoiseen DNA-sekvenssipalaseen kuten plasmidiin. Merkittävä huono puoli plasmidien käytössä vektoreina geneettisen tiedon ilmaisemiseksi ja vahvistamiseksi on kuitenkin ollut niiden stabiilisuuden puute. Teollisen mittakaavan tuotantoa varten vahvistetun geenin stabiilisuus on 2 104326 välttämätön edellytys vahvistetun geenin koodaaman ilmentä-mistuotteen korkean tuotantotason ylläpitämiseksi, sillä tarvitaan useita solujakaantumisia ennen kuin on muodostunut riittävästi biomassaa huomattavan tuotemuodostuksen saavuttamiseksi.

Epästabiilisuutta esiintyy kahdessa muodossa: segregaatio-epästabiilisuus, jossa tapahtuu plasmidihävikkiä viljelyn aikana; ja rakenne-epästabiilisuus, jossa osa plasmidista deletoituu. Segregaatioepästabiilisuutta voi ilmetä esimerkiksi isäntäsolun sisältäessä yli-ilmentyvän geenin käsittävän vektorin. Yleensä tällöin esiintyy valikointipainetta solujen valikoitumiseksi, jotka ovat menettäneet kykynsä yli-ilmentää kyseistä geeniä, sillä yli-ilmentyminen on transformoidulle isäntäsolulle epäedullinen ominaisuus. Suuri määrä metabolienergiaa kuluu yli-ilmentyvään geenituot-teeseen, millä on kielteinen vaikutus solun kilpailukykyyn (kasvunopeuteen) verrattuna isäntäsoluihin, jotka eivät ole samalla tavalla yli-ilmentäviä.

Eräs segregaatioepästabiilisuuden vastustamiseksi käytetty menetelmä on valikoida solut, jotka sisältävät monikopio-plasmideja, jotka puolestaan sisältävät plasmidin sisältävälle solulle edun tuottavia geenejä, esimerkiksi antibioottiresistenssin tuottavia geenejä, jolloin käymislietteeseen lisätään kyseistä asiaankuuluvaa antibioottia. Yleensä antibiootit eivät kuitenkaan ole suuren mittakaavan kaupallisissa tuotantoprosesseissa käyttökelpoinen valikointikeino johtuen käymisprosessin tai itse tuotteen hyväksymistä koskevista säädöksistä.

Toinen segregaatioepästabiilisuudesta johtuvan plasmidihävi-kin minimoimiseksi käytetty menetelmä on insertoida vektori-molekyyliin jokin geeni, joka on isäntäsolulle funktionaali-sesti välttämätön (Ferrari et ai., Biotechnology 3 (1985) 3 104326 1003-1007). Tämä menetelmä ei kuitenkaan takaa vektorin rakenteellista stabiilisuutta.

Rakenteellisen plasmidiepästabiilisuuden muodostaman ongelman ratkaisemiseksi käytettyjä menettelytapoja ovat olleet kyseisen geenin ilmentymisen välttäminen eksponentiaalisen kasvun vaiheessa esimerkiksi säätösekvenssejä kuten lämpö-tilaherkkiä säätösekvenssejä kuten lämpötilaherkkiä säätö-sekvenssejä käyttämällä, sekä eksogeenisen DNA:n integroiminen isäntäsolun kromosomiin. Muita käytettyjä menetelmiä ovat olleet itsenäisesti toisiintuvien vektorimolekyylien käytön välttäminen, jolloin sen sijaan käytetään menettelytapoja, jotka suosivat siirrettävän DNA:n integroitumista isäntäsolukromosomiin.

Menetelmiä, joilla saadaan aikaan vieraan DNA:n integroituminen isäntäsolun kromosomiin ovat olleet homologinen rekombinaatio ja epäsäännöllinen (illegitimate) rekombinaatio. DNA-sekvenssien insertoimiseksi kromosomiin spesifisiin si-jaintikohtiin homologisen rekombinaation avulla on olemassa kaksi tapaa: Campbell-tyyppinen homologinen rekombinaatio ja kaksinkertainen käänteinen rekombinaatio, jotka on esitetty kuviossa IA ja vastaavasti IB. Kolmas tapa DNA-sekvenssien viemiseksi kromosomiin on esitetty kuviossa 1C, jolloin tässä menetelmässä käytetään kaksivaiheista korvausmekanismia. Periaatteessa käytetään Campbell-tyyppistä rekombinaatiota, mutta lopputuloksena saadaan kromosomi-järjestäytyminen, joka ei sisällä kahdentuneita sekvenssejä, eikä täten vahvistumisyksikköä, kromosomin rekombinaatio-osassa. Sen vuoksi se muistuttaa kaksinkertaista käänteistä : rekombinaatiota.

Paitsi homologisen rekombinaation käyttöä vieraan DNA:n integroimiseksi kromosomiin DNA:n integroiminen epäsäännöllisellä rekombinaatiolla on niinikään mahdollista. Integroitu- 4 104326 neet vektorimolekyylit voidaan valikoida esiin olosuhteissa, jotka estävät ei-integroituneiden vektorimolekyylien itsenäisen toisiintumisen. Epäsäännöllisen rekombinaation käyttöä integraation suorittamiseksi kuvataan kuviossa ID. Toisiinsa liittyvien peräkkäiskahdentumisien (tandem duplication) puuttuminen saaduista kromosomisekvenssijärjestäyty misistä tekee kuvioissa IB, 1C ja ID esitetyistä reiteistä edullisia DNA-sekvenssien viemiseksi genomiin stabiilisti. Kromosomi-integroituihin geeneihin on lukeutunut sekä homologisia että heterologisia geenejä, jolloin kromosomi-integroituneen DNA:n vahvistuminen on tapahtunut peräkkäisjärjestelynä. Näiden kromosomin mukana vahvistettujen sekvenssien on ilmoitettu olevan epästabiileja, vaikkakin stabiili-suuteen on ilmoitettu päästyn joissain tapauksissa. Tämän vuoksi on toivottavaa kehittää menetelmiä, joiden mukaan kromosomiin integroitunut DNA säilyy stabiilina.

Eksogeenisen DNA:n integroimista homologisen rekombinaation avulla Bacillus subtilis-kromosomiin ovat kuvanneet Duncan et ai., Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 75 (1978) 3664-4668 ja

Anacystis nidulansin osalta Williams ja Szalay, Gene 24 (1983) 37-51 sekä kansainvälinen patenttihakemus julkaisu WO 84/00381. Heterologisen geenin, jota ei voida säilyttää stabiilina kuljetuksen tapahtuessa plasmidivektorissa, integroimista homologisen rekombinaation avulla jonkin mikro-organismin kromosomiin on kuvattu EP-hakemusjulkaisussa 0127328.

Sekä homologisten että heterologisten kromosomiin integroitujen geenien vahvistaminen on dokumentoitu. Katso esimer-kiksi: Saito et al^., "Proceedings of the Fourth International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms", Kioto, Japani, 1982, ss. 125-130; Young; J. Gen. Microbiol.

130 Bacteriol. 161 (1985) 589-595; Gutterson ja Koshland, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80 (1983) 4849-4898; Hashi- , 104326 5 huchi et ai., Agric. Biol. Chem. 49 (1985) 545-550; Wilson ja Morgan, J. Bacteriol. 163 (1985) 445-453; FR-hakemusjulkaisu n so 84.06701; ja EP-hakemusjulkaisu 0134048. Spontaanista vahvistumisesta prokaryoottisissä soluissa on raportoitu ja sen suhteen voidaan valikoida soluja. Katso esimerkiksi Andersonin ja Rothin yleiskatsaus, Ann. Rev. Microbiol. 31 (1977) 473-505.

Kaikissa tapauksissa, joihin edellä viitataan, kromosomiin integroituneen DNA:n vahvistuminen tapahtui peräkkäisjärjestelynä. Tämäntyyppisen kromosomivahvistussekvenssin on ilmoitettu olevan epästabiili, vaikka melko hyvää stabiili-suutta esiintyi muutamissa tapauksissa, kuten ovat esittäneet JanniSre et ai., Gene 40 (1985) 47-55.

Luontaisesti esiintyvien vahvistettujen prokaryoottisten geenien stabiloitumisesta muiden, näiden vahvistettujen sekvenssien välissä sijaitsevien oleellisten geenien läsnäolon johdosta on raportoitu. Esimerkiksi B. subtilis-kromo-somissa esiintyvistä ribosomi-RNA-geenisarjojen 9-10 kopiosta kahta peräkkäin sijaitsevaa sarjaa erotti ryhmä tRNA-gee-nejä (Wawrousek ja Hansen, J. Biol. Chem. 258 (1983) 291-298). Muissa tapauksissa luontaisesti esiintyvät perät-täisesti toistuvat ribosomi-RNA-operonit olivat deletoitu-" neet sekä E_j_ colissa että B. subtiliksessa, millä oli vain vähäinen vaikutus organismin fenotyyppi-ominaisuuksiin: Ell-wood ja Momura, J. Bacteriol. 143 (1980) 1077-1080 ja vastaavasti Loughney et ai., J. Bacteriol. 154 (1983) 529-532.

Plasmidien integroimista B. subtilis-kromosomiin epäsäännöl- lisen rekombinaation avulla vektoria pE194 käyttäen ovat ku vanneet Hofemeister et ai., Mol. Gen. Genet. 189 (1983) 58-68 ja Prorozov et ai., Gene 34 (1985) 39-46.

Useita Bacillus-lajien solunulkoisten entsyymien geenejä on menestyksekkäästi kloonattu, kuten B. amyloliquefaciensin β 104326 alfa-amylaasigeeni (Palva et ai.. Gene 15 (1981) 43-51), B. licheniformis (Ortlepp, Gene 23 (1983) 267), B. stearo-thermophilus (Mielenz et ai., Proc. Acad. Sei. USA 80 (1983) 5975-5979; EP-A-0057976) ja B. subtilis (Yang et ai.,

Nucleic Acids Res. LI (1983) 237); levaanisakkaraasigeeni Β. subtilis (Gay £t al., J. Bacteriol. 153 (1983) 1424); neutraalia proteaasia koodaavat geenit B. stearothermophilus (Fuji et al., J. Bacteriol. 156 (1983) 831), B. amyloliguefaciens (Hon jo £t al_., J. Biotech. 1^ (1984) 165) ja B. subtilis (Yang et al^., J. Bacteriol. 160 (1984) 115; seriini- tai alkalista proteaasia koodaavat geenit B. subtilis (Wong et^ al., Proc. Natl. Acad.. Schi. USA ^1^ (1984), B. licheniformis (Jacobs et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8913) ja B. amyloliguefaciens (Wells et al., Nucleic Acids Res. 1_1^ (1983) 7911).

Useiden gram-positiivisten mikrobilajien protoplastitrans-formoinnista on raportoitu. B. subtiliksen osalta menetelmää protoplastitransformoinnin suorittamiseksi ovat kuvanneet Chang ja Cohen (Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115), ja sitä on laajalti käytetty. Samanlaisia menestyksekkäitä menetelmiä on kuvattu B. megaterium-protoplastien transfor-moinnille (Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Letters Ί_ (1980) 261-263), B. amyloliquefaciens-protoplastit (Smith et al., Appi. nd Enc. Microbiol. 51^ (1986) 634), « B. thur ingiens is -protoplast it (Fisher et_ al., Arch. Microbiol. 139 (1981) 213-217), B. sphaericus-protoplastit (McDonald, J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 203), ja B. lar- vae-protoplastit (Bakhiet et al., Appi. and Env. Microbiol. 49 (1985) 577); samassa julkaisussa ilmoitettiin B. popillae* lie epäonnistunut tulos. Menetelmä oli onnistunut, kun kyseessä oli B. polymyxa, B. licheniformis, B. macerans, tai B. laterosporus, mutta ei lajien B. coagulans, B. cereus ja B. pumilus kohdalla, joskin todettiin hyvää protoplastimuodostusta (Mann et a_l., Current Microbiol. 1_3 (1986) 131-135).

7 104326

Muita menetelmiä DNA:n viemiseksi protoplasteihin ovat fuusioiminen DNA-pitoisiin liposomeihin (Holubova, Folia Microbiol. 30 (1985) 97) tai protoplast ifuusioiminen käyttämällä helposti transformoitavaa organismia väli-isäntäsoluna (EP-hakemusjulkaisu 0134048).

Keksinnön kohteena ovat transformoidut prokaryoottiset isän-täsolut, jotka sisältävät vähintään kaksi hydrolaasientsyymiä koodaavaa DNA-sekvenssin kopiota stabiilisti isäntäsolukromo-somiin integroituneina, ja menetelmät niiden valmistamiseksi. Eksogeenisen DNA-sekvenssin stabiiliin ylläpitoon päästään integroimalla kaksi tai useampi sekvenssin kopio isäntäsolu-kromosomiin, jossa kopioita erottavat endogeeniset kromosomi-DNA-sekvenssit, jotka ovat välttämättömiä isäntäsolulle.

LYHYT KUVAUS PIIRROKSISTA

KUVIOT 1A-1D ovat kaavioesityksiä neljästä tavasta integroida kromosomin ulkoisia DNA-sekvenssejä prokaryoot-tisten mikro-organismien kromosomiin.

T on kohdesekvenssi, eli kromosomissa ja plasmidissa läsnäolevat DNA-sekvenssit, joiden välillä voi tapahtua homologinen rekombinaatio.

S merkitsee kromosomiin integroitavaa DNA-sekvenssiä.

M merkitsee rekombinanttikannan valinnassa käytettyä merkki-geenisekvenssiä.

KUVIOT 2A ja 2B ovat kaavioesityksiä kahdesta tavasta aikaansaada stabiili geenivahvistus prokaryoottisessa kromosomissa .

KUVIOSSA 3 esitetään tulokset histidiini/MOPS-geeli-elektroforeesiajosta, joka suoritettiin pUBHOtn ja vastaavasti pM58:n sisältävän B. subtilis-kannan DB104 viljelmäsu-pernatantista, verrattuna useaan subtilisiiniin: vyöhyke 1: Carlsberg-subtilisiini vyöhyke 2: Bacillus PB92-proteaasi 3 104326 vyöhyke 3: Bacillus subtilis-subtilisiini vyöhyke 4: Bacillus subtilis DB104 (pM58) vyöhyke 5: Bacillus subtil is DB104 (pUBHO) KUVIOSSA 4 esitetään plasmidin pM58 restriktiokartta. Lisäksi kuvion yläosassa esitetään sevenssointistrategia. Päätynuolilla varustetut kiinteät viivat edustavat fragmentteja, jotka kloonattiin £aagi-M13-vektoreihin mplO, mpll ja mpl8. Kuvion alaosassa esitetään sekvenssointistrategia, jossa käytettiin säännöllisin välein proteaasigeenissä sijaitsevia 10 oligonukleotidiä.

KUVIOSSA 5 esitetään koodaavan juosteen nukleotidi-sekvenssi ja siihen liittyvä Bacillus PB92-seriiniproteaasin aminohapposekvenssi. DNA-sekvenssin promoottorit (Pj, P2)# ribosomisitoutumiskeskukset (rbs) ja lopetusalueet (term) on myös esitetty. Numeroidut kiinteät viivat edustavat sek-venssoinnissa käytettyjen 10 oligonukleotidin sijainteja.

KUVIOSSA 6A esitetään plasmidin pE194-neo rakentaminen .

KUVIOSSA 6B esitetään plasmidin pMAX-4 rakentaminen.

KUVIO 7A: Kantojen PB92, PBT109 ja PBT108 kromosomi-DNA:n HindiII-pilkkomistuotteillä suoritettiin elektroforee-siajo 0,5-%:isessa agaroosigeelissä, erotetut tuotteet siirrettiin nitroselluloosakalvolle kuten Southern on kuvannut, ja hybridisoitiin 32p_^eiinattuun nick-translatoituun pM58-DNA:han. Kuviossa nähdään autoradiokuva.

KUVIOT 7B ja 7C havainnollistavat integoitumistapah-tumia, joita esiintyy pMAX-4sn ja Bacillus PB92-kromosomin välisen homologisen () ja epäsäännöllisen (C) rekombinaation yhteydessä.

KUVIOSSA 8 esitetään integroimisvektorin pElatB ra-: kentaminen.

KUVIOSSA 9A havainnollistetaan plasmidin pElatB integroimista B. licheniformis-kannan T9 kromosomiin, jolloin tuloksena saadaan B. licheniformis-kanta TB13.

KUVIOSSA 9B havainnollistetaan B. licheniformis- 9 104326 kantojen TB13 ja T5 kromosomirekombinaatiota käytettäessä näiden kantojen protoplastifuusiota, jolloin tuloksena saadaan B. licheniformis-kanta T13F.

KUVIOSSA 10 esitetään kannan T13F esimerkissä 11 kuvatun mukaisen fermentaation yhteydessä eristettyjen yhdeksän eri pesäkkeen kromosomianalyysiä. Eristetty kromosomi -DNA pilkottiin EcoRI:llä, pilkkomistuotteet erotettiin 0,8-%:isessa agaroosigeelissä ja siirrettiin blot-kuvina nitroselluloosakalvoille. Blot-siirtojäijenteen hybridisoin-ti suoritettiin ^2P-leimattuun, nick-translatoituun pElatB-DNAthan. Kuviossa esitetään autoradiokuva. Ylempi nuoli osoittaa kohdan, johon noin 15 kb:n EcoRI-DNA-fragmentti migroituu sen sisältäessä kokonaisuudessaan pElatB-sekvens-sin, joka ei ollut alkuperäisen alfa-amylaasigeenin vieressä, kuten esitetty kannalle TB13 kuviossa 9A. Alempi nuoli osoittaa kohdan, johon noin 33 kb:n EcoRI-DNA-fragmentti migroituu sen sisältäessä kokonaisuudessaan B. lichenifor-mis-kannassa T5

alunperin läsnäolleen alfa-amylaasigeenin (katso myös kuvio 9B). Analysoitiin seuraavat DNA-näytteet: vyöhyke 1: Bacillus licheniformis T5-DNA

vyöhyke 2: Bacillus licheniformis TB13-DNA

vyöhyke 3: Bacillus licheniformis T390-DNA

vyöhyke 4: Bacillus licheniformis-kannan T390 neomy- ·; siinille herkästä johdannaisesta peräisin oleva DNA, joka eristettiin fermentoinnin jälkeen kuten on kuvattu esimerkissä 12. vyöhyke 5: Bacillus licheniformis T13F-DNA. vyöhykkeet 6-14: DNA yhdeksästä eri pesäkkeestä, jotka eristettiin kannan T13F esimerkissä 12 l' kuvatun mukaisen fermentoinnin yhteydessä.

« Tämän keksinnön kohteena ovat prokaryoottiset solut, joissa jonkin DNA-sekvenssin kaksi tai useampaa kopiota on stabii-listi integroitu kromosomiin, ja menetelmät niiden valmista- 104326 miseksi. Kiinnostavaa polypeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin käsittävä isäntäsolu transformoidaan sanotun DNA-sekvenssin käsittävällä DNA-rakenteella. Sitten valikoidaan transformoitujen solujen suhteen, joissa integroituneita DNA-sek-venssejä erottavat vahvistettavasta geenistä endogeeniset kromosomisekvenssit. Kyseiset endogeeniset välisekvenssit ovat yleensä isäntäsolulle välttämättömiä. Vahvistettujen sekvenssien menetys homologisen rekombinaation kautta johtaisi isäntäsolun kuolemaan. Täten tällöin ilmenee valikoin-tipainetta vahvistetut sekvenssit käsittävien solujen suhteen ilman, että tarvitsee käyttää antibiootteja tai muita samankaltaisia valikointikeinoja. Integraatioon voidaan päästä joko homologisella rekombinaatiolla tai epäsäännöllisellä rekombinaatiolla. Haluttujen solujen saamiseksi käyttökelpoisia menettelytapoja on esitetty kuviossa 2A ja vastaavasti 2B.

Käytettäessä homologista rekombinaatiota vektorimolekyylit voivat sisältää useita DNA-sekvenssijaksoja, jotka ovat homologisia isäntäsolukromosomiin nähden, erityisesti mikäli vahvistettavan geenin yksi tai useampi kopio on jo viety isäntäsoluun. Vektorimolekyyliin voi täten sisältyä kiinnostava DNA-sekvenssi; kohde-DNA-sekvenssi; ja merkki-DNA-sek-venssi.

•

Tulee huolehtia siitä, että valikointi tulee suoritetuksi vain haluttujen rekombinaatiokromosomijärjestäytymisien suhteen. Tähän voidaan päästä käyttämällä rekombinaatioon lineaarisia DNA-molekyylejä. Integroitava renkaan muotoinen vektorimolekyyli leikataan restriktioentsyymillä kohdesek-venssiin nähden homologiselta alueelta. Tällä tavoin rekombinaatio ja integroituminen voivat tapahtua edullisesti tässä spesifisessä kohdassa. Sen lisäksi, että kiinnostava DNA-sekvenssi on läsnä vektorimolekyylissä, se voi sisältyä myös isäntäsolukromosomiin. DNA-sekvenssi voi olla mitä ta- 11 104326 hansa vahvistettavaksi haluttua rakennegeeniä koodaava DNA-sekvenssi. DNA-sekvenssi voi olla isäntäorganismille endo-geeninen tai se on voitu insertoida isäntäkromosomiin jossain edeltävässä transformoimisvaiheessa.

Kohdesekvenssit ei-perättäisjärjestelynä tapahtuvan geeni-vahvistuksen suorittamiseksi valitaan edullisesti ei-välttä-mättömistä geeneistä, esimerkiksi Bacillus-lajin toimiessa isäntäorganismina kohdeeekvensseinä voidaan käyttää solunul-koisia entsyymejä koodaavia geenejä tai itiöintiin liittyviä geenejä. DNA-sekvenssien integrointi näihin geeneihin inak-tivoi yleensä kyseisen geenin. Kyseisen geenin ilmaisun puuttumista voidaan sitten tarkkailla ja käyttää haluttujen rekombinanttikantojen valikoinnissa.

Käytettäessä epäsäännöllistä rekombinaatiota kromosomigeeni-vahvistuksessa kuvioissa ID ja 2A kuvatun mukaan integroi-mis- ja valikoimisolosuhteet, joissa homologinen rekombinaatio ei saa yliotetta epäsäännöllisestä rekombinaatiosta, ovat edullisia. Edullinen keino homologisen rekombinaation välttämiseksi on transformoida ensimmäisen ja toisen isännän soluja, joista puuttuu kyseinen kiinnostava rakennegeeni, vektorilla, joka sisältää kiinnostavaa polypeptidiä koodaa-van DNA-sekvenssin ja merkkigeenin. Sitten voidaan valikoida ·; ensimmäisen ja toisen isännän soluja, joissa kyseinen DNA- sekvenssi esiintyy eri sijaintikohdissa, ja yhdistää ne fuu-sioimisolosuhteissa transformoidun solun saamiseksi, joka käsittää kiinnostavaa rakennegeeniä koodaavasta DNA-sekvens-sistä vähintään kaksi kopiota hajautetuissa sijaintikohdissa toisen isännän genomissa. Valikoinnin helpottamiseksi ensim-mäinen isäntä voidaan tapaa ennen fuusiointia.

Kiinnostava/-t geeni/-t voi/-vat olla jokin tai useampi prokaryoottinen tai eukaryoottinen geeni. Näihin geeneihin voi lukeutua bakteerigeenejä, yksisoluisten organismien gee- 12 104326 nejä, nisäkäsgeenejä tai muita samankaltaisia. Rakennegeenit voidaan valmistaa vaihtelevilla tavoilla, mukaanlukien synteesi, eristys genomi-DNArsta, valmistaminen cDNA:sta, tai mainittujen yhdistelmät. Geenimanipulaation eri menettelytavat ovat hyvin tunnettuja, ja niihin lukeutuvat restriktio, pilkkominen, irtileikkaus (resection), ligatointi, in vitro-mutatointi, alukkeella korjaaminen (primer repair), liittä-jien ja siltasekvenssien käyttö, ja muita vastaavia. Täten jostain isännästä saatuja DNA-sekvenssejä voidaan manipuloida vaihtelevilla tavoilla DNA-rakenteelle asetetuista vaatimuksista riippuen. Katso Maniatis et ai., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

Rakennegeenit voivat ilmentää vaihtelevia polypeptidejä ja proteiineja kuten entsyymejä, hormoneja, lymfokiinejä, solu-pintaproteiineja, veriproteiineja, rakenneproteiineja, immu-noglobuliineja tai muita vastaavia, jotka ovat peräisin nisäkkäistä, yksisoluisista mikro-organismeista, esim. bakteereista, sienistä (fungi), kuten hiivasta tai rihmasienistä, levistä, alkueläimistä jne., kasveista tai muusta DNA-läh-teestä. Erityisen kiinnostavia ovat entsyymit, etenkin pro-teaasit ja amylaasit. Esimerkkejä tällaisista entsyymeistä ovat seriini- ja ei-seriiniproteaasit, mukaanlukien korkea-*; alkaliset seriiniproteaasit, alfa- ja beta-amylaasit, ja muut samankaltaiset. Edullinen seriiniproteaasilähde on Bacillus novo-laji PB92, ja alfa-amylaasin B. licheniformis-kanta T5, sekä näiden kantojen mutantit ja variantit.

Geeni, joka muodostaa osan sopivasa vektorista, voidaan saa-da alalla yleisesti tunnettujen menetelmien mukaan. Yleensä ottaen menetelmä käsittää genomikirjaston valmistamisen korkea-alkalista proteaasia ilmentävästä organismista. Geno-mikirjasto valmistetaan kätevästi esimerkiksi ligatoimalla luovuttajakannan DNA-fragmentteja sopivaan vektoriin.

„ 104326 X w

Ilmaisulla "sopiva vektori" tarkoitetaan DNA-rakennettä, joka käsittää jotain kiinnostavaa proteiinia tai polypeptidiä koodaavaa rakennegeenin. Rakennegeeni liittyy oikein suuntautuneena kontrollualueisiin kuten promoottorialue, riboso-misitoutumiskeskuksen muodostava sekvenssi ja rakennegeenin transkription ja translaation päättymistä kontrolloivat sekvenssit, jotka kontrollialueet ovat isäntäsolussa funktionaalisia. Siinä tapauksessa, että isäntäsolun transformoitu-mis- ja integraatiotiheydet ovat liian alhaiset salliakseen integroitumistuotteiden suoran esiinvalikoinnin ilman plas-midin sisältävien solujen välieristystä, kuten teollisten Bacillus-kantojen kohdalla, vektori voi käsittää lisäksi toisiintumisalkukohdan, joka kykenee toisiintumaan isäntäsolussa itsenäisesti.

Jos geeni on saatu luovuttajasolusta, joka omaa prokaryoot-tisen isäntäsolukannan tunnistamia transkription ja translaation aloitus- ja lopetussäätösignaaleja, on tavallisesti käytännöllistä säilyttää alkuperäiset rakennegeenin säätö-sekvenssit. Lisäksi transkription aloitusalue voi tuottaa konstitutiivisen tai indusoitavan ilmentymisen, jolloin soveliaissa tilanteissa isäntää voidaan kasvattaa suuriin tiheyksiin, ennen kuin saadaan kiinnostavien rakennegeenien korkeaiImentyrni staso.

1 ·«

Rakennegeenin ollessa peräisin lähteestä, jonka säätösignaa-leja isäntäsolu ei tunnista, on välttämätöntä hankkia isäntäsolun tunnistamia säätöalueita ja insertoida rakennegeeni näiden aloitus- ja lopetussäätösignaalien väliin. Joissain tapauksissa eksogeeninen rakennegeeni omine lopetuskodonei- : neen voidaan insertoida lukukehykseen luontaiset säätö- signaalinsa säilyttävän endogeenisen rakennegeenin N-termi-naalisten kodonien taakse.

On toivottavaa, että ilmentymistuote erittyy. Siinä tapauksessa, että ilmentymistuote on luontaisesti erittyvä ja että 14 104326 isäntäsolu tunnistaa johtosignaalit ja prosessointisignaa-lin/-it, tähän ei liity vaikeuksia. Kuitenkin jos tuote ei erity, koska isäntäsolu ei tunnista erityksen johtosignaale-ja ja/tai prosessointisignaalia/-leja, tai signaalit eivät ole tyydyttävässä määrin funktionaalisia kyseisessä isäntä-solussa, saattaa olla välttämätöntä eristää tai syntetisoida DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat isäntäsolupolypeptidin erityksen johtosignaaleja ja prosessointisignaalia/-leja ja liittää ne oikeaan lukuvaiheistukseen rakennegeenin 5'-päähän.

Vektoriin voi lisäksi sisältyä merkkigeeni, joka tuottaa resistenssin jollekin antibiootille, jolle isäntäkanta on herkkä. Vektorin kromosomi-integraatiossa käytettävän merk-kigeenin on täytettävä se vaatimus, että eloonjääntivali-koinnin on oltava mahdollista myös silloin, kuin vain yksi tai muutama merkkigeenikopio on läsnä isäntäkannassa. Merkillä tarkoitetaan rakennegeeniä, joka kykenee ilmentymään isännässä ja tarjoaa eloonjäännin suhteen valikoimis-mahdollisuuden. "Eloonjäännin suhteen valikoinnilla" tarkoitetaan prototrofian tuottamista auksotrofiseen isäntään, biosidi- tai virusresistenssiä. Prototrofiaa silmälläpitäen voidaan käyttää erilaisia geenejä, kuten leu, his, trp tai muu vastaava. Biosidiresistenssin kyseessä ollessa tähän ** saattaa liittyä antibioottiresistenssi, esim. neo-, cam-, tet-, tun-, kan- tai vastaava resistenssi. Muita merkkejä ovat resistenssi raskasmetalleille, immuniteetti, ja muut vastaavat. Eri DNA-sekvenssit voivat olla peräisin vaihtele-vista lähteistä ja ne voidaan liittää toisiinsa tuottamaan vektori, joka käsittää yhden tai useamman kätevän, edulli-sesti yksittäisen, restriktiokohdan, jotta olisi mahdollista insertoida tai korvata rakennegeeni tällaisissa kohdissa tai menetettyjen fragmenttien korvauksen niissä plasmidiraken-teen aikaansaamiseksi.

15 104326

Kromosomi-integraation suhteen suoritettua valikointia voidaan helpottaa käyttämällä plasmidia, jonka toisiintumisen alkukohta omaa mutaation, joka tekee sen toiminnasta isäntä-solussa lämpötilaherkän. Katso esimerkiksi Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75 (1978) 1433.

Kun plasmidirakenne on valmistettu, se voidaan seuraavaksi kloonata sopivaan kloonausisäntään. Voidaan käyttää mitä tahansa käytännölliseksi havaittua isäntää, joka on helposti transformoituva ja sallii plasmidirakenteen toisiintumisen ja siirron isäntäsoluun. Saatavana on suuri määrä kantoja, joiden transformoitumistehokkuus on korkea ja jotka ovat tavallisesti auksotrofisiä ja/tai antibioottiherkkiä. Mikäli isäntäsoluna on teollinen Bacillus-kanta, saman organismin käytöllä isäntäsoluna plasmidirakenteen kloonauksessa on monia etuja, sillä se mahdollistaa yksittäisen toisiintumis-järjestelmän käytön sekä saman eloonjäämisvalikointimerkin käytön sekä kloonausisännässä että isäntäkannassa. Katso esimerkiksi EP-hakemusjulkaisu 134048, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä.

Plasmidirakenne voidaan viedä kloonausisäntään tavanomaisten menettelytapojen mukaan, joita ovat transformointi, kalsiumilla saostetun DNA:n käyttö, konjugointi tai muu kätevä menettelytapa. Kloonausisäntää voidaan sitten viljellä sopivassa ravintokasvualustassa valikoivissa olosuhteissa plasmidirakenteen sisältävän isännän esiinvalikoimiseksi. Aukso-trofisten isäntien kyseessä ollen ravintokasvualustasta puuttuu vaadittu ravintoaine, kun taas biosidiresistenssin, esim. antibioottiresistenssin, kyseessä ollessa ravintokasvualustassa käytetään sytotoksista määrää kyseistä biosidiä tai kyseisiä biosidejä.

Voidaan käyttää erilaisia isäntäsoluja. Näitä ovat E. coli, Bacillus-kannat, erityisesti Bacillus subtilis, Pseudomonas 16 104326 ja Streptomyces. Isäntäsolua valittaesa otetaan huomioon eri tekijöitä, mukaanlukien tekijät, joilla saattaa olla vaikutusta vahvistettavan geenin ilmentymiseen ja halutun tuotteen tuotantoon. Täten on toivottavaa käyttää isäntäsolua, joka tunnistaa säätösignaalit; jossa eritys on helppoa? jossa haluttu tuote hajoaa vain vähän jne. Edullinen isäntäsolu tuottaa jo valmiiksi kyseistä kiinnostavaa polypeptidiä ja se voi olla joko villityypin organismi tai mutanttiorganis-mi. Isäntäsolu voi olla myös sellaisen organismin mutantti, joka tuottaa kyseistä kiinnostavaa polypeptidiä, mutta on itse ei-tuottaja. Kiinnostavan polypeptidin ollessa jokin proteaasi tai amylaasi edullisia kantoja ovat Bacillus novo-kanta PB92 ja vastaavasti Bacillus licheniformis-kanta T5 sekä näiden kantojen mutantit ja variantit.

Lisäksi voidaan käyttää teollisia kantoja, jotka omaavat teollisen kannan toivottavia erityispiirteitä. Esimerkkejä käytettäviksi soveltuvista kannoista ovat kannat, joita käytetään entsyymien teollisessa tuotannossa kuten: B. licheniformis, B. amyloliquefaciens ja alkalofiiliset Bacillus-lajit. Teolliset kannat valitaan organismeista, jotka ovat eristettävissä maaperästä tai joita on saatavana talletuslaitoksista tai joita voidaan saada tällaisia kantoja modifioimalla. Teolliset kannat ovat erittäin voimakasrakenteisia ja stabiileja. Lisäksi sanotut kannat omaavat vastuskykyä faagitartuntaa ja geenivaihtoa vastaan, eli DNA:n siirtoa perinteisillä transformointimenettelyillä vastaan. Tavanomaiset teolliset kannat ovat niinikään pro-totrofisia, jotta vältettäisiin kalliiden aminohappojen lisääminen ravintokasvualustaan. Teollisten kantojen muita ' tunnuspiirteitä ovat niiden korkea tuottokyky fermentaation loppuun asti sen saattaessa kestää viikonkin, stabiili solu-pitoisuus liemen tullessa loppuunkäytetyksi ja spesifisen erittyvän proteiinin korkea tuottokyky, joka on tavallisesti vähintään 5 g/l (0,5% w/v).

17 104326

Voidaan saada transformantteja, joissa geenit ovat joko peräkkäisjärjestelmässä tai sijaitsevat hajallaan kromosomissa. Yleisesti ottaen on mahdollista valikoida hajautettuja geenejä sisältävät transformantit kyseistä kahta trans-formanttityyppiä sisältävistä seoksista eristämällä kunkin yksittäisen transformantin kromosomi-DNA, analysoimalla sitten tämä DNA sanottujen geenien suhteellisten sijaintipaikkojen suhteen esimerkiksi Southern'n, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517, menetelmän mukaan tai muilla, alan ammattilaisten tuntemilla keinoilla, jolloin sanottujen geenien hajautettu integraatio tulee identifioiduksi.

Keino hajautettuja geenejä käsittävien transformanttien saamiseksi peräkkäis-integraatiota välttäen on kuvioissa IB ja 2B havainnollistettua kaksinkertaista kääteisrekombinaatiota käyttäen linearisoitujen DNA-rakenteiden käyttö, jotka käsittävät vahvistettavan DNA-sekvenssin, merkkigeenin ja koh-desekvenssin rekombinaatiota varten.

Lisäksi spesifisiin keinoihin hajautettuja geenejä käsittävien transformanttien saamiseksi kuuluu kuviossa 2A havainnollistetun epäsäännöllisen rekombinaation käyttö, jolloin peräkkäis-transformanttien eristys voidaan välttää valikoimalla käyttäen jonkin merkkigeenin erottavaa ilmentymistä • esimerkiksi jonkin antibioottiresistenssiä koodaavan geenin, silloin kun antibioottiherkkyys on erilainen geenin peräk-käis-integraation käsittävissä kannoissa verrattuna ei-peräkkäis-integraation käsittäviin kantoihin. Yleensä välittävän endogeenisen DNA-sekvenssin pituus on alle 10 kbp:tä.

: Lisäksi keinoihin hajautettuja geenejä käsittävien transfor manttien saamiseksi peräkkäis-kahdentumisia välttäen kuuluu tapettujen protoplastien käyttö jostain homologisesta luo-vuttajakannasta, joka sisältää rakennegeenin ja merkkigeenin käsittävän DNA-rakenteen, jolloin rakennegeeni on integroi- 18 104326 tunut kromosomiin vastaanottajakantaan nähden eri sijainti-kohtaan.

Isäntäsolujen transformoinein liittyy edullisesti isäntä-kannasta valmistettujen protoplastien käyttö. Protoplastit valmistetaan soluista yleensä tavanomaisilla tavoilla, esim. käsittelemällä lysotsyymillä tai tsymolyaasilla, minkä jälkeen protoplastit suspendoidaan varovaisesti sopivaan väliaineeseen, joka omaa protoplastin eheyden säilyttämiseksi sopivan osmolaalisuuden. Teollisille Bacillus-kannoille kuvataan protoplastien valmistusmenetelmiä EP-hakemusjulkaisussa 0134048, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä. Isäntäkannan ollessa alkalofiilinen Bacillus-kanta protop-lasteja voidaan valmistaa kätevästi emäksisessä pH:ssa, edullisesti noin pH:ssa 8,0. Tämä menettelytapa julkistetaan EP-hakemusjulkaisussa n:o 87200358.7, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteenä.

Isäntäsolu voidaan transformoida yhdistämällä plasmidiraken-ne tai kloonausisäntäprotoplasti isäntäsolun protoplastiin sopivan fusogeenin läsnäollessa. Voidaan käyttää mitä tahansa fusogeenia, joka tuottaa toivottavan tehokkuuden tason, useimmissa tapauksissa polyetyleeniglykolin todetaan tarjoavan korkean fuusiotehokkuuden huomattavaan kätevyyteen yhdistyneenä. Lyhyen aikajakson kuluttua fusogeeniseos korvataan sopivalla ravintokasvualustalla ja solut regeneroidaan valikoivassa kasvualustassa, kätevästi agar-maljoille maljäämällä.

Transformantit, jotka on saatu yhdistämällä isäntäsolu sopi-vaan DNA-rakenteeseen, voivat sisältää sanotun DNA-rakenteen tai osan siitä joko suoranaisesti kromosominsa integraalise-na osana tai vapaina vektorimolekyyleinä, mikäli DNA-raken-teet sisältävät sanotussa isäntäsolussa funktionaalisen toi-siintumisen alkukohdan.

19 104326

Keino transformanttien valikoimiseksi, joissa DNA-rakenne on integroitunut kromosomiin, on käyttää lämpötilaherkän toi-siintumisen alkukohdan sisältävää plasmidia. Transformantte-ja kasvatetaan valikoivassa kasvualustassa sallivassa lämpötilassa, minkä jälkeen ne siirretään ei-sallivaan lämpötilaan. Ei-sallivassa lämpötilassa merkkigeenin ilmaisevat pesäkkeet eristetään sitten ja niitä viljellään valikoivassa kasvualustassa sallivassa lämpötilassa. Plasmidin puuttumisesta voidaan varmistua esimerkiksi eristämällä kokonais-DNA pesäkkeistä ja suorittamalla sen elektroforeesiajo agaroosigeelissä tai osoittamalla transformanteilta puuttuvan kyvyn transformoida transformoitumiskelpoisia soluja. Tavan, jolla integroituminen kromosomiin on tapahtunut, määritys voi käsittää kromosomi-DNA:n analyysin esimerkiksi Southern'n, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517, menetelmän mu kaan tai muulla alan ammattilaisten tuntemilla tavoilla.

Mikäli herkkyydessä valikointlaineen suhteen esiintyy eroja transformanttien, jotka sisältävät merkkigeenin ylimääräisiä kopioita peräkkäisjärjestelmässä, ja transformanttien välillä, joissa merkkigeeni on sijoittunut isäntägenomissa eri puolilla sijaitseviin sijaintikohtiin, transformantteja voidaan kätevästi viljellä alustassa, joka sisältää valikointi-ainetta tarkoituksenmukaisen pitoisuuden ei-peräkkäis-inte-·.· graatioita käsittävien transformanttien esiinvalikoimiseksi.

Toinen keino transformanttien saamiseksi, jotka sisältävät kiinnostavan DNA-sekvenssin kopioita hajautetusti integroituneina, on käyttää homologisesta luovuttajasolusta valmistettua protoplastia, joka sisältää kiinnostavan DNA-sekvens-·' sin ainakin yhden kopion kromosomissaan sijaintikohdassa, joka poikkeaa sijaintikohdasta vastaanottavassa isäntäsolus-sa. Homologinen luovuttajasolu voidaan valmistaa esimerkiksi transformoimalla solu, joka ei sisällä kiinnostavaa rakenne-geeniä, kyseisen rakennegeenin käsittävällä vektorilla. DNA- 104326 20 sekvenssin integroitumista luovuttajasolun kromosomiin voidaan helpottaa käyttämällä lämpötilaherkän toisiintumisen alkukohdan käsittävää plasmidia ja viljelemällä transfor-mantteja valikoivissa olosuhteissa ensin sallivassa lämpötilassa ja sitten ei-sallivassa lämpötilassa ja sitten eristämällä merkkigeenin ilmaisevat pesäkkeet.

Plasmidi-DNA:n puuttumisesta varmistumista seuraten kromoso-mi-DNA voidaan eristää ja analysoida Southern'n, supra, menetelmän mukaan hybridisoimalla koettimeen, joka on leimattu esimerkiksi 32p:llä tai biotinyloiduilla nukleotideillä.

Koetin voi olla kiinnostavaa polypeptidiä tai sen fragmentteja koodaavaa cDNA sekä kiinnostavan DNA-sekvenssin käsittävä DNA-rakenne tai fragmentti siitä, esimerkiksi vektori. Transformantteja, jotka sisältävät kiinnostavan geenin sen luovuttajakantaan nähden vaihtoehtoisessa sijaintikohdassa, voidaan sitten käyttää homologisina luovuttajasoluina. Vastaanottava isäntäkanta on edullisesti sama kanta, jota käytettiin kiinnostavan DNA-sekvenssin lähteenä, tai kanta, jossa kiinnostava DNA-sekvenssi sijaitsee kromosomissa toisella alueella kuin transformoidussa luovuttajasolussa.

Valikoinnin helpottamiseksi luovuttajasolu tapetaan edulli-v sesti sytotoksisella aineella enen protoplastien muodostusta tai sen aikana. Luovuttajasolun tappamiseksi voidaan käyttää erilaisia aineita, mukaanlukien antibiootteja, mutta käteväksi on havaittu jodoasetamidi, joka on tehokas eikä häiritse jatkossa suoritettua fuusiota. Käytettäessä kuolleen kloonaus isännän protoplasteja kuolleen protoplastin suhde vastaanottajakantaisäntään on edullisesti vähintään noin 1:1 ja kuollutta protoplastia voidaan käyttää ylimäärin.

Kuolleen luovuttajasolun protoplastin ja vastaanottavan isäntäsolun protoplastin fuusiota seuraten transformantit * 2i 104326 voidaan valikoida merkkigeenin avulla. DNA voidaan sitten eristää ja analysoida kuten edellä on kuvattu transformant-tien tunnistamiseksi, joissa genomiin on liittynyt useampi kuin yksi kiinnostavan geenin kopio, joita erottavat endo-geeniset kromosomisekvenssit.

Kaksi geeniä hajautetusti sisältävät transformantit seulotaan sitten tarkoituksenmukaisella tavalla kiinnostavan po-lypeptidin lisääntyneen ilmaisun toteamiseksi. Voidaan käyttää erilaisia menettelytapoja, erityisesti kun kyseessä ovat entsyymit, joille on olemassa pysyviksi vakiintuneita toteamismenetelmiä. Vaihtoehtoisesti, jos kyseessä eivät ole entsyymit tai toteamisjärjestelmää ei ole saatavilla, voidaan käyttää biomäärityksiä, vasta-aineita tai RNA- tai DNA-hybridisaatiota kloonien seulomiseksi plasmidirakenteen läsnäolon määrittämiseksi ja kiinnostavan rakennegeenin ilmaisun määrittämiseksi.

Sitten kromosomiin integroituneet plasmidirakenteet tai -rakenneosat sisältävää isäntäsolua viljellään ravintokasvu-alustassa tavanomaisissa fermentaatio-olosuhteissa. Fermen-tointia voidaan jatkaa, kunnes liemi on tullut loppuunkäyte-tyksi. Mikäli tuote on erittynyt, se voidaan eristää liemestä tavanomaisilla menettelytavoilla, esim. uuttamalla, kro-matografisesti, elektroforeettisesti, tai muulla vastaavalla tavalla. Mikäli tuote on jäänyt sytoplasmaan, solut voidaan ottaa talteen sentrifugoimalla, suodattamalla, jne., tuottaa niihin lyysi mekaanisesti rikkomalla, detergentin avulla, lysotsomia käyttäen tai muilla tavoilla ja eristää tuote kuten aiemmin on kuvattu. Kyseistä menetelmää käyttämällä voi-* daan geenivahvistuskeinona päästä DNA-sekvenssin ainakin kahden kopion stabiiliin integroitumiseen.

Seuraavat esimerkit esitetään havainnollistamistarkoitukses-sa, eikä rajäävässä ominaisuudessa.

22 104326 ESIMERKKI 1

Genomi-DNA-kirjaston valmistus alkalofiilisestä Bacillus novo-lajista PB92 ja seriiniproteaasiqeenin eristys

Kromosomi-DNA:ta eristettiin Bacillus novo-lajista PB92 (talletettu talletusnumerolla OR-60 laitokseen Laboratorium voor Microbiologie, Technical University of Delft, Hollanti; katso US-patenttijulkaisu n:o Re. 30,602) Saito-Miuvan, Biochim. Biophys. Acta T2. (1963) 619-632, kuvaaman menetel män mukaan, minkä jälkeen se pilkottiin osittain restriktio-entsyymillä Sau3A ja pilkkomistuotteet ligatoitiin plasmidin PUBI10 (Gryczan et ai., J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329) BamHI-kohtaan. pUB110-plasmidi-DNA valmistettiin kuten Birn-boim ja Doly (Nucl. Acids. Res. 1_ (1979) 1513-1523) ovat kuvanneet .

Ligatointiseoksella transformoitiin B. subtilis-kanta 1A40 (talletuslaitos Bacillus Genetic Stock Centre) Spizizenin et ai. , J. Bacteriol. (Π (1961) 741-746, menetelmän mukaan käyttäen 0,6-1 /ug DNA:ta millilitraa kohden transformoitu-miskelpoisia soluja. Transformoimisseoksen solut maljättiin minimaalimaljoille, joissa kasvualusta sisälsi: 2,8%, K2HPO4:ää, 1,2% KH2P04:ää, 0,4% (NH4)2S04:ää, 0,2% tri-Na-sitraatti.2H20:ta, 0,04ς MgS04.7H20:ta, 0,00005 MnS04.4H20:ta, 0,4 L-glutamiinihappoa, 0,5% glukoosia, 0,02% kasaminohappoja, 50 /ug/ml tryptofaania, 20 /ug/ml metionii-nia, 20 /ug/ml lysiiniä, 20 /ug/ml neomysiiniä, 0,4% kaseiinia ja 1,5% agaria. Yön yli kestäneen inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa yksi 50 000:sta neomysiiniresistentistä pesäkkeestä • osoitti lisääntynyttä proteaasituotantoa, mikä määritettiin pesäkettä agarmaljassa ympäröivän kaseiinipilkkoutumistuot-teiden saostumamuodostuksen tuottaman kehän kasvusta. Tästä pesäkkeestä eristettiin plasmidi-DNA Birnboimin ja Dolyn, Nucleic Acids. Res. Ί_ (1979) 1513-1523, kuvaaman menetelmän mukaan ja se nimettiin pM58:ksi.

ESIMERKKI 2 23 104326 PB92;n seriiniproteaasigeenin ilmentyminen pM58sn sisältävää Bacillus subtilis-kantaa 1A40 viljeltiin minimaalikasvualuetassa (Spizizen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 44 (1958) 1072-1078), johon oli lisätty 0,02% kasaminohappoja, 50 /ug/ml tryptofaania, 20 /ug/ml metionii-nia, 20 /ug/ml lysiiniä ja 20 /ug/ml neomysiiniä. Viljelmä sentrifugoitiin 24 tunnin kuluttu ja supernatantista määritettiin proteaasiaktiivisuus dimetyylikaseiinia substraattina käyttäen (Lin et ai., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793). Kontrollina käytetty plasmidin pUBHO sisältävän B. subti-lis-kannan 1A40 viljelmä osoitti alle 1/60-osan pM58:lla transformoidun viljelmän proteaasiaktiivisuudesta. Proteaasiaktiivisuus inhiboitu! täysin käsittelyllä ImM fenyylisul-fonyylifluoridiliuoksella (PMSF), mutta ei käsittelyllä 20 mM EDTA-liuoksella.

Näytteitä edellä kuvatuista supernatanteista analysoitiin proteiinigeelissä Laemmlin, Nature 227 (1970) 680, menetelmän mukaan. Näytteet näissä geeleissä analysoitaviksi valmistettiin käsittelemällä supernatantteja 5-%:isella trik-loorietikkahapolla (TCA). Näyte sentrifugoitiin ja saatu sa-V ostuneen proteiinin muodostama pelletti pestiin kahdesti asetonilla, minkä jälkeen se liuotettiin 40 mikrolitraan näytepuskuria (0,5M Tris/HCl, pH 7,5, 10% v/v 2-merkaptoeta-nolia, 50% v/v glyserolia ja 0,05% bromifenolisinistä) keittämällä 10 minuuttia. Elektroforeesiajon jälkeen geelit värjättiin Coomassie Brilliant Blue-valmistetta käyttäen. Käytettiin kolmea eri B. subtilis lA40-kantaa: kantaa, joka sisälsi plasmidin pUBllO; tai pM58y tai ei lainkaan plasmi-dia; jolloin Bacillus PB92-proteaasia käytettiin kontrollina. Elektroforeesiajoa seuraten geelit värjättiin käyttäen valmistetta Coomassie Brilliant Blue ja poistettiin väri.

24 104326 Näyte, joka oli peräisin pM58:n sisältävästä B. subtilis-kannasta 1A40, sisälsi 31 kD;n proteiinin, joka komigroitui Bacillus PB92-proteaasin kanssa. Tätä proteiinia ei todettu pUB110:n sisältävästä Bacillus subtilis-kannasta 1A40 saadussa kontrollivyöhykkeessä.

Kaikilla seriiniproteaaseilla on samankaltainen molekyyli-paino. Tämän vuoksi Bacillus PB92:n kloonattu seriiniprote-aasi erotettiin tunnetuista seriiniproteaaseista (B. subti-lis-subtilisiini, Carlsberq-subtilisiini) transformoimalla pM58 ja pUBHO proteaasinegatiiviseen B. subti1is-kantaan DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) ja analysoimalla syntyneet solunulkoiset proteaasit. Saatuja trans-formantteja kasvatettiin minimaalikasvualustassa (Spizizen et ai., supra), joka sisälti 0,02% kasaminohappoja, 50 /ug/ml histidiiniä ja 20 /ug/ml neomysiiniä. 24 tunnin kuluttua otettiin näytteitä, jotka sentrifugoitiin ja analysoitiin niitä esikäsittelemättä histidiini/MOPS-geeleissä, jotka sisälsivät 75 mM kaliumhydroksidia, 40 mM histidiiniä, 100 mM MOPSrää (3-(N-morfoiino)propaanisulfonihappo), pH 7,5, ja 5% polyakryyliamidia. Elektroforeesipuskuri sisälsi 40 mM histidiiniä, 100 mM MOPStää, pH 6,6. Näytteet ajettiin katodiin päin. Proteaasinauhat todettiin Agfa Pan 100 Professional-fiImien avulla (Zuidweg et^ ai., Biotechnol. and ·. Bioengin. (1972) 685-714). Nämä tulokset on esitetty ku viossa 3. Kuten on esitetty kuviossa 4, pM58 käsittää Bacillus pB92-proteaasia koodaavan geenin.

ESIMERKKI 3 .· Bacillus PB92-seriiniproteaasigeenin sekvenssointi pM58:n erään Ball-Hpal-fragmentin sekvenssi kokonaisuudessaan määritettiin Sangerin, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.

74 (1977) 6463, menetelmän mukaan. pM58-restriktiofragment- 25 104326 teja (katso kuvio 4) kloonattiin faagi-M13-vektoreihin mplO, mpll ja mpl8 (Messing et ai.. Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321). pM58-fragmentti-insertioiden suhteen seulottiin plakki-hybridisäätiön avulla. Sekvenssointia seuraten valmistettiin kymmenen geenissä tasaisin välein sijaitsevaa oligonukleotidiä ja toistettiin sekvenssointi, jolloin varmistui kuviossa 5 esitetty sekvenssi.

ESIMERKKI 4

Plasmidin pMAX-4 sisältävän seriiniproteaasin rakentaminen.

Plasmidin pUCN710 (kuvio 6A) rakentamiseksi pUB110:aa pilkottiin Taqlsllä ja PvuII:lla. Neomysiiniresistenssin tuottavan geenin sisältävää fragmenttia puhdistettiin alhaisen sulamispisteen omaavassa agaroosissa ja fragmentista tehtiin tylppäpäinen Klenow-polymeraasin ja NTP-molekyylien avulla (Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, 1982). Plasmidi pUC7 (Vieira et^ al^., Gene 1_9 (1982) 259-268) linearisoitiin Sällillä ja siitä tehtiin tylppäpäinen kuten edellä on kuvattu. Fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-ligaasin avulla (Maniatis) ja ligatointituot-teella transformoitiin E. coli JM103. Valikointi suoritettiin 2xTY-maljoissa (1,6% w/v Bacto-tryptonia, 1% w/v hiiva-,· uutetta, 0,5% natriumkloridia), jossa kasvualusta sisälsi 50 /ug/ ml ampisilliiniä ja 10 /ug/ml neomysiiniä. Saatua, pUCN710:ksi nimettyä plasmidia pilkottiin BamHI:llä. Plasmi-dia pEl94 (Jordanescu, Plasmid 1^ (1978) 468-479) pilkottiin Bell:llä. Pilkkomisista saadut fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-ligaasin avulla ja ligatointiseoksella transfor-\ moitiin B. subti1is-kanta 1A40. Valikointi suoritettiin mi- nimaalimaljoilla, joissa kasvualusta siälsi 20 /ug/ml neomysiiniä (katso esimerkki 1). Saatu plasmidi, pE194-neo-(kuvio 6A), sisältää neomysiinigeenin sekä lämpötilaherkän toisi intumisalkukohdan.

e 26 104326

Proteaasigeenin alakloonaus integroimisvektoriin pE194-neo suoritettiin seuraavasti: pM58:aa (katso esimerkki 1) pilkottiin Hpal:llä ja Ball:llä ja Bgl11: llä. Plasmidia pE194-neo pilkottiin Hpal:llä. Saadut fragmentit ligatoitiin toisiinsa T4-ligaasilla ja ligatointiseoksella transformoitiin B. subtilis-kantaa 1A40. Transformantit valikoitiin neomysiiniresistenssin sekä kasvaneen proteaasituoton suhteen, jolloin viimemainittu pääteltiin kaseiinin pilkkoutu-mistuotesaostumasta (kehämuodostus, katso esimerkki 1). Saatiin plasmidi pMAX-4, jonka rakenteesta varmistuttiin rest-riktioentsyymianalyysin avulla (katso kuvio 6B).

ESIMERKKI 5

Bacillus-kannan PB92 protoplastitransformointi pMAX-4:llä

Baci11us-kantaa PB92 kasvatettiin yön yli 100 ml:ssa NBSG-X-kasvualustaa (Thorne et ai., J. Bacteriol. 91^ (1966) 1012-1020). Viljelmää sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 4500 kierr./min kierrosnopeudella Sorvall-GSA-roottorilla varustetussa sentrifugissa. Protoplastit valmistettiin inkuboi-malla Bacillus-mikrobeja tunnin ajan 37°C:ssa 10 ml:ssa valmistetta Alkalic Holding Medium (AHM), joka sisälsi 0,5 M sakkaroosia, 0,02 M magnesiumkloridia ja 0,02 M Tris/male-aattia, pH 8,0, steriilissä vedessä, ja johon oli lisätty 0,4 mg/ml lysotsyymiä. Protoplastit pelletoitiin (10 minuuttia, 4500 kierr./min), uudelleensuspendoitiin 5 ml:aan AHM+-puskuria, pH 8,0 (AHM-puskuri, johon on lisätty 3,5% w/v valmistetta Bacto Penassay Broth ja 0,04% w/v valmistetta Albumine Merieux), sekoitettiin ja uudelleenpelletoitiin kuten edellä. Pelletti uudelleensuspendoitiin 5,0 ml:aan AHM:ää, minkä jälkeen 0,5 ml tätä protoplastisuspensiota sekoitettiin 5 /ug:aan demineralisoitua vettä, joka sisälsi 1 /ug:n plasmidi-DNA:ta, ja inkuboitiin 2 minuutin ajan 30-%risen w/v polyetyleeniglykoli 8000-liuoksen, pH 8,0, 27 104326 läsnäollessa. Laimennettiin suhteessa 1:3 AHM+-kasvualus-taan, pH 8,0, ja sentrifugoitiin, jonka jälkeen pelletti uu-delleensuspendoitiin pieneen tilavuuteen (1 ml) AHM+-kasvualustaa ja inkuboitiin 2-3 tunnin ajan. Sadan mikrolitran näyte-eriä maljättiin vastavalmistetuille regeneroimismal-joille, joissa kasvualusta sisälsi 0,5 M Na-sukkinaatti/ HCl:ää, pH 8,0 1,5% w/v agaria, 0,5% w/v kasaminohappoja, 0,5% w/v hiivauutetta, 0,031 M fosfaattipuskuria, pH 8,0, 0,5% w/v glukoosia, 0,02 M magnesiumkloridia ja 0,02% w/v Albumine Merieux-valmistetta. Nämä maljat sisälsivät niinikään 1000 /ug/ml neomysiiniä valikointi varten. Maljoja inkuboitiin 37°C:ssa vähintään 72 tunnin ajan, minkä jälkeen pesäkkeet kopiomaljättiin Heart Infusion-valmiste-agar-maljoihin, jotka sisälsivät 20 /ug/ml neomysiiniä.

ESIMERKKI 6 pMAX-4;n integrointi Bacillus-kannan PB92 kromosomiin.

Erästä plasmidin pMAX-4 sisältävää Bacillus PB92-transfor-manttia inkuboitiin valmisteessa Tryptone Soya Broth (TSB), joka sisälsi joko 1 /ug:n/ml tai 20 /ug/ml neomysiiniä, 24 tunnin ajan 37eC:ssa. Sitten kahden millilitran solususpen-sioeriä laimennettiin 100 ml saan TSBsää, joka sisälsi 1 /ug/ ·.· ml tai vastaavasti 20 /ug/ml neomysiiniä, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 50°C:ssa. 24 tunnin kuluttua 5 mlsn näytteitä kummastakin viljelmästä laimennettiin toistamiseen kuten edellä on kuvattu ja inkuboitiin 24 tunnin ajan 50°C:ssa, jälleen 1 /ug:n/ml tai vastaavasti 20 /ug/ml neomysiiniä läsnäollessa. Viimemainittu menettely toistettiin edelleen : kerran. Sitten solususpensioita laimennettiin satakertaises ti, minkä jälkeen ne maljättiin Heart Infusion-(HI-) valmiste-agar-maljoille, joissa kasvualusta sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä 1 /ug/ml neomysiiniä sisältävistä viljelypul-loista peräisin olevien näytteiden kyseessä ollessa ja 20 28 104326 /ug/ml neomysiiniä 20 /ug/ml neomysiiniä sisältävistä vilje-lypulloista peräisin olevien näytteiden kyseessä ollessa. Maljoja inkuboitiin 16 tunnin ajan 50eC:ssa. Neomysiinire-sistentit pesäkkeet eristettiin ja niitä viljeltiin 10 ml:ssa TSB-kasvualustaa, joka sisälsi 1 /ug/ml neomysiiniä, 16 tunnin ajan 37°C:ssa. Näistä viljelmistä eristettiin kokonais-DNA (Holmes et ai., Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197). Plasmidin puuttuminen varmistettiin siten, että DNAssta suoritettiin elektroforeesiajo agaroosigeelissä. Plasmidi-DNA:n puuttuminen näytteistä, joista plasmidi-DNA ei ollut todettaviss, varmistettiin transformoimalla koko-nai s-DNA:llä B. subtilis-kantaa 1A40, katsottiin plasmidia sisältämättömiksi.

pMAX-4:n mahdollisen integroitumisen kromosomiin ja liittyvän integroitumistavan tutkimiseksi kromosomi-DNA eristettiin, sitä pilkottiin Hindlll:11a, pilkkoutumistuotteilla suoritettiin elektroforeesiajo 0,5% DNA:ta sisältävissä agaroosigeeleissä ja tuotteet siirrettiin nitroselluloosa-kalvolle (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) sekä hybridisoitiin ^2p_ieimattuun nick-translatoituun pM58:aan (Maniatis, 1982). Tämän analyysin tulos on esitetty kuviossa 7A.

Valikoinnin 1 /ug/ml neomysiiniä sisältävässä kasvualustassa tuloksena todettiin proteaasigeenien sijaitsevan kromosomissa perättäin järjestäytyneinä ja plasmidisekvenssien erottamina (kanta PBT109) seurauksena homogolisesta rekombinaati-osta (Campbell-tyyppinen mekanismi). Kolmenkymmenen itsenäisesti eristetyn integrantin yhdistelmästä valikointi suoritettiin 1 /ug/ml neomysiiniä sisältävässä kasvualustassa. Eristettiin yksi integrantti, joka sisälsi plasmidin pMAX-4 satunnaisessa kohdassa kromosomia seurauksena epäsäännöllisestä rekombinaatiosta (kanta PBT122). Valikoimalla 20 /ug/ ml neomysiiniä sisältävässä kasvualustassa saatiin tuloksena 104326 kromosomissa satunnaisessa asemassa sijaitseva plasmidi pMAX-4-kopio, mikä oli seurausta epäsäännöllistä tyyppiä edustavasta rekombinaatiosta. Viimemainittu kanta nimettiin PBT108:ksi. Kantojen PBT109 ja 108 geeni järjestelmät on esitetty kuviossa 7B ja vastaavasti 7C. Kromosomianalyysi osoitti, että integroituminen tapahtui PBT122:ssa ja PBT108:ssa kromosomin eri kohtiin.

ESIMERKKI 7

Kahdentuneiden proteaasigeenien stabiilisuus PBT108- ja PBT109-kannassa 100 ml:aan tuotantokasvualustaa (joka sisälsi: 1% tärkkelystä, 4% laktoosia, 0,87% K2HP04tää, 0,5% hiivauutetta, 0,5% (NH4)2HP04:ää, 0,2% Tri-Na-sitraatti.2H20:ta, 0,05% MgS04.7H20:ta, 0,07% CaCl2:ta, 0,068% FeS04·71^0: ta ja vaah-donestoainetta 1 ml/litra), joka ei sisältänyt neomysiiniä, siirrostettiin 0,2 ml yön yli kasvanutta kannan PBT108 tai PBT109 TSB-viljelmää (37°C) 500 ml:n ravistelupulloihin. In-kuboitiin 44 tunnin ajan 37eC:ssa samalla jatkuvasti ilmastaen, minkä jälkeen viljelmä analysoitiin neomysiiniresis-tenttien pesäkkeiden suhteen ja määritettiin sen proteaasi-aktiivisuus.

•

Sekä PBT108- ett- PBT109-kantaa testattiin myös samaa tuotantokasvualustaa sisältävissä Eschweiler-fermentoreissa määrän suurentamisen 10 litraksi vaikutuksen tutkimiseksi. Fermentoimmiskokeiden tulokset on esitetty yhteenvetona seu-raavassa taulukossa 1.

# 30 104326

Taulukko 1 { kanta suhteellinen neomysiiniresistenttien proteaasituot- solujen %-osuus fermen- __to*__toinnin jälkeen_ kontrolli 100% (PB92) PBT108 120% 100% PBT109_ 115-120%_ 75-97%_ * Proteaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen substraattina dimetyylikaseiinia kuten Lin et ai., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793, ovat kuvanneet.

PBT109:n Eschweiler-fermentoinnista 2 päivän viljelyn jälkeen saatujen pesäkkeiden analysointi osoitti, että näistä pesäkkeistä 3-25%:n tuottotaso vastasi vain yhden yksittäisen proteaasigeenin sisältävän kannan tasoa. Nämä samat pesäkkeet todettiin neomysiiniherkiksi johtuen pMAX-4-sekvens-sin poistumisesta homologisen rekombinaation tuloksena. Kannan PBT108 fermentoimiskokeesta saatujen pesäkkeitten analyysi osoitti kuitenkin, että nämä solut olivat kaikki neomy-siiniresistenttejä. Valittiin umpimähkään 100 tällaista neo-mysiiniresistenttiä pesäkettä ja analysoitiin yksittäin niiden proteaasituottokyky, jotta saatiin määritetyksi, sisäl-sivätkö ne yhden vai kaksi tuottavaa proteaasigeeniä. Jokaisen sadasta yksittäin testatusta pesäkkeestä tuottotaso vastasi kaksi geeniä sisältävän kannan tuottotasoa, mikä osoitti, että PBTl08:aan satunnaisesti integroituneet kaksi proteaasigeeniä tulivat stabiilisti ylläpidetyiksi käytetyissä : fermentaatio-olosuhteissa.

3i 104326 ESIMERKKI 8

Integroimisvektorin pElatB rakentaminen

Plasmidia pGB34, jota kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 0134048, pilkottiin restriktioentsyymeillä BelI, BglI ja Bglll. Saaduista restriktiofragmenteista tehtiin tylppäpäisiä Klenow-polymeraasin avulla, minkä jälkeen ne ligatoitiin pE194-neosn Hpal-kohtaan (katso esimerkki 6). Plasmidi-pE194-neo-DNA eristettiin kuten ovat kuvanneet Birnboim ja Doly (Nucl. Acids Res. T. (1979) 1513-1523).

Ligatointiseoksella transformoitiin B. subtilis-kantaa 1A40 Spizizenin et al^. (J. Bacteriol. 81_ (1961) 741-746) menetelmän mukaan käyttäen 0,5-1 /ug/ml DNA:ta millilitraa trans-formoitumiskelpoisia soluja kohden. Transformointiseoksesta saadut solut maljättiin minimaalimaljoille, joissa kasvualusta sisälsi 2,8% K2HP04«ää, 1,2% Kl^PO^jsää, 0,4% (NH4)2SO4.ää, 0,2% Tri-Na-sitraatti-2H20:ta, 0,04%

MgS04·7H20:ta, 0,00005% MnS04.4H20:ta, 0,4% glutamiinihappo-a, 0,5% glukoosia, 0,02% kasaminohappoja, 50 /ug/ml trypto-faania, 20 /ug/ml metioninia, 20 /ug/ml lysiiniä, 20 /ug/ml neomysiiniä, 0,4% kaseiinia, 0,5% tärkkelystä ja 1,5% aga-r ia.

AI fa-amylaasia tuottavista pesäkkeistä eristettiin DNA kuten Birnboim ja Doly ovat kuvanneet ja rakennetta tutkittiin restriktioentsyymien avulla. Yhdestä näistä transformanteis-ta eristettiin plasmidi pElatB, katso kuvio 8.

32 104326 ESIMERKKI 9

Alfa-amylaasi-neqatiivisen kannan Bacillus licheniformis T9 transformointi pElatBillä

Bacillus licheniformis-kannan T9 transformointi suoritettiin kuten on kuvattu EP-hakemusjulkaisussa 0253455 paitsi että menettely kokonaisuudessaan suoritettiin 37°C:n asemasta 30°C:ssa. Transformantit valikoitiin minimaalimaljoilla joissa kasvualusta sisälsi 20 /ug/ml neomysiiniä. Kaikki transformantit tuottivat amylaasia. Birnboimin ja Dolyn mukaan valmistetun DNA:n restriktioentsyymianalyysi osoitti, että kaikki transformantit sisälsivät pElatB:n.

ESIMERKKI 10 pElatB;n integrointi B.licheniformis T9:n kromosomiin

Plasmidin pElatB sisältävää Bacillus licheniformis-kantaa T9 siirrostettiin valmisteeseen Tryptone Soya Broth (TSB), joka sisälsi 20 /ug/ml neomysiiniä, ja inkuboitiin 16 tunnin ajan 30°C:ssa. Viiden millilitran erä solususpensiota laimennettiin 100 ml:ksi samalla kasvualustalla ja inkuboitiin 50°C:ssa 24 tunnin ajan.

« Tämä menettely toistettiin kerran. Sitten solususpensio laimennettiin satakertaisesti ja maljättiin Heart Infusion Agar-valmistemaljoihin, joissa kasvualusta sisälsi 10 /ug/ml neomysiiniä. Inkuboitiin 40 tunnin ajan 50°C:ssa, minkä jälkeen neomysiiniresistentit pesäkkeet eristettiin ja niitä viljeltiin 10 ml:ssa TSB-kasvualustaa, joka sisälsi 10 /ug/ml neomysiiniä, 16 tunnin ajan 30°C:ssa. Näistä viljelmistä eristettiin kokonais-DNA (Holmes et al_.. Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197) Plasmidien puuttuminen näistä soluista valmistettiin suorittamalla DNA:n elektroforeesi ♦ « 33 104326 agaroosigeeleissä. Näytteet, joista alhaisen molekyylipainon omaava DNA puuttui käytännöllisesti katsoen kokonaan, analysoitiin uudelleen plasmidi-DNAsn läsnäolon suhteen transformoimalla DNA:11a B.subtilis-kantaa 1A40 (Spizizen et ai., 1961). Näytteet, joilta puuttui kyky transformoida B.subtilis-kanta 1A40 neomysiiniresistentiksi, katsottiin plasmidia sisältämättömiksi.

pElatBsn mahdollisen integroitumisen ja liittyvän integroi-tumistavan tutkimiseksi transformanteista eristettiin kromosomi-DNA (Saito-Minwa, Biochem. Biophys. Acta J72 (1963) 619-532), se pilkottiin EcoRI:11ä ja pilkkomistuotteet erotettiin 0,5-%:isissa agaroosigeeleissä, tuotteet siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) ja hybridisoitiin 32p_ieimattuun nick-translatoi-tuun pGB33:een (katso EP-hakemusjulkaisu 0134048). Tämän analyysin tulokset on esitetty kuviossa 9A. Tulostiedoista ilmenee, että oli tapahtunut pElatBsn epäsäännöllistä rekom-binoitumista, mistä seurauksena saatiin kanta, joka sisälsi yhden amylaasigeenin genomin eri geenipaikassa alkuperäiseen Bacillus licheniformis T5-amylaasikantaan verrattuna. Saatu pElatBtn sisältävä kanta nimettiin TB13:ksi.

ESIMERKKI 11

Kannan T13F rakentaminen, joka sisältää kaksi amylaasigeeniä endogeenisten kromosomisekvenssien erottamana

Kannan kehittämiseksi, joka sisältää kaksi amylaasigeeniä endogeenisten kromosomi-DNA-sekvenssien erottamana, suori-• tettiin fuusioimiskoe Bacillus licheniformis-kannan T5 (alkuperäinen amylaasigeenin sisältävä kanta, ktso EP-hake-musjulkaisu 0134048) ja kannan TB13 (satunnaisesti integroitu, amylaasigeenin sisältävä kanta) välillä. Protoplastifuu-sio suoritettiin kuten on kuvattu EP-hakemusjulkaisussa 34 104326 0134048, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi. Kanta TB13 tapettiin jodoasetamidilla ennen protoplastimuodostus-ta. Kantaa T5 (neomysiiniherkkä) ei tapettu. Fuusiotuottei-den valikointi suoritettiin 10 /ug/ml neomysiiniä sisältävissä regeneroimismaljoissa.

Mahdollisten fuusiotuotteiden tutkimiseksi ja tunnistamiseksi eristettiin kromosomi-DNA, se pilkottiin EcoRI;llä, pilk-komistuotteet erotettiin 0,5-%:isissä agaroosigeeleissä, tuotteet siirrettiin nitroselluloosakalvoille -(Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) ja hybridisoitiin 32P-lei-mattuun nick-translatoituun pGB33:een (katso EP-hakemusjulkaisu 0134048). Tämän analyysin tulokset on esitetty kuviossa 9B. Saaduista fuusiotuotteista yksi, T13F, sisälsi kaksi amylaasigeeniä endogeenisten kromosomisekvenssien erottamana .

ESIMERKKI 12

Kahdennettujen amylaasigeenien stabiilisuus kannoissa T390 ja T13F

Kannan T13F, joka on kaksi kromosomaalista amylaasigeeniä solulle välttämättömien kromosomisekvenssien erottamana sisältävä kanta, stabiilisuutta verrattiin kantaan T390, joka käsittää kaksi kromosomaalista amylaasigeeniä peräkkäis-järjestelyn mukaan sijoittuneina. Kannan T390 valmistus on julkistettu EP-hakemusjulkaisussa 134048 (sivu 17, taulukko 1), jossa siihen viitataan nimellä B. licheniformis T5 (pGB33). Kantoja T13F ja T390 testattiin fermentaatio-olo-suhteissa, jolloin 0,2 ml yön yli ksvanutta TSB-viljelmää (37°C) siirrostettiin 500 ml:n ravistelupulloihin, jotka sisälsivät 100 ml tuotantokasvualustaa (katso esimerkki 7; steriloinnin jälkeen pH säädettiin 6,9:ksi lisäämällä nat-riumhydroksidia) vailla neomysiiniä. Inkuboitiinn 6 päivän 35 1 0 4 3 2 6 ajan 40°C:ssa samalla jatkuvasti ilmastaen, minkä jälkeen viljelmä analysoitiin neomysiiniresistenttien pesäkkeiden ja amylaasiaktiivisuuden suhteen. Fermentoimiskokeen tulokset on esitetty ytheenvetona seuraavassa taulukossa 2.

Taulukko 2 kanta suhteellinen neomysiiniresistenttien solujen amylaasiak- %-osuus fermentoinnin jälkeen __tiivisuus__;_ T5 100% TB13 20% 100% T13F 120% 100% T390 200%_ 88%_ * Kantaa kohden testattiin yli 1000 pesäkettä.

Sen mahdollisuuden poissulkemiseksi, että kannata T13F olisi yksi amylaasigeeni poistunut ilman samanaikaista neomysiini-geenin menetystä, T13Fsn fermentoinnista saatuja 20 pesäkettä analysoitiin. Eristettiin kromosomi-DNA 20:sta satunnaisesti valitusta pesäkkeestä ja luonnehdittiin sitä hybridi-saatiokokeiden avulla kuten edellä kuvattu. Näistä analyyseistä yhdeksästä saadut tulokset on esitetty kuviossa 10. Jokainen testattu kanta sisälsi kaksi amylaasigeeniä, minkä osoitti kaksi alfa-amylaasigeeniä sisältävien EcoRI-frag-menttien läsnäolo niiden kromosomi-DNA:ssa.

Vastakkaisesti kannan T13F geneettiselle stabiilisuudelle kanta T390 todettiin epästabiiliksi sitä fermentoitaessa, jolloin tuloksena saaduista pesäkkeistä 12% oli neomysiini-herkkiä. Yhtä näistä pesäkkeistä analysoitiin ja sen todettiin sisältävän vain yhden alfa-amylaasigeenin (kuvio 10, vyöhyke 4). Tämä osoittaa, että satunnaisesti integroituneet amylaasigeenit ovat stabiilimpia kuin peräkkäisjärjestelyn mukaan integroituneet geenit fermentaatio-olosuhteissa.

36 104326

Edelläsaatujen tuloksien perusteella on ilmeistä, että on mahdollista saada prokaryoottinen solu, jossa stabiiliin geenivahvistukseen päästään valikoimalla transformoituja soluja, joissa on tapahtunut vahvistettavan rakennegeenin vähintään kahden kopion ei-peräkkäisjärjestelyn mukainen inte groituminen. Integroituminen voi tapahtua homologisena re-kombinaationa tai epäsäännöllisenä rekombinaationa.

Kaikki tässä selityksessä mainitut julkaisut ja patenttihakemus julkaisut osoittavat viitteellisesti tämän keksinnön koskeman alan ammattilaisten teknisen taidon tason. Kaikki julkaisut ja patenttihakemusjulkaisut sisällytetään tähän viitteinä samassa määrin, kuin jos kukin yksittäinen julkaisu tai patenttihakemusjulkaisu olisi nimenomaisesti ja itsenäisesti osoitettu sisällytettäväksi viitteeksi.

Kuvattuamme keksinnön nyt kokonaisuudessaan alan keskimääräiselle ammattilaiselle lienee ilmeistä, että siihen voidaan tehdä useita muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta oheisten patenttivaatimuksien hengestä tai piiristä.

m 4 m

Claims (18)

1. Transformoitu prokaryoottinen isäntäsolu, joka käsittää vähintään kaksi jonkin DNA-sekvenssin kopiota kromo-5 somissaan sanotun DNA-sekvenssin koodatessa hydrolaasi-entsyymiä, tunnettu siitä, että mainittuja kopioita erottaa endogeeninen kromosomaalinen DNA, joka on välttämätön isäntäsolulle.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu prokary oottinen isäntäsolu, joka käsittää vähintään kaksi jonkin hydrolaasientsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin kopiota, jolloin endogeeninen, isäntäsolulle välttämätön kromosomaalinen DNA erottaa mainittuja kopioita kyseisen isän-15 täsolun genomissa, jolloin mainittu solu on tunnettu siitä, että se on tuotettu menetelmällä, jossa: yhdistetään vastaanottava isäntäsolu, joka käsittää vähintään yhden sanotun DNA-sekvenssin kopion kromosomiinsa integroituneena, (a) DNA-rakenteeseen, joka 20 käsittää vähintään yhden sanotun DNA-sekvenssin kopion ja vähintään yhden kopion jostain merkkigeenistä ja lämpö-tilaherkän toisiintumisalkukohdan tai (b) luovuttaja-isäntäsoluun, joka käsittää sanotun DNA-rakenteen, trans-formoimisolosuhteissa; 25 valikoidaan transformantin suhteen, jossa mai nittu DNA-rakenne on integroitunut sanotun transformantin kromosomiin; ja eristetään näiden transformanttien joukosta transformoituja prokaryoottisia isäntäsoluja, jotka 30 käsittävät vähintään kaksi sanotun DNA-sekvenssin kopiota ; isäntäsolulle välttämättömän endogeenisen kromosomaalisen DNA:n erottamana.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen transformoitu 35 prokaryoottinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että sanottu prokaryoottinen solu on jokin Bacillus-kanta, edullisesti jokin alkalofiilinen Bacillus-kanta, erityisesti Bacillus 104326 38 novo -kanta PB92, tai Bacillus licheniformis -isäntäkan-ta, erityisesti Bacillus licheniformis -kanta T5.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen transformoitu 5 prokaryoottinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että sanottu hydrolaasientsyymi on jokin seriiniproteaasi, mieluiten seriiniproteaasi, joka käsittää oleellisesti seuraavan aminohapposekvenssin:

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen transformoitu prokaryoottinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että Bacillus 25 novo -lajin PB92 tai Bacillus licheniformis -kannan T5 genomi käsittää sanotun DNA-sekvenssin.

6. Menetelmä transformoidun prokaryoottisen isäntäsolun valmistamiseksi, joka käsittää vähintään kaksi hydro- 30 laasientsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin kopiota endo-: geenisen, isäntäsolulle välttämättömän kromosomaalisen DNA:n erottaessa sanottuja kopioita mainitun isäntäsolun genomissa, joka menetelmä on tunnettu siitä, että siinä: yhdistetään vastaanottava isäntäsolu, joka 35 käsittää vähintään yhden sanotun DNA-sekvenssin kopion kromosomiinsa integroituneena, (a) DNA-rakenteeseen, joka käsittää vähintään yhden sanotun DNA-sekvenssin kopion ja 104326 39 vähintään yhden kopion jostain merkkigeenistä ja jonkin lämpötilaherkän toisiintumisalkukohdan, tai (b) luovut-tajaisäntäsoluun, joka käsittää sanotun DNA-rakenteen, transformoimisolosuhteissa; 5 valikoidaan transformantin suhteen, jossa mai nittu DNA-rakenne on integroitunut sanotun transformantin kromosomiin; ja eristetään näiden transformanttien joukosta transformoituja prokaryoottisia isäntäsoluja, jotka 10 käsittävät vähintään kaksi sanotun DNA-sekvenssin kopiota endogeenisen, isäntäsolulle välttämättömän kromosomaali-sen DNA:n erottamana.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että valikoimisen suorittamiseksi jonkin merkkigeenin käsittävän DNA-rakenteen sisältämää transformanttia viljellään biosidin läsnäollessa, jonka suhteen kyseinen merkkigeeni tuottaa resistenssin; ja 20 tunnistetaan ja eristetään mainituista transfor- manteista vailla plasmidia olevat transformantit.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valikoimisen suorittamiseksi 25 jonkin merkkigeenin ja jonkin lämpötilaherkän toisiintumisalkukohdan käsittävän DNA-rakenteen sisältämää transformanttia viljellään biosidin läsnäollessa ei-sallivassa lämpötilassa, ja valikoidaan mainituista transformanteista vailla 30 plasmidia olevat transformantit.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eristämisen suorittamiseksi kromosomi-DNA eristetään sanotuista transforman-35 teista; ja tämä kromosomi-DNA hybridisoidaan leimattuun koettimeen, joka käsittää sanotun DNA-rakenteen tai sen 104326 40 fragmentin, jolloin mainitut transformoidut prokaryoot-tiset isäntäsolut valikoidaan toteamalla kyseinen leima.

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu 5 siitä, että sanottu luovuttajaisäntäsolu saadaan menetelmällä, jossa: yhdistetään vailla hydrolaasientsyymiä koodaavaa DNA-sekvenssiä oleva prokaryoottinen solu mainittuun DNA-rakenteeseen fuusioimisolosuhteissa; 10 eristetään transformoituja soluja; viljellään sanottuja transformoituja soluja ei-sallivassa lämpötilassa; ja tunnistetaan ja eristetään transformoituja soluja, joissa mainittu DNA-rakenne on integroitunut 15 kromosomissa muuhun sijaintipaikkaan kuin kyseisessä vastaanottavassa isäntäsolussa.

10 H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-tMl-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-R-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-Vi-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-15 S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-C-S-T-Y-A-S-L-N-C-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-H-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH. 20 tai jokin amylolyyttinen entsyymi, erityisesti alfa-amy-laasi.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 6-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu prokaryoottinen solu on 20 jokin Bacillus, edullisesti jokin alkalofiilinen Bacil-lus-kanta, erityisesti Bacillus novo -laji PB92, tai jokin B. licheniformis -kanta, erityisesti B. lichenifor-mis -kanta T5 tai sen mutantti.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 6-11 mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että mainittu hydrolaasientsyymi on jokin seriiniproteaasi tai jokin amylaasi, erityisen edullisesti sellainen seriiniproteaasi, joka omaa nukleo-tidisekvenssin osalta vähintään 70%:n homologian Bacillus 30 novo -lajista PB92 peräisin olevaan, jotain proteolyyt-tistä entsyymiä koodaavaan geeniin nähden, erityisesti sellainen seriiniproteaasi, joka omaa oleellisesti seu-raavan aminohapposekvenssin: 104326 41 H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V- c K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-H-L-0 S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-H-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-C-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-Vf-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH. 10

13. Jonkin patenttivaatimuksista 6-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA-rakenne on plasmidi pMAX-4, jonka koko on 7,6 kb ja jonka fysikaalinen kartta on esitetty kuviossa 6B, ja joka sisältää Bacillus PB92:n 15 proteaasia koodaavan geenin, joka sisältyy Bacillus novo -lajiin PB92, lämpötilaherkän replikaation aloituskohdan, joka on peräisin plasmidista pEl94, ja neomysiiniresis-tenssigeenin, tai plasmidi pElatB, jonka koko on 8,2 kb ja jonka fysi-20 kaalinen kartta on esitetty kuviossa 8, ja joka sisältää α-amylaasia koodaavan geenin, joka sisältyy plasmidiin pGB34, joka on talletettu Bacillus subtilis -kannassa 1S-53 numerolla CBS 467.83, lämpötilaherkän replikaation aloituskohdan, joka on peräisin plasmidista pE194, ja 25 neomysiiniresistenssigeenin.

14. Jonkin patenttivaatimuksista 6-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi on integroitunut epäsäännöllisen tai homologisen rekombinaation 30 välityksellä.

15. Bacillus-kanta PBT108, tunnettu siitä, että se on saatavissa integroimalla patenttivaatimuksessa 13 määritelty plasmidi pMAX-4 Bacillus novo lajiin PB92 ja selek- 35 toimella 20 pg/ml neomysiinillä, ja että se sisältää kaksi alkalista proteaasia koodaavaa geeniä, jotka on 104326 42 erotettu toisistaan kannalle välttämättömällä kromosomaa-lisella DNA:11a.

16. Bacillus-kanta PBT122, tunnettu siitä, että se on 5 saatavissa integroimalla patenttivaatimuksessa 13 määritelty plasmidi pMAX-4 Bacillus novo lajiin PB92 ja selek-toimalla 1 pg/ml neomysiinillä, ja että se sisältää kaksi alkalista proteaasia koodaavaa geeniä, jotka on erotettu toisistaan endogeenisella, kannalle välttämättömällä 10 kromosomaalisella DNA:11a.

17. Bacillus-kanta T13F, tunnettu siitä, että se sisältää kaksi α-amylaasia koodaavaa geeniä, jotka on erotettu toisistaan endogeenisella, kannalle välttämättömällä 15 kromosomaalisella DNA:11a, ja joka on saatavissa suorittamalla protoplastifuusio B. licheniformis -kannan T5 ja B. licheniformis -kannan T9 protoplasteille, joka jälkimmäinen kanta on B. licheniformis -kannan T5 α-amylaasivajaa mutanttikanta, jonka genomiin on integroitunut pa-20 tenttivaatimuksessa 13 määritelty plasmidi pElatB.

18. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen transformoidun prokaryoottisen isäntäsolun käyttö hydrolaasient-syymin valmistamiseksi. « 104326