KR100372514B1 - 효모균주및변형된알부민 - Google Patents

효모균주및변형된알부민 Download PDF

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Abstract

알부민, 예를들면 인체 알부민이 효모에서 발현 및 분비되는데, 상기 효모는 아스파르틸 프로티아제3(Yap3p) 또는 그 동등물이 결여되도록 돌연변이 유발되어, 45kD 알부민 단편의 생성을 감소시키게 된다. Kex2p 기능을 추가로 제거함으로써 더욱 감소시킬 수 있다. 선택적으로 예를들면 R410A, K413Q 및 K414Q인 인체 알부민과 같이, Yap3p 개열을 받기 쉽지 않은 변형된 알부민이 제조된다.

Description

효모균주 및 변형된 알부민
본 발명은 효모종에 의한 재조합 인체 알부민(rHA)의 제조에 관한 것이다.
종전기술의 배경
인체혈청 알부민(HAS)은, 혈청의 삼투압의 상당한 부분에 원인이 되는 585 아미노산의 단백질이며, 내인성 및 외인성 리간드의 캐리어로서의 역할도 한다. 인체혈청 알부민은 심각한 화상, 충격 또는 혈액상실중 환자를 치료하는데 임상적으로 사용되며, 현재는 인체혈액으로 부터의 추출에 의하여 상업적으로 제조된다. 미생물에 있어서의 재조합 인체 알부민(rHA)의 제조는 EP 330 451호 및 EP 361 991호에 개시되어 있다.
최근 효모종은, rHA를 포함한(슬리입(Sleep)등, 1990, 1991; 필리어(Fleer)등, 1991) 이종 단백질의 제조를 위한 숙주 유기체로서 널리 사용되어 왔다(로마노스(Romanos)등에 의해 재검토(1992)). 효모는 용이하게 유전자 조작될 수 있으며, 단순 배지상에서 고밀도 세포로 성장될 수 있으며, 분비 및 세포질 단백질의 제조에 있어서 진핵세포로서 적절하다.
사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)가 rHA의 제조에 사용되는 경우, 주 분비단백질은 성숙 67kDa 알부민이다. 그러나, rHA의 45kDa N-말단 단편도 관측된다(슬리입등, 1990). rHA가 클루이베로미세스종(Kluyveromyces sp.)(플리어등, 1991) 및 피치아 파스토리스종(Pichia pastoris) (EP 510 693호)에서 발현될 경우,유사한 단편이 얻어진다. 단편은 성숙 rHA와 동일한 N-말단 아미노산 서열을 지니나, 카르복시 말단은 이종성이며, 아래에 표시된 바와같이, Phe403및 Val409사이에서 일어나며, 가장 통상적인 말단은 Leu407및 Val409이다.
분비된 총 rHA의 백분율로서, 생성된 단편의 양은 사용된 균주 및 분비리더 서열과 함께 가변적이나, 제로로 감소되지는 않는다(슬리입등, 1990). 본 발명자들은 또한, 고밀도세포 발효(75∼100g/L 세포건조중량)에서 생성된 단편의 양이, 진탕 플라스크 배양에서 보다 약5배 높다는 것을 알았다.
45kDa의 알부민 단편은 혈청-유도 HSA에서는 관찰되지 않으며, 재조합 생성물 중에 그것이 비-자연적 동일물질로서 존재한다는 것은 바람직하지 않다. 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 생성물 중의 45kDa 단편의 양을 감소시키는 것이다. 가장 단순하고 가장 명료한 방법은 기스트-브로케이즈(Gist-brocades)의 EP 524 681호(특히 P4, L17-22 참조)에서 제안한 바로서, 전장 알부민에서 단편을 정제, 제거하는 것이다. 그러나, 본 발명자들은 전혀 다른 접근법, 즉, 먼저 단편의 생성을 피하고자 하는 방법을 선택하였다.
슬리입등(1990)은, rHA 단편은 세포내에서 생성되며, 세포외 단백질분해의 결과는 아니라고 가정하였다. 이들은 Glu382로 부터 Ser419까지 HSA cDNA를 코돈-최적화하였으나, 이것은 rHA 단편의 생성에는 아무런 효과가 없었다. 그들은 rHA 아미노산 서열의 잠재성 Kex2p 프로세싱 부위인 Lys413Lys414가 단편의 이종 카르복시 말단에 아주 근접하여 있으나, kex2 숙주균주(KEX2 유전자에서의 돌연변이를 내재하고 있어서, Kex2 프로티아제를 생성하지 않는 균주)를 사용하거나, Lys414에 대한 코돈의 부위-지향 돌연변이 유발에 의하여 잠재성 개열부위를 제거하여도, 단편의 양이 감소하지 않는다는 것을 알았다.
yscA, yscB, yscY, yscS, 기타 공포성 단백질분해효소, yscD, yscE, yscF(kex2p와 동등), yscα, yscIV, yscG, yseH, yscJ, yscE 및 kex1(S. 세레비지에내에서)을 포함하며, 원칙적으로 소정의 단백질 생성물을 분해시킬 수 있는, 방대한 배열의 효모 프로티아제가 있다.
바우어보나이스(Bourbonnais)등 (1991)은 1염기 부위에 대하여 특이적인 사카로미세스 세레비지에 엔도프로티아제 활성을 기술하였는데, 그 하나의 예(Arg410)가 알부민의 이 영역에 존재한다. 이 활성은 나중에 에겔-미타니(Egel-Mitani)등(1990)에 의하여, 특이성에 있어서 Kex2p에 유사한 엔도프로티아제로 처음 설명된, 효모 아스파르틸 프로티아제 3(Yap3) (바우어보나이스등, 1993)에 기여할 수 있는 것으로 판명되었는데, 여기서 이것은 쌍을 이룬 염기성 잔기에서 개열된다. 좀 더 연구된 결과는, Yap3이 1염기성 부위 및 염기성 잔기쌍의 사이 및 C-말단을 개열시킬 수 있으나, 양 형태의 부위에서의 개열은 서열 내용에 좌우된다는 것을 제시하고 있다(아자아얀(Azaryan)등, 1993, 카우레이(Cawley)등, 1993).
이미 논의한 바와같이, rHA 단편의 C-말단영역은 1염기성(Arg410및 2염기성(Lys413Lys414) 부위를 내포하고 있다. 그러나 Kex2p와 같은 단백질분해 활성이 인체세포내에 존재하고, 아르기닌 잔기의 쌍에 대한 HSA C-말단의 프로(pro) 서열의 개열에 대하여 원인된다하더라도, 위에서 논의한 단편이 인체내에서 생성된다는 것은 알려지지 않았다. 이것은 염기성 잔기 Arg410, Lys413및 Lys414가 이 Kex2p와 같은 프로티아제에 의하여 인식되지 않는다는 것을 가르키며, 여기서 분자의 이 영역은 분비과정에서 프로티아제에 접근할 수 없을수도 있다는 것을 암시한다. 따라서, Yap3p 프로티아제가 45kDa 단편의 생성을 초래하는 것으로 예상될 수 없었다. 또한, 에겔-미타니등(1990 효모(Yeast) 6, 127∼137페이지)은 MFα 프로페로몬(propheromone)을 개열하는데 있어서 Yap3p가 Kex2p와 유사함을 보여주었다. Kex2p 기능만의 제거로는, 생성된 단편의 양을 감소시키지 않기 때문에, Yap3p 기능의 제거가 유리할 것이라고 가정할 하등의 이유가 없다. 사실, 바우어보나이스등(1993)은 yap3 균주가 프로소마토스타틴(prosomatostatin)을 처리하는데 있어서 저하된 능력을 가진다는 것을 나타내어, 이종 단백질의 제조에 있어서 yap3 균주를 사용한다는 것을 알수는 없었다.
발명의 요약
위에서 확인된 문제점에 대한 본 발명에 따른 해결방법은 알부민의 정제중에 단편을 제거하기 보다는, 초기 발효중의 단편의 생성을 회피 또는 최소한 감소시키는 것이다. 현재 본 발명자들은, 지금까지 존재하는 것으로 알려진 20개 이상의 효모 프로티아제중에서, 효모중에서 생성된 rHA의 45kD 단편에 크게 영향을 미치는 것은 사실 Yap3p 프로티아제라는 것을 알게 되었다. 본 발명은, rHA가 효모종으로 부터 분비될 때 생성된 45kDa 단편의 양을 실질적으로 감소시키는 방법을 제공한다. 단편의 양을 감소시키면 정제공정중에 rHA의 회수율을 개선시키며 및 고품질의 최종제품을 제공하게 된다. 또한, 전혀 예상밖으로, 효모의 yap3균주를 사용하는 이점은, 그들이 Yap3p 기능을 지닌 균주보다 30∼50% 이상의 rHA를 생성시킬 수 있다는 것이다. 이와같은 장점이, 단순히 ∼15%로 부터 3∼5% 까지의 rHA 단편의 감소때문이라고 간주될 수는 없다.
본 발명의 하나의 관점은, 알부민을 생성 및 분비하기 위하여 유전자적으로 변형된 효모로 부터의 분비에 의한 알부민 제조방법을 제공하는데, 이 방법은 알부민이 배지로 분비되도록 효모를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는데, 여기서 효모세포가 감소된 효모 아스파르틸 프로티아제3 단백질분해 활성을 지니는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 상기 단백질분해 활성은, 폴리펩티드의 쌍을 이룬 염기성 아미노산 및 1염기성 부위에 대하여 특이적인 엔도프로티아제 활성이다.
적절하게는, 효모는 기능적 YAP3 유전자가 결여된 사카로미세스 세레비지에이다. 그러나, 45kDa 단편 생성의 문제점이 다른 효모종, 예를들면 동등한 프로티아제(즉, Yap3p 단백질분해 활성; 클럭(Clerec)등 (1994), 253페이지)를 지니는 것으로 나타나는 피치아 및 클루이베로미세스에서도 발견되기 때문에, 본 발명은 사카로미세스 세레비지에의 사용에 국한되지 않는다. 본 발명자들은 이것을, Yap3p의상동체를 비-사카로미세스(non-Saccharomyces)종에 위치시키기 위한 하이브리디제이션 분석에 의하여 확인하였다. 일반적으로 번역 생성물의 서열이 Yap3p에 대하여 50% 이상의 동일성을 갖는다면 그 유전자는 상동체로 간주된다. 비-사카로미세스종에 있어서, Yap3p형 프로티아제 및 그 유전자는 상이하게는 명명될 수 있으나, 그렇다고 이것이 당연히 그들의 본질적인 특성을 변경시키는 것은 아니다.
상술한 바와같이, Kex2p 기능만의 제거가 단편의 양에 영향을 미치는 것은 아니나, Yap3p 단백질분해 활성을 실질적으로 제거함은 물론, Kex2p 기능도 실질적으로 제거되면, 단편의 양이 보다 더 감소될 수 있다. Yap3p의 경우와 같이, Kex2p 기능은 사카로미세스에 제한되지 않는데; 겔리센(Gellissen)등(1992)에서, 피치아가 Kex2p 기능을 지니는 것을 나타내고 있는 415∼416페이지를 참조할것. 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 야로위아 리포리티카(Yarowia lipolytica)의 Kex2p 동등 활성을 코드화하는 유전자가 클론화되었다(탱가이-로우규(Tanguy-Rougeau)등, 1988; 엔더린 및 오그리드지악(Enderlin & Ogrydziak, 1994).
프로티아제의 활성을 제거하는 적절한 방법은 프로티아제를 코드화하는 숙주 유전자를 파괴하여, 프로티아제에 대한 유전자의 전부 또는 일부가 상실된 비가역 균주를 생성하는 것이다(로드스테인(Rothstein), 1983). 선택적으로, 상기 활성은, 고전적인 돌연변이유발 공정 또는 특정지점 돌연변이의 도입에 의하여 감소 또는 제거될 수 있다(윈스톤(Winston)등, 1983). 바람직하게는, 효소의 활성은 야생종 레벨의 최대 50%, 좀 더 바람직하게는 25%, 10% 또는 5% 이하, 및 가장 바람직하게는 검출되지 않을 정도로 감소된다. Yap3p 단백질분해 활성의 양은, 45kDa 단편의 생성을 계량하거나 또는 카우레이(Cawley)등(1993)도 사용한, 아자아얀(Azaryan)등 (1993)의125I-Bh-리포단백질 검정법에 의하여 측정될 수 있다. Kex2p 단백질분해 활성은 공지의 검정법, 예를들면 풀러(Fuller)등 1989)에 제시된 바와같은 방법에 의하여 유사하게 측정될 수 있다.
알부민은 인체 알부민 또는 그 변이체, 또는 임의의 기타 동물의 알부민 일 수 있다.
"변이체"에는 삽입체, 결실체 및 보존적이거나 또는 비보존적인 치환체가 포함되는데, 여기서 이와 같은 변형은 알부민의 팽창의, 유용한 리간드-결합성 또는 비-면역원성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 특히 본 발명자들은 인체 알부민의 자연발생 다형성 변이체; Yap3p-개열영역(여기서 n은 403∼419)을 포함하기에 충빈히 긴, EP 322 094호에 개시된 단편들(소위 HSA(1-n), 여기서 n은 369∼419)과 같은, Yap3p에 의하여 개열된 영역을 내포하는 인체 알부민의 단편; 및 WO 90/13653호에 개시된 바와같은 종류의, 기타 단백질과의 알부민의 용융체(또는 그들의 Yap3-개열가능 부분)을 포함한다.
"보존성 치환체"라는 것은 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr와 같은 그룹내의 교환체를 의미한다.
이와같은 변이체는 아래에 기술되는 바와같은 단백질 조작방법 및 부위-지향 돌연변이유발에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 제2관점은, 자연발생 알부민과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 알부민을 제공하는 것인데, 상기 자연발생 알부민은, 효모내에서 발현되는 경우 사카로미세스 세레비지에 효모 아스파르틸 프로티아제3(Yap3p)로 개열되기 쉬우나, 변형된 알부민은 그와 같은 개열이 용이하지 않다는 점을 특징으로 한다.
바람직하게는, 변형된 알부민은 자연발생 알부민 단백질에 존재하는 1염기성 아미노산을 결여하고 있다 적절하게는 상기 1염기성 아미노산은 아르기닌이다. 편리하게는 변형된 알부민은 또한 자연발생 알부민에 존재하는 염기성 아미노산의 쌍, 구체적으로는 임의의 Lys, Lys; Lys, Arg; Arg, Lys; 또는 Arg, Arg쌍을 결여하고 있다. 하나의 특정 구체예에 있어서, 자연발생 알부민은 인체 알부민이며 변형된 단백질은 Arg410및 임의로 하나 또는 모두의 Lys413Lys414라이신을 결여하고 있다. 예를들면, 변형된 알부민은 아미노산 변형 R410A, K413Q, K414Q를 지닌 인체 알부민일 수 있다. 소 혈청 알부민에서의 동등 변형체는 Arg408및/또는 하나 또는 모두의 Arg411Lys412를 대체하는 것을 포함한다. 당 분야의 숙련자는 별다른 어려움없이 기타 알부민에서 1염기성 부위 및 염기성 잔기의 쌍을 확인할 수 있을 것이다.
잔기의 번호는 정상적인 성숙 인체 알부민의 순서에 대응한다. 알부민이, 확인된 위치에 대한 잔기 N-말단의 순 제거 또는 첨가를 지니는 변이체(예를들면 다형성의)이면, 번호는, 2개의 서열이 명백한 동일성을 최대화하도록 정렬되었을때의, 정상 알부민의 번호가 부여된 위치와 정렬된 변이체 알부민의 잔기를 말한다.
본 발명의 세번째 관점은 상기 변형된 알부민을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
DNA는 적절한 효모(변형된 알부민용 DNA나 또는 Yap3p 기능이 결여된 효모)에서 발현되어 알부민을 생성한다. 따라서 알부민을 코드화하는 DNA는, 여기에 개시된 내용의 관점에서 적절히 변형된 공지의 기술에 따라 사용되어, 발현벡터를 구성할 수 있는데, 이 발현벡터는 다음에 알부민의 발현 및 생성을 위한 적절한 효모세포의 형질전환에 사용된다.
알부민을 코드화하는 DNA는 적절한 숙주로의 도입을 위한 다양한 기타 DNA서열에 결합될 수 있다. 컴페니온(companion) DNA는 숙주의 특성, 숙주로의 DNA의 도입양식 및 유전자 부체 유지(episomal maintenance) 또는 형성이 요구되는지 여부에 의존하게 된다.
일반적으로, DNA는 발현을 위한 적절한 정위(orientation) 및 올바른 해독 프레임으로, 플라스미드와 같은 발현벡터로 삽입된다. 다음에 벡터는 표준 기술을 통하여 숙주로 도입되는데, 일반적으로 형질전환된 숙주세포를 선택할 필요가 있게된다.
본 발명의 재조합 DNA에 의하여 형질전환된 숙주세포는 다음에 충분한 시간 및 여기에 개시된 내용의 관점에서 당분야의 숙련자에게 공지된 적절한 조건하에서 배양되어 알부민의 발현 및 선별을 허용하게 되는데, 알부민은 다음에 공지된 바와같이 회수될 수 있다.
유용한 효모 플리스미드 벡터는 pRS403∼406 및 pRS413∼416인데, 일반적으로 스트라타진 클론닝 시스템스(Stratagene Cloning systems, La Jolla, CA 92037,USA)로 부터 구입가능하다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효모집적 플라스미드(YIP, Yeast Integrating Plasmid)이며, 효모선별성마아커 HIS3, TRP1, LEU2 및 URA3을 포함한다. 플라스미드 pRS413∼416은 효모동원체 플라스미드(YCP)이다. 기타 효모발현 플라스미드는 EP-A-258 067, EP-A-286 424 및 EP-A-424 117호에 개시되어 있다.
본 발명의 변형된 알부민을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 코딩서열은, 변형된 알부민을 생성하는데 요구되는 것에 추가의 차이점을 가질 수 있다. 예를들면, 원래의 코돈과 동일한 아미노산에 대하여 코드화하는 상이한 코돈이 치환될 수 있다. 선택적으로, 치환체 코돈은 상이한 아미노산에 대하여 코드화할 수 있는데, 이 상이한 아미노산은 알부민의 활성 또는 면역원성에 영향을 미치지 않으며 또는 그 활성 또는 면역원성을 개선시킴은 물론, Yap3p 프로티아제 활성에 대한 감수성을 저하시킬 수 있다. 예를 들면, 보트스테인(Botstein) 및 숏틀(Shortle) (1985)에 기술된 바와 같이, 치환, 삽입, 결실 및 전위와 같은 단일 또는 다중 돌연변이를 창조하기 위하여, 부위-지향 돌연변이 유발 또는 기타 기술이 채용될 수 있다. 이와같은 변형된 코드화 서열이, 여기에 개시된 내용에 공지된 기술의 응용에 의하여 얻어질 수 있기 때문에, 이와같은 변형된 코드화 서열은 본 발명의 특허청구의 범위에 속한다.
본 발명의 실시에 유용하다고 생각되는 효모종을 예시하면 피치아, 사카로미세스, 클루이베로미세스, 캔디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 한세눌라(Hansenula) (현재 피치아로 재분류됨), 히스토플라스마(Histoplasma), 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 시테로미세스(Citeromyces), 파치솔렌(Pachysolen), 데바로미세스(Debaromyces), 메추니코위아(Metschunikowia), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 루코스포리듐(Leucosporidium), 보트리오아스커스(Botryoascus), 스포리디오볼루스(Sporidiobolus), 엔도미코프시스(Endomycopsis)등이 있다. 바람직한 종은 피치아, 사카로미세스, 클루이베로미세스, 야로위아 및 한세눌라로 구성되어 있는 군으로 부터 선택된 것들이다. 사카로미세스종의 예에는 에스. 세레비지에, 에스. 이탈리커스(S.italicus) 및 에스. 로우시(S. Rouxii)가 있다. 클루이베로미세스종의 예에는 케이. 프라길리스(K. flagilis) 및 케이. 락티스(K. lactis)가 있다. 한세눌라(피치아)종의 예에는 에치. 폴리모르파(H. polymorpha)(현재는 피치아 앙구스타(angusta)), 에치. 아노말라(H. anomala) (현재는 피. 아노말라) 및 피. 파스토리스(P. pastoris)가 있다. 와이. 리폴리티카(Y. lipolytica)는 적절한 야로위아종의 일례이다.
사카로미세스 세레비지에의 형질전환 방법은 일반적으로 EP 251 744, EP 258 067호 및 WO 90/01063호에 개시되어 있는데, 이들 모두가 여기서 참고로 인용된다. 사카로미세스 세레비지에에 대한 적절한 프로모터에는, PGK1 유전자, GAL1 또는 GAL10 유전자, CYC1, PHO5, TRP1, ADH1, ADH2, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 트리오즈 포스페이트 이소머라제, 포스포글루코오즈이소머라제, 글루코키나제, α-접합 인자 페로몬(α-mating factor pheromone), a-접합 인자 페로몬에 대한 유전자와결합된 것들, PRB1 프로모터, GPD1 프로모터, 및 5' 조절영역과 다른 프로모터의 5' 조절영역 또는 상류 활성부위와의 하이브리드를 포함하는 하이브리드 프로모터(예를들면 EP-A-258 067호의 프로모터)가 있다.
시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)에 사용하기에 편리한 조절가능 프로모터는, 마운드렐(Moundrell) (1990)에 의하여 기술된 바와같은, nmt 유전자로 부터의 티아민-억제성 프로모터 및 호프만 및 윈스톤(Hoffman & Winston) (1990)에 의하여 기술된 바와같은, 글루코오스-억제성 fbp1 유전자 프로모터 이다.
외래 유전자의 발현을 위한 피치아의 형질전환 방법은, 예를들면 크레그(Cregg)등 (1993) 및 다양한 필립스(Phillips) 특허(예를들면 US 4 857 467호, 여기서 참고로 인용)에 개시되어 있으며, 피치아 발현 키트는 인비트로겐 비브이(Invitrogen BV, 리이크, 네덜란드) 및 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp. 산디아고 캘리포니아)로 부터 구입가능하다. 적절한 프로모터에는 AOX1 및 AOX2가 포함된다.
상술한 겔리센등(1992)의 문헌 및 글리손(Gleeson)등 (1986)의 J. Gen. Microbiol. 132, 3459∼3465페이지에는 한세눌라 벡터 및 형질전환에 관한 정보가 기재되어 있는데, 적절한 프로모터는 MOX1 및 FMD1이며; 반면에 EP 361 991호, 플리어(Fleer)등 (1991) 및 로온-포울렌스 로오러(Rhone-Poulenc Rorer)로부터의 기타 간행물은 클루이베로미세스종에서의 외래 단백질의 발현방법 및 적절한 프로모터가 PGK1이라는 것을 개시하고 있다.
전사종결 시그널은 바람직하게는, 전사종결 및 폴리아데닐화에 대한 적절한시그널을 포함하고 있는 진핵세포 유전자의 3' 인접서열(flanking sequence)이다. 적절한 3' 인접서열은, 예를들면, 사용된 발현조절 서열에 자연적으로 연결된 유전자의 것들로, 즉 프로모터에 대응할 수 있다. 선택적으로, 그들은 상이할 수 있는데, 이 경우 사카로미세스 세레비지에 ADH1 유전자의 종결시그널이 바람직하다.
알부민은 처음 분비리더(leader) 서열로 발현되는데, 분비리더서열은 선택된 효모에 유효한 임의의 리더일 수 있다. 사카로미세스 세레비지에에 유용한 리더에는 접합인자α 폴리펩티드(MFα-1)로 부터의 리더 및 EP-A-387 319호의 하이브리드 리더를 포함한다. 이와같은 리더(또는 시그널)은, 성숙 알부민이 주위의 배지로 방출되기 전에, 효모에 의하여 개열된다. 효모균주가 yap3은 물론 Kex2p 활성(또는 동등물)을 결여하고 있는 경우, Kex2p에 의하여 알부민으로 개열될 필요가 없는 분비 리더를 선택하는 것이 편리할 수 있다. 그와 같은 리더에는, JP 62-096086호(공고번호 91/036516호)에 개시된 사카로미세스세레비지에 인버타제(SUC2), 산 포스파타제(PHO5), MPa-1, B-글루카나제(BGL2) 및 킬러통신의 프레-서열; S. 디아스타티커스 글누코아밀라제II; S. 칼스베르겐시스α-갈락토시다제(MEL1); K. 락티스 킬러 톡신; 및 칸디다 글루코아밀라제의 리더들이 포함된다.
본 발명의 다양한 비 제한적인 구체예가 하기 실시예 및 첨부된 도면을 참고로 하여 설명된다.
제1도는 돌연변이된 rHA 발현 플라스미드의 구성을 위한 일반적인 설계도인데, 여기서 HA는 인체 알부민 코드화 서열, L은 분비리더를 코드화하는 서열, P는 PRB1 프로모터, T는 ADH1 터미네이터, amp는 암피실린 저항 유전자 및 LEU2 는 로이신(leucine) 선택성 마아커이다.
제2도는 사카로미세스 세레비지에에 의하여 분비된 돌연변이 rHA의 웨스턴 블룻트 분석을 나타내는 도면인데, 여기서 트랙 A는 DBI cir°pAYE316(정상 rHA)으로 부터의 배양상청액을 나타내며, 트랙B는 DB1 cir+pAYE464(변형 1)로 부터의 배양상청액 및 트랙 C는 DB1 cir+pAYE468(변형 3)로 부터의 배양상청액을 나타낸다.
제3도는 pAYE515의 구성을 위한 설계도이다.
제4도는 비-환원성 10% SDS/PAGE에 의하여 분리된 진탕배양으로 부터의 배양상청액의 항-HSA 웨스턴 블롯트의 도면으로 제시된, 야생형 및 프로티아제-파괴 균주에 의한 rHA 단편생성의 비교인데, 여기서 트랙 A는 DB1 cir°pAYE316, 트랙 B는 DXY10 cir°pAYE316(yap3 균주), 및 트랙 C는 ABB50 cir°pAYE316(yap3, Kex2 균주)에 대응한다.
제5도는 제4도와 유사하나, 공급 뱃치 발표로 부터의 배양상청액의 쿠마시 브릴리안트 블루 착색 12.5% SDS 파스트겔(phastgel) (파아마시아(Pharmacia)사 제조)을 나타내는데, 트랙 D는 HSA 표준, 트랙 E는 DB1 cir°pAYE316, 트랙 F는 DB1 △kex2 cir°pAYE522, 및 트랙 G는 DXY10 cir°pAYE522에 대한 것이며; 및
제6도는 pAYE519의 구성을 위한 설계도이다.
별도의 언급이 없는 한 모든 표준 재조합 DNA 방법은 셈브룩(Sambrook)등 (1989)에 기재된 바와같다. HSA를 코드화 하는 DNA 서열은 EP 201 239에 개시된cDNA로 부터 유도된다.
실시예 1: HSA cDNA의 변형
rHA 단편의 생성에 있어서의 엔도프로티아제의 역할을 조사하기 위하여, HSA cDNA (SEQ 1(WO 90/01063호의 인공 분비리더 서열을 코드화하는 서열을 내포하고 있는))는 부위-지향 돌연변이유발에 의하여 변형되었다. HSA 서열(SEQ 2)에 3개의 별도의 변화가 가해졌다. 첫째, 돌연변이 유발 프라이머 FOG1을 사용하여, Arg410코돈만을 변경, 이를 Ala 코돈으로 대체하고, 2염기성 부위 Lys413Lys414를 그대로 두었다. 제2변화는 프라이머 FOG2를 사용하여, 단편의 C-단말 잔기를 내포하고 있는, 잔기 407∼409를 LeuLeuVal로 부터 AlaValAla로 변경하였다. 제3변화는 프라이머 FOG3을 사용하여, 잔기 410∼414를 ArgTyrThrLysLys(SEQ3)로 부터 AlaTyrThGlnGln(SEQ4)로 변경하였다. 올리고뉴클레오티드는 아미노산 변화뿐만 아니라, 변화된 서열의 검출을 용이하게 하기 위하여 돌연변이체의 PvuII나 또는 SpeI 제한부위를 생성시키는 보존성 염기 변화도 코드화하였다.
HSA cDNA를 함유하고 있는, M13mp클론, mp19.7의 단일-사슬 DNA(EP 201 239; 제2도)가, 제조자의 지시에 따라서 시험관내 돌연변이유발 시스템, 버전2(In Vitro Mutagenesis System, Version 2, Amersham International plc)를 사용하는 돌연변이유발 반응용 주형으로서 사용되었다. 돌연변이의 존재를 확인하기 위하여, 개별 플라크(plaque)들이 선별되어 서열결정되었다. 다음에 2중 사슬 RF DNA가 예정대로 변화된 클론으로 제조되고, 돌연변이를 지니고 있는 DNA가 XbaI/SacI 단편(제1도)상에서 절제되었다. 이것은 pAYE309의 대응 야생형 단편을 대체하는데 사용되었다(EP 431 880호; 제2도). 플라스미드내의 돌연변이 XbaI/SacI 단편의 존재는 PvaII 또는 SpeI로 적절히 다이제스트함으로써 점검된다. 이들 HindIII 단편은 절제되고 발현벡터 pAYE219(제1도)로 삽입되어 플라스미드 pAYE464(변형1, R410A), pAYS470(변형2, L407A, L408V, V409A) 및 pAYE468(변형3, R410A, K413Q, K414Q)를 생성하였다. 이들 발현 플라스미드는, ADHI 전사 터미네이터가 뒤따르는 돌연변이 HA 코딩서열과 함께 프레임에 융합된 HSA/MFα1 리더 서열(WO 90/01063호)의 발현을 촉진하는 사카로메세스 세레비지에 PRB1 프로모터(WO 91/02057호)를 포함한다. 플라스미드는 또한 2㎛ 플라스미드 부분을 내포하여 형질전환체의 선별을 위한 LEU2 유전자 및 복제기능을 제공한다.
pAYE464, pAYE470 및 pAYE468이 형질전환에 의하여 사카로미세스 세레비지에 DB1 cir+(a, leu2; 슬리입등, 1990)로 도입되고, 개별 형질전환체는 10ml YEPS(1% w/v 효모추출물, 2% w/v 펩톤, 2% w/v 슈크로오즈)에서 30℃로 3일간 성장된 후, 상청액은 항-HSA 웨스턴 블롯트로 rHA 단편의 존재가 검사되었다. 웨스턴 블롯트 결과는, 야생형 rHA를 발현시키는 대조물에 비하여 그양이 약간 감소되기는 하였으나, 단편이 pAYE464를 지니고 있는 균주에 의하여 여전히 제조되었다는 것을 명백히 나타내고 있다. 플라스미드 pAYE470에서의 돌연변이는 단편의 생성에 아무런 영향을 미치지 않는것으로 나타났다. 그러나, DB1 cir+pAYE468은 단편이 거의 또는 전혀 없는 신규 양상의 HSA-관련 밴드를 나타내었다.
각각의 DB1 cir+pAYE464 및 DB1 cir+pAYE468의 하나의 예가, 발효장치(콜린스((Collins), 1990)내에서 최소배지에서의 공급 뱃치 배양에 의하여 고밀도 세포로 성장되었다. 요약하면, 10L 작업용적의 발효장치에, 50mL/L의 농축염 혼합물(표1), 10mL/L의 미량원소용액(표2), 50mL/L의 비타민 혼합물(표3) 및 20g/L의 슈크로오즈를 함유하고 있는 5L의 초기 뱃치 배지로 채웠다. 100mL/L의 혼합물, 20mL/L의 미량원소용액, 100mL/L의 비타민 용액 및 500g/L의 슈크로오즈를 함유하고 있는 동일용적의 공급 배지가, 계량펌프에 의하여 발효장치에 연결된 별도의 저장조에 채워졌다. pH는 수산화암모늄 또는 황산을 자동적으로 첨가하여 5.7±0.2로 유지되고, 온도는 30℃로 유지되었다. 교반기 속도는 1 v/v/분 공기 유속에서 〉20% 공기포화의 용해된 산소장력을 유지하도록 조절되었다.
표 1. 염 혼합물
표 2. 미량원소 용액
표 3. 비타민 용액
발효장치는 완충 최소배지에서 성장된 100mL의 철야 배양 사카로메세스 세레비지에로 접종되었다(효모질소기재[아미노산 없이, 황산 암모늄 없이, 디프코(Difco)] 1.7g/L, (NH4)2SO45g/L, 시트르산 일수화물 6.09g/L, Na2HPO420.16g/L, 슈크로오즈 20g/L, pH6.5]. 탄소원이 소모될 때 까지 초기 뱃치 발표가 진행되었는데, 이 시점에서 계량펌프가 가동되고, 왕(Wang)등(1979)에 의하여 개발된 것을 기초로한 알고리즘을 이용하여, 공급물의 추가가 컴퓨터 조절되었다(미크로 MFCS시스템, B. Braun, Melsungen, 독일). 컴퓨터 조절 시스템과 함께 질량 분석계를 사용하여 발효로 부터의 배출가스를 감시하고 및 세트성장속도(예를들면 0.1h-1)을 유지하기 위하여 추가공급을 조절하였다. 탄소기재의 생물체량으로의 최대 전환은 호흡율을 1.2 이하로 유지함으로써 달성되고(콜린스, 1990) 및, 이 수단에 의하여 약 100g/L 세포건조중량의 세포밀도가 달성될 수 있다. 배양상청액은, 쿠마시-착색 SDS/PAGE 및 웨스턴 블롯트에 의하여 야생형 rHA의 것과 비교되었다. 이들은, 1염기성 Arg410(pAYE464)의 제거가 단편의 양을 유용한 양만큼 감소시키나, 양방의 잠재성 프로티아제부위(pAYE468)의 제거로 45kDa 단편을 거의 폐지하였다는 것을 가르킨다(제2도).
Arg410의 제거와 결합되지 않는한 잠재성 Kex2p 부위 Lys413(슬리입등, 1990 및 여기에서 지적되지 않는 기타 연구문헌에 의하여 확인됨)의 제거효과의 부재가 복합 병인론을 제시하였다 하여도, 상기 데이타는 rHA 단편의 생성은 내부단백질분해성(endoproteolytic) 공격 때문이라는 것을 암시한다. 돌연변이 rHA를 지닌 단편의 양적감소는, 원칙적으로 분자 겹침의 운동학상에 미치는 변화의 효과때문일 수 있는 것이지, 프로티아제 개열부위의 제거때문이 아니다.
실시예 2: YAP3 유전자의 파괴
효모 아스파르틸 프로티아제3을 코드화하는 YAP3 유전자가, YAP3 코드화 서열의 부분을 효율적으로 제거한 유전자 파괴 방법(로드스테인 1983)에 의하여 돌연변이되어, 활성 Yap3p의 생성을 방지하였다.
YAP3 유전자(에겔-미타니등, 1990)의 5' 및 3' 단부의 PCR 증폭에 적절한 4개의 올리고뉴클레오티드가, 어플라이드 바이오시스템스 380B 올리고뉴클레오티드 합성장치(Applied Biosystems 380B Oligonucleotide Synthesiser)를 사용하여 합성되었다. 본 명세서의 독자를 위하여, 본 발명자들은 SEQ15로서 YAP3 유전자의 서열을 포함시키는데, 그 541∼2250은 코딩서열이다.
PCR 반응이 수행되어 사카로미세스 세르비지에 게놈 DNA (클론테크라보라토리스, 인크(Clontech Laboratiories, Inc.))로 부터 YAP3 유전자의 5' 및 3' 단부가 개별적으로 증폭되었다. 조건은 다음과 같다: 제조업자의 추천에 따라, 페르킨-엘머-세터스 서말 사이클러(Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cyeler) 및 페르킨-엘머-세터스 PCR 키트를 사용하여, 2.5㎍/ml 게놈 DNA, 5㎍/ml의 각 프라이머를, 94℃에서 61초간 변성시키고, 37℃에서 121초간 아닐링하고, 72℃에서 181초간 40사이클 연장(extend)시킨 후 4℃에서 소킹(soaking)을 하였다. 생성물은 겔 전기영동법으로 분석되어 예상크기인 것으로 판명되었다. 5' 단편이 SphI로 다이제스트되고, pUC19HX(HindIII 부위를 결여하고 있는 pUC19)의 SphI 부위로 클론화되어 pAYE511(제3도)를 제공하였는데, 여기서 YAP3이 pUC19HX 폴리링커의 KpnI 부위를 향하여 전사되도록 배향된다. 3' YAP3 단편은 HindIII 및 Asp718(KpnI의 하나의 이소시조머(isoschizomer))로 다이제스트되고 HindIII/ASP718로 다이제스트된 pUC19로 결찰되어 pAYE512를 제공한다. 플라스미드 DNA 서열결정은 요망서열이 클론화 되었는지를 확인하기 위하여 삽입체상에서 수행되었다. 다음에 pAYE512의 HindIII/Asp718 단편은 pAYE511의 해당부위로 서브클론화되어 pAYE513(제3도)를 제공하는데, 여기서 YAP3의 5' 및 3' 영역은, 그들사이에 특이한 HindIII+부위를 지니며 바르게 배향된다. URA3 유전자가 HindIII 단편으로서 YEp24(보트스테인 등, 1970)으로 부터 유리된 후, 이 부위에 삽입되어, YAP3의 5' 및 3' 영역에 인접된 URA3을 지닌 pAYE515(제3도)를 제공하고, YAP3의 반대방향에 전사된다.
균주 DB1 cir°pAYE316(슬리입등, 1991)의 ura3 유도체가 화학적 랜덤 돌연변이유발 및 5-플루오로-오로트산(뵈케(Boeke)등, 1987)에 대한 저항성의 선별에 의하여 제조된다. 균주는 100mL 완충최소배지에서 철야로 성장되고, 세포가 원심분리에 의하여 수집된 후, 살균수로 1회 세척되었다. 다음에 세포는 10mL의 살균수에 재부유되고 2mL의 분취가 별도의 15mL 팰콘(Falcon) 튜우브에 놓였다. 다음에5mg/mL의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 용액이 다음과 같이 튜우브에 첨가되었다; 0μL, 20μL, 40μL, 80μL 또는 160μL. 다음에 세포가 30℃에서 30분간 배양된 후 원심분리되고, 살균수로 3회 세척되었다. 마지막으로, 세포가 1mL YEP(1% w/v 효모추출물, 2% w/v 박토(Bacto)펩톤)에 재부유되어 4℃에서 저장되었다. 돌연변이유발 처리에서 생존한 세포의 백분율은, 2% w/v 슈크로오즈를 함유하는 YEP 플레이트 상에서 샘플의 희석물을 확산하시키고 30℃에서 3일간 배양함으로써 측정되었다. 약 50%의 생존율을 가져온 처리로 부터의 세포는, 2% w/v 슈크로오즈를 함유하는 YEP 플레이트상에서 성장된 후 2% w/v 슈크로오즈를 함유하는 YNB 최소배지상으로 레플리카 플레이팅(replica plating)되고, 5-플루오로-오로트산(1mg/mIL) 및 우라실(50㎍/mL)로 보충되었다. 이 배지상에서 성장가능한 콜로니가 정제되고, 이들이 우라실 보충없이는 성장이 불가능하며 이와같은 결점은 형질전환에 의한 URA3 유전자의 도입에 의하여 정정될 수 있다는 것이 시험으로 입증되었다. 이와같은 하나의 균주, DBU3 cir°pAYE316이, Ura+ 콜로니에 대하여 선별된 pAYE515의 SphI/Asp718 YAP3-URA3-YAP3 단편으로 형질전화되었다. 다수의 형질전환체의 다이제스트된 게놈 DNA의 써던블롯트가, YAP3유전자의 5' 및 3' 단부로 탐침 검사되어 YAP3 유전자의 파괴가 확인되었다. 2개의 형질전환체의 YEPS 진탕-플라스크 상청액의 항-HSA 웨스턴블롯트는, YAP3의 파괴가 rHA 단편량을 현저히 감소시켰음을 나타내었다.
DXY10 cir°pAYE316으로 명명되는, DBU3 cir°pAYE316의 하나의 yap3유도체가 최소배지에서 공급-뱃치 발효에 의하여 수차례 성장되어 고건조중량 세포가 되었다. 쿠마시-착색 PAGE 및 항-HSA 웨스턴블롯트에 의하여 상청액을 검사한 결과 (제4도 및 5도), rHA 45kDa 단편량의 감소가 명백히 나타났으며; 분해 생성물의 측정양은, YAP3 모체로 본 양의 1/3 내지 1/5로 변하였다. 생성된 rHA의 양은 yap3 돌연변이에 의하여 불리한 영향을 받지 않으며, 사실 DXY10 cir°pAYE316은 YAP3 동등물, DB1 cir°pAYE316 보다 30∼50% 많은 rHA를 생성하는 것으로 판명되었다. HA 서열로 부터의 리더서열의 개열이 염기성 잔기쌍에 대한 C-말단이라는 사실에도 불구하고, rHA는 바른 N-말단을 지니는 것으로 판명되었다.
세포를 제거하기 위하여 발효액이 원심분리된 후, 다음과 같이 친화성 크로마토그라픽 정제처리 되었다. 배양 상청액이 시바크론 블루 F3GA 세파로으즈 칼럼(Cibacron Blue FG3A Sepharose column, 파아마시아사 제조) 을 관통한 후, 0.1M 포스페이트 글리신 완충액, pH8.0으로 세척되었다. rHA는 다음에 2M NaCl, 0.1M 포스페이트 글리신, pH8.0으로 칼럼으로 부터 용출되었는데, 이 상태에서의 순도는 〉95%이었다. 이것은 당분야에 공지된 방법에 의하여 더욱 정제될 수 있다.
알부민은, 예를들면 WO 92/04367호, 마우렐(Maurel)등 (1989), 컬링(Curling) (1980) 및 EP 524 681의 것과 같은 별효배지 또는 혈청으로 부터 알부민을 정제하기 위한 임의의 가변적인 공지기술에 의한 배지로 부터 선택적으로 정제될 수 있다.
실시예 3: yap3 균주에서의 KEX2의 유전자의 파괴
Yap3 및 Kex2p 활성 모두가 결여된 균주를 구성하기 위하여, 화학적 랜덤 돌연변이 유발 및 α-아미노 아디페이트에 대한 저항의 선별에 의하여, 효모 균주DXY10 cir°(pAYE316)의 lys2 유도체가 제조되었다(바아네스(Barnes) 및 토르너(Thorner), 1985). 실시예 2에서와 같이 세포가 돌연변이유발된 후 2% w/v 슈크로오즈를 함유하고 있는 YNB 최소배지에 놓여지고, 단독 질소공급원으로서의 2mg/mL의 DL-α-아미노 아디페이트 및 30㎍/mL의 라이신으로 보충되었다. 이 배지위에서 성장 가능한 콜로니가 정제되고, 그들이 라이신 보충없이는 성장 불가능하며, 이 결점은 형질전환에 의한 LYS2 유전자의 도입에 의하여 정정될 수 있다는 것을 시험으로 입증하였다. 이 균주는 다음에, KEX2 코딩서열의 부분을 효율적으로 파괴한 유전자 파괴 공정에 의하여 돌연변이되어, 활성 Kex2p의 생성을 방지하였다. 독자의 편의를 위하여 KEX2p 유전자의 서열이 SEQ14로서 여기에 재생산되는데 그중 13291∼3773은 코딩서열이다.
KEX2 유전자의 5' 및 3' 단부의 PCR 증폭에 적절한 4개의 올리고뉴클레오티드(풀러등, 1989)가 어플라이드 바이오시스템스 380B 올리고뉴클레오티드 합성장치를 사용하여 합성되었다.
사카로미세스 세레비지에 게놈 DNA로 부터 KEX2 유전자의 5' 및 3' 단부를 각각 증폭하기 위하여 PCR 반응이 수행되었다(클론테크 라보라토리스인크.). 조건은 다음과 같다 2.5: 2.5㎍/ml 게놈 DNA, 5㎍/ml의 각 프라이머가, 제조업자의 추천에 따라 페르킨-엘머-세터스 서말 사이클러 및 페르킨-엘마-세터스 PCR 키트를 사용하여, 94℃에서 61초간 변성시키고, 37℃에서 121초간 아닐링시키며 72℃에서 181초간 40회 연장시킨 후, 4℃에서 소킹되었다. 생성물은 전기 영동법에 의하여 분석되어 예상크기인 것으로 판명되었다(5' 생성물 0.9kb, 3' 생성물 0.62kb). 5'생성물은 BamHI 및 HindIII로 다이제스트 되고, 3' 생성물은 HindIII 및 SalI로 다이제스트된 후 2개의 단편이 함께, BamHI 및 SalI로 다이제스트된 pUC19HX로 클론화 되었다. 사카로미세스 세레비지에 LYS2 유전자를 포함하는 4.8kb HindIII 단편(바아네스 및 토너(Barnes & Thorner, 1985)은 다음에 HindIII에서(즉 2개의 KEX2 단편사이) 얻어진 플라스미드로 삽입되어 pAYE519(제6도)를 형성하였다.
DXY10 cir°(pAYE316)의 lys2유도체, lys2-16이, Lys+ 콜로니에 대하여 선별하는 pAYE519의 6.0kb KEX2-LYS2-KEX2 단편으로 형질전환되고, 다수의 형질전환체의 다이제스트된 게놈 DNA의 써던블롯트가, KEX2 유전자의 5' 및 3' 단부로 탐침검사되어 KEX2 유전자의 파괴가 확인되었다. 이들 형질전환체의 YEPS 진탕 플라스크 배양상청액의 항-HSA 웨스텐 블롯트는, 하기 실시예 4번에서의 KEX2만의 파괴효과의 결여에도 불구하고, yap3 균주에서의 KEX2의 파괴가 rHA 단편의 양을 여전히 더욱 감소시켰음을 나타내었다. 이와같은 하나의 균주, ABB50에 의하여 생성된 rHA의 분석결과는 리더서열이 부정확하게 공정처리되어 비정상 N-말단으로 선도하는 것을 나타내었다.
균주 ABB50(pAYE316)는 그 플라스미드(슬리입등, 1991)가 교정되었으며, 유사한 플라스미드 pAYE522로 형질전환 되었는데, 여기서 하이브리드 리더서열은, 사카로미세스 세레비지에 인버타아제(SUC2) 리더서열로 대체되었는데, 코드화리더 및 HSA 서열과의 접합부는 다음과 같다:
이 구성에 있어서, HSA로 부터의 리더서열의 개열은 Kex2 프로티아제의 활성에 의존하지 않는다. 균주 ABB50(pAYS522)는, 마찬가지로 매우 낮은 양의 rHA 단편을 지닌 rHA를 생성하는 것으로 판명되었으나, 이 예에 있어서 N-말단은 혈청-유도 HSA의 것에 해당하였는데, 즉 효율적이며 정밀하게 리더서열이 제거된 것이다.
실시예 4: KEX2 유전자만의 파괴(비교 실시예)
실시예 3에 개시된 바와 유사한 방법으로, KEX2 유전자가 사카로미세스 세레비지에에서 파괴되었다. 이 균주는 Yap3 단백질분해 활성을 지니며, 따라서 본 발명의 범위에 속하지 않는다. 이 균주가 공급 뱃치 발효중에서 성장될때, 생성된 rHA는 완전한 KEX2 유전자를 지닌 균주에 의하여 생성된 것과 유사한 양의 단편을 함유하였다. 또한, 총 rHA 양은 감소되었으며, 리더서열은 바르게 공정처리되지 않아서, 비정상 N-말단으로 선도하였다.
실시예 5: 피치아에서 동등 프로티아제의 확인
위에서 알 수 있는 바와같이, 비-사카로미세스 효모가 불필요한 rHA 단편을 마찬가지로 생성하므로 Yap3p 단백질분해 활성을 갖는다. 본 발명자들은, 프로브로서 사카로미세스 세레비지에를 사용하여, 피치아 안구스타(Pichia angusta) DNA의 써던 하이브리디제이션을 수행함으로써 이것을 확인하였다. 특정 DNA 단편이 확인되었는데, 피치아 안구스타에 Yap3p 단백질분해 활성뿐만 아니라 YAP3 유전자의 특정 상동체도 존재하는것을 나타내었다.
YAP3 상동체의 검출용으로 사용된 써던 하이브리디제이션 방법은, 표준방법(삼부르욱등, 1989)을 사용하는 피치아 DNA의 게놈 DNA 라이브러리로부터 유전자 서열을 클론화하는데 적용될 수 있다. 피치아종에서의 YAP 상동체의 파괴는, 사카로미세스에 대하여 위에서 사용된 것과 유사한 기술을 사용하여 달성될 수 있다(크레그 및 마덴, 1987).

Claims (17)

  1. 알부민을 배지로 분비하도록 배양 배지에서 효모를 배양하는 단계를 포함하는, 알부민을 생성 및 분비하도록 유전자적으로 변형된 효모로부터의 분비에 의하여 알부민을 제조하는 방법에 있어서, 효모세포가 야생형에 비해 50% 이하의 효모 아스파르틸 프로티아제 3 단백질분해 활성을 지니는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질분해 활성이 폴리펩티드의 쌍을 이룬 염기성 아미노산 및 1염기성 부위에 대하여 특이적인 엔도프로티아제 활성인 방법.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 효모가 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 효모가 기능적 YAP3 유전자 또는 YAP3P에 대하여 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 전사 생성물을 생성하는 YAP3 유전자 상동체를 결여하고 있는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 효모세포가 또한 야생형에 비해 50% 이하의 사카로미세스 세레비지에 Kex2p 단백질분해 활성을 갖고 있는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 알부민이 인체 알부민인 방법.
  7. 알부민을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 효모로부터 분비되는 제1 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된 알부민을 유발시키는 분비 시그널을 코드화하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 효모세포의 배양균에 있어서, 효모세포가 야생형에 비해 50% 이하의 효모 아스파르틸 프로티아제 3 단백질분해 활성을 지니는 것을 특징으로 하는 효모세포의 배양균.
  8. 제7항에 있어서, 알부민이 인체 알부민인 배양균.
  9. 제7항 또는 8항에 있어서, 효모가 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)인 배양균.
  10. 제9항에 있어서, 효모로부터 알부민을 방출하기 전에 상기 시그널이 효모에 의하여 개열되는 배양균.
  11. 제10항에 있어서, 효모세포가 또한 야생형에 대해 50% 이하의 Kex2p 단백질분해 활성을 지니는 배양균.
  12. 제11항에 있어서, 상기 분비 시그널이 Kex2p 이외의 프로티아제에 의하여 알부민으로부터 개열되는 배양균.
  13. 효모에서 발현 및 분비될 때 효모 아스파르틸 프로티아제 3(Yap3p)로 개열되기 쉬운 자연발생 알부민에 대하여 90% 이상의 동일성을 지니는 변형된 알부민에 있어서, 변형된 알부민이 인체 알부민의 Arg 410에 대응하는 위치의 1 염기성 아미노산을 결여하고 있으며, 상기와 같은 개열이 일어나기 쉽지 않는 것을 특징으로 하는 변형된 알부민.
  14. 제13항에 있어서, 변형된 알부민이 또한, 인체 알부민의 Lys413Lys414, Lys413Arg414, Arg413Lys414또는 Arg413Arg414에 대응하고 자연발생 알부민에 존재하는 한쌍의 염기성 아미노산을 결여하고 있는 변형된 알부민.
  15. 제13항 또는 14항에 있어서, 아미노산 변형 R410a, K413Q, K414Q를 갖는 인체 알부민인 변형된 알부민.
  16. 제13항 또는 14항의 변형된 알부민을 코드화하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제16항에 따른 폴리뉴클레오티드, 변형된 알부민이 효모에서 발현되도록 하는 전사 시그널 및 변형된 알부민이 효모로부터 분비되도록 상기 폴리뉴클레오티드에 인접한 또 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 효모.
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