JPH06189783A - 工業バチルス微生物種によるタンパク質又はポリペプチドの製造 - Google Patents

工業バチルス微生物種によるタンパク質又はポリペプチドの製造

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JPH06189783A
JPH06189783A JP5269181A JP26918193A JPH06189783A JP H06189783 A JPH06189783 A JP H06189783A JP 5269181 A JP5269181 A JP 5269181A JP 26918193 A JP26918193 A JP 26918193A JP H06189783 A JPH06189783 A JP H06189783A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 形質転換された工業バチルス微生物種によ
り、所望のタンパク質又はポリペプチドを効率的に製造
する。 【構成】 原栄養体性であり、ファージ感染及び遺伝子
交換あるいは形質転換に耐性であり、ＤＮアーゼを分泌
し、かつ工業的醗酵条件下において少くとも0.５％ｗ／
ｖの分泌タンパク質を生産する形質転換した工業バチル
ス株を、適当な栄養培体中で生長させる。形質転換した
工業バチルス株は、プラスミド構築体、染色体中に組込
まれたプラスミド構築体又はそのフラグメントの形にお
いて挿入されたＤＮＡを含み、前記構築体は、所望タン
パク質又はポリペプチド及び選択マーカーをコードする
遺伝子を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、形質転換された工業バ
チルス微生物種によるタンパク質又はポリペプチドの製
造に関する。
【０００２】
【従来技術及び発明の解決すべき課題】ポリペプチドを
高収率で生産するため工業単細胞微生物株を組換えＤＮ
Ａを有する宿主として使用することに対して大きな関心
が払われている。多くの工業的に重要な酵素、例えばデ
ンプン分解酵素及びタンパク分解酵素はバチルス属の微
生物、例えばＢ．サチリス(B. subtilis) 、Ｂ．アミロ
リクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)、Ｂ．リヘ
ニホルミス(B. licheniformis)、Ｂ．ステアロセルモフ
ィルス(B. stearothermophilus) 、及びＢ．コアギュラ
ンス(B.coagulans) 、により生産される。発酵槽中に非
常に丈夫で安定な菌株が使用される。更に、菌株はファ
ージ感染や、遺伝子交換、すなわち普通の形質転換操作
によるＤＮＡの導入に対して耐性である。普通の工業菌
株はまた栄養培地に対する高価なアミノ酸の添加を避け
るために原栄養体である。工業菌株は、１週間ほどの長
さにできる発酵の終りまでの高い生産性、ブロスを消費
するときの安定な細胞濃度、及び高い生産性、通常少く
とも約0.５ｗ／ｖの分泌タンパク質等の他の特徴を有す
る。更に、培地中にＤＮＡの実質的な分解があるように
ＤＮアーゼの実質的な分泌があることがバチルスでしば
しば認められる。
【０００３】工業菌株の遺伝子修飾耐性及びそれを飢餓
にするのを困難にするその原栄養特性のために、それら
は形質転換に対する耐性を示す。従って、工業菌株中へ
ＤＮＡを導入する有効な方法を提供することは非常に有
用であり、その場合にＤＮＡは工業菌株中に安定に保持
され、工業菌株の生存能力及び活性の喪失及び実質的な
喪失がなく、内生及び外生のポリペプチド又はタンパク
質生産物の高い収率を得ることができよう。更に、宿主
細胞の修飾又は形質転換が内生遺伝子又は先に導入した
遺伝子のコピー数を増加することを含む場合に細胞の選
択が困難であり、その場合に遺伝子は生存選択と関連が
ない。従って、追加の遺伝子（増加したコピー数）の存
在を検出及び選択できる有効な方法をもつことが非常に
望ましい。
【０００４】Ｂ．サチリスの遺伝子操作は、ヨネダ他、
Biochem. Biophs. Res. Commun. （１９７３）５０；７
６５〜７７０；ヨネダ及びマルオ、J. Bacteriol. （１
９７５）１２４；４８〜５４；セキグチ他、J. Bactrio
l.（１９７５）１２１；６８８〜６９４；ヒトツヤナギ
他、Agric. Biol. Chem.（１９７９）４３：２３４２〜
２３４９；ヨネダ、Appl. Env. Microbiol. （１９８
０）３９：２７４〜２７６、により報告された。Ｂ．サ
チリスの一定の有効形質転換性研究室菌株、例えはα−
アミラーゼ、β−アミラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、
インターフェロン及びインシュリンの生産性改良に関す
る組換えＤＮＡ技術の良好な応用が報告された（Palva,
Gene （１９８２）１９：８１〜８７；シノミヤ他、Ag
ric. Biol.Chem.（１９８１）４５；１７３３〜１７３
５；Gray及びChang, J. Bacteril（１９８１）１４５：
４２２〜４２８；Williams他、Gene（１９８１）１６：
１９９〜２０６；Palva, Gene （１９８３）２２：２２
９〜２３５）。バチルス・リヘニホルミス土壌分離体の
遺伝子操作における困難は、Thorne及び Stull. J. Bac
teriol（１９６６）９１：１０１２〜１０１４、により
報告されている。また英国特許出願ＧＢ２，０９１，６
２８号；ヨーロッパ特許出願０，０３４，４７０号；ヨ
ーロッパ特許出願０，０３２，２３８号；及びヨーロッ
パ特許出願０，０７７，１０９号の開示はｐＵＲ１５２
３に関し、参照としてここに導入する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】遺伝子的に修飾された単
細胞微生物株、殊に工業バチルス株及び生成物により関
心のあるタンパク質又はポリペプチドを製造する方法が
提供される。工業菌株宿主中に発現できる関心のある遺
伝子を含む染色体外ＤＮＡは適当な細胞宿主、便宜には
工業菌株に関連する研究室菌株宿主、及び工業菌株と組
合せた修飾細菌宿主中へ融合条件のもとで導入する。関
心のある遺伝子（類）を含む工業菌株の細胞は関心のあ
る遺伝子に関連したマーカーにより選択する。ポリペプ
チド生成物を高収率で生産するために発酵に使用する工
業単細胞微生物株としては、バチルス株がこのような微
生物の例証として使用する。得られる工業バチルス菌株
は、工業バチルス菌株の所望の特性を保持し、同時に内
生（同種）又は外生（異種）の遺伝子の発現生成物の高
い収率を与える。この方法は、ＤＮＡを複製することが
でき、染色体外ＤＮＡの導入が容易に可能である細菌宿
主中へ染色体外ＤＮＡを導入することを含む。染色体外
要素を含む修飾された細菌宿主細胞は次いで工業バチル
ス株と融合条件のもとで組合され、そこで受容株バチル
ス細胞を、次に染色体外要素が生ずる関心のある遺伝子
又は遺伝子類の存在について選択することができる。
【０００６】本発明は、所望の遺伝子の発現生成物を生
産するための適当な栄養培地中で前記菌株を生長させ
る。所望の遺伝子（類）は原該細胞又は真該細胞の遺伝
子である。これらの遺伝子は細菌遺伝子、単細胞微生物
遺伝子、哺乳動物遺伝子などを含む。構造遺伝子は合
成、ゲノムＤＮＡからの分離、ｃＤＮＡからの調製又は
それらの組合せを含む種々の方法で調製できる。遺伝子
の種々の操作法は周知であり、制限消化、切除(resecti
on) 、連結(ligation)、インビトロ突然変異誘発、プラ
イマー修復、リンカー及びアダプターの使用などが含ま
れる。従って、宿主から得られるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ
構築の要件により種々の方法で操作することができる。
Maniatis他、Morecular Cloning, Gold Spring Harbor
Laboratory, Gold Spring Harbor, N.Y.１９８２参照。
遺伝子が、工業バチルス株により認識される転写及び
翻訳の開始及び終結の調節シグナルを有する宿主から得
られる場合には、通常工業バチルス宿主中に発現できる
シストロンを与えるために構造遺伝子の５′−及び３′
−フランキング領域を維持することが便宜であろう。転
写開始領域は、適当な状態において、所望の構造遺伝子
の高水準の発現が得られる前に宿主が高密度に生長でき
るように構造的又は誘導的発現を与えることができる。
【０００７】構造遺伝子を、調節シグナルがバチルスに
より認識されない源から得る場合に、バチルスにより認
識される調節領域を得、開始及び終結の調節シグナルの
間に構造遺伝子を挿入することが必要であろう。ある場
合には、自身の停止コドン（類）を有する外生構造遺伝
子をリーディングフレーム中、自然調節シグナルを有す
る外生バチルス構造遺伝子のＮ−末端コドンの背後に挿
入することができる。生ずる生成物はそのとき若干の、
例えば０〜３０個の、追加Ｎ−末端アミノ酸を有するこ
とができる。あるいは、オペロンを調製することがで
き、その場合に単一プロモータが複数のポリペプチドを
コードするメッセンジャーＲＮＡの転写開始を与える。
ある場合には、表現生成物が分泌されることが望ましい
かもしれない。表現生成物が自然に分泌され、リーダー
シグナル及びプロセシングシグナル（類）がバチルス宿
主により認識される場合に、これは何ら困難を要しな
い。しかし、生成物が普通には分泌されないか、又はバ
チルスが分泌シグナル及び又はプロセシングシグナル
（類）を認識しない、すなわち、シグナルがバチルスに
十分な程度に機能しない場合には、バチルスポリペプチ
ドの分泌シグナル及びプロセシングシグナル（類）をコ
ードするＤＮＡ配列を分離又は合成し、それらを適当な
リーディングフレーム中の構造遺伝子の５′末端に接合
することが必要であろう。
【０００８】構造遺伝子は酵素、ホルモン、リンフォカ
イン、表面タンパク質、血液タンパク質、構造タンパク
質、免疫グロブリンなどのような種々のポリペプチド又
はタンパク質を、哺乳動物、単細胞微生物、例えば細
菌、菌類、例えば酵母菌又は線状菌、藻類、原生動物な
ど、植物、あるいは他のＤＮＡ源から発現することがで
きる。特に重要なものは酵素、例えばヒドロラーゼ、具
体的にはプロテアーゼ及びサッカリダーゼ(saccaridas
e) である。そのような酵素の例はエンドペプチダー
ゼ、エキソペプチダーゼ、セリン及び非セリンプロテア
ーゼ、α−及びβ−アミラーゼ（殊に耐熱性のα−アミ
ラーゼ）などである。和合性宿主並びにバチルス株に使
用できる広い数のベクターが存在する場合には、複製系
は和合性宿主及びバチルス株に対し同じでも異なってい
てもよい。（ベクターによって、１又は２以上の宿主、
通常宿主中の選択するマーカー、少くとも１つの便宜
な、通常独自の制限部位に和合性の複製系を意味す
る。）通常、和合性宿主、非工業用又は研究室バチルス
株を有することは便利であろうが、しかしこれは必須で
はなく、ある場合には他の生物、例えばE. coli.を使用
することができる。ベクターは１又は２以上の複製系を
含むので、少くとも和合性宿主中でクローニングするこ
とができる。複製系は高又は低コピー数、好ましくは少
くとも約１０、一般に約１００を超えないコピー数を与
えることができる。
【０００９】工業バチルス株中の構造遺伝子の組込みを
望むか、染色体外要素上の保持を望むかにより、バチル
スに対する複製系が含まれたり、含まれなかったりす
る。あるいは、組込みのために、ベクター又はプラスミ
ド構築体中の相同のストレッチ（stretch)にバチルスゲ
ノムを与え組換えの確率を高めることができる。複製系
に加えて、少くとも１つのマーカーが存在し、２以上の
マーカー、通常約３個を超えないマーカーを存在させて
もよい。マーカーによって、宿主中で発現できる構造遺
伝子を意味し、それが生存選択を与える。「生存選択」
は栄養要求性宿主に原栄養性、生物致死剤又はウイルス
耐性を与えることを意味する。原栄養性のために種々の
遺伝子、例えは leu、ura 、 trpなどを用いることがで
きる。生物致死剤耐性のためにこれは例えばneo 、am、
tet 、un、kan など、抗生物質に対する耐性を含むこと
ができる。他のマーカーには重金属、免疫などに対する
耐性が含まれる。種々のＤＮＡ配列は、種々の源から誘
導し、接合して１つ又はより多くの便宜な、好ましくは
独自の制限部位を含むベクターを与え、そのような部位
に、又は失ったフラグメントの代わりに、構造遺伝子の
挿入又は置換を可能にしプラスミド構築体を与えること
ができる。
【００１０】プラスミド構築体が調製されれば、次にそ
れを和合性又はクローニング宿主として示す適当な和合
性宿主中でクローンすることができる。便宜で容易に形
質転換できるプラスミド構築体の複製及び融合による工
業バチルス株への転移を与える任意の宿主を用いること
ができる。形質転換の高い効率を有し、通常栄養要求性
及び／又は抗生物質感受性である多数の研究室菌株を利
用できる。プラスミド構築体のクローニングに対するバ
チルス宿主の使用は、それが１つの複製系並びに同一マ
ーカーの和合性宿主及び工業菌株の両方における生存選
択に対する使用を可能にする点で多くの利点を有する。
従って、大抵はプラスミド構築体が適当なバチルス宿主
中でクローンされよう。バチルス宿主は工業宿主と同じ
バチルス株である必要がなく、主に便宜上選択される。
プラスミド構築体は常法、例えば形質転換により、カル
シウム沈殿ＤＮＡ、接合又は他の便宜な方法を用いて和
合性宿主中へ導入することができる。和合性宿主は次い
で適当な栄養培地中で、プラスミド構築体を含む宿主を
選択する選択条件のもとで生長させることができる。栄
養要求性宿主のために栄養培地は必要栄養素を欠き、一
方生物致死剤耐性のために細胞傷害量の生物致死剤
（類）、例えば抗生物質（類）を栄養培地中に使用す
る。和合性宿主を十分な密度に生長させた後、次に和合
性宿主を処理して融合のための細胞を調製する。
【００１１】便宜上、細胞は原形質体の形成前又は形成
中に細胞傷害剤で殺(kill)される。抗生物質を含め、種
々の試薬を使用できるが、しかし、ヨードアセトアミド
が便利かつ有効であることが認められ、後の融合に干渉
しない。原形質体は普通の方法、例えばリソチーム又は
チモリアーゼ(zymolyase) 処理により細胞から調製さ
れ、原形質体は、原形質体の結合性を維持するために適
当なオスモラリティを有する適当な媒質中に慎重に懸濁
される。工業バチルス受容体株もまた和合性宿主菌株と
同様に処理して原形質体を形成するが、しかし生存可能
細胞が原形質体の調製に使用される。工業バチルス株の
所望特徴を有する種々のバチルス株、例えばサチリス、
リヘニホルミス、アミロリクエファンシス、ステアロセ
ルモフィルス、及びコアギュランス、好ましくはリヘニ
ホルミス及びサチリスを使用することができる。工業バ
チルス株は土壌中の分離あるいは寄託所又は耐性の源か
ら入手できる生物から選び、あるいはそのようなバチル
ス株の修飾により得られる。工業バチルス株は遺伝子交
換、例えばファージ感染又は形質転換に耐性であること
に特徴がある。菌株は安定であり、胞子形成が可能であ
ってもなくてもよい。それらは原栄養性であり、内生タ
ンパク質生成物、例えば酵素、α−アミラーゼ及び種々
のプロテアーゼの高い収量を与える。それらはまたはＤ
Ｎアーゼを分泌することが認められ、それが培地中でＤ
ＮＡの分解を生じ、遺伝子交換に対する保護を与える。
【００１２】死(dead)和合性宿主原形質体と生存可能工
業バチルス宿主原形質体とは適当なフソゲン(fusogen)
の存在下に組合される。所望の効率を与える任意のソフ
ゲンを使用できるが、大抵はポリエチレングリコールが
非常に便利で、融合の高い効率を与えることが認められ
る。死原形質体とバチルス受容体株との割合は好ましく
は少くとも１：１であり、過剰の死原形質体を用いるこ
とかができる。短時間後にフソゲン混合物は適当な栄養
培地及び選択された培地中で再生した細胞で、便宜には
寒天平板上で平板培養することにより置換される。次い
でクローンは付加構造遺伝子の発現の検出のために適当
な方法でスクリーンすることができる。種々の方法を、
殊に酵素が含まれる場合に用いることができ、それはよ
く確立された検出法を有する。あるいは、酵素が含まれ
ない場合に、または利用できる検出系がない場合には、
抗体、ＤＮＡ又はハイブリッド形成、あるいは生物検定
をクローンのスクリーニングに使用しプラスミド構築体
の存在及び関心の構造遺伝子（類）の発現を測定するこ
とができる。
【００１３】プラスミド構築体又は染色体に組込まれた
プラスミド構築体類又はそれらのフラグメントを含む工
業バチルス宿主は、次いで栄養培地中で普通の発酵条件
のもとで生長させる。発酵はブロスが消耗するまで続け
ることができる。生成物が分泌された場合には、生成物
は常法、例えば抽出、クロマトグラフィー、電気泳動な
どよりブロスから分離することができる。生成物が細胞
質中に保持されている場合には細胞が遠心分離、ろ過な
どにより収積し、機械的剪断、洗剤、リソチーム又は他
の方法により溶解し、生成物を前記のように分離するこ
とができる。主題の方法を用いることにより内生ポリペ
プチドの非常に高い収量、通常親細胞の収量の少くとも
約１５０％倍、より普通には少くとも１７５％、好まし
くは親細胞の収量の約２００％倍を達成することができ
る。以下、本発明について実施例により更に詳細に説明
するが、これらの実施例は、本発明の範囲をけっして限
定するものではない。
【００１４】実施例Ｉ 染色体ＤＮＡの分離 Central Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat
1, Baarn, the Netherlands（以下、ＣＢＳと記す）に
１９８３年７月６日にNo. ４７０．８３として寄託した
Ｂ．リヘニホルミス工業株Ｔ５の染色体ＤＮＡを３７℃
で通気下に生長させた３Ｌ培養物から分離した。細胞は
Sorvall GSA ローター中で１０分間１0,０００rpm で回
転沈降させ、２５％（ｗ／ｖ）スクロース及び５０mM T
ris-HClを含む１０mlのスクロース−Tris緩衝液pH8.０
中に懸濁させ、0.５mlリソチーム溶液（２０mg／ml）の
添加により溶解し、３７℃で１５分間インキュベートし
た。ＥＤＴＡ（0.５Ｍ）２mlを添加し、０℃で５分間イ
ンキュベートした後、２０％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）１mlを加えた。次いで懸濁液を１：
１フェノール−クロロホルム混合物で抽出した。上澄み
液を分離し、純エタノール２容を慎重に載せ、その後Ｄ
ＮＡをガラス棒を用いて分離した。１０μｇ／mlリボヌ
クレアーゼを含有する蒸留水に溶解した後、ＤＮＡ懸濁
液を１：１フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノ
ール２容で沈殿させ、ＴＥ緩衝液（すなわち、１ｍＭＥ
ＤＴＡを含有する１０mM Tris-HCl 、pH8.０）中に再び
懸濁した。
【００１５】実施例II プラスミドＤＮＡの分離 プラスミドｐＵＢ１１０を含むＢ．サチリス株１Ｇ２０
（ヨーロッパ特許明細書０，０２１，４６８号参照）
を、５μｌ／mlネオマイシンを加えた１Ｌ penassay ブ
ロス培地中で一夜生長させた。Sorvall モデルＧＳＡロ
ーター中で5,０００rpm で１５分間遠心分離した後、１
５mlスクロース−Tris緩衝液中に再び懸濁させ、細胞を
実施例Ｉに記載したように溶解し、ＥＤＴＡ及びＳＤＳ
で処理した。NaClを１Ｍの最終濃度に添加した後、上澄
液を４℃で一夜貯蔵し、次いでSorvall タイプＳＳ３４
ローター中で１2,５００rpm で４５分間遠心分離した。
上澄液の上部７０％（ｗ／ｖ）をＤＮアーゼを含まない
ＲＮアーゼ２０μｇ／mlで処理し（３７℃で0.５時
間）、フェノール−クロロホルム（１：１）混合物で抽
出し、次にクロロホルム単独で抽出した。抽出した上澄
液から、５Ｍ NaCl 0.２容及び４０％（ｗ／ｖ）ポリエ
チレングリコール6,０００、0.２５容を添加することに
よりＤＮＡを沈殿させ、次に４℃で１６時間インキュベ
ートした。沈殿及び遠心分離（１2,５００rpm で３０
分、Sorvall タイプＳＳ３４ローター）した後、ＤＮＡ
を２〜３mlのＴＥ緩衝液（実施例Ｉ中のように）に再び
懸濁させ、分散物を４Ｍ NaOH でpH１2.０にした。次い
で、pHを8.５に調整し、懸濁液をフェノールで抽出し
た。抽出物をエタノールで沈殿させた後、プラスミドＤ
ＮＡを少量のＴＥ緩衝液中に再び懸濁させた。
【００１６】プラスミドｐＵＲ１５２３（ヨーロッパ特
許明細書Ａ−７7,１０９号参照）ＤＮＡをＥ．コリ（E.
coli ）からBirnboim及びDoly, Nucl. Acids Res.（１
９７９）７；１５１３〜１５２３、により記載された方
法により分離した。
【００１７】実施例III ａ）α−アミラーゼ含有組換えプラスミドｐＧＢ３３及
びｐＧＢ３４（図１及び図２）の構築 バチルス生産株Ｔ５から分離した（実施例Ｉに記載し
た）染色体ＤＮＡ５μｇ及びＢ．サチリス１Ｇ２０から
分離した（実施例IIに記載した）ｐＵＢ１１０、１μｇ
をＥｃｏＲＩで消化した。６５℃で7.５分間の制限酵素
の熱変性の後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、２０mM
Tris-HCl pH7.６、１０mM MgCl2、１０mMジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）、0.２mg／mlウシ血清アルブミン、0.
５ｍＭＡＴＰ及びＴ4 リガーゼ１単位で含むリガーゼ混
合物（Boehringer-Mannheim)２０ml中に再び懸濁させ
た。混合物を４℃で一夜連結させた。連結した混合物を
実施例IVに記載したようにＢ．サチリス中へ転移させ
た。プラスミドＤＮＡを選択した組換え微生物から分離
し（実施例IIに記載の方法を用いた）、制限エンドヌク
レアーゼで分析した。プラスミドｐＧＢ３３はｐＵＢ１
１０及びα−アミラーゼシストロンを含む約３kbp の染
色体ＥｃｏＲＩフラグメントの組換え体であった。ｐＧ
Ｂ３３を制限エンドヌクレアーゼ Hind III 及び Bam H
I で消化し、次いで、Ｓ1 エキソヌクレアーゼ切除及び
Ｔ4 による連結をするとｐＧＢ３４（図２）が生じ、こ
れはなおα−アミラーゼシストロンを含むが、しかし多
くの不便な制限部位を含むＤＮＡセグメントを欠く。
Ｂ．サチリス１−８５（−trp - ) 中のプラスミドｐＧ
Ｂ３３及びＢ．サチリス１Ｓ−５３（Bacillus Genetic
Stock Center, Ohio,ＵＳＡ）中のｐＧＢ３４はそれぞ
れ１９８３年７月６日にNo. ４６6.８３及びNo. ４６7.
８３としてＣＢＳに寄託された。
【００１８】ｂ）キモシン含有組換えプラスミドｐＬＣ
２８、ｐＬＣ８３及びｐＬＣ８７（図３、図４及び図
５）の構築 ｐＧＢ３４ＤＮＡ0.５μｇ及びｐＵＲ１５２３、ウシキ
モシン遺伝子を有するＥ．コリプラスミド、0.５μｇを
Pstlで消化した。実施例III ａ記載のように熱変性及び
連結した後、混合物を形質転換に用いた。選択した形質
転換体（実施例IVに記載した選択手順を用いた）から分
離したプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで分
析した。選択されたプラスミド（ｐＬＣ２７と称する）
はｐＧＢ３４の独特のPst1部位中へ挿入されたｐＵＲ１
５２３のキモシン遺伝子を含むPst1フラグメントの組換
え体であった（図３）。ｐＬＣ２８を制限エンドヌクレ
アーゼCla Ｉで切り、次いでエキソヌクレアーゼBal 31
で切除し、Ｔ4 リガーゼで連結するとｐＬＣ８３（図
４）が生じ、それはキモシンのための遺伝子を含むが、
もはや多くの不便な制限部位を有するＤＮＡフラグメン
トを含まない。ともにＢ．サチリス１Ｓ−５３中のプラ
スミドｐＬＣ２８及びｐＬＣ８３は１９８３年７月６日
にそれぞれNo. ４６9.８３及びNo. ４６8.８３としてＣ
ＢＳに寄託された。
【００１９】α−アミラーゼ転写及び翻訳開始調節配列
の背後の相中にキモシン遺伝子を配置するために、ｐＬ
Ｃ８３をPstIで消化し、ヌクレアーゼＳ1 で切除し、Ｔ
4 リガーゼで連結した。得られたプラスミドはｐＬＣ８
７と称され、配列分析により正しい配置及び配向を有す
ることが示された。図５参照。
【００２０】ｃ）プロテアーゼ含有組換えプラスミドｐ
ＬＰ３３及びｐＬＰ８７（図７及び図８）の構築 プロテアーゼ生産Ｂ．サチリス１６８（Bacillus Genet
ic Stock Center, Columbus, Ohio)の染色体ＤＮＡ１０
０μｇを制限酵素Cla I で消化した。フェノール抽出後
ＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル上で分離し
た。エレクトロエリューションにより若干のＤＮＡフク
ラションをゲルから溶離し、Cla I で線状にしたｐＧＢ
３５（バチルスベクターｐＧＬ１１２、W. M. de Vos,
Thosis University of Groningen １９８３、及びｐＧ
Ｂ３３のα−アミラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミ
ド、図６参照）と連結させた。連結生成物を実施例IVに
記載したように反応性Ｂ．サチリスＲＵＢ３３１細胞中
へ転移させた。得られたクロラムフェニコール耐性形質
転換体を0.４％カゼイン−アミロース平板上で高められ
たプロテアーゼ活性（prot+ ) 及び低下したα−アミラ
ーゼ生産能力（amy - )について分析した。プラスミド
ＤＮＡをprot+ amy - 形質転換体から分離し、制限部位
地図を作成した。ｐＬＰ３３はセリンプロテアーゼをコ
ードする構造遺伝子を含む3.３kbp Cla I フラグメント
を含むと考えられる（図７）。ｐＬＰ８７（図８）は非
セリンプロテアーゼに対する遺伝子情報を含む1.８kbp
の染色体Cla Ｉ挿入物を有する。
【００２１】実施例IV バチルス株の形質転換 細胞懸濁液１ml及び連結したＤＮＡ１μｇを３７℃で0.
５時間、穏やかに振りまぜてインキュベートすることに
よりＢ．サチリス１−８５（trp - amy - ）を形質転換
した(Anagnostopoulos及び Spizigen, J. Bacteriol.
（１９６１）８１；７４１〜７４６）。形質転換体を、
0.０２％（ｗ／ｖ）カサミノ酸(Difco) 及び１０μｇ／
ml抗生物質を添加した最少培地寒天平板上で抗生物質耐
性について選択した。これらの形質転換体は次に所望の
構造遺伝子の存在について分析した。α−アミラーゼの
場合には、0.６％（ｗ／ｖ）Kl及び0.３％（ｗ／ｖ）Ｉ
2 を含有する溶液で平板を覆った後ハロ(halo)を求める
ことにより；生物活性酵素のＮ−末端アミノ酸配列によ
りインビトロ合成した３２Ｐｐ標識ＤＮＡプローブに対
する正のハイブリッド形成により；酵素に対する抗体と
の免疫沈殿により、及び比較エレクトロフォーカシング
により行なった。キモシンの場合には、正の選択を３２
ｐ標識ｐＵＲ１５２３ＤＮＡとのハイブリッド形成を経
て、及び抗キモシン抗体により免疫沈殿により行なっ
た。
【００２２】バチルスプロテアーゼに対する遺伝子を同
定するため、形質転換体をそのカゼイン最少培地寒天平
板上のハロの形成能力について試験した。セリン及び非
セリンプロテアーゼ間の差異はScheiner及びQuiglyの方
法(Anal. Biochemistry （１９８２）１２２；５８〜６
９）により決定した。選択された形質転換体を細胞融合
試験において供与体菌株として使用した。
【００２３】実施例Ｖ 細胞融合及び再生 形質転換したＢ．サチリス株（ｐＧＢ３３を含むＢ．サ
チリス株１−８５、ｐＬＣ８７を含むＢ．サチリス株１
Ｓ−５３又はｐＬＰ３３を含むＢ．サチリス株ＰＵＢ３
３１）を、その中に関連抗生物質を有する５０mlＮＢＳ
Ｇ−Ｘ培地（Thorne及びStull, J. Bacteriol.（１９６
６）９１：１０１２〜１０２０（表II、ｐ１０１４））
中３７℃で一夜生長させた。培養物を新ＮＢＳＧ−Ｘ培
地で１：１に希釈し、１０mMヨードアセトアミドの存在
下に更に１〜1.５時間生長させた。Sorvall タイプＧＳ
Ａローター中で5,０００rpm で１０分間遠心分離し、1.
５Ｍスクロース、0.０６Ｍ MgCl2及び0.０６Ｍマレエー
トを含有する１０mlＳＭＭ緩衝液中に再び懸濁した後、
細胞を２mg／mlリソチームの存在下に３７℃で２時間イ
ンキュベートすることにより細胞を原形質体化した。原
形質体を回転沈降させ（１０分×5,０００rpm ）、５ml
ＳＭＭＬ緩衝液（1.５Ｍスクロース、0.０６Ｍ MgCl2及
び0.００６Ｍマレエートを溶解したＬブロス）中に再び
懸濁し、混合し、再びペレットにした。再懸濁後、原形
質体を受容体菌株Ｔ５の原形質体、前記のように原形質
体化した生存可能細胞と混合し、約３０％（ｗ／ｖ）ポ
リエチレングリコール6,０００の存在下に２分間インキ
ュベートした。ＳＭＭＬ媒質による１：３希釈及び遠心
分離後、ペレットを少量のＳＭＭＬ媒質中に再び懸濁し
た。次いで１００μｌアリコートを、0.７％（ｗ／ｖ）
K2HPO4、0.３％（ｗ／ｖ）KH2PO4、0.１２５％（ｗ／
ｖ）(NH4)2SO4 、0.０３５％（ｗ／ｖ）MgSO4 ・７H2O
、1.５％（ｗ／ｖ）寒天、3.７％（ｗ／ｖ）KCl 、0.
１％（ｗ／ｖ）グルコース；0.２％（ｗ／ｖ）MnSO4 、
0.２％（ｗ／ｖ）ZnSO4 、0.２％（ｗ／ｖ）及びCoC
l2 、0.５％（ｗ／ｖ）FeSO4 、６％（ｗ／ｖ）NaCl及
び0.５％（ｗ／ｖ）CaCl2 を含有する0.１％（ｗ／ｖ）
微量成分溶液を補充した0.０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清ア
ルブミンを含む再生寒天平板上で平板培養した。更に、
これらの平板は関連抗生物質、ｐＧＢ３３、ｐＬＰ３３
及びｐＬＣ８７の場合に１００〜１６０μｇネオマイシ
ンを含有した。３７℃で少くとも７２時間インキュベー
トした後、平板を、受容体菌株は耐性であるが、供与体
菌株が感受性である他の抗生物質もまた含有するウシ心
臓浸出液（heart-infusion) 寒天平板上でレプリカ平板
培養した。
【００２４】Ａ型として示す融合体（fusant) は実施例
IVに記載した方法により分析した。α−アミラーゼの場
合に手順は次のようしに繰返した。Ａ型融合体をｐＧＢ
３６〔トリメトプリムに対する耐性をコードする遺伝子
を含むｐＴＬ１２（タナカ及びカワノ、Gene（１９８
０）１０：１３１〜１３６）及びＢ．リヘニホルミスα
−アミラーゼをコードする遺伝子を含むｐＧＢ３３のEc
oR I制限フラグメントの組換えプラスミド〕を含むＢ．
サチリス原形質体と融合させるとＢ型として示す融合体
が生じた。Ａ型及びＢ型の融合体はともに、３２ｐ標識
プラスミドｐＧＢ３３を用いるゲノム分析により、及び
比較ＳＤＳゲル−電気泳動により特性化した。最後に、
得られた融合体を種々の酵素の発酵生産のために選択し
た。
【００２５】実施例VI 遺伝子操作したバチルス生産株によるα−アミラーゼ、
プロテアーゼ及びキモシンの発酵生産 ｐＧＢ３３を含むＢ．サチリス株１−８５との融合によ
り（実施例Ｖに記載したように）得られたＢ．リヘニホ
ルミスＴ５の遺伝子操作した生産菌株を工業栄養ブロス
中で、分泌したタンパク質の生産が少くとも0.５％ｗ／
ｖであるような、α−アミラーゼが主成分である、発酵
条件のもとで７日間培養した。この操作した菌株の生産
を親菌株Ｂ．リヘニホルミスＴ５の生産と比較した。生
産菌株Ｂ．リヘニホルミスＴ５により分泌された生成物
（図９レーン３参照）及びｐＧＢ３３を含む遺伝子的に
操作した菌株Ｂ．リヘニホルミスＴ５により分泌された
生成物（図９レーン２参照）のＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル−電気泳動図により示されるように、α−アミラ
ーゼの生産はプラスミドｐＧＢ３３の導入により相当に
増加した。類似の結果がプラスミドｐＬＰ３３、その導
入はプロテアーゼの生産を改良した、及びプラスミドｐ
ＬＣ８７、その導入はキモシンを生産できるＢ．リヘニ
ホルミスＴ５株を生じた、で得られた。
【００２６】表Ｉはそれぞれの遺伝子的に操作した微生
物の改良の量的表示の要約結果を示す。
【００２７】
【表１】 表 Ｉ ───────────────────────────────── 生 物 プラスミド α−アミラーゼ生産 Ｂ．リヘニホルミスＴ５ − １００％＊ Ｂ．リヘニホルミスＴ５ ｐＧＢ３３ １８０％＊＊ Ｂ．リヘニホルミスＴ５ ｐＧＢ３６ ２３０％＊＊ （Ａ型） ───────────────────────────────── 生 物 プラスミド プロテアーゼ生産 Ｂ．リヘニホルミスＴ５ − １００％＊ Ｂ．リヘニホルミスＴ５ ｐＬＰ３３ １４５％＊＊ ───────────────────────────────── 生 物 プラスミド キモシン生産 Ｂ．リヘニホルミスＴ５ − − Ｂ．リヘニホルミスＴ５ ｐＬＣ８７ ＋ ───────────────────────────────── ＊１＝α−アミラーゼ遺伝子 ＊＊２＝α−アミラーゼ遺伝子 ＊＊＊３＝α−アミラーゼ遺伝子
【００２８】主題の方法はバチルスに非常に良好である
ことを示した。しかし、バチルス以外の多くの単細胞微
生物が工業的発酵に使用され、そしてそれらを効率的な
形質転換を受けつけなくする工業バチルス株のような性
質を有する。従って、主題の方法は、原核生物及び真核
生物、例えば他の細菌、菌類、例えば酵母菌及び線状
菌、原生動物、藻類などの工業菌株に適用できることが
分かる。属の種、例えばアスペルギルス(Aspergillus)
、カンジタ(Candida) 、エシエリヒア(Escherichia)
、クルイベロマイセス(Kluyveromyces) 、ペニシラム
(Penicillum)、シュードモナス(Pseudomonas) 、サッカ
ロマイセス(Saccharomyces) 及びストレプトマイセス(S
treptomyces)は殊に重要である。これらの生物中及びバ
チルスについて示した部分中で殊に重要なものは、内生
ポリペプチド、例えばα−アミラーゼ、アミログルコシ
ダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キモシン、β−ガラ
クトシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、ヘミセルラー
ゼ、インベルダーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、ペクチナ
ーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペニシリンアミダーゼ、
ペニシリナーゼ、プロテアーゼ、エキソ−及びエンド−
ペプチダーゼ、プルラナーゼ並びにキシラナーゼの工業
生産である。また、外生タンパク質、例えば哺乳動物の
血液タンパク質、例えば因子VII 、Ｃ及びＲ、血清アル
ブミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、他の血液因
子例えばＶ、VI、VII 、IX、Ｘ、XI及びXII 、リンフォ
カイン、インターフェロン、例えばα−、β−及びγ
−、哺乳動物の酵素、細胞表面レセプター、免疫グロブ
リンなどが重要である。
【００２９】上記結果から相同又は異種の遺伝子を工業
バチルス株中へ安定に導入し、一方菌株の所望特性を保
持し、バチルス宿主に内生の所望の発現生成物を増加し
た生産、又は所望の新規発現生成物の生産における高い
受容能力を与えるための簡単で効率的な手順が提供され
ることが明らかである。転移の高い効率が達成され、実
質的な相同関係がプラスミド構築物と工業バチルス株染
色体との間に存在する場合に、構造遺伝子の１つ又は複
数のコピー組込みを達成できる。主題の方法は、現在存
在する工業バチルス株を所望の種々のポリペプチド及び
タンパク質の効率的な発酵生産を与えるために修飾する
能力を非常に高める。本発明は、理解を平易にするため
に例示及び実施例として詳細に説明したが、一定の変更
及び修正を請求の範囲内で実施できることは明らかで
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はプラスミドｐＧＢ３３の線図であり、
【図２】図２はプラスミドｐＧＢ３４の線図であり、
【図３】図３はプラスミドｐＬＣ２８の線図であり、
【図４】図４はプラスミドｐＬＣ８３の線図であり、
【図５】図５はプラスミドｐＬＣ８７の線図であり、
【図６】図６はプラスミドｐＧＰ３５の線図であり、
【図７】図７はプラスミドｐＬＰ３３の線図であり、
【図８】図８はプラスミドｐＬＰ８７の線図であり、
【図９】図９は種々のバチルス工業菌株により分泌され
た生成物のタンパク質分子量マーカーに関するＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル−電気泳動図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/57 (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 15/56 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:10） (72)発明者 アンドレオリ ペーター ミハエル オランダ国 3055エーイェー ロッテルダ ムモレンラーン 111 (72)発明者 フォス イヴォンネ ヨハンナ オランダ国 1106デーエル アムステルダ ムゼット オー ワーメルストラート 42 (72)発明者 ファン エー ヤン ヘンドリック オランダ国 3068ベーイックス ロッテル ダム パルクルース ４ (72)発明者 ムーレナース レオ イェー エス エム オランダ国 5044エーハー チルブルク クウェンデルホフ 192

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 原栄養体性であり、ファージ感染及び遺
    伝子交換あるいは形質転換に耐性であり、ＤＮアーゼを
    分泌し、かつ工業的醗酵条件下において少くとも0.５％
    ｗ／ｖの分泌タンパク質を生産する工業バチルス株を、
    適当な栄養培体中で生長させる、ただし、前記工業バチ
    ルス株は、プラスミド構築体、染色体中に組込まれたプ
    ラスミド構築体又はそのフラグメントの形において挿入
    されたＤＮＡからなり、前記構築体は、所望のタンパク
    質又はポリペプチド及び選択マーカーをコードする遺伝
    子を含む；次いで該ＤＮＡにより発現されたタンパク質
    又はポリペプチドを分離する、ことからなる所望のタン
    パク質又はポリペプチドの製造法。
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