JPS5889194A - 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents
微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法Info
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- JPS5889194A JPS5889194A JP56188089A JP18808981A JPS5889194A JP S5889194 A JPS5889194 A JP S5889194A JP 56188089 A JP56188089 A JP 56188089A JP 18808981 A JP18808981 A JP 18808981A JP S5889194 A JPS5889194 A JP S5889194A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、インドール又はアンスラニル酸を原料とす
る微生物によるＬ−）リープ′トファンの製造法に関す
る。
る微生物によるＬ−）リープ′トファンの製造法に関す
る。
インドール又はアンスラニル酸を原料とするＬ−）リプ
トファンの製造法として、バチルス・ズブチリスの５−
ノチルトリプトファンに耐性を有する人工変異株を用い
る方法が知られている（特公昭５ａ−１３ｓｓ）。
トファンの製造法として、バチルス・ズブチリスの５−
ノチルトリプトファンに耐性を有する人工変異株を用い
る方法が知られている（特公昭５ａ−１３ｓｓ）。
一方、最近上述のような人工変異による育種と異なると
ころの遺伝子組換え技術なＬ−）リプトフ７ン生産菌の
育種に利用する試みもいくつか報告されている。例えば
、Ａｐｐｌ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ。
ころの遺伝子組換え技術なＬ−）リプトフ７ン生産菌の
育種に利用する試みもいくつか報告されている。例えば
、Ａｐｐｌ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ。
Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、３８．（２１，１８１−１９０，
（１９７９）株が、約１．３ｆ／ｌのＬ−）リプトファ
ンを生産したことが記載されている。又、［日本発酵工
学会 昭和５５年度大会講演要旨集１．７０頁（１９８
０）Ｊにもやはりエシェリヒア・ブリのトリプトファン
オペロンを組み込んだプラスミドを含有するエシェリヒ
ア・コリの変異株が３６０ｍｙ／ｌのＬ−）リプトフ７
ンを生産したことが記載されている。 、 本発明者らは、叙上のような従来のＬ−トＩＪプトファ
ンノ製造法に対し、トリプトファンアンタゴニス）１こ
耐性を有するバチルス属の変゛異株の染色体より得たト
リプトファンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領域
が組み込まれているベクターを合方しているバチルス属
の細菌が高い収率でインドール又はアンスラニル酸より
Ｌ−）リプトファンを生産することを知った。
（１９７９）株が、約１．３ｆ／ｌのＬ−）リプトファ
ンを生産したことが記載されている。又、［日本発酵工
学会 昭和５５年度大会講演要旨集１．７０頁（１９８
０）Ｊにもやはりエシェリヒア・ブリのトリプトファン
オペロンを組み込んだプラスミドを含有するエシェリヒ
ア・コリの変異株が３６０ｍｙ／ｌのＬ−）リプトフ７
ンを生産したことが記載されている。 、 本発明者らは、叙上のような従来のＬ−トＩＪプトファ
ンノ製造法に対し、トリプトファンアンタゴニス）１こ
耐性を有するバチルス属の変゛異株の染色体より得たト
リプトファンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領域
が組み込まれているベクターを合方しているバチルス属
の細菌が高い収率でインドール又はアンスラニル酸より
Ｌ−）リプトファンを生産することを知った。
トリプトファンアンタゴニストとは、バチルス属の微生
物の増殖を抑制するようなものであるが、その抑制はＬ
−） ！ｌブト７アンが培地中に共存すれば、全体的ま
たは部分的に解除されるようなものである。例えば、４
−フルオロ−トリプトファン（以下４−ＦＴと記す）、
５−フルオロトリプトファン（以下５−ＦＴと記す）、
６−フルオロ−トリプトファン、７−フルオロ−トリプ
トファン、４−メチル−トリプトファン、５−メチルト
リプトファン、６−メチル−トリプトファン、７−メチ
ル−トリプトファン、ナフチルアラニン、インドールア
クリル酸、ナフチ−ルアクリル酸、β−（２−ベンゾチ
ェエール）アラニン、スチリール酢酸、インドール、ト
リプトザン等がある。
物の増殖を抑制するようなものであるが、その抑制はＬ
−） ！ｌブト７アンが培地中に共存すれば、全体的ま
たは部分的に解除されるようなものである。例えば、４
−フルオロ−トリプトファン（以下４−ＦＴと記す）、
５−フルオロトリプトファン（以下５−ＦＴと記す）、
６−フルオロ−トリプトファン、７−フルオロ−トリプ
トファン、４−メチル−トリプトファン、５−メチルト
リプトファン、６−メチル−トリプトファン、７−メチ
ル−トリプトファン、ナフチルアラニン、インドールア
クリル酸、ナフチ−ルアクリル酸、β−（２−ベンゾチ
ェエール）アラニン、スチリール酢酸、インドール、ト
リプトザン等がある。
トリプトファンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝子の
供参画は、バチルス属のトリプトファンアンタゴニスト
に耐性を有する変異株ならどのような菌株でもよいが、
耐性の程度のより高いものカ望ましい、又多くの場合、
Ｌ −）リプトファン生産能がより高いものを遺伝子供
参画として用いれば、よりよい結果が得られる。
供参画は、バチルス属のトリプトファンアンタゴニスト
に耐性を有する変異株ならどのような菌株でもよいが、
耐性の程度のより高いものカ望ましい、又多くの場合、
Ｌ −）リプトファン生産能がより高いものを遺伝子供
参画として用いれば、よりよい結果が得られる。
遺伝子供参画より染色体ＤＮＡを抽出する方法は、例え
ばＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、８９． １０６５（１９
６５）に記載されているような通常の方法で行うことが
できる。
ばＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、８９． １０６５（１９
６５）に記載されているような通常の方法で行うことが
できる。
ベクターＤＮＡとしては、どのようなものでもよい。例
えば、スタフィコフッヵス属微生物由−来（１） ｐＴ
ｌ−２−７、ｐｃ１９４ 、 ｐｃ２２１ 、 ｐ
Ｃ２２３。
えば、スタフィコフッヵス属微生物由−来（１） ｐＴ
ｌ−２−７、ｐｃ１９４ 、 ｐｃ２２１ 、 ｐ
Ｃ２２３。
ＰＵＢ１１２ （以上Ｐｒｏｅ、 Ｎａｔｌ、 Ａａ
ａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ。
ａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ。
７４：１６８０−１６８２（１９７７）参照）、ｐＵＢ
ｌｌｏ（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １３４：３
’１８−３２９（１９７８）参照Ｌ ｐ’ｒｐ４．ｐＴ
Ｐ５（以上Ｍｉａｒｏｂｌｏａ ４ｓｔｔｅｒｓ。
ｌｌｏ（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １３４：３
’１８−３２９（１９７８）参照Ｌ ｐ’ｒｐ４．ｐＴ
Ｐ５（以上Ｍｉａｒｏｂｌｏａ ４ｓｔｔｅｒｓ。
５：５５−５９（１９７８）参照）、枯草菌由来ノｐＬ
ｓ１５、 ｐＬ８２８ （以上Ｊ、ＢＡｅｔｅｒｉ
ｏ１．． １３１：６９９−７０１（１９７７）参照、
ｐＬｓ１３（Ｊ、Ｂｉｃｔｅｒｉｏｌ、、１２９：１４
８７−１４９４（１９７７）参照） ＋ ｐｐＩ、、
ｐＰＬ２ （以上Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋１２
４．４８４（１９７５）参照）等がある。
ｓ１５、 ｐＬ８２８ （以上Ｊ、ＢＡｅｔｅｒｉ
ｏ１．． １３１：６９９−７０１（１９７７）参照、
ｐＬｓ１３（Ｊ、Ｂｉｃｔｅｒｉｏｌ、、１２９：１４
８７−１４９４（１９７７）参照） ＋ ｐｐＩ、、
ｐＰＬ２ （以上Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋１２
４．４８４（１９７５）参照）等がある。
染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡはそれぞれ制限エンド
ヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれのベクターは
適した制限エンドヌクレアーゼがあるが、それは、上記
ベクターについての記載がある文献に開示されている。
ヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれのベクターは
適した制限エンドヌクレアーゼがあるが、それは、上記
ベクターについての記載がある文献に開示されている。
染色体ＤＮＡについては、制限エンドヌクレアーゼによ
る切断が部分的に行われるように反応条件を調節すれば
、多くの種類の制限酵素が使用できる。
る切断が部分的に行われるように反応条件を調節すれば
、多くの種類の制限酵素が使用できる。
かくして得られた染色体ＤＮＡ断片と、切断されたベク
ターＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる
通常の方法が使用できる。
ターＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる
通常の方法が使用できる。
一方、ターミナルトランスフェラーゼを用いて、染色体
ＤＮＡ断片と開裂したベクターＤＮＡとにデオキシアデ
ニル酸とデオキシアクリル酸、または、デオキシグアニ
ル酸とデオキシアクリル酸をそれぞれ付加し、混合した
のち、アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる
。
ＤＮＡ断片と開裂したベクターＤＮＡとにデオキシアデ
ニル酸とデオキシアクリル酸、または、デオキシグアニ
ル酸とデオキシアクリル酸をそれぞれ付加し、混合した
のち、アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる
。
かくして得られた染色体ＤＮＡ断片とベクターの結合物
の受容菌は、バチルス属の微生物ならばどのようなもの
でもよいが、Ｌ−）リプトファン要求菌を用いれば、形
質転換株を選択する際に好都合である。もちろんインド
ール又はアンスラニル酸からのＬ−、）リプトファン生
産能がより高い菌株、あるいはよりＬ−）リプトファン
生産能が高い菌株より誘導したＬ−）リプトファン要求
菌を用いれば、より好ましい結果が得られる。
の受容菌は、バチルス属の微生物ならばどのようなもの
でもよいが、Ｌ−）リプトファン要求菌を用いれば、形
質転換株を選択する際に好都合である。もちろんインド
ール又はアンスラニル酸からのＬ−、）リプトファン生
産能がより高い菌株、あるいはよりＬ−）リプトファン
生産能が高い菌株より誘導したＬ−）リプトファン要求
菌を用いれば、より好ましい結果が得られる。
組換えＤＮＡを上記のようなりＮＡ受容菌に導入するに
は、例えばＭｏ１ｅｃ、 ｉ、ｎ、Ｇ＠ｎｅｔ、↓１し
１１１−１１５（１９７９） に記載されているよう
な、通常の形質転換法が使用できる。
は、例えばＭｏ１ｅｃ、 ｉ、ｎ、Ｇ＠ｎｅｔ、↓１し
１１１−１１５（１９７９） に記載されているよう
な、通常の形質転換法が使用できる。
形質転換株のうちより、インドール又は７ンスラニル酸
よりＬ−）リプトファン生産能を有し、トリプトファン
アンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領域が組み込まれ
ているベクターを含有する形質転換株を選択するには、
例えば、ＤＮＡ受容菌として、Ｌ−）リプトファン要求
菌を用い、インドール又はアンスラニル酸を含む培地中
又は培地上に生育しうるような菌株を選別すればよい。
よりＬ−）リプトファン生産能を有し、トリプトファン
アンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領域が組み込まれ
ているベクターを含有する形質転換株を選択するには、
例えば、ＤＮＡ受容菌として、Ｌ−）リプトファン要求
菌を用い、インドール又はアンスラニル酸を含む培地中
又は培地上に生育しうるような菌株を選別すればよい。
又ベクターＤＮＡ上のマーカーとして用いることができ
る形質を併せもつ菌株を選別できるような培地を用いれ
ば、より選別が容易である。
る形質を併せもつ菌株を選別できるような培地を用いれ
ば、より選別が容易である。
このようｔこして一旦選別されたトリプトファンアンタ
ゴニスト耐性に関与する遺伝子領域が組み込まれている
組換えベクターは、ＤＮＡ受容菌より抽出後他のＤＮＡ
受容菌、例えばインドール又はアンスラニル酸よ−）Ｌ
−トリプトファン生産能を有するＤＮＡ受容菌に導入す
ることができる。
ゴニスト耐性に関与する遺伝子領域が組み込まれている
組換えベクターは、ＤＮＡ受容菌より抽出後他のＤＮＡ
受容菌、例えばインドール又はアンスラニル酸よ−）Ｌ
−トリプトファン生産能を有するＤＮＡ受容菌に導入す
ることができる。
得られたＬ−）リプトファン生産菌を用いてＬ−トリプ
トファンを製造するには、インドール又はアンスラニル
酸を含有する培地中にＬ−トリプトファン生産菌を培養
する。
トファンを製造するには、インドール又はアンスラニル
酸を含有する培地中にＬ−トリプトファン生産菌を培養
する。
使用する培地は、炭素源、窒素源１、無機イオン、更に
必要ｔこ応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を
含有する通常のものである。炭素源としては、グルコー
ス、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する
澱粉加水′分解液、ホエイ、糖蜜等の糖類、酢酸、フマ
ール酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸が用いられる
。窒素源としては、アンモニアガス、アンター冊７水、
アンモニウム塩その他が使用できる。
必要ｔこ応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を
含有する通常のものである。炭素源としては、グルコー
ス、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する
澱粉加水′分解液、ホエイ、糖蜜等の糖類、酢酸、フマ
ール酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸が用いられる
。窒素源としては、アンモニアガス、アンター冊７水、
アンモニウム塩その他が使用できる。
インドール又はアンスラニル酸は培養当初に培地に添加
してもよいし、Ｌ−トリプトファン生産菌がある程度増
殖してから培地に添加してもよい。
してもよいし、Ｌ−トリプトファン生産菌がある程度増
殖してから培地に添加してもよい。
インドール及びアンスラニル酸は、培地中の濃度が一定
限度を超えると微生物の増殖等を抑制するので、濃度が
一定限度を超えないように少量ずつを培地に添加しても
よい。
限度を超えると微生物の増殖等を抑制するので、濃度が
一定限度を超えないように少量ずつを培地に添加しても
よい。
培地にはセリン、システィン、シスチン、β−クロロア
ラニン、β−メトキシ７ラニン等のアミノ酸を添加すれ
ばよりＬ−”）リプトファンの収率が高くなることが多
い。
ラニン、β−メトキシ７ラニン等のアミノ酸を添加すれ
ばよりＬ−”）リプトファンの収率が高くなることが多
い。
培養は好気的条件下で培地のｐＨ及び温度を適宜調節し
つつ、実質的にＬ−）！Ｊブトファンの生産蓄積が停止
するまで行なわれる。
つつ、実質的にＬ−）！Ｊブトファンの生産蓄積が停止
するまで行なわれる。
得られたＬ−）リプトファン生産菌を用いてＬ−トリプ
トファンを製造する他の方法は、Ｌ−トリプトファン生
産菌が充分増殖した後、培養液層又は充分増殖した後、
一旦菌体を分離上シてその菌体のけん濁液ｔこ、Ｌｌ）
アンスラニル酸と（２）リポース、５−ホスホリポース
、１−ホスホリボース又は５−ホスホリボシルピロホス
フェートを、又はインドールとアラニン側鎖供与体とを
添加してＬ−）リプトファン生成反応を行わせしめる方
法である。
トファンを製造する他の方法は、Ｌ−トリプトファン生
産菌が充分増殖した後、培養液層又は充分増殖した後、
一旦菌体を分離上シてその菌体のけん濁液ｔこ、Ｌｌ）
アンスラニル酸と（２）リポース、５−ホスホリポース
、１−ホスホリボース又は５−ホスホリボシルピロホス
フェートを、又はインドールとアラニン側鎖供与体とを
添加してＬ−）リプトファン生成反応を行わせしめる方
法である。
Ｌ−）’Ｊブトファン生産菌を増殖せしめる培地は、先
ｔこ述ぺた炭素源、窒素源、無機イオン更に必要に応じ
アミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する０通
常の培地が使用できる。培地には、少量のアンスラニル
酸又はインドールを添加した方がよりＬ−）リプトファ
ン生成活性の高い菌体が得られる場合が多い。培養方法
についても先に述べたような好気的条件下で行うとよい
。
ｔこ述ぺた炭素源、窒素源、無機イオン更に必要に応じ
アミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する０通
常の培地が使用できる。培地には、少量のアンスラニル
酸又はインドールを添加した方がよりＬ−）リプトファ
ン生成活性の高い菌体が得られる場合が多い。培養方法
についても先に述べたような好気的条件下で行うとよい
。
培養液にアンスラニル酸又はＬ−トリプトファンを添加
する場合には培養液を予め水で希釈して菌体けん濁液な
調製する水性媒体は、燐酸バッファーのようなバッファ
ーでもよし−が単に水であったもよい。けん濁液には更
に亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、ピリド
キサル燐酸を添加すれば、より好ましい結果が得られる
場合力を多い。又けん濁液にイノシンを添加しておくと
、難溶性のトリプトファン・イノシン複合体を形成して
、トリプトファンは反応液より除かれるので、反応はＬ
−トリプトファンの生成により向うことになる。
する場合には培養液を予め水で希釈して菌体けん濁液な
調製する水性媒体は、燐酸バッファーのようなバッファ
ーでもよし−が単に水であったもよい。けん濁液には更
に亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、ピリド
キサル燐酸を添加すれば、より好ましい結果が得られる
場合力を多い。又けん濁液にイノシンを添加しておくと
、難溶性のトリプトファン・イノシン複合体を形成して
、トリプトファンは反応液より除かれるので、反応はＬ
−トリプトファンの生成により向うことになる。
アンスラニル酸又はインドールの培養液又１１菌体けん
濁液への添加量は、アントラニル酸ｉｔｏ、ｔ〜５９／
ｄｌｓインドールのときｏ、ｔ〜４．５ｔ／ｄｌである
。
濁液への添加量は、アントラニル酸ｉｔｏ、ｔ〜５９／
ｄｌｓインドールのときｏ、ｔ〜４．５ｔ／ｄｌである
。
培養液又は菌体けん濁液には更にアンスラ；ル酸の場合
にはリポース、５−ホスホリポース、１−ホスホリポー
ス又は５−ホスホリボースピーリン酸が添加される。添
加量は、何れも０．１〜５ｆ ／ ｄｉが良く、アンス
ラニル酸が基質として高濃度に添加するときは、それに
応じてこれらの添カロ物濃度を高めることが望ましい。
にはリポース、５−ホスホリポース、１−ホスホリポー
ス又は５−ホスホリボースピーリン酸が添加される。添
加量は、何れも０．１〜５ｆ ／ ｄｉが良く、アンス
ラニル酸が基質として高濃度に添加するときは、それに
応じてこれらの添カロ物濃度を高めることが望ましい。
培養液又ｉｔ菌体けん濁液にインドールが添加される場
合仁は、アラニン側鎖供与体又はピルビン酸とアンモニ
ウムイオンが更に培養液又は菌体けん濁液に添加される
。アラニン側鎖供与体は次の一般式で示されるものであ
る。
合仁は、アラニン側鎖供与体又はピルビン酸とアンモニ
ウムイオンが更に培養液又は菌体けん濁液に添加される
。アラニン側鎖供与体は次の一般式で示されるものであ
る。
Ｘ −ＣＭ、 −ＣＨ（ＮＨ，）Ｃｏ、Ｈ（Ｘはとドル
キシル基、ハロゲン、フルキルメルカプト基、メルカプ
ト基、アルコキシ基、ベンジルオキシ基、又はチオベル
ジル基である）アラニン側鎖供与体及びピルビン酸の添
加量はそれぞれ０．１Ｍ〜ＩＭである。Ｌ−）リプトフ
ァン生成反応は、アントラニル酸のときは、反応液を２
５〜４５Ｃ，１０〜４８時間振盪反応させるとよい。又
、インドールのときは、反応液を、２５〜４５Ｃ，５〜
４８時間静置又はゆるやかに振盪反応させるのがよい。
キシル基、ハロゲン、フルキルメルカプト基、メルカプ
ト基、アルコキシ基、ベンジルオキシ基、又はチオベル
ジル基である）アラニン側鎖供与体及びピルビン酸の添
加量はそれぞれ０．１Ｍ〜ＩＭである。Ｌ−）リプトフ
ァン生成反応は、アントラニル酸のときは、反応液を２
５〜４５Ｃ，１０〜４８時間振盪反応させるとよい。又
、インドールのときは、反応液を、２５〜４５Ｃ，５〜
４８時間静置又はゆるやかに振盪反応させるのがよい。
培養液又は反応液中に生成されたＬ−）ＩＪブトファン
は通常の方法で分離、採取できる。
は通常の方法で分離、採取できる。
実施例１
ｆｉｌ 染色体ＤＮＡの調製
バチルス・ズブチリスＡＪ１１７１１（アルギニン、ロ
イニン複要求性）からニトロングアニジン変異処理によ
って誘導したトリプトファン生産菌ＡＪ １１７１３
（ＦＥＲＭ−Ｐ６１９３”１（５−フルオロトリプトフ
ァン耐性、アルギニン、ロイシン複要求性）を原株とし
、これより次の様な方法で新規トリプトファン生産菌を
造成した。（１）ＡＪ１１７１３株を１ｔのＢａｃｔ
−Ｐｅｎａａｓａｙ ＢｒｏｔＪ （商品名 Ｄｉｆｅ
ｏ製）中３０Ｃで約２時間振盪培養を行ない対数増殖期
の菌体を集菌後通常のＤＮＡ抽出法（Ｊ、 Ｂａ＠、
８９ 。
イニン複要求性）からニトロングアニジン変異処理によ
って誘導したトリプトファン生産菌ＡＪ １１７１３
（ＦＥＲＭ−Ｐ６１９３”１（５−フルオロトリプトフ
ァン耐性、アルギニン、ロイシン複要求性）を原株とし
、これより次の様な方法で新規トリプトファン生産菌を
造成した。（１）ＡＪ１１７１３株を１ｔのＢａｃｔ
−Ｐｅｎａａｓａｙ ＢｒｏｔＪ （商品名 Ｄｉｆｅ
ｏ製）中３０Ｃで約２時間振盪培養を行ない対数増殖期
の菌体を集菌後通常のＤＮＡ抽出法（Ｊ、 Ｂａ＠、
８９ 。
１０６５（’６５））により染色体ＤＮＡを抽出、精製
し最終４．ＩＩＩｇを得た。
し最終４．ＩＩＩｇを得た。
（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入Ｌ−）！＋
ブトファン生産能を支配する遺伝子領域をクローニング
するため、その担体（ベクター）となる自己増殖ＤＮＡ
としてカナマインン耐性（Ｋｍｒ） 、ネオマイシン耐
性（Ｎｍｒ）プラスミドの１種ｐＵＢ １１０ を用い
た。（１）で得ｔ÷染色体ＤＮＡｌ０μｔとベクターＤ
ＮＡ ５μｔをそれぞれとり、各々に制限エンドヌクレ
アーゼの１種ＥｅｏＲＩ を３７Ｃ１時間作用させて
ＤＮＡ鎖を切断した。６５ｒｌＯ分の熱処理後両反応液
を混合し、ＡＴＰ及びジチオスライトール存在下Ｔ４フ
ァージ由来のＤＮＡリガーゼにて１０Ｃ１２４時間ＤＮ
Ａ鎖の連結反応を行なつｔＯ （３）トリプトファン生産遺伝子を担ったプラスミドに
よる形質転換 バチルス拳ズブチリスＡＪ１１７１１（アルギニン、ｐ
イシン複要求性）からニトロソグアニジン変異処理によ
って誘導したトリプトファい第１培養培地（グルコース
ｏ、５ｔ／ｄｌ、（ＮＨ４）、５ｏ４０．２ ｆ／ｄｌ
、 ＫＩ（、ＰＯ４０，６ｆ／ｄｌ、Ｋ、ＨＰｏ、
１．４ ｆ ／ ｄｉ、 Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ，ＯＯ，
０２ｔ／ｄｔ。
ブトファン生産能を支配する遺伝子領域をクローニング
するため、その担体（ベクター）となる自己増殖ＤＮＡ
としてカナマインン耐性（Ｋｍｒ） 、ネオマイシン耐
性（Ｎｍｒ）プラスミドの１種ｐＵＢ １１０ を用い
た。（１）で得ｔ÷染色体ＤＮＡｌ０μｔとベクターＤ
ＮＡ ５μｔをそれぞれとり、各々に制限エンドヌクレ
アーゼの１種ＥｅｏＲＩ を３７Ｃ１時間作用させて
ＤＮＡ鎖を切断した。６５ｒｌＯ分の熱処理後両反応液
を混合し、ＡＴＰ及びジチオスライトール存在下Ｔ４フ
ァージ由来のＤＮＡリガーゼにて１０Ｃ１２４時間ＤＮ
Ａ鎖の連結反応を行なつｔＯ （３）トリプトファン生産遺伝子を担ったプラスミドに
よる形質転換 バチルス拳ズブチリスＡＪ１１７１１（アルギニン、ｐ
イシン複要求性）からニトロソグアニジン変異処理によ
って誘導したトリプトファい第１培養培地（グルコース
ｏ、５ｔ／ｄｌ、（ＮＨ４）、５ｏ４０．２ ｆ／ｄｌ
、 ＫＩ（、ＰＯ４０，６ｆ／ｄｌ、Ｋ、ＨＰｏ、
１．４ ｆ ／ ｄｉ、 Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ，ＯＯ，
０２ｔ／ｄｔ。
クエン酸ナトリウムｏ、１ｔ／ｄｔｓ酵母エキス０．２
ｔ ／ｄｉ、 Ｌ −）リプトファン１０１１９ ／
ｄｉ、つた後、さらに第１培養培地（グルコース０．
５ｔ／ｄｉ、 （ＮＨ４）、５ｏ４０．２ ｆ／ｄｔ、
ＫＨ，ＰＯ４０，６ｔ ／ ｄｌ、 Ｋ、ＨＰＯ４１
，４ｆ ／ ｄｉ％ＭｇＳＯ４・７ Ｈ，００，１２ｔ
／ｄｉ、クエン酸ナトリウムｏ、ｔｔ／ｄｌｓ酵母エ
キス０．０２ ｔ ／ｄｅ１Ｌ−アルギニン５冒９ ／
ｄｌ、Ｌ−ロイシン０．５寓９／ｄｌ＞へ接種し３７
Ｃ１，５時間振盪培養を行なうことによっていわゆる
コンビチニトな（ＤＮＡ取込能を有する）細胞を調製し
た（参考文献： Ｃ−Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、 Ｊ、 ５ｐｉ
ｚｉｚｅｎ ：リプトファン生産遺伝子を担ったプラス
ミドＤＮＡが含まれる）の溶液を加えて３７ｔＴでさら
に２時間振盪培養を行なって形質転換反応を完了させた
後、細胞懸濁液をカナマイシン５μｔ／−含有最小培地
プレート（ＫＷ、ｐＯ４ｏ、ａｆ／ｄｔ％に、ＨＰＯ，
’ １．４ ｔ／ｄ１１（ＮＨ４）９８０４０．２ｔ
／ｄ１． クエン酸ナトリウムｏ、ｔｔ／ｄｌｓ門ｇｓ
ｏ４番７Ｈ，ＯＯ，０２ｆ／ｄｌ、グルコース０．５ｐ
／ｄ７！（ＰＨ７，２）を基本最小培地とし、これに寒
天２チ及び使用菌の栄養要求物質Ｌ−アルギニン、Ｌ−
ロイシンを各々１ｏ、ｍｇ／ｄｌ添加する。）に塗抹し
３７Ｃで培養した。３日後に上記培地上に３個の：ＩＩ
：に−が出現したので、これを釣菌し各クローンをそれ
ぞれ純粋に分離した。得られた形質転換株はいずれも用
いた受容菌ＡＪ１１７１２と異なってトリプトファン非
要求性である。このことは染色体ＤＮＡ上のトリプトフ
ァン生合成系遺伝子領域がｐＵＢ１１０プラスミド上の
ＤＮＡｒ−挿入されて生じた新規プラスミドＤＮＡを取
込んだ細胞のみがコロニー、として選択されてきたこと
を意味する。
ｔ ／ｄｉ、 Ｌ −）リプトファン１０１１９ ／
ｄｉ、つた後、さらに第１培養培地（グルコース０．
５ｔ／ｄｉ、 （ＮＨ４）、５ｏ４０．２ ｆ／ｄｔ、
ＫＨ，ＰＯ４０，６ｔ ／ ｄｌ、 Ｋ、ＨＰＯ４１
，４ｆ ／ ｄｉ％ＭｇＳＯ４・７ Ｈ，００，１２ｔ
／ｄｉ、クエン酸ナトリウムｏ、ｔｔ／ｄｌｓ酵母エ
キス０．０２ ｔ ／ｄｅ１Ｌ−アルギニン５冒９ ／
ｄｌ、Ｌ−ロイシン０．５寓９／ｄｌ＞へ接種し３７
Ｃ１，５時間振盪培養を行なうことによっていわゆる
コンビチニトな（ＤＮＡ取込能を有する）細胞を調製し
た（参考文献： Ｃ−Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、 Ｊ、 ５ｐｉ
ｚｉｚｅｎ ：リプトファン生産遺伝子を担ったプラス
ミドＤＮＡが含まれる）の溶液を加えて３７ｔＴでさら
に２時間振盪培養を行なって形質転換反応を完了させた
後、細胞懸濁液をカナマイシン５μｔ／−含有最小培地
プレート（ＫＷ、ｐＯ４ｏ、ａｆ／ｄｔ％に、ＨＰＯ，
’ １．４ ｔ／ｄ１１（ＮＨ４）９８０４０．２ｔ
／ｄ１． クエン酸ナトリウムｏ、ｔｔ／ｄｌｓ門ｇｓ
ｏ４番７Ｈ，ＯＯ，０２ｆ／ｄｌ、グルコース０．５ｐ
／ｄ７！（ＰＨ７，２）を基本最小培地とし、これに寒
天２チ及び使用菌の栄養要求物質Ｌ−アルギニン、Ｌ−
ロイシンを各々１ｏ、ｍｇ／ｄｌ添加する。）に塗抹し
３７Ｃで培養した。３日後に上記培地上に３個の：ＩＩ
：に−が出現したので、これを釣菌し各クローンをそれ
ぞれ純粋に分離した。得られた形質転換株はいずれも用
いた受容菌ＡＪ１１７１２と異なってトリプトファン非
要求性である。このことは染色体ＤＮＡ上のトリプトフ
ァン生合成系遺伝子領域がｐＵＢ１１０プラスミド上の
ＤＮＡｒ−挿入されて生じた新規プラスミドＤＮＡを取
込んだ細胞のみがコロニー、として選択されてきたこと
を意味する。
（４１）！Ｊブトファン生合成系遺伝子領域を担うｐＵ
Ｂｌｌｏの抽出 （３）で得られたクローンのうちＡＪ１１７１４（ＦＩ
ＲＭ−Ｐ６１９４）を用いてＣ，Ｉ、 Ｋａｄ。
Ｂｌｌｏの抽出 （３）で得られたクローンのうちＡＪ１１７１４（ＦＩ
ＲＭ−Ｐ６１９４）を用いてＣ，Ｉ、 Ｋａｄ。
らの方法（Ｊ、 Ｂａ＆、 １土５．３．１３６５（’
８１））に基づいたフェノールによるＤＮＡ抽出法によ
り菌体のＤＮＡを抽出しアガロース晶ル電気泳動じより
プラスミドＤＮＡと染色体ＤＮＡを分ゲ 離しプラスミドＤＮＡを含むアガｐ−スールよりトリプ
トファン生合成系遺伝子領域を担うｐＵＢ １１０
を抽出に透析して精製した。こうして得られた新規プラ
スミドを（３）で述べたのと同様の方法によって今度は
原株のＡＪ１１７１３（トリプトファン非要求性でトリ
プトファンを生産する）へ形質転換法により挿入しＫｍ
ｒ株ＡＪ１１７１５（ＦＥＲＭ−Ｐ６１９５）を得た。
８１））に基づいたフェノールによるＤＮＡ抽出法によ
り菌体のＤＮＡを抽出しアガロース晶ル電気泳動じより
プラスミドＤＮＡと染色体ＤＮＡを分ゲ 離しプラスミドＤＮＡを含むアガｐ−スールよりトリプ
トファン生合成系遺伝子領域を担うｐＵＢ １１０
を抽出に透析して精製した。こうして得られた新規プラ
スミドを（３）で述べたのと同様の方法によって今度は
原株のＡＪ１１７１３（トリプトファン非要求性でトリ
プトファンを生産する）へ形質転換法により挿入しＫｍ
ｒ株ＡＪ１１７１５（ＦＥＲＭ−Ｐ６１９５）を得た。
（５） 新規トリプトファン生産菌によるＬ−）リプ
トファン生産 （４）で得られたＡＪ１１７１４、ＡＪ１１７１５をア
ントラニル酸を添加した培地で培養した結果を第１表に
示す。培養は５ｏＯＮｌフラスコ中會こトリプトファン
生産培地（グルコース８９）’ｄ７！、ＮＨ４Ｃｌ 、
１ ｆ ／ ｄｌｌＫＣＩ Ｏ，２ｆ ／ ｄｉ、
ＫＨ，ＰＯ４０，１係、Ｍｇ５ｏ、７Ｈ，ＯＯ，０４ｔ
／ｄｌ、「カザミノ酸Ｊ Ｏ，４％、Ｆ ｅ ８０４
’ ４Ｈ＠ ０ １ ｍ１Ｆ ／ ｄｌ ％Ｍｎ ８
０４ ・４ Ｈａ Ｏ１■ｙ／ａｔ、Ｌ−フルギニン、
Ｌ−ロイシン各２０ ｍｇ ／ ｄｌ、 ＣａＣＯ３４
％、ｐＨ７，０（ＫＯＨ） ）を２０ｄずつ分注し菌体
を接種後３０Ｃ，９６時間振盪培養して行なった。尚、
ＡＪ１１７１４とＡＪ１１７１５のときは、カナマイシ
ン５μｆ／−を生産培地に添加しである。又、アントラ
ニル酸は培養開始後４８時間目に０．５チ添加°した。
トファン生産 （４）で得られたＡＪ１１７１４、ＡＪ１１７１５をア
ントラニル酸を添加した培地で培養した結果を第１表に
示す。培養は５ｏＯＮｌフラスコ中會こトリプトファン
生産培地（グルコース８９）’ｄ７！、ＮＨ４Ｃｌ 、
１ ｆ ／ ｄｌｌＫＣＩ Ｏ，２ｆ ／ ｄｉ、
ＫＨ，ＰＯ４０，１係、Ｍｇ５ｏ、７Ｈ，ＯＯ，０４ｔ
／ｄｌ、「カザミノ酸Ｊ Ｏ，４％、Ｆ ｅ ８０４
’ ４Ｈ＠ ０ １ ｍ１Ｆ ／ ｄｌ ％Ｍｎ ８
０４ ・４ Ｈａ Ｏ１■ｙ／ａｔ、Ｌ−フルギニン、
Ｌ−ロイシン各２０ ｍｇ ／ ｄｌ、 ＣａＣＯ３４
％、ｐＨ７，０（ＫＯＨ） ）を２０ｄずつ分注し菌体
を接種後３０Ｃ，９６時間振盪培養して行なった。尚、
ＡＪ１１７１４とＡＪ１１７１５のときは、カナマイシ
ン５μｆ／−を生産培地に添加しである。又、アントラ
ニル酸は培養開始後４８時間目に０．５チ添加°した。
他方、インド７−ルは４８〜９６時間のあいだに、少量
ずつフィードし、全量で０．５係添加した。対照として
原株ＡＪ１１７１３を同様の条件で発酵を行なった。ま
たＡＪ１１７１３、ＡＪ１１７１４、ＡＪ１１７１５を
用いて同条件でアントラニル酸およびインドールを添加
せずに培養した結果を第１表に示す。
ずつフィードし、全量で０．５係添加した。対照として
原株ＡＪ１１７１３を同様の条件で発酵を行なった。ま
たＡＪ１１７１３、ＡＪ１１７１４、ＡＪ１１７１５を
用いて同条件でアントラニル酸およびインドールを添加
せずに培養した結果を第１表に示す。
第 １ 表
ＡＪ１１７１３ １１０ １２０ ＴＯＡＪ１１７１
４ １４０ １５５ ２０ＡＪ １１７１５ ２３０
３１０ ８０実施例２ 第２表に示す各菌株を各々、下記組成の５００−容肩付
フラスコに入れた培地６０−に１白金耳接種し、３１ｒ
ｔこて２０時間培養した。
４ １４０ １５５ ２０ＡＪ １１７１５ ２３０
３１０ ８０実施例２ 第２表に示す各菌株を各々、下記組成の５００−容肩付
フラスコに入れた培地６０−に１白金耳接種し、３１ｒ
ｔこて２０時間培養した。
゛「カザミノシュ５ｆ、酵母エキス２ｆ、コーンスチ−
ＮＨ２ＯＨ緩衝液（ｐＨ８，０） １ ｔに添加し、３
７ｒにて２０時間振盪しながら反応させたところ、反応
終了液中第２表に示すように’Ｌ−）！Ｊブトファンが
生成した。
ＮＨ２ＯＨ緩衝液（ｐＨ８，０） １ ｔに添加し、３
７ｒにて２０時間振盪しながら反応させたところ、反応
終了液中第２表に示すように’Ｌ−）！Ｊブトファンが
生成した。
第 ２ 表
菌 株 Ｌ−）リプトファン蓄積（ｆ／ｌ
’）Ａ Ｊ １ １ ７ １ ３
２．１ＡＪ１１７１４ 、
．６．８Ａ Ｊ １ １ ７ １ ５
９．７実施例３ 第３表ｔこ示す各菌株を各々下記組成の培地６゜ｄにｌ
白金耳接種し、３１ＵＣて２０時間培養した。
’）Ａ Ｊ １ １ ７ １ ３
２．１ＡＪ１１７１４ 、
．６．８Ａ Ｊ １ １ ７ １ ５
９．７実施例３ 第３表ｔこ示す各菌株を各々下記組成の培地６゜ｄにｌ
白金耳接種し、３１ＵＣて２０時間培養した。
「カザミノ―、５９％−酵母エキス２９．コーンスチー
尚、ＡＪ１１７１４とＡＪ１１７１５のときは。
尚、ＡＪ１１７１４とＡＪ１１７１５のときは。
カナマイシンを５μｔ７ｂｔ添加して培養した。
培養液１ｔを遠心分離して菌体な集め、これを１２表の
化合物ノホカｒ−Ｎ＆＊ ＳＯｓ Ｏ，１ｔ ／ ｄ
ｌ １Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｏ，３ｆ ／ ｄｌｓ ピリ
ドキ’ｆ ルリン酸０．０１ｔ ／ ｃｒｔ 、イノシ
ン５．４ ｔ ７ｔｔｔｓ （ｐＨ８，５）の組成を
もつ反応液１００．Ｊｌ／に懸濁し、３ｏｃで４８時間
反応を行なった。第２表に結果を示した。
化合物ノホカｒ−Ｎ＆＊ ＳＯｓ Ｏ，１ｔ ／ ｄ
ｌ １Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｏ，３ｆ ／ ｄｌｓ ピリ
ドキ’ｆ ルリン酸０．０１ｔ ／ ｃｒｔ 、イノシ
ン５．４ ｔ ７ｔｔｔｓ （ｐＨ８，５）の組成を
もつ反応液１００．Ｊｌ／に懸濁し、３ｏｃで４８時間
反応を行なった。第２表に結果を示した。
Claims (1)
- トリプトファンアンタゴニストに耐性を有するバチルス
属の変異株の染色体より得たトリプトファンアンタゴニ
スト耐性に関与する遺伝子領域が組み込まれているベク
ターを含有し、インドール又はアンスラニル酸よりＬ−
トリプトファン生産能を有するバチルス属細菌を培養し
、培地中ｔこ生成蓄積されたＬ−）リプトファンを採取
することを特徴とする、微生物によるＬ−トリプト・フ
ァンの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56188089A JPS5889194A (ja) | 1981-11-24 | 1981-11-24 | 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
| EP82306254A EP0080378B1 (en) | 1981-11-24 | 1982-11-24 | L-tryptophan-producing microorganisms |
| DE8282306254T DE3278569D1 (en) | 1981-11-24 | 1982-11-24 | L-tryptophan-producing microorganisms |
| US06/444,151 US4588687A (en) | 1981-11-24 | 1982-11-24 | Method for producing L-tryptophan by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56188089A JPS5889194A (ja) | 1981-11-24 | 1981-11-24 | 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5889194A true JPS5889194A (ja) | 1983-05-27 |
| JPH0515434B2 JPH0515434B2 (ja) | 1993-03-01 |
Family
ID=16217506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56188089A Granted JPS5889194A (ja) | 1981-11-24 | 1981-11-24 | 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4588687A (ja) |
| EP (1) | EP0080378B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5889194A (ja) |
| DE (1) | DE3278569D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06189783A (ja) * | 1983-07-06 | 1994-07-12 | Gist Brocades Nv | 工業バチルス微生物種によるタンパク質又はポリペプチドの製造 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59196098A (ja) * | 1983-04-23 | 1984-11-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
| JPH06102029B2 (ja) * | 1984-07-31 | 1994-12-14 | 味の素株式会社 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
| DE3585357D1 (de) * | 1984-10-29 | 1992-03-19 | Light Oil Utilization Res Ass | Plasmide. |
| EP0229161B1 (en) | 1985-06-24 | 1991-05-29 | THE NUTRASWEET COMPANY (a Delaware corporation) | Composite plasmids for amino acid synthesis |
| JPH022349A (ja) * | 1988-02-17 | 1990-01-08 | Takeda Chem Ind Ltd | ピリミジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 |
| DE4232468A1 (de) * | 1992-09-28 | 1994-03-31 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen für die Produktion von Tryptophan und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| JP4149178B2 (ja) * | 2001-03-09 | 2008-09-10 | 松下電器産業株式会社 | リモートメンテナンスシステム |
| IL270179B2 (en) | 2017-04-25 | 2024-07-01 | Temple Otorongo Llc | A pharmaceutical preparation containing tryptophan and a phyllokinin derivative for the treatment of psychiatric and psychological disorders |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS531358A (en) * | 1976-06-28 | 1978-01-09 | Sanyo Electric Co Ltd | Total heat exchange element |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3700558A (en) * | 1967-11-20 | 1972-10-24 | Lepetit Spa | Production of l-tryptophan by fermentation |
| GB2048894A (en) * | 1979-05-11 | 1980-12-17 | Gist Brocades Nv | Plasmid |
| US4302544A (en) * | 1979-10-15 | 1981-11-24 | University Of Rochester | Asporogenous mutant of B. subtilis for use as host component of HV1 system |
| JPS575694A (en) * | 1980-06-10 | 1982-01-12 | Showa Denko Kk | Production of l-tryptophane |
| US4371614A (en) * | 1980-08-22 | 1983-02-01 | Ajinomoto Co., Inc. | E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan |
| JPS57208994A (en) * | 1981-06-19 | 1982-12-22 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-tryptophan by fermentation |
-
1981
- 1981-11-24 JP JP56188089A patent/JPS5889194A/ja active Granted
-
1982
- 1982-11-24 DE DE8282306254T patent/DE3278569D1/de not_active Expired
- 1982-11-24 US US06/444,151 patent/US4588687A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-11-24 EP EP82306254A patent/EP0080378B1/en not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS531358A (en) * | 1976-06-28 | 1978-01-09 | Sanyo Electric Co Ltd | Total heat exchange element |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06189783A (ja) * | 1983-07-06 | 1994-07-12 | Gist Brocades Nv | 工業バチルス微生物種によるタンパク質又はポリペプチドの製造 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4588687A (en) | 1986-05-13 |
| EP0080378B1 (en) | 1988-06-01 |
| EP0080378A3 (en) | 1984-02-22 |
| JPH0515434B2 (ja) | 1993-03-01 |
| EP0080378A2 (en) | 1983-06-01 |
| DE3278569D1 (en) | 1988-07-07 |
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