JPS6332489A - 特異的リパ−ゼをコ−ドするｄｎａセグメント、それを発現するためのベクタ−、これらのベクタ−により形質転換された微生物及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特
異性を有する、トリグリセライド類の加水分解を触媒す
るリパーゼをコードするＤＮＡセグメントに関する。更
に、特定的には、本発明は、微生物において前記セグメ
ントの発現を確実にするクローニングベクター及び、該
ベクターによってそのように形質転換された微生物に関
する。本発明は、このような形質転換された微生物を増
殖させることによって前記リパーゼを製造する方法にも
関する。

カビ、デオトリクム　カンジダム（ｍｏｌｄ　Ｇｅｏｔ
ｒｉｃｕｍ　Ｃａｎｄｉｄｕ饋）は、トリグリセライド
の脂肪酸により占められた位置はどこであってもよいが
、即ち、）　Ｕグリセライド内のＩＩＩ肋酸の位置に関
して特異性は見られないが、少な（とも１つのシス−９
二重結合を含む脂肪酸に対して、絶対ではないが、独特
な特異性を示す細胞外リパーゼを生産することは周知さ
れている〔デオトリクム、カンノダムリバーゼの特異性
に関する文献としては、例えば、アール、ノー、ツエン
セン、リビッド、第９巻、第３号、１４９頁、１９７４
年（Ｒ，Ｇ、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｌｉｐｉｄｓ　９．ｎ”３
，１４９．１９７４）参照］、、この特異性は、工業的
目的には興味あるものである。その理由は、天然の脂肪
及び油を加水分解する古兵的方法に用いられる厳しい条
件（２３０−２５０℃、３〇−４０気圧）は、広範な縮
合及び重合副生物を形成させ、出発天然生成物が、例え
ば、大豆油、ひまわり油、菜種油、カルサム油（ｅａｒ
ｔｈａｍ　　ｏｉｌ）、あまに油の如く、不飽和脂肪酸
に富んでいればいる程そうであるからである。

Ｙ！トリクム、カンジダムからのリパーゼの他の実際的
用途は、他のリパーゼとは対照的に、２−プロパツール
、３−ヘキサノール又はシクロヘキサノールの如き二級
アルコールとオレイン酸のエステル化を引き起こし得る
ことが示されたこの酵素の明らかに独特な別の性質から
生じる〔ニス。

オフムラ等、、パイオヒミカ、工、バイオフイジヵ。

アクタ５７５．１５６．１９６９　（Ｓ、０ｋｕｌｌｕ
ｒａ　ｅｔａｌ、、　Ｂｉｏｃｌ＋ｉｎ、［１ｉｏｐｈ
ｙｓ、＾ｅｔａ　５７５＊１５６ｔ１９６９）］。

更に、デオトリクム、カンジダムのリパーゼは、特に、
酪農工業の矯味矯臭剤＊（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ　ａｇ
ｅｎｔ）として、食品工業における用途を見出だすこと
ができることが知られている〔エム、デー、デー。

ハウレフト、食品及び飲料工業における生物工学。

Ｉ第１回国民会議、ブライトン１９−２０／９／１９８
３、会議議＄鉢、６４式（Ｍ、ｌ）、Ｉ）、ｌｌｏい１
゜ｔｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、ｉｎ　ｔｈｅ　Ｆｏｏ
ｄ＆Ｄｒｉｎｋ　Ｉｎｄ、、Ｆｉｒａｔ　ＮｔｌＣｏｎ
ｊ’、Ｂｒｉ　ｇｈｔｏｎ　　１９−２０／９／１９８
３ｙＣｏｎｆ、Ｐｒｏｃ　、Ｐ、６４）］　　。

しかしながら、これらの興味ある特徴は、今日まで、エ
ステル交換反応（ベルギー特許ｔＰＪ８５１゜２６５号
；１９’／７）以外には実際の目的には利用されたこと
はない。この逆説的情況は、多分、グオトリクムー、カ
ンジグム自身の使用によるリパーゼの製造に固有の困難
から生じる。この製造は、糸状ａｌｊＭ（ｆｉｌａｍｃ
ｎｔｏｕｓ　ｆｕｎｇｉ）の大規模増殖ニオいて最近遭
遇した実際的問題により妨害されるのみならず、ｒオト
リクム、カンノグムのリパーゼの生産性は一般に小さい
、結果として、リパーゼを生産するには、大量のバイオ
マスの同時製造を必ず必要とするが、その価格安定化は
、ヒトにおいて、デオトリクム、　１２＞ｉζ７４ヨが
デオトリクム症（ｇｅｏｔｒｉｃｈｏｓｉｓ）　（デイ
クシΔネール　デ　メデイシン、７ラマリオン１９８２
．３４２真（Ｄｉｃｔｉｏｎｎａｉｒｅ　ｄｅ　Ｍｅｄ
ｉｖｉｎｅ、Ｆｌａａ＋ｍａｒｉｏｎ　１９８２．ｐ、
３４２）］として知られた種々の病理゛Ｔ的発現の原因
であることが知られているということによって困難と成
る。

これらの困難を収り除く１つの方法は、適当に固定化さ
れた菌類（ｆｕｎｇｕｓ）によりリパーゼを生産させる
ことである。しかしながら、この方法は、だ−ＬＬクメ
、カンジ乙Ａｌこよるリパーゼの生産には、厳審な好気
性条件を必要とし〔ワイ、ツノサカ等、？アグリカルチ
ュラル、アンド、バイオロンカル。ケミストリー、第３
７８、ｔｔＳ４号、８３７．１９７３　（Ｙ、Ｔｓｕｊ
ｉｓａｋａ　ｅｔ　ａｔ、、＾ｇｒ、　Ｈｉｏ　ｌ　、
　ＣＩｕｅｍ曝７．ｎ　４−８３７．１９７３）］　、
そして）ｌｆｆｌの存在（エム、イワイ等、、アグリカ
ルナユラル、アンド、バイオロジカル、ケミストリー、
第３７巻、４号、９２９頁、１９７３　（Ｎｊｗａｉ　
ｅｔ　ａｌ、＾ｓｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３７．ｎ　
４，９２９．１９７３）ｌは培地を複雑な多相系とする
という事実により、この場合には実際的ではない。

本発明の主な目的は、この目的のために遺伝子工学的に
処理された選ばれた微生物に生産させることにより工業
的用途に利用可能な、’ＩｔＬＵムム、カンジグムのリ
パーゼ又は実質的に同じ特異性を保持したその変種（ｖ
ａｒｉａｎｔ）を＊造することである。

この目的は、少なくとも１個のシス−９二重結合を含む
脂肪酸が選択的に遊離されるような特異性を持った、ト
リグリセライド鼠の加水分解を触媒するリパーゼをコー
ドするＤＮＡセグメントであっζ、下記の配列、 実質的に同じ特異性を保持しＣいるリパーゼをコードす
るそのサブフラグメント（ｓｕｂｆｒａｇＩＩＩｅｎｔ
３）及び突然変異体（ｍｕＬａｎＬｓ）から成る群より
選ばれた配列を含んで成るＤＮＡセグメントを提供する
ことにより達成される。

本発明は、宿主として選ばれた微生物における＾１１記
セグメントの発現を確実にするクローニングベクター、
該ベクターによりこのようにして形質転換された微生物
及び該形質伝換された微生物による該リパーゼの発酵製
造方法も提供する。

下記実施例においては添付図面を参照されたい。

第１図は、本発明のリパーゼをコーーする７ラグメント
を大腸菌（Ｅｓｅｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）で発
現するのに使用されるプラスミドｐ　ＬＩＰＩの構築を
示す。

この構築は、λＮＭＳ９０に挿入することに上りカビ　
デオトリクム、力ζＬｆＬのデノムから単離された２、
３ｋｂ７ラグメントと唯一のＨｉｎｄｌ［制限部位で開
かれたプラスミドｐＢＲ３２２との連結反応により行な
われた。図では、デオトリクム、カンシダムからのＤＮ
Ａは二重線により示されている。第２図は、プラスミド
ｐ　ＬＩＰＩにより形質転換された大腸菌により示され
るリパーゼ活性が関連しているＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ−
Ｅｃ　ｏ　Ｒ１セグメントを含んでいるＤＮＡ領域の最
初の１８３１塩基対の配列を示す。第３関は、本発明の
リパーゼをコードする７ラグメントを酵母で発現するの
に使用されるプラスミドｐＬＩＰ２の構築を示す。この
構築は、プラスミド、ＬＩＰｌのＡ　ＴＧｌｌｌｌ始フ
ドンから上流の領域を欠失した後プラスミド、ＬＩＰＩ
からのリパーゼをコードする７ラグメントを発現ベクタ
ーｐ　ＥＸ−２に挿入することにより行なわれる０図で
は、デオトリクム、カンノダムからのＤＮＡは二重線に
より示され、バクテリアのＤＮＡは細い線により示され
、酵母ＤＮＡは太い線により示される。

その特異性は別にして、デオトリクム、カンシｊＡのリ
パーゼの研究は比較的少なかったので、その酵素学的特
性は大部分はまだ知られていない。

例えば、その分子液は、成る著者により３７ｓ０００で
ある〔ノエー、ケー、クロール等、、ファー７ノー第２
８巻、第４号、２６３．１９７３　（Ｊ、Ｋ。

Ｋｒｏｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｈａｒｍａｚｉｅ　２
８ｖ１１４，２６３ｔ１９７３）］ことが報告され、そ
して成る別の著者により５３゜０００−５５　、０００
である（ワイ、ツノサカ。

等、、アグリカルチュラル ル、ケミストリー、第３７巻、第６号、１４５７、１　
９　’／　３　（Ｙ，Ｔｓｕｊｉｓａｋａ　ｅｔ　ａｌ
．ｔ＾ｇｒ，Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｗ，３７＊ｎ　ｂ＋　１
４５７．１９７３）］ことが報告された。それは、主と
してマン７ースから成る約７．５％の炭水化物を含有す
るように僅かにグリコジル化されているようである。そ
れは、小さい割合の（約１％）脂質も含有するが（ワイ
．ツノサカ等の上記文献）、これらがＰ＃．素話性に対
して必須の役割を果たすかどうかは知られていない。唯
一の予備的ＸＡ９を回折の研究がこれまでになされた〔
ワイ．ハタ等．，エイチ．バイオケム．第８６巻、１８
２１、１９７！ｌ　（Ｙ．ｌｌａｔａ　ｅｔ　ａｔ，、
ｔｌ．Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ，８６．１８２１ｙ１９７９）
Ｊが、それからＭ索の二次及び三次構造に閃する限られ
た情報しか引き出すことはでさない。そのアミノ酸組成
は決定され〔ワイ．ツノサカ等の前記文献）：硫貿合有
アミ／＠（　システィン及びメチオニン）は加水分解物
には検出されなかった。しかしながら、精製したリパー
ゼの工業的生産からなされた最も最近の決定〔ジャーム
．マルセイユ（Ｃ；ｅｒｍｅ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ）］
は、下記表に示された知きメチオニンの存在を示し、こ
の表には、前記したヌクレオチド配列から計算された組
成も示されている。

ト　　　１　ス　： Ｑ　　　１　　　　・ ン）゛ ；　　＼・ 」 ［保 ；　　　　ボ ・　　　　　４ ３Ｉ　　　ψ　　−−Ｑ　　）　　　−　　Ｑ３２　　
　−　　　　１−　　　−　　　　　　　　　＞　　　
　＋５　　　　　Ｏ−ロ　　　　ｈ　　　＋＋：　　　
　　　１　　　　　　畳力　　ロ　　−　　リ　　く　
　ロ　　＞　　　Ｘ　　　＋　　　−−−。

前記したヌクレオチド配列から計Ｗ、された組成とリパ
ーゼのｙ！、＋ａの＃Ｉ製物から得られた分析データと
の不一致は、部分的には、＃素の不十分な精製の結果と
みなすことができるが、リパーゼは普通はゲオトリクム
、カンジグムにより分泌されるというｌｔ’ｆｆにも帰
することができる〔グブリュ。

オー、ネルソン、ジャーナル、イブ。プリー、サイエン
ス、第３５巻、４５５．１９５２　（Ｗ、Ｏ，Ｎｅｌｓ
ｏｎｗＪ、Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、３５，４５５．１９５
２）］　、それ故、リパーゼ遺伝子により暗号化された
（ｃｎｅｏｄｅｃｌ）ポリペプチドは、リパーゼの小胞
体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｅ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｗ）へ
の輸送を可能とし且つ成熟タンパク質において切ｒ）ｌ
！Ｌされるシグナル配列を含有するべきである。しかし
ながら、後に不すように、リパーゼが細胞内タンパク貿
として発現された大腸菌から！！遺されたホモジネート
は、デオトリク牟ユ２Ｌンノグムにより分泌された成熟
タンパク質と同じ特異性を持つリパーゼ活性を示す。本
発明は、そのヌクレオチド配列が前記に示されたもとも
との遺伝子に関するのみならず、突然型ｙ４（ｍｕｔａ
ｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）により
それから得られたそしてデオトリクム、カンジグ船リパ
ーゼの典型的な特異性を少なくとも部分的に保持してい
るポリペプチドをコードしているすべての変異体（Ｖａ
ｒｉａｎｔｓ）にも関すると理解されるべきである。特
に、カビにより実際に分泌されたままの成熟リパーゼを
コードするＤＮＡ領域は、本発明の範囲内に含まれると
みなされなければならない。同様に、該領域が、宿主と
して選ばれた微生物からのリパーゼの分泌を可能とする
シグナル配列をコードしている他のＤＮＡ配列と融合し
ているいかなる構造も本発明の範囲内に含まれると考え
るべきである１例えば、酵母が異種ポリペプチドの！ｌ
！造に使用されるべき場合には、このポリペプチドをコ
ードしているＤＮＡ領域を酵母接合７エロルモンａ因子
（ｙｅａｓｔ　　ｍａｔｉｒ＋ｇ　　ｐｂｅｒｏｍｏｎ
ｅα−ｆａｃｔｏｒ）の前駆体のり−グー領域（ｌｅａ
ｄｅｒ　ｒｅビ１ｏｎ）を暗号化している配列と融合す
ることが最近は実施されている〔例えば、ニー、ジェー
、ブレーク等、、グロシーディング、オブ、ザ、ナショ
ナル、アカデミ−０イブ。サイエンス、オブ、ザ、ニー
、ニス、ニー。

第８１＠、４６４２．１９８４（＾、Ｊ、　Ｂｅａｋｅ
　ｅｔ　ａｌ、、）’ｒｏｅ、ＮａＬｌ、＾ｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、υ５Ａ８１，４８４２．１９８４）参照］。

他のＩＩｆ能性は、上記興味あるコード領域を、酵母開
裂機構により認識される異種シグナル配列、例えば、ニ
ワトリリゾチームのシグナル配列（ベルギー特許ｔｌＳ
９０１．２２３号、１９８５）をコードするＤＮＡ７ラ
グメントと融合することである。

乞Ｌ）　＋７　ｉ−ムユＬ乙１）−ｆｌ、−リパーゼと
χ質的に同じ（Ｍ油分解活性及び特異性を持ったどりペ
プチドの酵母による分泌を確実にすることを目的とする
このような捕集は、本発明の範囲内に含めるべきである
。

本発明の他の観点に従えば、前記したリパーゼをコード
しているＤＮＡセグメントの発現を確実にするためのク
ローニングベクターが提供される。

これらのベクターは選ばれた受容体微生物を４匹して選
ばれるべきことは明らかである。大腸菌が好ましい場合
には、古典的マルチコピープラスミド、例えば、内在性
レプリコン（ｅｎｄｏＩ？ｅｎｏｕｓ　ｒｅｐｌｉｃｏ
ｎｓ）Ｃｏ　ｌ　Ｅ　１、ｐＭＢｌ及びｐ１５Ａ由米の
プラスミド、特に、ｐＢＲ：（２２系列のプラスミドが
有利に使用されるであろう。

リパーゼをコードするセグメントをクローニングするた
めに、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、プソイドモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（
ＳｔｒｅｐＬｏＩＩｌｙｃｅ！り属、のバクテリア宿主
も使用することができる。しかしながら、本発明の好ま
しい態様に従えば、このクローニングは酵母において行
なわれる。当業者には知られているとおり、工業的目的
には、酵母はバクテリアより優れた種々の実際的利、α
を持っている。種々の酵母種が一般に安全と認められて
いる（Ｇ　ＲＡ　Ｓ　）のみならず、それらは飼料配合
物のタンパク質及びビタミンの価値あるソースでもある
。更に、それらは大規ＰＡ発酵に好適であり、７アーノ
感染に鋭敏ではなく、半無菌条件のみを必要とする。ポ
リペプチドの製造のための工業的微生物としての酵母の
他の利点は、多くの場合に、遺伝子工学によりタンパク
質排出をさせやすくでき、従って、古典的な下流処理手
段、例えば、クロマトグラフィー、限外ろ過、沈でん等
により培養培地から所望のタンパク質を容易に回収する
ことができる。＃母の更に他の利点は、それらが嫌気性
条件下に増嬉することができ、そのため、酵素を包含す
る代謝物の製造のために同定化された形態で容易に使用
可能であるという事実から生じる。このような目的に対
して、分子生物学的に特に良く知られており且つ実際の
食品用途に大背から使用されてきた酵母”ｔ　ｙ　ＩＪ
　Ｃ７Ｅ−±−３、セレビｐ　：ｘ、　（Ｓａｃｃｌ＋
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が特に好適
である。しかしながら、外米性Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｅｘ。

Ｈｅｎｅｏｕｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）により形質転換ｉ＋７
能な他の種の酵母も使用することができる。このような
他の酵母の例としては、”ｆ　７ｊ−三！不Ｐ−プｊ６
１ニー！Ｌ（去＋　！Ｌ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐ
ｓｉｓ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、スキゾサツ力ロミセ
ス、ボンビ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｐｏＩＩｌｂｅ）、クリエイベロマイセス。ラクチス
（Ｋ　ｌ　ｕｙｙｅｒｏｎｙｃｅｓ　１ａｅＬｉｓ）、
カンソゲ、シリンドラセア（Ｃａ＋ｔｄｉｄａｃｙｌ　
１ｎｄｌａｃｅａ）等を挙げることができる。これらの
も培養培地中にタンパク質を分泌する傾向が大島い６例
えば、培養培地中にリパーゼを分泌し、この培地から例
えば沈でんにより酵素を回収することができることが周
知されているカンノグ、シリンドラセアの場合がそうで
ある（米国特許第３゜１８９．５２９号、１９６５）。

ｉヱプロマイコプシス、リボリチ久もリパーゼを分泌す
ることが知られている、２種類の他のリパーゼが分泌さ
れるが細胞壁と結合したままである〔ワイ、オータ等、
、アグリカルチュラル、アンド、バイオロジカル、ケミ
ストリー、第４６巻、第１２号、２８８５　、　１　９
　８　２　　（Ｙ、Ｏｔａ　　ｅｔ　　ａｌ、、八ｇｒ
、Ｂｉｏ１．ＣＩ＋ｅｗ、４６゜ｎ　１２．２８８５．
１９８２）］。

しかしながら、当業者には知られているとおり、実質的
量の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　）タメバク質の
生産をｆ＃実にするクローニング法が役　有効であるの
は、特にサツカロミセスエ処−の酵母、更に特定的には
”？　エｌ）ロミセス、セレばシエ樵に属する酵母であ
り、成る場合には、例えば、スーパーオキシドジスムタ
ーゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕＬａｓｅ）（
国際特許出願ＷＯ３５１０１５０３）について、格段に
高い発現レベルを可能とする。本発明のリパーゼをコー
ドするＤＮＡセグメントのサツカロミセス。

文とく一辷丑での発現を確実にするために、異なる種類
のクローニングベクターが利用−可能である。

この目的に組込みベクターを使用することができるが、
しかしながら、本発明の好ましい態様に従えば、クロー
ニングは自０Ｉ複製性プラスミドを用いることにより達
成されるであろう、このようなプラスミドは、これらの
種の大抵の菌株に存在する２−ミクロン内在性プラスミ
ド（２−ｍｉｃｒｏｎ　ｅｎｄ。

ｇｅｎｏｕｓ　ｐｌａｓｍｉｄ）の複製起点（ｒｅｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒｉｌ（ｉｎ）又は、結局は染色体
起源の自律複製のａ−ｒｓ上セグメント含んで成る。こ
のようなプラスミドは、プラスミドにより有効に形質転
換された細胞の視覚１ヒ及び選択を可能とする楳ｌ＆遺
伝子も含有しなければならない、４２ａ遺伝チとしては
、必須代謝物、例えば、アミノ酸の生合成に関与する酵
素をコードする遺１云子が一般に使用される。このよう
な場合には、使用されるべき宿主細胞は、突然変ｙ４に
よってこの代＃物に対して栄養要求性となっｌこ酵母株
が使用される６直配代１甜物を含まない培地にこの株を
接種することによっζ、欠失遺伝子を担うプラスミドに
より形質転換されたこれらの細胞のみが増殖することが
できるであろう。このような標識の典型的な例は、ロイ
シン及びトリプトファンの生合成に関与する酵素をそれ
ぞれコードしている遺伝子ＬＥＵ　２−及びＴＲＰＩで
ある。

他の典型的な例は、ウラシルの生合成−二関与する酵素
をコードしている遺伝子−見−いユである。これらの発
現ベクターは、興味の対象であるコード部分を挿入する
ための、１つ又は好ましくは幾つかの特異な制限部位と
、その発現を最適にするために必要な種々の要素、即ち
、プロモーター、ターミネータ−１及び他の制御要素も
含まなければならない。

これらの酵母ベクタープラスミドは、中間バクテリア宿
主、例えば大腸菌においてそれらの複製及びそれらの選
択を確実にすることができるバクテリアの配列も含むこ
とが多い。このようなシャトルプラスミドの例としては
、ＹＥｐ１３（ノエー、アール、ブローチ等、、ジェネ
第８巻、１９７９．１２１　（Ｊ、Ｈ，Ｂｒｏａｃｈ　
ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　８．１９７９゜１２１）］　
、ｐ　Ｆ’Ｌ　１−４　（エム、７−ル、シェパリ工等
、、ノヱネ第１１巻、１９８０．１１（町Ｒ，Ｃｈｅｖ
ａｌｌｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、ｔ　ＧｅｎｅｌＬ　１９８
０＋　１１）Ｊ　、ｐ　Ｊ　ＤＬｌ　２０　’１　（ノ
ヱー、デー、ベッグス　アル７レフド　ベンゾン　、コ
ベンハーデン　ムンクスが−ドでの第１６同シンポジウ
ム、１９８１，３８３Ｓｔ　（Ｊ、Ｄ、Ｂｅｇｇｓ　　
＾Ｉｆｒｅｄ　　ｔｌｅｎｓｏｎ　　Ｓｙ輸ｐｏｓｉｕ
ｍ　　ｎ　　１６．　　Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ、　Ｃｏ
ｐｅｎｈａｅｇｅｎｗ　１９８１．　ｐ、　３８３）Ｊ
　、ｐＨＭ１５８及ｃ／ｐＪＯ１５Ｂ（エム、ホイスタ
ースプリュート等、、ジェネ、第３４巻、１９８５．３
６３−３６６（Ｍ、■ｅｕｓｔｅｒｓｐｒｅｕｔｅ　ｅ
ｔ　ａｌ、ｖＧｅｎｅ　ｗ３４、１９８５．３６３−３
６６）］　を挙げることができる。

本発明の好ましい態様に従えば、主として、宿主細胞が
１１１１１文ん一土上χ之メー性−に属している場合に
は、少なくとも、２−ミクロン内在性プラスミドの配列
のａ製（）（Ｆ’Ｐ）機能を含むプラスミドが使用され
る。この機能は、特に、宿主細胞がその２−ミクロンプ
ラスミドを前以て除かれているならば、プラスミドに大
きい安定性をもたらす〔シー、ピー、ホレンバーグ、カ
レント。

トピックス、イン、マイクロバイオロジカル。イムノロ
ノー、＃ｔＪ９６巻、１９８２．１１９　（Ｃ０ＩＩ。

Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｃｕｒｒ、　ｌ’ｏｐ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏ１＋Ｉ＋ｏ＋ｏｕｎｏ１．９−暖、　１
９８２．１１９）；アール、エム、ワルムスレイ等、。

モレキュラー、アンド、ジェネラル、ノエネティックＸ
、１９８：（，３６１（Ｒ，Ｍ、Ｗａａｌｍｓｌｅｙ　
ｅｔ　ａｌ、＋Ｍｏ１．　にｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１
９８３ｔ　３６１）ｌ　、このようなベクターの古典的
な例は、プラスミドｐＪＤＢ２１９及び、ＪＤＢ２４Ｂ
である〔ジェー、デー、ベッグス、ネイチャー　２７５
．１９７８．１０４　（Ｊ。

０．１）ｅｇｇｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　２７−５．１９７
Ｌ　１０４）Ｊ　。

最後に、興味の対象であるコード部分のできるだけ商い
発現レベルを確実にするために、できるだけ有効なプロ
モーターにそれを関連させることが必要である。種々の
強いプロモーターが酵母において知られており、例えば
、アルコールデヒドロデナーゼ（Ａｔ）Ｈｌ）、エノラ
ーゼ（ＥＮＯ８及びｉ：；Ｎ０４６）、グリセルアルデ
ヒド−３−？ホス７エートゲヒドロデナーゼ（Ｇ　Ａ　
Ｐ　ｆ；　３及びＧＡｌ’４９１）、ホスホグリセレー
トキナーゼ（ＰＧ　Ｋ　）のプロモーター〔エム、ジェ
ー、ドブソン等、ヌクレイツクアシクズリサーチ。第１
（）巻、１９８２　、　２　６　２　５　　（Ｎ、Ｊ、
　　ロｏｂｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　１（ｅｓ、　１０ｖ　１９８２＋　
２８２５）ｊ　、アルカリホスファターゼ（ＰＨ０３及
びＰＨ０５）のプロモーター（ヨーロッパ特許出願第１
００，５６１号）又は、プロモーターｐ４１５又はその
′＆異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）（ベルギー特許第９０１
，２２２号、１９８５）が知られている。

クローニング及び酵母における多くのｙ４種遺伝子の発
現に用いて成功したこれらの種々の方法を、本発明のリ
パーゼをコードするセグメントの酵母での発現を確実に
するために更に使用することができる。標準的方法〔チ
ー、マニアチス等、、モレキュラークローニング、コー
ルドスプリングへ−パーラボラトリー、、　１９８２　
Ｃｒ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、＋Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｏｒ　Ｌａｂ、ｙ１９８２）１により行なわれ
る特定の構築の例が、説明の目的で本特許に示されてい
るが、他の方法がｏｆ能でありそして種々の複製起点、
標識遺伝子、有効なプロモーター及び他の構造的要素を
、同様な結果を得るために組み合わせることができるこ
とは明らかである。

本発明の他の観点に従えば、これらの種々の場合に得ら
れる形質転換された！Ｓ胞も又本発明の範囲内にあるも
のと考えるべきである。

微生物、バクテリア又は酵母が、不飽和基質に対する所
望の特異性を示すリパーゼを生産するように本発明に従
って誘導された場合に、この新しい特徴を利用するため
に、その増殖に最し好ましい条件下にそれを増Ｊ４させ
ることが必要である。

当業者は、宿主としで使用される微生物に特有のＶｆ徴
に従ってこれらの条件を決定するのは容易である。

形質転換された微生物は、大抵の場合に、人口的にＮＩ
ｔ染されたプラスミドを損失する多少顕著な傾向を持っ
ているので、それらに対して正の選択圧力（ｐｏｓｉｔ
ｉｖｅ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を及
ばすような培養培地を使用することは有利である。受容
体酵母が１つの又は他の必煩代謝物に対する栄養安水性
′＆九株である場合及び使用されるベクタープラスミド
がその株に原栄ｔｅ求性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）を
同宿させることができる標識遺伝子、例えば、Ｍｉ記し
たｋ【阻ζ又は工実工亡１を含む場合には、この選択圧
力は、培養培地から直配代謝物を省くことによって及ば
すことができる。反対に、プラスミドが、増殖抑制因子
、例えば、Ｇ４１８（ジー、ジメネフツ及びノエー、グ
ビイス、冬イナヤー　２８７．１９８０．８６９　（Ｊ
、Ｊｉｍｅｎｅｚ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｄａｖｉｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　２８７．１９８０．８６
９）ｌの如き抗生物質又はグイユロン（ｄｉｕｒｏｎ）
（ベルギー特許第８９９．６０７号、１９８４）の如き
除草剤に対する渋かれ少なかれ顕著な剛性を酵母に与え
ることがでさる遺伝子を標識として含む場合には、形質
転換された＃母に有利になるような選択圧力は、この抑
制因子を補光した培地でそれを増殖させることによって
かけることができる。

形質転換された酵母が、所望のリパーゼの最善の生産を
確実にする条件下に増殖させられた場合に、これは回収
されなければならない。各の場合にリパーゼの最善の回
収収率及び最も高い純度を得るために、当業者が組み合
わせる多くの方法を利用できる。しかしながら、好まし
い態様に従えば、該リパーゼをコードするＤＮＡ領域は
、形質転換された細胞の形質膜（ｐｌａｓｍｉｃ　ｍｅ
＋ａｂｒａｎｅ）を通してのリパーゼの輸送を確実にす
ることができるシグナルペプチドをコードするリーダー
配列（ｌｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を持っている
ことが好ましい。この場合に、＃索の分離は、それが培
地に放出され、この培地から古艮的方法により酵素を回
収しよもが、それがｖＩ母細胞壁に結合したままであり
、その細胞壁から他の方法により分離する必要があろう
が、実際に相当より容易であろう。

本発明の種々の観点は、純粋に説明のための下記実施例
により更に特定的に明らかになるであろう。これらの実
施例は本発明の範囲を限定するものと考えるべきではな
い。

天施例 ７ア一ジλＮＭ５９０からのＤＮＡ調製物〔エヌ、イー
、マーレイ等、モレキエラー、アンド。

ジェネラル、フェネティックス。第ｉｂｏ：８、ｓ３．
１９　’７　’／　（Ｎ、Ｅ、　Ｍｕｒｒａｙ　ｅｔ　
ａｌ、ｙ　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　！灰、　５
３．１９７７）Ｊ及びカビ　れ煮上Ｊ−バー２−久ンノ
グムからのＤＮＡ調製物の両方とも制限エンドヌクレア
ーゼＨｉｎｄｌｌ［で剛製される。７ア一ジλＮＭ５９
０は唯一のＨｉｎｄｌｌｌ制限部位を持っており、それ
から生じた２つの７ラグメントは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を使用して、デオトリクム、カンジダムからの相当量の
ＤＮＡ７ラグメントと連結される。このようにして得ら
れる組換え１）ＮＡは、２種の大腸菌株ＢＨ２６７１及
びＢ　Ｈ２６１３中に存在する欠陥７７−ノから、ビー
。

ホーン及びケー、マレイ（Ｂ、Ｈｏｈｎ　ａｎｄ　Ｋ、
Ｈｕｒｒａｙ）の方法〔プロシーディング、オブ、ザ、
ナシＢナル、アカデミ−、オア。サイエンス、第７４８
．８号、３２５９．１９　’７７　（Ｐｒｏｃ、Ｎａ１
ｌ、Δｃａｄ、Ｓｃｉ。

７４、　ｎ　８．３２５９．１９７７）Ｊによって！！
！遺されたタンパク貿と混合することによりパッケージ
された。

このようにして得られた完全な７ア一ジ粒子は、次いで
大腸菌株ＨＢ１０１を感染させるのに使用された。

“スピリッツブル−アが一″（“５ｐｉｒｉｔ　１ｔｌ
ｕｅ　Ａｇａｒ″〔デ４７　：Ｉ　（Ｄｉｒｃｏ）Ｊ及
び“リパーゼ試薬°゛（“１ｉｐａｓｅ　ｒｅａｇｅｎ
ｔ″）を含有する７個のベトリ皿に、感染したバクテリ
アを接種し、そして３７℃で一′夜インキュベーション
し、それにより、ベトリ皿１個につき約１０００プラー
クの溶菌゛が出現した。

これらのプラークの１つは、典型的な青色着色により証
明されるリパーゼ活性を示した。この活性の原因となる
λＮＭ５９０１ｉｐと呼ばれる７アーノは希釈により精
製されそして、λ７Ｔ−シにより容易に感染されること
が知られた大腸菌株ＣＬ　１２０４　（Ｃ１３００恒肛
咀０１垣励」りを液体培地中に溶菌することによって比
較的大蛍に調製された。次いで、この７７−）を分離し
、そして、予め形成されたＣ５ＣＬ勾配上でのｍ遠心分
離及びトリス緩衝液９Ｈ’？、５に対する透析によって
更に精製された。

このようにして精ｇ１された７アーノのＤＮＡは２回の
７エノール処理及びトリス／　Ｅ　Ｄ　ｉ’　Ａ　４１
衝液ｐ８８に対する透析により分離された。制限号析に
より特徴付けると、リパーゼをコードする領域は、それ
ぞれ、２．３及び１，６ｋｂの２つの旦、主ｎ−ｄｌｌ
！サブフラグメントより成る３、９ｋｂＶ（ｊ−１−■
挿入品にｌｓ［Ｊ述していることが決定された。

直配災施例に記載の如くして得られた７ア一ノλＮＭ５
９０１ｉｐからのＤＮＡ調製物の、制限酵素Ｈｉｎｄｌ
ｌｌによる不完全な消化により得られた７＆ｌグメント
を、同じ＃素で開いたｐ１３Ｒ３２２と連結させ、そし
てアルカリホスファターゼにより脱リン酸化した。この
ようにして得られた組換えＤＮＡは、Ｃａ１ｌ□処理に
より競合性にせしめられた大腸菌株ＨＢＩＯＩ（む！ど
１農１店Ｌ」几側１込匝岨；エイチ、ダブリュ、ボイヤ
ー及びデー、ローランドーデュソイックス（ＩＩ、ｌｉ
ｌ、Ｂｏｙｅｒ＆υ、　１（ｏｕ　ｌ　Ｉ　ａｎｄ　−
Ｄｕｓｓｏ　ｉ　ｘ　）、ジャ１ナル、オブ。

モレキエラー、バイオロノー、第４１（ｉｒ、４５９．
１９６９　（Ｊ、Ｍｏ１，１ｌｉｏｌ、４Ｌ　４５９．
１９６９）ｌを形質転換するのに使用され、次いで形質
転換体を“リパーゼ試薬”を有する“スプリットブルー
ア〃−”のベトリ皿上の移行により、リパーゼ活性につ
いてスクリーニングした：８つのクローンが、コロニー
のまわりに青いハローを生じることにより正（ｐｏｓｉ
ｔｉｖｅ）であることが示された。

これらの正のクローンの１つが有効なリパーゼ生産のた
めに選ばれそしてテトラサイクリンに感受性であること
がボされた。このクローンは以後、Ｌｌ）’１と称する
。その中に含まれたプラスミドは制限Ｈ，索分析及びそ
れに続くアガロースデルでの電気泳動によりＷ全件けら
れそして２．３にｂ挿入部を含有することが示された。

アクリルアミドデルでの電気泳動により更に特徴付ける
と、この挿入部は、制限によって約１４００塩基対（ｂ
ｐ）の１つの比較的大きイＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ−Ｅｃ
　ｏ　ＲＩ７ラグメントと１図にボされた如き約５２０
．２３０及び１２０塩基討の３つのより小さい７ラグメ
ントを生じる３つのＥｅｏＲ１部位を含んで成ることが
決定された。

他の構築においては、前記の大きい及び小さい外１１ｓ
（ｅｘｔｅｒｎａｌ）Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ　−Ｅｃ　ｏ
　ＲＩ　７ラグメントを分離しそして制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで開かれたプラスミドｐ　ＢＲ３２２とのトリプ
ル連結反応により連結し、得られる組換えプラスミドを
ＨＢｌｏｌを形質転換するのに使用した。とのようにし
て得られた形質転換体は、リパーゼ活性を示し、これは
リパーゼをコードする領域全体が大きいＨｉｎｄｌｌｌ
−ｈ：ｅｏＲＩ７ラグメント内に含まれることをホす。

１１図は、前記大きい７ラグメントを含んで成るＤＮＡ
セグメントのヌクレオチド配列〔ニー、マクサム及びダ
ブリュ、ギルバート、酵素Ｔにおける方法、論者、エル
、グロスマン及びケー０モルグブ、アカデミツク、プレ
ス、インコーボレーテット、、ニューヨークアンドロン
ドン、第６５８．４９９真、１９８０（＾、Ｍａｘａｍ
　ａｎｄ　ＪＣ；１１ｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｂｏｄｓ　ｉ
ｎ　ＥｎｚｙｌＩ＋ｏｌｏｇｙ、　Ｅｄ、　ｂｙ　Ｌ、
Ｇｒｏｓｓｗａｎ　　ａｎｄ　　Ｋ、Ｍｏ１ｄａｖｅ、
　　＾ｅａｄ、　Ｐｒｅｓｓ、　　ｉｎｃ、＋　　Ｎｅ
ｗ　　Ｙｏｒｋ＆Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｖｏｌ、　６５．　
ｐ、４９９．１９８０）の方法により決定された］をボ
す。それは２００より多くのアミノ酸のタンパク貿をコ
ードする１つのみの読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉ
ｎｇ　ｆｌａｍｅ）を含み二重のコード領域は位置２０
３の−Ａ　ＴＧ聞始コドンで始まりそして二重停止シグ
ナル（ｄｏｕｂｌｅ　　５ｔｏｐ　　ｓｉｇｎａｌ）（
ＴＡＡ、ＴＧＡ）により位置８３８の後で終わる、こと
が分かる。

更に、その５′７ランキング領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ　
　ｒｅｇｉｏｎ）は、Ａ　’ｒ　ａから３８塩基対上流
の典型的なフ’）　フｆ　’７　Ｋ　−／　９スＴ　Ａ
　’ｒ’　Ａ　Ａ　Ｔ及び、Ａ　′ｒ　Ｇ　カら１１塩
基対上流で始まる典型的なシャイン−ダル〃ルノの配列
ＡＧＧＡＧＧを含んで成る。

このコードしている領域が、ｐ　ＬＩＰＩＩラスミドで
形質転換されたバクテリアにより生産されたリパーゼに
実際に対応するという別の証拠が、下記の欠失実験によ
り得られた：（ａ）プラスミドｐ　ＬＩＰＩをその唯一
のＣ１ａｌ及びＮｃｏ１部位で！ＩＬ４裂して５８００
塩基対７ラグメントと、２つのＨｐａｌ制限部位を含む
コードしている領域の５′末端を含んで成る７３３塩基
対７ラグメントを発生する；（ｂ）この小さいほうの７
フグメントをＨｐａエロで開裂する；（Ｃ）後者の制限
により発生したｑ」−Ｌｌ−±ＬＬＩＩ　（４３４塩暴
対）及び旦」−３−■−町−Ｑ　Ｉ（１１０塩基対）７
ラグメントは及び前者に上り発生した５８００塩基討の
Ｃｊ　ａ　　［−Ｎｅｏ　１７ラグメントを、精製しそ
して、同時に連結してコードｇ１域内に１８６塩基対の
ＬＬＬＩＩ−！−！３土」７ラグメントを欠失したプラ
スミドを得る：（ｄ）このプラスミドを大腸菌の形質転
換に使用した。得られる形質転換体においてはリパーゼ
活性は検出されなかった。

最後に、プラスミドｐＬｌ）’１で形質転換されたバク
テリアにより生産されたリパーゼが、１も１−去久人、
ｊ２浸萄乙Ｋからのリパーゼにより示される所望の特異
性を持つことを確実にするために、形質転換されたバク
テリアのｔＩ波熱処理び凍結乾燥により得られた粗製酵
素調製物を使用して、シーエル、７ランツケ等（Ｃ１，
Ｆｒａｎｚｋｅ　ｅｔ　ａｌ）の方法〔デイ−、ナール
ング第１７巻、第２号、１７１．１９°／　３　（Ｄｉ
ｅ　Ｎａｈｌｕｎｇ１７．　ｎ　２ｔ　１７１．１９７
３）に従ってトリオレイン及びトリパルミナンの等モル
混合物を加水分解した。リパーゼの作用にょＩＪ離した
遊離酸を、溶媒として石油エーテル／ノエチルエーテル
／酢酸７０／３０／２混介物を使用して薄層クロマトグ
ラフィーにより分離し、ビー、ニー、ビオシン及びエム
、カグナッソ（Ｐ、＾、　Ｂｉｏｎｄｉ＆Ｍ、Ｃａｇｎ
ａｓｓｏ）の方法〔ジャーナル、イブ。クロマトグラフ
ィー、第１０９巻、３８９．１９７５（Ｊ、Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｊ０９．、ｖ　３８９．１９７５
）Ｊによりメチルエステルに転化し、１０％サイラー（
Ｓｉｌａｒ）５Ｃ）’／りａモソーブ（ｃｈｒｏｍｏｓ
ｏｒｂｅ）Ｗ　ＨＰ　８０／１００メツシユ〔クロモパ
ック（Ｃｈｒｏｍｏｐａｃｋ）］カラムを使用して蒸気
相クロマトグラフィーにょリ分析した。このようにして
決定された遊離酸の割合は、モル％で、バルミチン酸８
％、オレイン酸９２％であった９ 大腸菌株（ｓｔｒａｉｎ　Ｅ、ｃｏｌｉ）ＨＢ　１０１
　（ｐ　Ｌ　１ｐ　ｉ　）は、オランダ国、バーン市、
３７４０ＡＧ。

Ｐ、０．ボックス２７３、オースチルストラード１　　
（Ｏｏｓｔｅｒｓｔｒａａｔ　　Ｌ　　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ
２７３ｖ　　ＭＬ−３７４（ｌ　　ＡＧ　　Ｂａａｒｎ
　（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））の、セントラル。ビニ
−ロー、プール、シンメルカルチャーズ（ＣｅｎＬｒａ
ａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ）に、１９８６年、４８２２日に寄託し、
そこで受は入れ番号Ｃ０Ｂ。

Ｓ、２２９．８６が付けられた。

３．１．ベクター、ＪＤＢ２０７中への２．３ｋｂ　　
−旧−ｎ−ｄ　Ｉｌｌ　７ラグメントの挿入直配実施例
に記載の如くしてプラスミドｐＬＩＰ１で形質転換され
たバクテリアのリパーゼ活性ノ旅因となる２、３ｋ　ｂ
　　Ｈｉ　ｎ　ｄ　１ＩＩＤＮＡ７ラグメントを、酵母
−大腸菌シャトルプラスミドｐＪ　ＯＢ　２０　’？　
（ノエー、デー、ベッグス、ジェネティックエンノニア
リング２、アール、ウィリアムソン編、アカデミツクプ
レス１９８１．１７５頁（Ｊ、Ｄ、口ｅｇｇｓ＋　　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２．　　Ｅ
ｄ、　　ｂｙｌ（Ｊｉｌｌｉａｍｓｏｎｔ　　＾ｃａｄ
ｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　１９８Ｌ　　ｐ、　　１７
５）１に挿入した。このプラスミドは、大腸菌において
選択するためのアンピシリン及びテトラサイクリン耐性
を付与するバクテリアし１−　及びｔ　ｅ　ｔ’遺伝子
並びに、酵母のＬｅｕ−株における選択のための酵母Ｌ
ＥＵ２遺伝子を含む。得られる組換えプラスミドを次い
で大［株ＨＢＩＯＩを形質転換するのに使用し、この形
質転換体をアンピシリン耐性についてスクリーニングし
た。“スピリットブルーア〃−”上に１００の耐性クロ
ーンを移行させると、それらの内９つがリパーゼポジテ
ィブ（Ｉｉｐａｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であることが
示され；それらはテトラサイクリン耐性であることもボ
された。

ｐＥＫ８と呼ばれるこれらのクローンの１つを酵母の形
質転換のために選んだ。このクローンからのプラスミド
ＤＮＡをエイチ、シー、ビルンボイム及びシュー。ドリ
ー（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｓ＋＆Ｊ、Ｄｏｌｙ）の方
法〔ヌクレイツクアシッド　リサーチ、第７巻、第６号
、１５１３．１９　’／　９　（Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａｃ
１ｄ　Ｒｅｓ。

７、　ｎ　６．１５１３．１９７９）ｌにより単離し、
そして酵母株ＡＨ２２（Ｌｅｕ　２　３　　Ｌｅｕ　２
−１１２ｊｉｓ４−５１９　　ＣＡＮ）を形質転換する
のに使用した。

形質転換体を、０．００２％ヒスチジン、ＩＭＭＬビト
ール及び２％ア〃−を補充した最小培地（０，６７％酵
母窒素塩基、２％グルコース）上でのロイシン原栄養要
求性（ｉｅｕｃｉｎｅ　ｐｒｏｔｏｔｏｒｏｐｈｙ）に
ついてスクリーニングした。得られる形質転換体を次い
で、ヒスチジンを補充した液体最小培地で培養し、ブラ
ウンホモジナイザー（Ｂｒａｗｎ　ｈｏ麹ｏＨｅｎｉｚ
ｅｒ）中で〃ラスビーズとともに振とうさせることによ
りリン酸塩ｔＩＬｇＩ液０．１ＭｐＨ’７中で細胞を破
ＩＪ！させ、エム、シー、ショルツ等（Ｎ、Ｃ，５ｃｈ
ｏｌｔｚ　ｅｔ　ａｌ）の方法〔ジャーナル、オブ、リ
ビツド、リサーチ、第１１巻、６８．１９７０　（Ｊ、
Ｌｉｐ。

Ｒｅｓ、　！−１．６８．１９７０）］から修正したラ
シオアフ七イによりリパーゼ活性を決定することによっ
て、リパーゼ活性について試験した。細胞ホモノネート
中に有意なリパーゼ活性を検出することができなかった
。リパーゼをコードするセグメントが形質転換された酵
母中に実際に存在していることを確かめるために、その
中に存在するプラスミドＤＮＡを抽出し、再び、大ａｍ
株ＨＢＩＯＩを形質転換するのに使用した。’／’ｆ）
リクム、１ンジダにのデノムからの元の２．３ｋｂ７ラ
グメントにおけるリパーゼをコードする領域を伴う制御
１要素が大腸菌により正しく認識されたが、醇母発現磯
枯によっては認ａされなかったとい）のが結論であった
。

３．２　発現ベクター、ＥＸ−２を使用する、文ムｐロ
ミセス、セレ（辷丑におけるリパーゼをコードするセグ
メントのクローニング 本発明のリパーゼをコードするセグメントの酵母におけ
る発現を確実にするために、これまでの結果からして、
Ａ　Ｔ　Ｇ　１％１始コドンから上流で、その５′７フ
ンキング領域を除去し、トリミングされた７ラグメント
を酵母プロモーターとを、適当なＭ、母発現ベクターに
おいて融合することが必要であると思われる。

この溝築においては、酵母−大腸菌シャトルプラスミド
ｐ　ＥＸ−２が、酵母におけると同様に大腸菌において
も異種遺伝子の発現を確保することができる能力の故に
〔ノエー、エフ、エルンスト及１アール、クー。シャン
、ジャーナル、オブ。

バクテリオロジー、＃５１６３巻、第１号、８．１９８
５　（Ｊ、Ｆ、Ｅｒｎ５ｔ　ａｎｄ　Ｒ，に、Ｃｈａｎ
ｔ　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８３、　ｎ　１．８．
１９８５）］　、発現ベクターとして選ばれた。このプ
ラスミドは、大腸菌における選択のための１１吐！Ｉ：
Ａａ遺伝子及び、酵母のＵｒ　ａ　−株における選択の
ためのＵＲＡ３遺伝子を含む。

ｖＩ築の種々の工程は下記のとおりであった（■図参照
）： ａ）プラスミドｐ　ＬＩＰＩをその唯一のＣｌａｌ部位
で開きそして、ヌクレアーゼＢＡＬ：（１（ＤＮＡ１８
ｇにっ終０．１単位）で、２０℃で１゜３０分間消化し
、後者の反応をフェノール処理により停止させた。

ｂ）このようにして得られた短くしたプラスミドの集団
を次いでアール、レース等の方法（ＤＮＡ第３春、１°
１３．１９８４）により仲人されたリンカ−郵−ａｍＨ
１１２マーを使用して再環化し、そして、その高い形ｆ
ｆ転換頻度で注目されるｂｉｏ　　ｈｓｄＲ；エム、７
−ル、シェバリエ、モレキュラー、アンド、セルラー、
バイオロジー。

第２巻、第８号、９７７．１９８２　（Ｍ、Ｒ，Ｃｂｅ
ｖａｌｌｉｅｒ、Ｈｏｔ、＆ｃｅ１１．Ｂｉｏ１．２．
　ｎ　８．’　９７７、１９８２）ｌ中に形質転換した
。

ｅ　）９６０の形質転換されたクローンから、６１３（
６４％）のクローンはリパーゼ活性を失っていた。これ
らの不活性なりローンを、選択培地（１％トリプトン、
１％Ｎａ　ＣＬ、０．５％酵母抽出物、５０ｍｇ／ｊ！
アンピシリン）中での増殖及びプラスミドＤＮＡの単離
のためにプールした。

ｄ）このようにして調製されたプラスミドＤＮＡを制限
酵素Ｂａａ＋ＨＩで［！１２Ｌそして得られる７ラグメ
ントを７〃ロースデルでの電気泳動により分離した。リ
パーゼをコードする領域を担っているこれらの７ラグメ
ントは単一の大きなバンドとして移動し、これをノー、
ドレッツェン等（Ｇ、Ｄｒｅｔｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ）の
方法〔７ナリテイカル、バイオケミストリー、ＰＩＳ１
１２巻、２９５．１９８１（＾ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、１１２．２９５．１９８１）Ｉにより１）ＥＡＥ−セ
ルロース紙上で前記デルから回収した。

ｅ）このようにして単離した７ラグメントを、ＣＹＣＩ
プロモーター及びターミネータ−領域間のその唯一のＢ
ａｍＨＩ部位で開かれたプラスミド９　ＥＸ−２と連結
し、そしてバクテリアのアルカリホスファターゼ〔ワシ
ントン（ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）］の作用により脱リ
ン酸化した。

ｆ）このようにして得られた組換えプラスミドの集団を
、大腸菌株Ｂ　Ｊ　５１８　：（中に形質転換しそして
、形質転換体をアンピシリン耐性及びリパーゼ活性につ
いて同時にスクリーニングした：約２５００００からの
２６クローンが、形質転換体の選択のために“リパーゼ
試薬”及びアンピシリンを補充した“スピリットブルー
フｊ！７−”上に現れた青色により証明される如く、２
日以内にリパーゼ活性を現すことができることから選択
された。

ｇ）これらのリパーゼポジティブクローンからのプラス
ミド１）ＮＡを、ビルンボイム及びドリーのＨ法（前記
参照）により単離し、そしてＤＮＡＪ１＃ｉのために株
ＢＪ５１８３よりも適当な大腸菌株ＨＢ　１０１を形質
転換するのに使用した。得られる形質転換体を、プラス
ミドＤＮＡ単離、バーｓＨＩ制限及びアブロースデル電
気詠動により特徴付けた。これらのりａ−ンの１つは、
良好なリパーゼ活性及びプラスミドｐＥＸ−２における
予想される寸法のはっきりしたＢａａ＋ＨＩ一旦ａ　ｍ
−Ｈ１挿入部の存在について選択された６以後ρＬＩＰ
２と呼ぶこのクローンを酵母の形質転換のために選んだ
、プラスミドｐ　ＥＸ−２とリパーゼをコードする領域
間の接合部のヌクレオナト配列は、マクサム、ギルバー
ト法により決定され、そして−−−ＧＧＡ’ｒＣＣＣＧ
ＡＧＧＡ１’ＡＴＴＡＴＧＡ＾＾ＴＴＴ−・　−司居艷
１１１　　　リパーゼをコードする領域であることが示
された。

ｈ）プラスミドｐ　ＬｉＦ２を使用して、Ｌｌｒａ３−
酵母株０１９０４Ｂを形質転換し、形質転換体を最小培
地でスクリーニングした。得られるクローンの１つを液
体最小培地中で２８℃で定常期まで（約４日）培養した
。次いで細胞を遠心分離により回収し、リン酸塩緩衝液
ｐＨ７中に再懸濁させ、ゲラ１ンンホモノナイザーでプ
ラスビーズと共に振とうさせることにより破袋させた。

得られるホモジネートの０．２ｍ１ｉ分を、標準として
ジャーム社（Ｇｅｒｗ＋ｅ）（７フンス、マルセイユ）
により市販されているリパーゼを使って、ｉ丁ｆ記のラ
ジオアッセイと同じラジオアッセイによりリパーゼ活性
を決定するのに使用した。デイ、バーパート等（Ｄ、Ｈ
ｅｒｂｅｒｔ　ｅＬ　ａｌ）により修正されたローリ−
（Ｌｉｗｒｙ）の方法〔ビー、アール、スチュアート、
メソッド、イン、セル、バイオロジー、ピー、アール、
スチュアート祠、第１巻、１１３頁、１９８１　（Ｐ、
Ｒ，Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｃｅ１
ｌ　　Ｂｉｏｌ、＋　　Ｅｄ。

ｂｙ　Ｐ、）ｌ、Ｓｔｅｗａｒｔ　Ｖｏｌ、　Ｘｌ［ｔ
　ｐ、　ＩＬＬ　１９８１）］　により、他の７リコ一
ト部分に対して全タンパク質を決定した。ｅＩＩ素０，
３４２＋ａｌｌに相当する１７国際単位のリパーゼ（１
単位は、１分につき脂肪酸１ｍｇの放出を引き起こすリ
パーゼの量である）（特異的活性：約３００ｕ／ｍｇ）
が、全タンパク１ｊ２０．５ｍｇ中に存在する、即ち、
発現されたリパーゼは全タンパク質の１．７％に相当す
る、ことがこのようにして決定された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のリパーゼをコードする７ラグメント
を、大腸菌において発現するのに使用されたプラスミド
ｐ　ＬＩＰＩの構築を示す。 第２図は、プラスミドｐ　ＬＩＰＩで形質転換された大
腸菌により示されるリパーゼ活性と関連がある、Ｈｉｎ
ｄＩ［ｒ−ＥｃｏＲ１セグメントを含んで成るＤＮＡ領
域の最初の１８３１塩基対の配列を示す。 第３図は、本発明のリパーゼをコードするセグントを酵
母において発現させるのに使用されるプラスミド、Ｌｉ
Ｆ２の構築を示す。 特許出願人　ラボフイナ・ソシエテ・アノニム已８　ヒ
ミ　ミミ　ｅ巳　日ミ　凸ミ　璧ミ　ミミ　已己手続補
正書（龍） 昭和６２年８月２６日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特異性を
   持ったトリグリセライド類の加水分解を触媒するリパー
   ゼをコードするＤＮＡセグメントであって、該セグメン
   トが下記のヌクレオチド配列、 【遺伝子配列があります】 実質的に同じ特異性を保持しているリパーゼをコードす
   るそのサブフラグメント及び突然変異体より成る群から
   選ばれた配列を含んで成ることを特徴とするＤＮＡセグ
   メント。 ２、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特異性を
   持ったトリグリセライド類の加水分解を触媒するリパー
   ゼをコードするＤＮＡセグメントの酵母での発現を確実
   にすることができるクローニングベクターであって、該
   ＤＮＡセグメントが下記のヌクレオチド配列、 【遺伝子配列があります】 実質的に同じ特異性を保持しているリパーゼをコードす
   るそのサブフラグメント及び突然変異体より成る群から
   選ばれたものであることを特徴とするクローニングベク
   ター。 ３、前記リパーゼをコードする前記ＤＮＡセグメントを
   、前記酵母からの前記リパーゼの分泌を許容するシグナ
   ル配列をコードするＤＮＡセグメントと融合させること
   を特徴とする特許請求の範囲第２項記載のクローニング
   ベクター。 ４、前記シグナル配列が、インベルターゼ、酸ホスファ
   ターゼ、α−接合因子（α−ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ
   ）、ａ−接合因子（ａ−ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）、
   ニワトリリゾチーム、大腸菌β−ラクタマーゼ及びアス
   ペルギルス．アワモリグルコアミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇ
   ｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）
   のシグナル配列より成る群から選ばれたものである特許
   請求の範囲第３項記載のクローニングベクター。 ５、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特異性を
   持ったトリグリセライド類の加水分解を触媒するリパー
   ゼをコードするＤＮＡセグメントのバクテリアでの発現
   を確実にすることができるクローニングベクターであっ
   て、該ＤＮＡセグメントが下記のヌクレオチド配列、 【遺伝子配列があります】 実質的に同じ特異性を保持しているリパーゼをコードす
   るそのサブフラグメント及び突然変異体より成る群から
   選ばれたものであることを特徴とするクローニングベク
   ター。 ６、前記リパーゼをコードする前記ＤＮＡセグメントを
   、前記バクテリアからの前記リパーゼの分泌を許容する
   シグナル配列をコードするＤＮＡセグメントと融合させ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のクロー
   ニングベクター。 ７、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特異性を
   持ったトリグリセライド類の加水分解を触媒するリパー
   ゼをコードするＤＮＡセグメントの酵母での発現を確実
   にすることができるベクタープラスミドであって、該Ｄ
   ＮＡセグメントが下記のヌクレオチド配列、 【遺伝子配列があります】 実質的に同じ特異性を保持しているリパーゼをコードす
   るそのサブフラグメント及び突然変異体より成る群から
   選ばれたものであることを特徴とするベクタープラスミ
   ド。 ８、前記リパーゼをコードする前記ＤＮＡセグメントを
   、前記酵母からの前記リパーゼの分泌を許容するシグナ
   ル配列をコードするＤＮＡセグメントと融合させること
   を特徴とする特許請求の範囲第７記載のベクタープラス
   ミド。 ９、前記シグナル配列が、インベルターゼ、酸ホスファ
   ターゼ、α−接合因子（α−ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ
   ）、ａ−接合因子（ａ−ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）、
   ニワトリリゾチーム、大腸菌β−ラクタマーゼ及びアス
   ペルギルス．アワモリグルコアミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇ
   ｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）
   のシグナル配列より成る群から選ばれたものである特許
   請求の範囲第８項記載のベクタープラスミド。 １０、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特異性
   を持ったトリグリセライド類の加水分解を触媒するリパ
   ーゼをコードするＤＮＡセグメントのバクテリアでの発
   現を確実にすることができるベクタープラスミドであっ
   て、該ＤＮＡセグメントが下記のヌクレオチド配列、 【遺伝子配列があります】 実質的に同じ特異性を保持しているリパーゼをコードす
   るそのサブフラグメント及び突然変異体より成る群から
   選ばれたものであることを特徴とするベクタープラスミ
   ド。 １１、前記リパーゼをコードする前記ＤＮＡセグメント
   を、前記バクテリアからの前記リパーゼの分泌を許容す
   るシグナル配列をコードするＤＮＡセグメントと融合さ
   せることを特徴とする特許請求の範囲第１０記載のベク
   タープラスミド。 １２、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特異性
   を持ったトリグリセライド類の加水分解を触媒するリパ
   ーゼをコードするＤＮＡセグメントの酵母での発現を確
   実にすることができ且つ該酵母において自律複製するこ
   とができるベクタープラスミドであって、該ＤＮＡセグ
   メントが下記のヌクレオチド配列、 【遺伝子配列があります】 実質的に同じ特異性を保持しているリパーゼをコードす
   るそのサブフラグメント及び突然変異体より成る群から
   選ばれたものであることを特徴とするベクタープラスミ
   ド。 １３、その複製が２−ミクロンプラスミドからの配列の
   存在により確実にされること及び少なくとも２−ミクロ
   ンプラスミドの複製起点を含んで成ることを特徴とする
   特許請求の範囲第１２項記載のベクタープラスミド。 １４、前記リパーゼをコードする前記ＤＮＡセグメント
   を、前記酵母からの前記リパーゼの分泌を許容するシグ
   ナル配列をコードするＤＮＡセグメントと融合させるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１２項又は１３項に記
   載のベクタープラスミド。 １５、前記シグナル配列が、インベルターゼ、酸ホスフ
   ァターゼ、α−接合因子（α−ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏ
   ｒ）、ａ−接合因子（ａ−ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）
   、ニワトリリゾチーム、大腸菌β−ラクタマーゼ及びア
   スペルギルス．アワモリグルコアミラーゼ（Ａｓｐｅｒ
   ｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ
   ）のシグナル配列より成る群から選ばれたものである特
   許請求の範囲第１４項記載のベクタープラスミド。 １６、前記プラスミドがプラスミドｐＬＩＰ２であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１２項又は１３項に記
   載のベクタープラスミド。 １７、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特異性
   を持ったトリグリセライド類の加水分解を触媒するリパ
   ーゼをコードするＤＮＡセグメントのバクテリアでの発
   現を確実にすることができ且つ該バクテリアにおいて自
   律複製することができるベクタープラスミドであって、
   該ＤＮＡセグメントが下記のヌクレオチド配列、 【遺伝子配列があります】 実質的に同じ特異性を保持しているリパーゼをコードす
   るそのサブフラグメント及び突然変異体より成る群から
   選ばれたものであることを特徴とするベクタープラスミ
   ド。 １８、前記リパーゼをコードする前記ＤＮＡセグメント
   を、前記バクテリアからの前記リパーゼの分泌を許容す
   るシグナル配列をコードするＤＮＡセグメントと融合さ
   せることを特徴とする特許請求の範囲第１７記載のベク
   タープラスミド。 １９、前記プラスミドがプラスミドｐＬＩＰ１であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１７項記載のベクター
   プラスミド。 ２０、特許請求の範囲第７、８、９、１２、１３、１４
   、１５及び１６項のいずれかに記載のプラスミドを含ん
   でいることを特徴とする形質転換された酵母。 ２１、￥サッカロミセス￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
   ｅｓ￥）、￥サッカロマイコプシス￥（￥Ｓａｃｃｈａ
   ｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ￥）、￥スキゾサッカロミセス￥
   （￥Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥）、￥
   クリユイベロマイセス￥（￥Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
   ｓ￥）及び￥カンジダ￥（￥Ｃａｎｄｉｄａ￥）より成
   る群から選ばれた属に属することを特徴とする特許請求
   の範囲第２０項記載の形質転換された酵母。 ２２、￥サッカロミセス．セレビシエ￥（￥Ｓａｃｃｈ
   ａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）、￥サッカ
   ロマイコプシス．リボリチカ￥（￥Ｓａｃｃｈｒｏｍｙ
   ｃｏｐｓｉｓｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ￥）、￥スキゾサッ
   カロミセス．ポンビ￥（￥Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
   ｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ￥）、￥クリュイベロマイセス
   ．ラクチス￥（￥Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔ
   ｉｓ￥）、￥カンジダ．シリンドラセア￥（￥Ｃａｎｄ
   ｉｄａｃｙｌｉｎｄｌａｃｅａ￥）より成る群から選ば
   れた種に属することを特徴とする特許請求の範囲第２１
   項記載の形質転換された酵母。 ２３、特許請求の範囲第１０、１１、１７、１８及び１
   ９項のいずれかに記載のプラスミドを含んでいることを
   特徴とする形質転換されたバクテリア。 ２４、該バクテリアが、大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
   ｉａｃｏｌｉ￥）及び￥バチルス．スブチリス￥（￥Ｂ
   ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ￥）より成る群から選
   ばれたものであることを特徴とする特許請求の範囲第２
   ３項記載の形質転換されたバクテリア。 ２５、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特異性
   を持ったトリグリセライド類の加水分解を触媒するリパ
   ーゼを製造する方法であって、特許請求の範囲第２０−
   ２２項のいずれかに記載の酵母を増殖させ、このように
   して生成したリパーゼを回収することから成ることを特
   徴とする方法。 ２６、シス−９不飽和を含有する脂肪酸に対する特異性
   を持ったトリグリセライド類の加水分解を触媒するリパ
   ーゼを製造する方法であって、特許請求の範囲第２３項
   又は２４項に記載のバクテリアを増殖させ、このように
   して生成したリパーゼを回収することから成ることを特
   徴とする方法。 ２７、特許請求の範囲第２５項又は２６項記載の方法に
   従って得られたリパーゼ。