FI85287C - Molekulaer kloning och expression i industriella mikro-organismarter. - Google Patents

Description

85287

Molekulaarinen kloonaus ja ilmentyminen teollisissa mikro-organismilajeissa - Molekulär kloning och expression i in-dustriella mikro-organismarter

On olemassa huomattavaa mielenkiintoa teollisten yksisolu-mikro-organismikantojen käyttämiseen yhdistelmä-DNA tekniikassa isäntinä polypeptidien tuottamiseksi suurina saantoina. Useita teollisesti tärkeitä entsyymejä kuten amylolyyt-tisiä ja proteolyyttisiä entsyymejä tuotetaan Bacillus-suvun mikro-organismien avulla, esimerkkeinä B. subtilis, B. amy-loliquefaciens, B. licheniformis, B. stearothermophilus ja B. coaqulans. Fermenttoreissa käytetään kantoja, jotka ovat erittäin vahvoja ja stabiileja. Kannat ovat edelleen resistenttejä faagi-infektiolle ja lisäksi geneettiselle vaihdolle, so. DNA:n liittämiselle tavanomaisin transfor-mointimenetelmin. Tavanomaiset teolliset kannat ovat myös prototrofisiä, jotta ravintoalustaan ei tarvitsisi lisätä kalliita aminohappoja. Teollisten kantojen muita luonteenomaisia piirteitä ovat niiden suuri tuottavuus fermentoinnin loppuun saakka, joka voi kestää viikonkin, vakaa solukon-sentraatio kasvuliuoksen loppumisen jälkeen ja suuri tuottavuus, tavallisesti vähintään 0,5 % w/v eritettyä proteiinia. Lisäksi sauvabakteereilla (bacilli) on havaittu, että niillä esiintyy huomattavaa DNaasien erittymistä, niin että kasvualustan DNA:t hajoavat huomattavassa määrin.

Koska teolliset kannat ovat luonteeltaan vastustuskykyisiä geneettisille muutoksille sekä ovat prototrofisia, so. ne eivät helposti kärsi ravinnon puutteesta, ovat ne vastustuskykyisiä transformaatiolle. Olisi sen vuoksi suuriarvoista saada aikaan tehokas menetelmä DNA:n liittämiseksi teollisiin kantoihin, jolloin DNA säilyisi stabiilisti teollisessa kannassa, jonka elinvoimaisuuden ja aktiivisuuden häviötä ei esiintyisi lainkaan tai ei oleellisesti, ja voitaisiin saada suuria saantoja endogeenisiä ja eksogeenisiä polypeptidi-tai proteiinituotteita.

2 85287

Lisäksi solujen valinta on vaikeaa silloin kun isäntäsolu-jen muuntamiseen tai transformointiin sisältyy endogeenisen geenin tai aikaisemmin liitetyn geenin kopiomäärän kasvaminen, jolloin geeni ei joudu eloonjäämisvalinnan kohteeksi.

On siksi erittäin toivottavaa saada tehokas menetelmä, jossa lisägeenien (lisääntynyt kopiomäärä) läsnäolo voidaan tutkia, ja valita solut sen perusteella.

B. subtiLis-bakteerin geneettisiä manipulaatioita ovat raportoineet Yoneda et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1973) 5^:765-770; Yoneda ja Maruo, J. Bacteriol. (1975) 124:48-54; Sekiguchi et ai., J. Bacteriol. (1975) 121:688-694; Hitot-suyanagi et ai., Agric. Biol. Chem. (1979) 43:2342-2349; Yoneda, Appi. Env. Microbiol. (1980) 39^:247-276. Yhdistelmä-DNA-teknologian onnistuneita sovellutuksia on raportoitu, liittyen B. subtilis-bakteerin tiettyjen, tehokkaasti transformoitavien laboratoriokantojen tuotannon parantamiseen, esimerkkeinä alfa-amylaasit, beta-laktamaasit, dihydrofo-laattireduktaasi, interferoni ja insuliini (Palva, Gene (1982) JL9:81-87; Shinomiya et ai., Agric. Biol. Chem. (1981) 4^:1733-1735, Gray ja Chang, J. Bacteriol. (1981) 145:422-428; Williams et ai., Gene (1981) 16:199-206; Palva, Gene (1983) 22:229-235). Vaikeuksista maaperästä eristetyn Bacillus licheniformis-bakteerin geneettisessä manipuloinnissa ovat raportoineet Thorne ja Stull, J. Bacteriol.

(1966) 91:1012-1014. Ks. myös GB-patenttihakemus n:o 2091628, sekä EP-patenttihakemukset n:o 0 034 470, 0 032 238 ja 0 077 109, jotka on esitetty tässä viitteenä sikäli kuin ne koskevat pUR1523:a.

Tässä keksinnössä esitetään uusia menetelmiä ja tuotteita, jotka käsittävät geneettisesti muunnettuja yksisolu-mikro-organismikantoja, erityisesti teollisia Bacillus-kantoja. Kromosomin ulkopuolella oleva DNA, joka sisältää mielenkiinnon kohteena olevan geenin, joka pystyy ilmentymään teolli- 3 85287 sen kannan isännässä/ liitetään sopivaan bakteeri-isäntään, tarkoituksenmukaisesti teolliselle kannalle sukua olevaan laboratoriokantaan, ja muunnettu bakteeri-isäntä yhdistetään teolliseen kantaan fuusio-olosuhteissa. Mielenkiinnon kohteena olevan geenin (geenit) sisältävät teollisen kannan solut valitaan mielenkiinnon kohteena olevaan geeniin liitetyn merkin avulla.

Kuvio 1 on kaaviokuva plasmidista pGB33, kuvio 2 on kaaviokuva plasmidista pGB34, kuvio 3 on kaaviokuva plasmidista pLC28, kuvio 4 on kaaviokuva plasmidista pLC83, kuvio 5 on kaaviokuva plasmidista pLC87, kuvio 6 on kaaviokuva plasmidista pGB35, kuvio 7 on kaaviokuva plasmidista pLP33, kuvio 8 on kaaviokuva plasmidista pLP87 ja kuvio 9 on erilaisten teollisten Bacillus-kantojen erittämien tuotteiden SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeto-grammi, vertailuna proteiinien molekyylipaino-merkintäai-neet.

Tässä on esitetty menetelmiä teollisten yksisolumikro-orga-nismikantojen geneettiseksi manipuloimiseksi, käytettäväksi fermentoinnissa polypeptidituotteiden tuottamiseksi hyvällä saannolla. Bacillus-kantoja käytetään muiden mikro-organismien mallina. Tuloksena saatavilla muunnetuilla teollisilla kannoilla on edelleen teollisten kantojen toivottavat luonteenomaiset piirteet, samalla kun saadaan suurempia saantoja endogeenisten (sama laji) tai eksogeenisten (eri lajit) geenien ilmentymistuotteista.

Menetelmässä kromosomin ulkopuolinen DNA liitetään bakteeri-isäntään, joka kykenee replikoimaan DNA:n ja helposti ottaa vastaan liitettävän kromosomin ulkopuolisen DNA:n. Kromosomin ulkopuolisen aineosan sisältävä muunnettu bakteeri-isäntäsolu yhdistetään sitten teolliseen Bacillus-kantaan 4 85287 fuusio-olosuhteissa, jolloin vastaanottavat Bacillus-solut voidaan sen jälkeen valita sen mukaan, onko läsnä mielenkiinnon kohteena olevaa, kromosomin ulkopuolisesta aineosasta peräisin olevaa geeniä tai geenejä.

Tämä keksintö voidaan jakaa seuraaviin osiin: (1) sellaisen plasmidirakenteen valmistus, joka sisältää geenin (geenit), jonka (joiden) lisääntynyt ilmentyminen Bacillus-isännässä on toivottavaa; (2) plasmidirakenteen kloonaus sopivaan isäntään, jota voidaan käyttää fuusioon teollisen Bacillus-kannan kanssa; (3) plasmidirakenteen sisältävän isännän fuusio teollisen Bacillus-kannan kanssa, sisältäen tällaisen teollisen kannan valinnan; ja (4) mainitun kannan kasvattaminen sopivassa ravintoalustassa mielenkiinnon kohteena olevan geenin (geenien) ilmentymistuotteen valmistamiseksi.

Mielenkiinnon kohteena oleva geeni (geenit) voi olla mikä tahansa prokaryoottinen tai eukaryoottinen geeni. Nämä geenit voivat olla bakteerigeenejä, yksisoluisten mikro-organismien geenejä, nisäkäsgeenejä tai vastaavia. Rakennegeenit voidaan valmistaa monella tavalla, joita ovat synteesi, eristäminen perimän DNA:sta, valmistaminen cDNA:sta tai näiden yhdistelmät. Geenimanipulaation erilaiset tekniikat ovat hyvin tunnettuja ja niitä ovat restriktiohajottaminen, re-sektio, liittäminen, in vitro mutageneesi, alukkeen korjaus (primer repair), sidoksenmuodostajien ja liittäjien (adapter) käyttäminen, ja vastaavat. Siten isännästä saatuja DNA-sekvenssejä voidaan manipuloida monella tavalla, riippuen DNA-rakenteen vaatimuksista. Katso Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982.

Kun geeni saadaan isännästä, jolla on aloitus- ja päätös-säätelysignaalit transkriptiota ja translaatiota varten, jotka signaalit teollinen Bacillus-kanta tunnistaa, on ta- 5 85287 vallisesti tarkoituksenmukaista pitää yllä rakennegeenin 5'-ja 3'-oheisalueita sellaisen kistronin tuottamiseksi, joka kykenee ilmentymään teollisessa Bacillus-isännässä. Transkription aloitusalue voi aikaansaada konstitutiivisen tai indusiivisen ilmentymisen, siten, että sopivissa olosuhteissa isäntä saattaa kasvaa suureen tiheyteen ennenkuin suuria määriä mielenkiinnon kohteena olevia rakennegeenejä saadaan ilmentymään.

Silloin kun rakennegeeni tulee sellaisesta lähteestä, jonka säätelysignaaleja Bacillus ei tunnista, on välttämätöntä saada aikaan säätelyalueita, jotka Bacillus tunnistaa, ja liittää rakcnnegeenit aloitus- ja päätös-säätelysignaalien väliin. Joissakin tapauksissa eksogeeninen rakennegeeni omine lopetuskodoneineen voidaan liittää luonnollisen säätely-signaalinsa omaavan endogeenisen Bacillus-rakennegeenin lepään kodonien takana olevaan lukualueeseen. Näin saadulla tuotteella voi olla joitakin, esimerkiksi 0-30 ylimääräistä N-terminaalista aminohappoa. Vaihtoehtoisesti voidaan valmistaa operoneita, joissa yksittäinen promoottori saa aikaan lähetti-RNA:n transkription alkamisen, joka RNA koodaa lukuisia polypeptideitä.

Joissakin tapauksissa voi olla toivottavaa, että ilmentymis-tuote erittyy. Kun ilmentymistuote erittyy normaalisti ja Bacillus-isäntä tunnistaa lähtösignaalin ja käsittelysignaa-lin (signaalit), ei ilmene mitään vaikeuksia. Kuitenkin silloin kun tuote ei erity normaalisti tai Bacillus ei tunnista erityssignaaleja ja/tai käsittelysignaalia (signaaleja), so. signaalit eivät ole tyydyttävässä määrin funktionaalisia Bacillus-kannalle, voi olla välttämätöntä eristää tai syntetisoida Bacillus-polypeptidin erityssignaaleja ja käsittely-signaalia (signaaleja) koodaavia DNA-sekvenssejä ja liittää ne oikeassa lukuvaiheistuksessa olevan rakennegeenin 5'-päähän.

6 85287

Rakennegeenit voivat ilmentää lukuisia erilaisia nisäkkäistä, yksisoluisista mikro-organismeista, esim. bakteereista, sienistä, kuten hiivasta tai rihmasienistä, levistä, proto-tsooista jne., kasveista tai muista DNA-lähteistä saatavia polypeptidejä tai proteiineja, kuten entsyymejä, hormoneita, lymfokiinejä, pintaproteiineja, veriproteiineja, raken-neproteiineja, immunoglobuliineja tai vastaavia. Erityisen kiinnostavia ovat entsyymit, erittäinkin hydrolaasit ja nimenomaisesti proteaasit ja sakkaridaasit. Tyypillisiä tällaisia entsyymejä ovat endopeptidaasit, eksopeptidaasit, seriini- ja ei-seriiniproteaasit, alfa- ja beta-amylaasit, (erityisesti termostabiili alfa-amylaasi) ja vastaavat.

On olemassa lukuisia vektoreita, joita voidaan käyttää sopivaan isäntään samoin kuin Bacillus-kantaan, joissa replikointi järjestelmä voi olla sama tai eri sopivalle isännälle ja Baclllus-kannalle. (Vektorilla tarkoitetaan replikointi-järjestelmää (järjestelmiä), joka sopii yhteen yhden tai useamman isännän kanssa, tavallisesti merkkikohtaa valinnan suorittamiseksi isännässä ja ainakin yhtä sopivaa, tavallisesti yhtä ainoata, restriktiokohtaa.) Tavallisesti on tarkoituksenmukaista käyttää yhteensopivana isäntänä ei-teollista tai laboratorio-Bacillus-kantaa, vaikkei tämä ole välttämätöntä, ja joissakin tapauksissa voidaan käyttää mui-ta organismeja, kuten E. coli-bakteeri a. Vektori sisältää ' ‘ yhden tai useampia replikointijärjestelmiä siten, että se voidaan kloonata ainakin yhteensopivassa isännässä. Replikointi-järjestelmä voi aikaansaada joko suuren tai pienen määrän kopioita, edullisesti kopiomäärän, joka on vähintään n. 10 ja yleensä korkeintaan n. 100.

Riippuen siitä halutaanko rakennegeenien integraatiota teol- :Τ. liseen Bacillus-kantaan vai niiden pysyttämistä kromosomin ulkopuolisessa aineosassa, Bacillus-kannan replikointi-järjestelmä voidaan sisällyttää koko järjestelmään tai jät- 7 85287 tää siitä pois. Vaihtoehtoisesti integraation saavuttamiseksi voidaan ottaa huomioon vektori- tai plasmidirakenteen ja Bacillus-perimän homologialueet, jotta rekombinaation todennäköisyys kasvaisi.

Replikaatiojärjestelmän lisäksi on olemassa ainakin yksi merkkikohta ja niitä voi olla enemmän kuin yksi, tavallisesti ei enempää kuin n. kolme merkkikohtaa. Merkkikohdal-la tarkoitetaan rakennegeeniä, joka pystyy ilmentymään isännässä, aikaansaaden eloonjäämisvalinnan. "Eloonjäämis-valinnalla" tarkoitetaan prototrofian aikaansaamista auk-sotrooppisessa isännässä, biosidi- tai virusresistenssiä. Prototrofian saavuttamiseksi voidaan käyttää eri geenejä, kuten leu, ura, trp tai vastaavia. Biosidiresistenssiä varten tämä voi käsittää antibioottiresistenssin, esim. neo, cam, tet, tun, kan tai vastaaviin. Muut merkkikohdat sisältävät resistenssin raskasmetalleihin, immuniteetin ja vastaavia. Eri DNA-sekvenssit voidaan johtaa erilaisista lähteistä ja liittää yhteen, jotta saataisiin aikaan vektori, joka sisältää yhden tai useampia sopivia, mieluimmin ainutlaatuisia restriktiokohtia, rakennegeenien liittämiseksi tai korvaamiseksi tällaisissa kohdissa tai puuttuvien fragmenttien kohdissa, plasmidirakenteen aikaansaami-. .· seksi.

Kun plasmidirakenne on valmistettu, se voidaan kloonata sopivaan yhteensopivaan isäntään, jota kutsutaan yhteensopivaksi tai kloonausisännäksi. Mitä tahansa isäntää voidaan käyttää, joka on sopiva, helposti transformoitava ja sallii plasmidirakenteen replikoitumisen ja siirtämisen teolliseen Bacillus-kantaan fuusion avulla. Käytettävissä on suuri ''*· määrä laboratoriokantoja, joilla on suuri transformaatiote- hokkuus ja jotka ovat tavallisesti auksotrofisia ja/tai .λ antibioottiherkkiä. Bacillus-isännän käytöllä plasmidira kenteen kloonauksessa on monia etuja sikäli että silloin s 85287 voidaan käyttää yksinkertaista replikointijärjestelmää sekä samaa merkkikohtaa eloonjäämisvalintaa varten sekä yhteensopivassa isännässä että teollisessa kannassa. Siten useimmiten plasmidirakenne kloonataan sopivaan Bacillus-isäntään. Bacillus-isännän ei tarvitse olla samaa Bacillus-kantaa kuin teollinen isäntä ja se valitaan ensisijaisesti tarkoituksenmukaisuuden perusteella. Plasmidirakenne voidaan liittää yhteensopivaan isäntään tavanomaisten menetelmien avulla, kuten transformaation avulla, käyttäen kalsium-saostettua DNA:ta, konjugaation avulla tai muulla sopivalla tekniikalla. Yhteensopiva isäntä voi sitten kasvaa sopivassa ravinto-alustassa, selektiivisissä olosuhteissa plasmidirakenteen sisältävän isännän valitsemiseksi. Auksotrooppisia isäntiä varten ravintoalustasta puuttuu haluttua ravintoainetta, kun taas biosidiresistenssiä varten sytotoksinen määrä biosidia (biosideja) esim. antibioottia (antibiootteja) käytetään ravintoalustassa. Kun yhteensopiva isäntä on kasvanut riittävään tiheyteen, se käsitellään solujen valmistamiseksi fuusiota varten.

Tarkoituksenmukaisesti solut tapetaan sytotoksisella aineella ennen protoplastien muodostumista tai niiden muodostumisen aikana. Voidaan käyttää eri aineita, mukaanlukien antibiootit, mutta jodiasetamidin on havaittu olevan sopivan ja tehokkaan eikä se häiritse seuraavaksi tapahtuvaa fuusiota. Protoplastit valmistetaan soluista tavanomaisten menetelmien mukaisesti, esim. lysotsyymi- tai tsymolyaasikäsittelyllä, ja protoplastit suspendoidaan varovaisesti sopivaan väliaineeseen, jolla on sopiva osmolaliteetti protoplastien säilyttämiseksi ehyinä.

Teollinen vastaanottava Bacillus-kanta käsitellään myös p r o t opi a s t i en muodostamiseksi samalla tavalla kuin yhteen-sopiva isäntäkanta, mutta protoplastien valmistamiseksi 9 85287 käytetään eläviä soluja. Voidaan käyttää eri Bacillus-kantoja, joilla on teollisen Bacillus-kannan halutut ominaisuudet, kuten seuraavia: subtllis, licheniformis, amy-loliquefaciens, stearothermophilus ja coaqulans, edullisesti licheniformis ja subtllis. Teolliset Bacillus-kannat valitaan organismeista, jotka voidaan eristää maaperästä tai ovat saatavissa talletuslaitoksista tai muista lähteistä tai saadaan muuntamalla sellaisia Bacillus-kantoja. Teollisille Baclllus-kannoille on tunnusomaista, että ne ovat resistenttejä geneettiselle vaihdolle, kuten faagi-infektiolle tai transformaatiolle. Kannat ovat stabiileja ja voivat kyetä itiönmuodostukseen tai ne voivat olla kykenemättömiä siihen. Ne ovat prototrofisia ja niistä saadaan suurilla saannoilla endogeenisiä proteiinituotteita, kuten sellaisia entsyymejä kuin alfa-amylaasi ja eri proteaasit. Niiden on myös havaittu erittävän DNaa-seja, jotka aiheuttavat DNA:n hajoamisen väliaineessa, suoden siten suojan geneettistä vaihtelua vastaan.

Kuollut yhteensopivan isännän protoplasti ja elävä teollisen Bacillus-isännän protoplasti yhdistetään sopivan fuusioivan aineen läsnäollessa. Vaikka mitä tahansa halutun tehon antavaa fuusioivaa ainetta voidaan käyttää, useimmiten polyeteeniglykolin on havaittu aikaansaavan suuren fuusiotehokkuuden ja se on hyvin tarkoituksenmukainen. Kuolleen protoplastin suhde vastaanottavaan Baclllus-kantaan on edullisesti vähintään 1:1 ja voidaan käyttää kuolleen protoplastin ylimääriä. Lyhyen ajan kuluttua fuu-sioivan aineen seos korvataan sopivalla ravintoalustalla ja soluilla, jotka ovat regeneroituneet selektiivisellä alustalla, tarkoituksenmukaisesti maljäämällä agar-maljalle. Kloonit voidaan sitten seuloa sopivilla tavoilla ylimääräisten rakennegeenien ilmentymisen tutkimiseksi. Voidaan käyttää eri tekniikoita, erityisesti silloin kun kyseessä oleville entsyymeille on olemassa vakiintuneet 10 85287 tutkimusmenetelmät. Vaihtoehtoisesti, kun kysymyksessä eivät ole entsyymit tai ei ole saatavissa tutkimussystee-miä, voidaan käyttää vasta-aineita, DNA- tai RNA-hybri-disaatiota tai bioanalyysejä kloonien seulomiseksi plasmi-dirakenteen läsnäolon ja mielenkiinnon kohteena olevan ra-kennegeenin (geenien) ilmentymisen määrittämiseksi.

Teollista Bacillus-isäntää, joka sisältää plasmidiraken-teen tai kromosomaalisesti integroituneita plasmidiraken-teita tai niiden fragmentteja, kasvatetaan sitten ravinto-alustassa tavanomaisissa käymisolosuhteissa. Käymistä voidaan jatkaa kunnes alusta on käytetty loppuun. Kun tuotetta on erittynyt, se voidaan eristää alustasta tavanomaisilla tekniikoilla, esim. uuttamalla, kromatografiällä, elektroforeesilla tai vastaavilla. Kun tuote on jäänyt sytoplasmaan, solut voidaan kerätä sentrifugoimalla, suodattamalla jne., lyysoida mekaanisella murskauksella, deter-gentillä, lysotsyymillä tai muilla menetelmillä ja tuote eristää kuten edellä on selitetty. Käyttämällä tässä esitettyä menetelmää voidaan saada suuresti lisääntyneitä saantoja endogeenisiä polypeptidejä, tavallisesti vähintään n. 150 % kantasolun saannosta, tavallisemmin vähintään 175 % ja edullisesti vähintään 200 % kantasolun saannosta.

Seuraavat esimerkit esitetään keksintöä kuvaavina.

Esimerkki I

Kromosomaalisen DNA:n eristäminen B. licheniformis-bakteerin teollisen kannan T5 kromosomaali-nen DNA, joka on talletettu Centraal Bureau voor Schimmel-cultures-talletuslaitokseen Oosterstraat 1, Baarn, the 11 85287

Netherlands (tästälähin CBS) 6.7.1983 numerolla 470.83, eristettiin 3L-viljelmistä, joita kasvatettiin yli yön 37 °C:ssa ilmastaen. Solut sentrifugoitiin (10000 rpm, 10 min) Sorvali GSA-roottorilla, suspendoitiin 10 ml:aan sakkaroosi-Tris-puskuria, joka sisälsi 25 % w/v sakkaroosia ja 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, ja lyysoitiin lisäämällä 0,5 ml lysotsyy-miliuosta (20 mg/ml) ja inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C:ssa. Kun oli lisätty 2 ml EDTArta (0,5 M) ja inkuboitu 5 minuuttia 0 °C:ssa, lisättiin 1 ml 20 % (w/v) natriumdodekyylisul-faattia (SDS). Suspensio uutettiin sitten 1:1 fenoli-kloro-formi-seoksella. Supernatantti erotettiin ja sen päälle kaadettiin varovasti 2 tilavuutta puhdasta etanolia, minkä jälkeen DNA eristettiin lasisauvan avulla. Kun DNA-suspensio oli liuotettu tislattuun veteen, joka sisälsi 10 pg/ml ribo-nukleaasia, se uutettiin 1:1 fenoli-kloroformilla, saostet-tiin kahdella tilavuudella etanolia ja suspendoitiin uudelleen TE-puskuriin (so. 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, joka sisälsi 1 mM EDTA:ta).

Esimerkki II

Plasmidi-DNA:n eristäminen B. subtilis-kantaa 1G 20, joka sisälsi plasmidin pUBHO (vrt, EP-patenttijulkaisu 0 021 468), kasvatettiin yli yön IL penassay-lihaliemialustassa, johon oli lisätty 5 μΐ/ml neomysiiniä. Kun oli sentrifugoitu 15 minuuttia 5000 rpm Sorvali GSA-roottorilla ja suspendoitu uudelleen 15 ml:aan sakkaroosi-Tris-puskuria, solut lyysoitiin ja käsiteltiin EDTA:11a ja SDS:llä, kuten esimerkissä I on esitetty. Kun oli lisätty NaCl:a lopulliseen konsentraatioon 1 M, super-natanttia säilytettiin yli yön 4 °C:ssa ja sentrifugoitiin sitten 45 minuuttia 12500 rpm Sorvali SS 34 roottorissa. Ylempi 70 % (v/v) supernatantista käsiteltiin 20 pg/ml:lla DNaasivapaata RNaasia (0,5 tuntia 37 °C:ssa) ja uutettiin fenoli-kloroformi-seoksella (1:1), minkä jälkeen uutettiin pelkällä kloroformilla.

12 85287 DNA seostettiin uutetusta supernatantista lisäämällä 0,2 tilavuutta 5 M NaCl ja 0/25 tilavuutta 40 %:sta (w/v) poly-eteeniglykolia 6000, minkä jälkeen inkuboitiin 16 tuntia 4 °C:ssa. Kun oli saostettu ja sentrifugoitu (30 min, 12500 rpm, Sorvali SS 34-roottori), DNA suspendoitiin uudelleen 2-3 ml:aan TE-puskuria (kuten esimerkissä I) ja 4 M NaOH:n avulla valmistettiin dispersio, jonka pH oli 12,0. pH säädettiin sitten arvoon 8,5 ja suspensio uutettiin fenolilla. Kun uute oli saostettu etanolilla, plasmidi-DNA suspendoitiin uudelleen pieneen tilavuuteen TE-puskuria.

Plasmidi-pUR1523-DNA (EP-julkaisu A-77109) E. coli-bakteerista eristettiin menetelmän mukaisesti, jonka ovat esittäneet Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res. (1979) 2Σ 1513-1523.

Esimerkki III

a) Alfa-amylaasia sisältävien yhdistelmäplasmidien pGB33 ja pGB34 rakentaminen (kuviot 1 ja 2)

5 yg kromosomaalista DNA:ta, eristetty Bacillus-tuotanto-kannasta T5 (kuten on selitetty esimerkissä I) ja 1 yg pUB110:aa, eristetty B. subtilis 1G 20:stä (kuten esimerkissä II on esitetty) hajotettiin EcoRltlla. Kun restrik-tioentsyymiä oli lämpödenaturoitu 7,5 minuuttia 65 °C:ssa, DNA saostettiin etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 20 yl:aan ligaasiseosta, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl:a, pH

7,6, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolia (DTT), 0,2 mg/ml naudan seerumialbumiinia, 0,5 mM ATP:tä ja yhden yksikön T4~ligaasia (Boehringer-Mannheim). Seosta liitettiin yli yön 4 °C:ssa. Liitännäisseos siirrettiin B. subtilis-kasvustoon, kuten esimerkissä IV jäljempänä on selitetty. Plasmidi-DNA eristettiin (käyttäen esimerkissä II esitettyä menetelmää) valituista yhdistelmä-mikro-organismeista ja analysoitiin restriktio-endonukleaasien avulla. Plasmi- 13 85287 di pGB33 oli pUBllOrn ja n. 3 kbp:n pituisen, alfa-amylaa-sikistronin sisältävän EcoRI-fragmentin yhdistelmä. Hajottamalla pGB33 restriktio-endonukleaasien Hindlll ja BamHI, ja sen jälkeen resektoimalla S^-eksonukleaasilla ja liittämällä T4;ngr saatiin pGB34 (kuvio 2), jossa edelleen on alfa-amylaasikistroni, mutta ei monia hankalia restriktiokohtia sisältävää DNA-segmenttiä. Plasmidit pGB33 B. subtilis 1-85:ssä (= trp“) ja pGB34 B. subtilis lS-53:ssa (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio, U.S.A.) talletettiin CBS:ään 6. 7.1983 numeroilla 466.83 ja 467.83, vastaavasti.

b) Kymosiinia sisältävien yhdistelmäplasmidien pLC28, pLC83 ja pLC87 rakentaminen (kuviot 3, 4 ja 5).

0,5 yg pGB34-DNA:ta ja 0,5 g pUR1523:a, joka on E. coli-plasmidi, joka sisältää naudan kymosiinigeenin, hajotettiin PstI:llä. Lämpödenaturoinnin ja liittämisen jälkeen, kuten esimerkissä lila on selitetty, seosta käytettiin transformaatioon. Valituista transformanteista eristetty plasmidi-DNA (käytetään valintamenetelmää, joka on selitetty jäljempänä esimerkissä IV) analysoitiin restriktio-endonukleaasien avulla. Valittu plasmidi, jota kutsutaan pLC28:ksi, oli pUR1523:n kymosiinigeenin sisältävän Pstl-fragmentin yhdistelmä, liitettynä pGB34:n ainoaan Pstl-kohtaan (kuvio 3). Pilkkomalla pLC28 restriktio-endonuk-leaasilla Clal, ja sen jälkeen resektoimalla eksonukleaa-si-Bal31:llä ja liittämällä T4~ligaasilla, saatiin pLC83 (kuvio 4), joka sisältää kymosiinin geenin, muttei enää useita hankalia restriktiokohtia sisältävää DNA-segment-tiä. Plasmidit pLC28 ja pLC83, molemmat B. subtilis lS-53:ssa, talletettiin CBS:ään 6.7.1983 numeroilla 469.83 ja 468.83, vastaavasti.

Kymosiinigeenin sijoittamiseksi alfa-amylaasin transkriptio- ja translaatio-aloitus-säätelysekvenssien takana ole- i4 85287 valle alueelle pLC83 hajotettiin Pstlrllä, resektoitiin S^-nukleaasilla ja liitettiin T^-ligaasilla. Saatu plasmi-di nimitettiin pLC87:ksi, ja sekvenssianalyysillä siinä osoitettiin olevan oikea järjestys ja orientaatio (katso kuvio 5).

c) Proteaasia sisältävien yhdistelmäplasmidien pLP33 ja pLP87 rakentaminen (kuviot 7 ja 8) 100 μ g proteaasia tuottavan B. subtilis 168-kannan (Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, Ohio) kromoso-maalista DNA:ta hajotettiin osittain restriktioentsyymillä Clal♦ Fenoliuuton jälkeen DNA-fragmentit erotettiin 1 %:sella agaroosigeelillä. Useita DNA-fraktioita eluoitiin geelistä elektroeluution avulla ja liitettiin Clal:llä linear isoidulla pGB35:llä (yhdistelmäplasmidi, joka sisältää Bacillus-vektorin pGL112, W.M. de Vos, väitöskirja University of Groningen 1983, ja pGB33:n alfa-amylaasigeenin ks. kuvio 6). Liittymistuotteet siirrettiin tarkoitukseen sopiviin B. subtilis RUB331-soluihin esimerkissä IV esitetyllä tavalla. Saadut kloramfenikoliresistentit transfor-mantit analysoitiin kasvaneen proteaasiaktiivisuuden suhteen (prot+) ja alentuneen alfa-amylaasin tuotantokyvyn suhteen (amy“) (ks. esimerkki IV) 0,4 % kaseiini-amyloosi-levyillä. Plasmidi-DNA eristettiin prot+amy“-transforman-teista ja restriktiokohdat kartoitettiin; pLP33 näyttää sisältävän 3,3 kbp:n Clal-fragmentin (kuvio 7), mikä sisältää rakennegeenikoodauksen seriiniproteaasille. pLP87:llä (kuvio 8) on kromosomaalinen 1,8 kbp:n Clal-insertti, joka sisältää geneettisen informaation ei-seriiniproteaasille.

15 85287

Esimerkki IV

Bacillus-kantojen transformaatio B. subtilis 1-85 (trp-amy-) transformoitiin inkuboimalla l ml solususpensiota ja 1 g liitettyä DNA:ta 0,5 tunnin ajan 37 °C:ssa kevyesti ravistellen (Anagnostopoulos ja Spizizen, J. Bacteriol. (1961) £1:741-746). Transformantit valittiin antibioottisen resistenssin perusteella minimi-alusta-agarlevyillä, joihin oli lisätty 0,02 % (w/v) kasa-minohappoja (Difco) ja 10 yg/ml antibioottia. Nämä transformantit analysoitiin sitten halutun rakennegeenin läsnäolon perusteella.

Alfa-amylaasin ollessa kyseessä tämä suoritettiin etsimällä halo-renkaita kun levyt oli peitetty liuoksella, joka sisälsi 0,6 % (w/v) KI:a ja 0,3 % (w/v) I2:a; positiivisella hybridisaatiolla 32P-leimattuun DNA-koettimeen, joka on syntetisoitu in vitro biologisesti aktiivisen entsyymin N-terminaalisen aminohapposekvenssin mukaisesti; immuuni-saostuksella entsyymin vastaisten antibodien kanssa ja vertailevalla isoelektrofokusoinnilla.

.. Kymosiinin ollessa kyseessä positiivinen valinta suoritet tiin hybridisaatiolla 32P-leimatun pUR1523-DNA:n kanssa ja immuunisaostuksella antikymosiinivasta-aineiden kanssa.

Bacillus-proteaasin geenin identifioimiseksi transformantit testattiin sen suhteen, kykenevätkö ne muodostamaan ha-lorenkaita kaseiini-minimaalialusta-agarlevyillä. Ero seriini- ja ei-seriiniproteaasien välillä määritettiin Scheinerin ja Quigleyn esittämällä menetelmällä (Anal. Blo-chemistry (1982) 122:58-69).

Valittuja transformantteja käytettiin donorikantoina solu-fuusiokokeissa .

i6 8 52 87

Esimerkki V

Solufuusio ja reqeneraatio

Transformoitua B. subtilis-kantaa (pGB33:a sisältävä B. subtilis-kanta 1-85, pLC87:a sisältävä B. subtilis-kanta 1S-53 tai pLP33:a sisältävä B. subtilis-kanta RUB331) kasvatettiin yli yön 50 ml:ssa NBSG-X-kasvualustaa® (Thorne ja Stull, J. Bacterlol. (1966) 91:1012-1020 (taulukko II, sivu 1014)), jossa oli asiaankuuluvaa antibioottia, 37 °C:ssa. Viljelmät laimennettiin 1:1 tuoreella NBSG-X-alustalla ja kasvatettiin vielä 1-1,5 tuntia, kun läsnä oli 10 mM jodiasetamidia. Kun on sentrifugoitu 10 minuuttia 5000 rpm Sorvali GSA-roottorilla ja suspendoitu uudelleen 10 ml:aan SMM-puskuria, joka sisälsi 1,5 M sakkaroosia, 0,06 M MgCl2 ja 0,06 M maleaattia, solut saatettiin protoplasteiksi inkuboimalla soluja 2 tuntia 37 °C:ssa, kun läsnä oli 2 mg/ml lysotsyymiä. Protoplastit sentrifu-goitiin (10 min. x 5000 rpm), suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan SMML-puskuria (L-lihaliemi, johon on liuotettu 1,5 M sakkaroosia, 0,06 M MgCl2 ja 0,006 M maleaattia), sekoitettiin ja sentrifugoitiin uudelleen. Kun protoplastit oli uudelleen suspendoitu, ne sekoitettiin vastaanot-tajakannan T5 protoplasteihin, elävät solut saatettiin protoplasteiksi kuten yllä on selitetty, ja inkuboitiin 2 minuuttia n. 30 %:sen (w/v) polyeteeniglykolin 6000 läsnäollessa. Kun oli laimennettu SMML-kasvualustalla 1:3 ja sentrifugoitu, sakka suspendoitiin uudelleen pieneen tilavuuteen SMML-kasvualustaa. Sitten 100 yl:n eriä maljattiin regeneraatio-agar-maljoille, jotka sisälsivät 0,7 % (w/v) K2HP04, 0,3 % (w/v) KH2P04, 0,125 % (w/v) (NH4)2S04, 0,035 % (w/v) MgS04.7H20, 1,5 % (w/v) agaria, 3,7 % (w/v) KC1, 0,1 % (w/v) glukoosia, 0,01 % (w/v) naudan seerumialbumii-nia lisättynä 0,1 %:seen itiöliuokseen, joka sisälsi 0,2 % (w/v) MnS04, 0,2 % (w/v) ZnS04, 0,2 % (w/v) CoCl2, 0,5 % i7 85287 (w/v) FeS04· (w/v) NaCl ja 0,5% (w/v) CaCl2· Lisäksi nämä maljat sisälsivät asiaankuuluvan antibiootin, pGB33:n, pLP33:n ja pLC87:n ollessa kysymyksessä 100-160 yg/ml neomysiiniä. Kun oli inkuboitu 37 °C:ssa ainakin 72 tuntia, maljoista tehtiin jäijennösmaljät heart-infuusio-agar-maljoille, jotka sisälsivät myös toista antibioottia, jolle vastaanottajakanta on resistentti, mutta jolle dono-rikanta on herkkä. Fuusiotuotteet, joita nimitettiin tyyppi A:ksi analysoitiin esimerkissä IV esitettyjen menetelmien mukaisesti. Alfa-amylaasin ollessa kyseessä menetel-mävaiheet toistettiin seuraavasti. Tyyppiä A olevat fuusiotuotteet fuusioitiin B. subtilis-protoplastien kanssa, jotka sisälsivät pGB36:a (pTLl2:n yhdistelmäplasmidi, joka sisältää geenin, joka koodittaa trimetoprim-resistenssiä (Tanaka ja Kawano, Gene (1980) 10:131-136) ja pGB33:n Eco-RI restriktiofragmentin, joka sisältää B. licheniformis-alfa-amylaasia koodaavan geenin), jolloin saadaan fuusio-tuotteita, joita kutsutaan B-tyypin fuusiotuotteiksi. Sekä tyypin A että B fuusiotuotteet karakterisoitiin perimäana-lyysillä käyttäen 32p-leimattua plasmidia pGB33 ja vertailevalla SDS-geelielektroforeesilla. Lopuksi saadut fuusio-tuotteet valittiin sen perusteella mitä eri entsyymejä ne fermentatiivisesti tuottavat.

Esimerkki VI

Alfa-amylaasin, proteaasin ja kymosiinin fermentatiivinen tuottaminen geneettisesti manipuloitujen Bacillus-tuotanto-kantojen avulla

Geneettisesti manipuloitua tuotantokantaa B. licheniformis T5, joka on saatu fuusiolla B. subtilis-kannan 1-85 kanssa ja joka sisältää pGB33:a (kuten on selitetty esimerkissä V), kasvatettiin 7 päivää teollisessa ravintoainealus-tassa sellaisissa fermentointiolosuhteissa, että eritetyn ie 6 5287 proteiinin tuotanto on ainakin 0,5 % (w/v), alfa-amylaasin ollessa pääaineosa. Tämän manipuloidun kannan tuotantoa verrattiin emokannan, B. licheniformis T5, tuotantoon. Kuten tuotantokannan B. licheniformis T5 (ks. kuvio 9, kaista 3) erittämien tuotteiden ja geneettisesti manipuloidun kannan B. licheniformis T5 (ks. kuvio 9, kaista 2), joka sisältää pGB33:n, erittämien tuotteiden SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforetogrammista käy ilmi, alfa-amylaasin tuotanto lisääntyi merkitsevästi, kun lisättiin plasmidi pGB33.

Vertailukelpoisia tuloksia saatiin plasmidilla pLP33, jonka liittäminen lisäsi proteaasin tuotantoa ja plasmidilla pLC87, jonka liittäminen johti B. licheniformis T5-kan-taan, joka kykenee tuottamaan kymosiinia.

Taulukossa I esitetään yhteenvetona tulokset kunkin geneettisesti manipuloidun mikro-organismin aikaansaaman lisäyksen määrästä.

19 85287

Taulukko I

Organismi Plasmidi Alfa-amylaasin tuotanto B. licheniformis T5 - 100 % * B. licheniformis T5 pGB33 180 % ** B. lich. T5 (Tyyppi A) pGB36 230 % ***

Organismi Plasmidi Proteaasin tuotanto B. licheniformis T5 - 100 % B. licheniformis T5 pLP33 145 %

Organismi Plasmidi Kymosiinin tuotanto B. licheniformis T5 - B. licheniformis T5 pLC87 + * 1 alfa-amylaasigeeni, ** 2 alfa-amylaasigeeniä, *** 3 alfa-amylaasigeeniä.

Tämä menetelmä on osoittautunut hyvin onnistuneeksi Bacillus-bakteerilla. Kuitenkin useita muitakin yksisoluisia mikro-organismeja kuin Bacillusta käytetään teollisessa fermentoinnissa ja niillä on samanlaisia ominaisuuksia kuin teollisilla Bacillus-kannoilla, jotka ominaisuudet tekevät ne vastustuskykyisiksi tehokkaalle transformaatiolle. Sen vuoksi tätä menetelmää voidaan soveltaa muiden 20 8 5 2 87 prokaryoottisten ja eukaryoottisten organismien teollisiin kantoihin, kuten muiden bakteerien, sienten, esim. hiivojen ja rihmasienten, prototsooien, levien jne. kantoihin. Sellaisten sukujen kuin Aspergillus, Candida, Escherichia, Kluyveromyces, Penicillium, Pseudomonas, Saccharomyces ja Streptomyces lajit ovat erityisen kiinnostavia.

Erityisen kiinnostavaa näissä organismeissa ja osaltaan kuten on osoitettu Bacillus-bakteerille, on endogeenisten polypeptidien, kuten alfa-amylaasien, amyloglukosidaasien, katalaasien, sellulaasien, kymosiinien, beta-galaktosidaa-sien, glukoosi-isomeraasien, hemisellulaasien, invertaa-sien, laktaasien, lipaasien, pektinaasien, pektiinieste-raasien, penisilliiniamidaasien, penisillinaasien, prote-aasien, ekso- ja endopeptidaasien, pullulanaasien ja ksy-lanaasien teollinen tuotanto. Kiinnostavia ovat myös ekso-geeniset proteiinit kuten nisäkkäiden veriproteiinit, esim. tekijä Vili, sekä C että R, seerumialbumiini, kudos-plasminogeeniaktivaattori, muut veri-tekijät, esim. v, VI, VII, IX, X, XI ja XII, lymfokiinit, interferonit, esim. alfa-, beta- ja gamma-, nisäkäsentsyymit, solun pintare-septorit, immunoglobuliinit jne.

Yllä esitettyjen tulosten perusteella on ilmeistä, että on esitetty yksinkertainen ja tehokas menetelmä homologisten ja heterologisten geenien liittämiseksi stabiilisti teollisiin Bacillus-kantoihin, samalla kun kantojen halutut ominaisuudet säilyvät, ja pidetään yllä solujen parantunutta kykyä haluttujen, Bacillus-isännän endogeenisten il-mentymistuotteiden lisääntyneeseen tuotantoon tai uusien mielenkiinnon kohteena olevien ilmentymistuotteiden tuotantoon. Saavutetaan suuri siirtotehokkuus ja kun plasmi-dirakenteen ja teollisen Bacillus-kannan kromosomin välillä esiintyy oleellista homologiaa, voidaan saavuttaa rakennegeenien yksin- tai moninkertaisen kopion integraa- 2i 85287 tio. Tämä menetelmä lisää suuresti mahdollisuuksia nykyisin olemassaolevien teollisten Bacillus-kantojen modifioi-miseksi, monenlaisten mielenkiinnon kohteena olevien poly-peptidien ja proteiinien tehokkaan fermentatiivisen tuotannon aikaansaamiseksi.

Vaikka edellä esitettyä keksintöä on selitetty yksityiskohtaisesti kuvauksin ja esimerkein, jotta se olisi selvä ja ymmärrettävä, on selvää, että tiettyjä muutoksia ja modifikaatioita voidaan suorittaa tähän liittyvien patenttivaatimusten suojapiirin puitteissa.

Claims (21)

22 8 5 287

1. Menetelmä mielenkiinnon kohteena olevan proteiinin tai polypeptidin stabiiliin säilyttämiseen ja ilmentämiseen teollisessa Bacillus-isäntäkannassa kykenevän DNA:n tehokkaaksi liittämiseksi kyseiseen teolliseen isäntäkantaan, jolloin mainitulle teolliselle Bacillus-isäntäkannalle on tunnusomaista se, että se on prototrofinen, resistentti geneettiselle vaihdolle ja faagi-infektiolle tai transformaatiolle, se erittää DNaaseja ja tuottaa ainakin 0,5 % w/v eritettyä proteiinia teollisissa fermentointiolosuhteissa, tunnet-t u siitä, että menetelmässä yhdistetään fuusioivan aineen läsnäollessa ensimmäiset helposti transformoitavat, yhteensopivat isäntäsolut, jotka sisältävät mainittua DNA:ta kromosomin ulkopuolisena elementtinä, joka kykenee säilymään kyseisen ensimmäisen isännän soluissa, ja mainitun teollisen Baclllus-isäntäkannan solut, olosuhteissa, jotka mahdollistavat näiden teollisten Bacillus-isäntäkantojen valinnan, jolloin mainitut ensimmäiset isäntäsolut ja kyseisen teollisen Bacillus-isäntäkannan solut ovat protoplasteina, ja jolloin mainittu DNA siirretään kyseisen teollisen Bacillus-isäntäkannan soluihin; ja valitaan tätä DNA:ta sisältävät Baclllus-isäntäkannan solut.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että teollinen Bacillus-kanta on Bacillus liche-nlformis.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi on kyseisen Bacillus-kannan endogeeninen entsyymi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että mainittu endogeeninen entsyymi on alfa-amy-laasi, mieluiten termostabiili alfa-amylaasi, tai proteaasi. 23 8 5 2 8 7

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että teollinen Bacillus-isäntäkanta on resistentti plasmidilla, faagilla tai kosmidilla suoritetulle geneettiselle muuntelulle.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä sellaisen teollisen Bacillus-kannan tuottamiseksi, jolla on lisääntynyt kyky tuottaa haluttua proteiinia tai polypeptidiä, tunnettu siitä, että tässä menetelmässä (a) fragmentoidaan haluttua proteiinia tai polypeptidiä koo-daavan geenin sisältävä DNA, (b) liitetään vektori mainittuun fragmentoituun DNA:hän, (c) transformoidaan ensimmäisiin isäntäsoluihin nämä liitetyt vektorit, (d) valitaan transformoidut solut halutun geenin läsnäolon ja vaihtoehtoisesti ilmentymisen perusteella ja vaihtoehtoisesti inaktivoidaan mainittujen transformoitujen ensimmäisten isäntäsolujen protoplastit, (e) fuusioidaan valittujen teollisten Bacillus-isäntämikro-organismisolujen protoplastit ja mainitut vaihtoehtoisesti inaktivoidut transformoitujen ensimmäisten isäntä-solujen protoplastit ja (f) valitaan ja regeneroidaan fuusioidut solut, jotka sisältävät haluttua polypeptidiä tai proteiinia koodaavan geenin, ja joilla on lisääntynyt kyky tuottaa haluttua proteiinia tai polypeptidiä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että haluttua proteiinia tai polypeptidiä koodaavan geenin sisältävä DNA fragmentoidaan yhdellä tai useammalla restriktioentsyymillä.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut ensimmäiset isäntäso-lut tapetaan ennen protoplastinmuodostusta tai sen aikana. 24 85287

9. Menetelmä mielenkiinnon kohteena olevan polypeptidin stabiiliin säilyttämiseen ja ilmentämiseen teollisessa Baclllus-isäntäkannassa kykenevän DNA:n tehokkaaksi liittämiseksi mainittuun teolliseen Bacillus-isäntäkantaan, jolloin mainitulle teolliselle Bacillus-isäntäkannalie on tunnusomaista se, että se on prototrofinen, resistentti geneettiselle vaihdolle ja faagi-infektiolle tai transformaatiolle, se erittää DNaaseja ja tuottaa ainakin 0,5 % w/v eritettyä proteiinia teollisissa fermentointiolosuhteissa, tunnettu siitä, että menetelmässä yhdistetään fuusioivan aineen läsnäollessa ensin tapetut, helposti transformoitavat, yhteensopivat Bacillus-isäntäsolut, jotka sisältävät kyseistä DNA:ta plasmidirakenteena, jossa on Bacillus-kannassa toimimaan kykenevä replikointijärjestelmä, ja mainitut teollisen Bacillus- isäntäkannan solut, jolloin mainitut solut ovat proto-plasteina, ja jolloin kyseinen DNA siirretään mainitun teollisen Bacillus-isäntäkannan soluihin; ja valitaan tätä DNA:-ta sisältävät teollisen Bacillus-lsäntäkannan solut.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että mainittu teollinen Baclllus-isäntäkanta on Bacillus lichenlformls.

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen mielenkiinnon kohteena oleva polypeptidi on Bacillus-bakteerin endogeeninen entsyymi.

12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kyseinen mielenkiinnon kohteena oleva polypeptidi on Bacillus-bakteerin eksogeeninen entsyymi.

13. Jonkin patenttivaatimuksista 9-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen DNA integroituu mainitun teollisen Bacillus-lsäntäkannan kromosomiin.

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että mainittu entsyymi on alfa-amylaasi, mieluiten termostabiili alfa-amylaasi, tai proteaasi. 25 85287

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kyseinen entsyymi on kymosiini.

16. Menetelmä mielenkiinnon kohteena olevan polypeptidin tuottamiseksi teollisessa Bacillus-isäntäkannassa, jolloin mainitulle teolliselle Bacillus-isäntäkannalle on tunnusomaista se, että se on prototrofinen, resistentti geneettiselle vaihdolle ja faagi-infektiolle tai transformaatiolle, se erittää DNaaseja ja tuottaa ainakin 0,5 % w/v eritettyä proteiinia teollisissa fermentointiolosuhteissa, tunnet-t u siitä, että kasvatetaan jonkin patenttivaatimuksista 1-15 mukaisesti valmistettuja teollisen Bacillus-isäntäkan-nan soluja sopivassa ravintoalustassa; ja eristetään kyseisen DNA:n ilmentämä polypeptidi.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kyseisen teollisen Baclllus-lsäntäkannan solut erittävät mainittua polypeptidiä; ja kyseinen eristäminen tarkoittaa tämän polypeptidin erottamista ravintoalustasta.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että mainittu eritetty polypeptidi on alfa-amy-laasi, mieluiten termostabiili alfa-amylaasi, tai proteaasi.

19. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vaiheen (b) liitostuote on jokin seuraavis-ta plasmideista: pGB33, jonka talletusnumero on CBS 466.83 ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 1; pGB34, jonka talletusnumero on CBS 467.83 ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 2; pLC28, jonka talletusnumero on CBS 469.83 ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 3; pLC83, jonka talletusnumero on CBS 468.83 ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 4; tai pLC87, joka saadaan plasmidista pLC83 Pstl-katkaisulla, Sj-nukleaasiresektiolla ja T4-ligaasilla suoritetulla ligaatiolla, ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 5. 26 85287

20. Plasmidi, tunnettu siitä, että se on plasmidi pGB33, joka on talletettu B. subtllls l-85:ssä CBS:ään numerolla 466.83 ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 1, plasmidi pGB34, joka on talletettu B. subtilis lS-53:ssa CBS:ään numerolla 467.83 ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 2, plasmidi pLC28, joka on talletettu B. subtilis lS-53:ssa CBS:ään numerolla 469.83 ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 3, plasmidi pLC83, joka on talletettu B_;_ subtills 1S-53:ssa CBS:ään numerolla 468.83 ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 4 tai plasmidi pLC87, joka saadaan plasmidista pLC83:sta Pstl-katkalsulla, S-^-nukleaasiresektiolla ja T4-ligaasilla suoritetulla ligaa-tiolla ja jonka restriktiokartta on esitetty kuviossa 5.

21. Jonkin patenttivaatimuksista 1-19 mukaisesti valmistetun, geneettisesti manipuloidun teollisen Baclllus-mlkro-organismin käyttö proteiinin tai polypeptidin tuotantoon. 27 8 5 2 8 7