JP2513896B2 - リパ―ゼの製造方法 - Google Patents
リパ―ゼの製造方法Info
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- JP2513896B2 JP2513896B2 JP2090888A JP9088890A JP2513896B2 JP 2513896 B2 JP2513896 B2 JP 2513896B2 JP 2090888 A JP2090888 A JP 2090888A JP 9088890 A JP9088890 A JP 9088890A JP 2513896 B2 JP2513896 B2 JP 2513896B2
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- Japan
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- lipase
- dna
- yeast
- gene
- vector
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はカビリパーゼ、特に、リゾプス（Rhizopus）
属の1.3位特異性を有するリパーゼをコードするDNAを組
み込んだ組換体DNAを含む酵母を用いる該リパーゼの製
造方法に関する。
属の1.3位特異性を有するリパーゼをコードするDNAを組
み込んだ組換体DNAを含む酵母を用いる該リパーゼの製
造方法に関する。
従来の技術および課題 リパーゼはその多岐の触媒作用から、工業的に重要な
酵素である。特に、カビのリパーゼはトリグリセルドの
1,3位を特異的に分解または合成できるという特徴を有
しており、油脂の改質やエステル合成等への利用価値が
高い。
酵素である。特に、カビのリパーゼはトリグリセルドの
1,3位を特異的に分解または合成できるという特徴を有
しており、油脂の改質やエステル合成等への利用価値が
高い。
本発明者らは、先に、カビの一種であるリゾプス・ニ
ベウス（Rhizopus niveus）のリパーゼをコードするDNA
を単離し、そのDNAを組み込んだ組換体DNAを含む大腸菌
を培養したところ、大腸菌内にカビリパーゼが蓄積され
ることを見い出し、該DNAの配列、該DNA配列を連結した
ベクターおよび該ベクターを大腸菌に導入して発現させ
ることよりなるカビリパーゼの生産方法の発明を完成
し、既に特許出願した（特開昭64−80290号）。
ベウス（Rhizopus niveus）のリパーゼをコードするDNA
を単離し、そのDNAを組み込んだ組換体DNAを含む大腸菌
を培養したところ、大腸菌内にカビリパーゼが蓄積され
ることを見い出し、該DNAの配列、該DNA配列を連結した
ベクターおよび該ベクターを大腸菌に導入して発現させ
ることよりなるカビリパーゼの生産方法の発明を完成
し、既に特許出願した（特開昭64−80290号）。
この方法は、カビリパーゼの生産方法として非常に有
用なものであるが、リパーゼが大腸菌の菌内に蓄積され
るため、精製工程が複雑となり、工業的に大量生産する
には、さらに改良が望まれる。
用なものであるが、リパーゼが大腸菌の菌内に蓄積され
るため、精製工程が複雑となり、工業的に大量生産する
には、さらに改良が望まれる。
そこで、本発明者らは、リパーゼが宿主菌体内に蓄積
されずに効率良く菌体外に分泌される生産系を目的と
し、宿主として酵母に着目して研究、開発に取り組ん
た。その結果、リパーゼをコードするDNA配列および発
現に適したプロモーターを連結した酵母形質転換用ベク
ターを構築することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
されずに効率良く菌体外に分泌される生産系を目的と
し、宿主として酵母に着目して研究、開発に取り組ん
た。その結果、リパーゼをコードするDNA配列および発
現に適したプロモーターを連結した酵母形質転換用ベク
ターを構築することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
課題を解決するための手段 本発明は、リゾプス属の1.3位特異性を有するリパー
ゼをコードするDNAを組み込んだ組換体DNAを含む酵母を
培地に培養し、酵母の菌体外に該リパーゼを産生・蓄積
させ、該培養物から該リパーゼを採取することを特徴と
するリパーゼの製造方法を提供するものである。
ゼをコードするDNAを組み込んだ組換体DNAを含む酵母を
培地に培養し、酵母の菌体外に該リパーゼを産生・蓄積
させ、該培養物から該リパーゼを採取することを特徴と
するリパーゼの製造方法を提供するものである。
本発明の製造方法を実施するには、まず、リパーゼを
コードするDNA配列（第２図に示した塩基配列を有す
る）を連結したベクターを酵母宿主に導入して発現させ
る。
コードするDNA配列（第２図に示した塩基配列を有す
る）を連結したベクターを酵母宿主に導入して発現させ
る。
かかるベクターの構築には、まず、常法に従い、固体
培養法または液体培養法によりカビを培養する。本発明
で用いるリゾプス属のカビの代表的なものとしては、リ
ゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）が挙げられる。
培養法または液体培養法によりカビを培養する。本発明
で用いるリゾプス属のカビの代表的なものとしては、リ
ゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）が挙げられる。
つぎに、培養したカビから、染色体DNAを調製する。
かかる調製は常法により、例えば、ハイネスらの方法
［ハイネス，エム・ジェイら、ネイチャー（Hynes,M.J.
et al.Nature），305,600（1983）］によって行うこと
ができる。
かかる調製は常法により、例えば、ハイネスらの方法
［ハイネス，エム・ジェイら、ネイチャー（Hynes,M.J.
et al.Nature），305,600（1983）］によって行うこと
ができる。
このように調製した染色体DNAから遺伝子ライブラリ
ーを作製し、これから目的遺伝子を含むDNA断片をクロ
ーニングする。これは、DNA断片を大腸菌に形質転換
し、例えば、コロニーハイブリダイゼーションによって
目的遺伝子を保持する形質転換菌を選択し、かかる形質
転換菌を増殖させることによって行うことができる。
ーを作製し、これから目的遺伝子を含むDNA断片をクロ
ーニングする。これは、DNA断片を大腸菌に形質転換
し、例えば、コロニーハイブリダイゼーションによって
目的遺伝子を保持する形質転換菌を選択し、かかる形質
転換菌を増殖させることによって行うことができる。
得られたクローン化DNA断片を用いて発現ベクターを
構築する。構築はクローン化DNA断片を適当なベクター
に連結することにより行う。同時に連結する適当なプロ
モーターとしては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PG
K）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAP
DH）、酸性ホスファターゼ（PHO5）、トリプトファン合
成酵素（TRP1）、アルコール脱水素酵素（ADH）等のプ
ロモーターが挙げられる。構築は制限エンドヌクレアー
ゼ法などの常法に従って行うことができる。得られた発
現ベクターは常法により精製、増殖させることができ
る。
構築する。構築はクローン化DNA断片を適当なベクター
に連結することにより行う。同時に連結する適当なプロ
モーターとしては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PG
K）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAP
DH）、酸性ホスファターゼ（PHO5）、トリプトファン合
成酵素（TRP1）、アルコール脱水素酵素（ADH）等のプ
ロモーターが挙げられる。構築は制限エンドヌクレアー
ゼ法などの常法に従って行うことができる。得られた発
現ベクターは常法により精製、増殖させることができ
る。
ついで、このように構築したベクターを宿主に導入
し、増殖させ発現させる。本発明では宿主として酵母を
用いる。例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）
属、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属など
を用いることができ、入手容易性等の観点より、ことに
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）が好ましい。
し、増殖させ発現させる。本発明では宿主として酵母を
用いる。例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）
属、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属など
を用いることができ、入手容易性等の観点より、ことに
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）が好ましい。
導入方法は、チモリアーゼなどで処理してプロトプラ
ストを作製する方法、あるいはアルカリ金属塩などで処
理する方法のような常法によって行うことができる。好
ましい導入方法は塩化リチウムで処理するリチウム法で
ある。
ストを作製する方法、あるいはアルカリ金属塩などで処
理する方法のような常法によって行うことができる。好
ましい導入方法は塩化リチウムで処理するリチウム法で
ある。
ベクターを導入した形質転換酵母の培養は、常法によ
り、例えば、振とう培養法、流加培養法などにより行う
ことができる。用いる培地は通常の酵母培養培地でよ
く、グルコース、シュクロース、フラクトース、ガラク
トースのような炭素源、硫酸アンモニウム、ペプトン、
大豆蛋白加水分解物のような窒素源、その他、ビタミ
ン、アミノ酸、無機塩、微量元素のような栄養成分を適
宜配合したpH3〜８のものが用いられる。通常、20〜35
℃で20〜100時間培養することにより、所望のカビリパ
ーゼが収率よく菌体外に分泌、蓄積される。
り、例えば、振とう培養法、流加培養法などにより行う
ことができる。用いる培地は通常の酵母培養培地でよ
く、グルコース、シュクロース、フラクトース、ガラク
トースのような炭素源、硫酸アンモニウム、ペプトン、
大豆蛋白加水分解物のような窒素源、その他、ビタミ
ン、アミノ酸、無機塩、微量元素のような栄養成分を適
宜配合したpH3〜８のものが用いられる。通常、20〜35
℃で20〜100時間培養することにより、所望のカビリパ
ーゼが収率よく菌体外に分泌、蓄積される。
培養の後、遠心等の常法により培養物から菌体を分離
除去し、上清からUF濃縮や硫安沈澱等の常法によりリパ
ーゼを回収、精製する。
除去し、上清からUF濃縮や硫安沈澱等の常法によりリパ
ーゼを回収、精製する。
かくして、本発明の製造方法は、加水分解、エステル
交換反応等に利用できるカビリパーゼの生産に好適に適
用できる。特に、1,3位特異性（1,3位特異的水解性や1,
3位特異的にエステル交換性）を有するリパーゼの生産
に好適に適用できる。
交換反応等に利用できるカビリパーゼの生産に好適に適
用できる。特に、1,3位特異性（1,3位特異的水解性や1,
3位特異的にエステル交換性）を有するリパーゼの生産
に好適に適用できる。
実施例 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明す
る。
る。
実施例１ リゾプス由来リパーゼ遺伝子の取得 （１）染色体遺伝子ライブラリーの作製 ハイネスらの方法（前出）に従い、リパーゼ生産菌リ
ゾプス・ニベウス IFO4759株から染色体DNAを調製し
た。
ゾプス・ニベウス IFO4759株から染色体DNAを調製し
た。
続いて、この染色体DNA中のいずれの制限酵素の分解
によるDNA断片上にリパーゼ遺伝子が存在しているかを
調べるために、特開昭64−80290号に記載のごとく単離
したリゾプス・ニベウスのリパーゼcDNAをプローブとし
てサザンハイブリダイゼーションを行った。
によるDNA断片上にリパーゼ遺伝子が存在しているかを
調べるために、特開昭64−80290号に記載のごとく単離
したリゾプス・ニベウスのリパーゼcDNAをプローブとし
てサザンハイブリダイゼーションを行った。
その結果、制限酵素Pst1で分解を受けた約4.5kbのDNA
断片上にリパーゼ遺伝子が存在することが判明した。そ
こで、染色体DNAをPst1で切断し、アガロースゲル電気
泳動を行った後、4.0kb〜5.0kbの分解物DNA断片をゲル
から切り出し抽出・回収した。次いで、T4DNAリガーゼ
を用い、該回収したDNA断片をプラスミドベクターpUC18
のPst1部位に連結し、大腸菌JM109株に形質転換し、染
色体遺伝子ライブラリーを得た。
断片上にリパーゼ遺伝子が存在することが判明した。そ
こで、染色体DNAをPst1で切断し、アガロースゲル電気
泳動を行った後、4.0kb〜5.0kbの分解物DNA断片をゲル
から切り出し抽出・回収した。次いで、T4DNAリガーゼ
を用い、該回収したDNA断片をプラスミドベクターpUC18
のPst1部位に連結し、大腸菌JM109株に形質転換し、染
色体遺伝子ライブラリーを得た。
（２）遺伝子ライブラリーのスクリーニング 先に作製した約300個の遺伝子ライブラリーについ
て、（１）と同様に、リパーゼcDNAをプローブとしてコ
ロニーハイブリダイゼーションを行い、プラスミドcGPI
を持つ形質転換菌をポジティブクローンとして選択し
た。該pGPIはリゾプスに由来する4.3kbのPst1切断のDNA
片を有するものであり、その制限酵素切断地図を第１図
に示す。
て、（１）と同様に、リパーゼcDNAをプローブとしてコ
ロニーハイブリダイゼーションを行い、プラスミドcGPI
を持つ形質転換菌をポジティブクローンとして選択し
た。該pGPIはリゾプスに由来する4.3kbのPst1切断のDNA
片を有するものであり、その制限酵素切断地図を第１図
に示す。
このプラスミドは平成２年３月22日に工業技術院微生
物工業技術研究に受託番号FERMP−11367の下で寄託し
た。
物工業技術研究に受託番号FERMP−11367の下で寄託し
た。
（３）染色体リパーゼ遺伝子の構造 リパーゼcDNAをプローブとして行ったサザンハイブリ
ダイゼーションの結果、pGPIのEcoRI3.0kb DNA断片上
にリパーゼ遺伝子が存在していることが判明した。そこ
で、このDNA断片についてサンガーらの方法［サンガ
ー，エフ、サイエンス（Sanger,F.Science），214,1205
（1981）］に従って、その全塩基配列を決定した。その
結果、決定した塩基配列中に、既に明らかにしたリパー
ゼ cDNAの塩基配列（特開昭64−80290号参照）と全く
同一の配列が存在し染色体リパーゼ遺伝子の構造が明ら
かになった。
ダイゼーションの結果、pGPIのEcoRI3.0kb DNA断片上
にリパーゼ遺伝子が存在していることが判明した。そこ
で、このDNA断片についてサンガーらの方法［サンガ
ー，エフ、サイエンス（Sanger,F.Science），214,1205
（1981）］に従って、その全塩基配列を決定した。その
結果、決定した塩基配列中に、既に明らかにしたリパー
ゼ cDNAの塩基配列（特開昭64−80290号参照）と全く
同一の配列が存在し染色体リパーゼ遺伝子の構造が明ら
かになった。
第２図に染色体リパーゼ遺伝子の構造遺伝子とその
５′側、３′側の塩基配列および塩基配列より推定され
るアミノ酸配列を示す。第２図から判るように、染色体
リパーゼ遺伝子はATG（Met）開始コドンから始まりTAA
の終止コドンで終わる、392個のアミノ酸をコードする1
176塩基対のフレームから構成される。
５′側、３′側の塩基配列および塩基配列より推定され
るアミノ酸配列を示す。第２図から判るように、染色体
リパーゼ遺伝子はATG（Met）開始コドンから始まりTAA
の終止コドンで終わる、392個のアミノ酸をコードする1
176塩基対のフレームから構成される。
実施例２ リパーゼ遺伝子の発現 （１）発現プラスミドの構築 リパーゼ遺伝子を酵母内で発現させるために、第３図
に示す工程により、発現プラスミドpMA9124を構築し
た。
に示す工程により、発現プラスミドpMA9124を構築し
た。
まず、pGPIのEcoRI−BamHI3.0kb DNA断片をアガロー
スゲル電気泳動法により抽出して単離し、DNAポリメラ
ーゼＩおよびクレノウ断片を用い、該単離したDNAの両
端末を平滑化した。
スゲル電気泳動法により抽出して単離し、DNAポリメラ
ーゼＩおよびクレノウ断片を用い、該単離したDNAの両
端末を平滑化した。
平滑末端化した3.0kb EcoRI−BamHI DNA断片をベク
ターpUC18のHinc II部位にサブクローニングしてプラス
ミドpGPE3を得た。
ターpUC18のHinc II部位にサブクローニングしてプラス
ミドpGPE3を得た。
pGPE3をBamHIおよびSacIの両制限酵素で切断し、エキ
ソヌクレアーゼIII及びマング・ビーン・ヌクレアーゼ
を用いて、BamHI部位側からリパーゼ遺伝子の５′側プ
ロモーター領域の欠失を行ってプラスミド pGPD24を得
た。
ソヌクレアーゼIII及びマング・ビーン・ヌクレアーゼ
を用いて、BamHI部位側からリパーゼ遺伝子の５′側プ
ロモーター領域の欠失を行ってプラスミド pGPD24を得
た。
該pGPD24をEcoRIおよびSalIの両制限酵素で切断した
後、DNAポリメラーゼＩおよびクレノウ断片によりDNA末
端を平滑化した。T4 DNAリガーゼによりBamHIリンカー
（５′GGGAATTCCC3′）を付加した後、発現ベクターpMA
91のBg1 II部位にクローニングして発現プラスミドpMA9
124を得た。
後、DNAポリメラーゼＩおよびクレノウ断片によりDNA末
端を平滑化した。T4 DNAリガーゼによりBamHIリンカー
（５′GGGAATTCCC3′）を付加した後、発現ベクターpMA
91のBg1 II部位にクローニングして発現プラスミドpMA9
124を得た。
このプラスミドは、平成２年３月22日に工業技術院微
生物工業技術研究所に受託番号FERMP−11368の下で寄託
した。
生物工業技術研究所に受託番号FERMP−11368の下で寄託
した。
なお、前記pMA91はJ.Mellor et al.Gene,24,1（198
3）に報告されている酵母用発現ベクターであり、Bg1 I
I部位の両側にはPGKプロモーターとPGKターミネーター
が保持されている。このpMA91の制限酵素切断地図を第
３図に示す。
3）に報告されている酵母用発現ベクターであり、Bg1 I
I部位の両側にはPGKプロモーターとPGKターミネーター
が保持されている。このpMA91の制限酵素切断地図を第
３図に示す。
前記のごとく構築した発現プラスミドpMA9124を、リ
チウム法［エイチ・イトーら、ジャーナル・オブ・バイ
オテクノロジー（H.Ito et al,J.Bacteriol.），153,16
3（1983）］に従ってサッカロミセス・セレビシエAH22
株に形質転換した。
チウム法［エイチ・イトーら、ジャーナル・オブ・バイ
オテクノロジー（H.Ito et al,J.Bacteriol.），153,16
3（1983）］に従ってサッカロミセス・セレビシエAH22
株に形質転換した。
（２）リパーゼ遺伝子の発現 pMA9124形質転換酵母の単一コロニーを終濃度50μg/m
lになるようにヒスチジンを添加したYNB培地（0.7％デ
ィフコ（Difco）社イースト・ナイトロジェン・ベース
（Yeast Nitrogen Base）、２％グルコース、pH5.6）
に植菌し、30℃で一晩振盪培養した。
lになるようにヒスチジンを添加したYNB培地（0.7％デ
ィフコ（Difco）社イースト・ナイトロジェン・ベース
（Yeast Nitrogen Base）、２％グルコース、pH5.6）
に植菌し、30℃で一晩振盪培養した。
0.25mlの培養液を50mlのYPD培地（１％酵母エキス、
２％ペプトン、２％グルコース）に加え、30℃にて48時
間振盪培養した。
２％ペプトン、２％グルコース）に加え、30℃にて48時
間振盪培養した。
培養終了後、遠心分離により菌体を除去し、培養上清
中のリパーゼ活性をオリーブ油乳化液を基質とした方法
（仲恭寛，薬剤学,45,341（1985）に従って測定した。
中のリパーゼ活性をオリーブ油乳化液を基質とした方法
（仲恭寛，薬剤学,45,341（1985）に従って測定した。
対照として、リパーゼ遺伝子が存在しないサッカロミ
セス・セレビシエAH22株に発現ベクターpMA91を導入し
た形質転換酵母を同様に培養し、培養上清中のリパーゼ
活性を調べた。
セス・セレビシエAH22株に発現ベクターpMA91を導入し
た形質転換酵母を同様に培養し、培養上清中のリパーゼ
活性を調べた。
結果を第１表に示す。
第１表より、対照実験ではリパーゼが全く検出されな
かったが、本発明の方法による場合には、リパーゼが分
泌生産されていることが示される。このように、本発明
の製造方法においては、産生されるリパーゼが培地に分
泌されるので、特開昭64−80290号の製造方法よりも精
製が簡単となり、生産性が向上する。
かったが、本発明の方法による場合には、リパーゼが分
泌生産されていることが示される。このように、本発明
の製造方法においては、産生されるリパーゼが培地に分
泌されるので、特開昭64−80290号の製造方法よりも精
製が簡単となり、生産性が向上する。
発明の効果 本発明により、リゾプス属のリパーゼの工業的に有利
な効率良い製造方法が提供される。
な効率良い製造方法が提供される。
第１図はプラスミドpGP1の制限酵素切断地図であり、第
２図はリゾプス属のリパーゼの塩基配列図であり、第３
図は宿主酵母に導入するベクターとして使用する組み換
え体プラスミドを構築する手順を示したフロー図であ
る。
２図はリゾプス属のリパーゼの塩基配列図であり、第３
図は宿主酵母に導入するベクターとして使用する組み換
え体プラスミドを構築する手順を示したフロー図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:845） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:845）
Claims (2)
- 【請求項１】下記配列表中に示す塩基配列を有するDNA
を組み込んだ組換体DNAを含む酵母を培地に培養し、酵
母の菌体外にリゾプス（Rhizopus）属の1,3位特異性を
有するリパーゼを産生・蓄積させ、該培養物から該リパ
ーゼを採取することを特徴とするリパーゼの製造方法。 - 【請求項２】酵母がサッカロミセス（Saccharomyces）
属である請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2090888A JP2513896B2 (ja) | 1990-04-04 | 1990-04-04 | リパ―ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2090888A JP2513896B2 (ja) | 1990-04-04 | 1990-04-04 | リパ―ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03290186A JPH03290186A (ja) | 1991-12-19 |
| JP2513896B2 true JP2513896B2 (ja) | 1996-07-03 |
Family
ID=14010965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2090888A Expired - Lifetime JP2513896B2 (ja) | 1990-04-04 | 1990-04-04 | リパ―ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2513896B2 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6041487A (ja) * | 1983-04-25 | 1985-03-05 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用 |
| JPS6332489A (ja) * | 1986-04-25 | 1988-02-12 | ラボフイナ・ソシエテ・アノニム | 特異的リパ−ゼをコ−ドするｄｎａセグメント、それを発現するためのベクタ−、これらのベクタ−により形質転換された微生物及びその使用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2540540B2 (ja) * | 1987-04-28 | 1996-10-02 | 不二製油株式会社 | リパ―ゼ遺伝子及び組み換え体ｄｎａ |
| JPS6443193A (en) * | 1987-08-11 | 1989-02-15 | Tanpaku Kogaku Kenkyusho Kk | Production of phospholipase a2 |
-
1990
- 1990-04-04 JP JP2090888A patent/JP2513896B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6041487A (ja) * | 1983-04-25 | 1985-03-05 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用 |
| JPS6332489A (ja) * | 1986-04-25 | 1988-02-12 | ラボフイナ・ソシエテ・アノニム | 特異的リパ−ゼをコ−ドするｄｎａセグメント、それを発現するためのベクタ−、これらのベクタ−により形質転換された微生物及びその使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03290186A (ja) | 1991-12-19 |
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