JP3795073B2 - 酵母株および修飾アルブミン - Google Patents
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Description
本発明は酵母種による組換えヒトアルブミン(rHA)の産生に関する。
背景および先行技術
ヒト血清アルブミン(HSA)は血清の浸透圧のかなりの割合に関与する585アミノ酸のタンパク質であって、内在および外来リガンドのキャリアとしても機能する。それは臨床的に重度熱傷、ショックまたは血液喪失の患者の治療に用いられ、現在ヒト血液からの抽出により商業上産生されている。微生物での組換えヒトアルブミン(rHA)の産生は、EP 330 451およびEP 361 991に開示されている。
近年、酵母種はrHA(Sleep et al,1990,1991;Fleer et al,1991)を含めた異種タンパク質(Romanos et al,1992で総説されている)の産生用の宿主生物として広く用いられている。酵母は容易に遺伝子操作しやすく、単純培地で高細胞密度まで増殖させることができ、しかも真核細胞として分泌および細胞質ゾルタンパク質の産生に適している。
S.cerevisiaeがrHAを産生するために使用される場合、主要分泌タンパク質は成熟67kDaアルブミンである。しかしながら、rHAの45kDa N末端断片も観察される(Sleep et al,1990)。類似断片はrHAがKluyveromyces sp.(Sleep et al,1990)およびPichia pastoris(EP 510 693)で発現されるときに得られる。その断片は成熟rHAと同様のN末端アミノ酸配列を有するが、カルボキシ末端は異なり、下記のようにPhe403とVal409との間にあり、最も共通した末端はLeu407およびVal409である(Geisow et al,1991)。
産生される断片の量は、分泌される全rHAのパーセンテージとして、利用される株および分泌リーダー配列の双方に応じて変わるが、ゼロまで減少されない(Sleep et al,1990)。我々は、高細胞密度発酵(75〜100g/l細胞乾燥重量)で産生される断片の量が振盪フラスコ培養の場合より約5倍高いことも発見した。
45kDaアルブミン断片は血清由来ヒト血清アルブミン(HSA)で観察されず、組換え産物中では非天然同一物質としてその存在は望ましくない。本発明で扱われる問題は、産物中における45kDa断片の量を減少させることである。最も簡単で明らかなアプローチでは、EP 524 681(特に、第4頁17〜22行目参照)でGist-brocadesにより提案されたように、全鎖長アルブミンからそれを精製しなければならなかった。しかしながら、我々は異なるアプローチ、即ち初めてその産生を回避する試みを選択した。
Sleep et al(1990)では、rHA断片が細胞内で産生されて、細胞外タンパク質分解の結果ではないと仮定していた。これらの著者はGlu382からSer419でHSA cDNAをコドン最適化したが、これはrHA断片の産生に効果を有しなかった。彼らは、rHAアミノ酸配列に存在しうるKex2pプロセッシング部位Lys413Lys414が断片の異種カルボキシ末端に極めて近接しているが、kex2宿主株(即ち、Kex2pプロテアーゼを産生しないような変異をKEX2遺伝子に有した株)の使用だけでなく、Lys414に関するコドンの部位特異的変異誘発による起こりうる開裂部位の除去でもその断片の量を減少させないと述べた。
(S.cerevisiaeで)yscA、yscB、yscY、yscS、他の液胞プロテイナーゼ、yscD、yscE、yscF(kex2pに相当)、yscα、yscIV、yscG、yscH、yscJ、yscEおよびkex1を含めて、望ましいタンパク質産物を原則として分解できる酵母プロテアーゼは多数ある。
Bourbonnais et al(1991)は一塩基性部位に特異的なS.cerevisiaeエンドプロテアーゼ活性について記載しており、その例(Arg410)はアルブミンのこの領域に存在する。この活性は酵母アスパルチルプロテアーゼ3(Yap3)によることが後でわかり(Bourbonnais et al,1993)、その酵素はそれが対合塩基性残基の箇所で開裂するという特異性の点でKex2pと類似したエンドプロテアーゼとしてEgel-Mitani et al(1990)により初めて記載された。更に研究では、Yap3pが一塩基性部位と、塩基性残基対間およびそのC末端側を開裂できて、双方のタイプの部位における開裂が配列関係に依存していることを示唆した(Azaryan et al,1993;Cawley et al,1993)。
既に開示されたように、rHA断片のC末端の領域は一塩基性(Arg410)および二塩基性部位(Lys413Lys414)の双方を含んでいる。しかしながら、Kex2p様タンパク質分解活性がヒト細胞に存在して、一対のアルギニン残基のC末端側にあるHSAのプロ配列の開裂に関与するとしても、上記断片はヒトで産生されないことが知られている。これは塩基性残基Arg410、Lys413およびLys414がこのKex2p様プロテアーゼにより認識されないことを示し、ひいては分子のこの領域が分泌経路でプロテアーゼに接近できないことを示唆している。このため、Yap3pプロテアーゼは45kDa断片の産生に関与していることが予想できなかった。加えて、Egel-Mitani et al(1990,Yeast,6,127-137)はMFαプロフェロモンを開裂する上でYap3pがKex2pと類似していることを示した。Kex2p機能の除去だけでは産生される断片の量を減少させないが、Yap3p機能の除去が有益であるとは考えられたなかった。実際に、Bourbonnais et al(1993)では、yap3株がプロソマトスタチンをプロセッシングする上で減少した能力を有することを示し、したがって異種タンパク質の産生でyap3株を用いることから離れるように勧めた。
発明の概要
上記問題の解決法は、本発明によれば、アルブミンの精製中に断片を除去するよりむしろ、初期発酵で断片の産生を避けるかまたは少くとも減少させることである。我々は、これまで存在することが知られた20種以上の酵母プロテアーゼの中から、酵母で産生されるrHAの45kD断片に主に関与しているのが事実上Yap3pプロテアーゼであることを発見した。本発明は、rHAが酵母種から分泌されるときに、産生される45kDa断片の量を実質上減少させるための方法を提供する。断片量の減少は精製プロセスでrHAの回収率を改善し、しかも最終産物の品質を高くする。酵母のyap3株を用いた更にかつ完全に予想外な効果は、それらがYap3p機能を有する株よりも30〜50%多くrHAを産生できることである。この効果は〜15%から3-5%へのrHA断片の減少によるだけでは説明できない。
このように、本発明の一面では、アルブミンが培地中に分泌されるように培地で酵母を培養することを含む、アルブミンを産生および分泌するように遺伝子修飾された酵母からの分泌によりアルブミンを製造するための方法を提供し、この方法は酵母細胞が減少したレベルの酵母アスパルチルプロテアーゼ3タンパク質分解活性を有することを特徴とする。
好ましくは、上記タンパク質分解活性は、ポリペプチドにおける一塩基性部位におよび対合塩基性アミノ酸に特異的なエンドプロテアーゼ活性である。
適切には、酵母は機能性YAP3遺伝子を欠いたS.cerevisiaeである。しかしながら、本発明は、S.cerevisiaeの使用に限定されず、その理由は45kDa断片産生の問題が他の酵母属、例えばPichiaおよびKluyveromycesでもみられ、それらが等価なプロテアーゼ(即ち、Yap3pタンパク質分解活性)を有することを示しているからである;Clerc et al(1994),page 253参照。我々は、非Saccharomyces属でYap3pのホモローグを位置決めするハイブリッド形成分析でこのことを確認した。遺伝子は、一般的に翻訳産物の配列がYap3pと50%以上の配列同一性を有するならば、ホモローグとみなされる。非Saccharomyces属において、Yap3p様プロテアーゼとその遺伝子は別々に命名してもよいが、勿論これでそれらの本質が変わるわけではない。
断片のレベルは、前記のようにKex2p機能の除去だけでは断片のレベルに影響を与えないが、Kex2p機能を実質上除去するだけでなくYap3pタンパク質分解活性も実質的に除去されるならば、更に一層減少させることができる。Yap3pの場合のように、Kex2p機能もSaccharomycesに限定されない;Gellissen et al(1992)参照、特に415〜416頁ではPichiaがKex2p機能を有することを示している。Kluyveromyces lactisおよびYarrowia lipolyticaでKex2p等価活性をコードする遺伝子がクローニングされた(Tanguy-Rougeau et al,1988;Enderlin & Ogrydziak,1994)。
プロテアーゼの活性を除去する適切な手段は、プロテアーゼをコードする宿主遺伝子を壊して、それによりプロテアーゼに関する遺伝子の全部または一部を欠いた非復帰株を作ることである(Rothstein,1983)。一方、活性は古典的変異誘発操作によるか、または移転(transplacement)のプロセスで特異的点変異の導入により減少または除去させることができる(Winston et al.1983)。好ましくは、酵素の活性は野生型レベルの多くて50%、更に好ましくは25%、10%または5%以下まで減少させ、最も好ましくは検出されない。Yap3pタンパク質分解活性のレベルは、45kDa断片の産生を調べるか、またはCawley et al(1993)でも用いられたAzaryan et al(1993)の125I-βh-リポタンパク質アッセイにより測定される。Kex2pタンパク質分解活性も同様に、例えばFuller et al(1989)で示されたような、公知アッセイにより測定される。
アルブミンはヒトアルブミンまたはその変種でも、いずれか他の動物からのアルブミンであってもよい。
“変種”として、我々は保存的または非保存的な挿入、欠失および置換を含み、このような変化はアルブミンの腫瘍的な(oncotic)、有用なリガンド結合または非免疫原性を実質上変えない。特に、我々はヒトアルブミンの天然多型性変種;Yap3pにより開裂される領域を含んだヒトアルブミンの断片、例えばYap3p開裂領域(即ち、nは403-419である)を含む十分長いEP 322 094に開示された断片(即ちHSA(1-n)、nは369-419である);アルブミン(またはそのYap3p開裂しうる部分)と他のタンパク質との融合体、例えばWO 90/13653に開示された種類を含めている。
“保存的置換”とは、Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;およびPhe、Tyrのようなグループ内での交換を意味する。
このような変種は、下記のようなタンパク質工学および部位特異的変異誘発の方法を用いて作ってもよい。
本発明の第二面では天然アルブミンと少くとも90%の配列同一性を有する修飾アルブミンを提供するが、該天然アルブミンは酵母で発現されたときにS.cerevisiae酵母アスパルチルプロテアーゼ3(Yap3p)による開裂をうけやすく、その修飾アルブミンはこのような開裂を受けにくいことを特徴する。
好ましくは、修飾アルブミンは天然アルブミンタンパク質に存在する一塩基性アミノ酸を欠く。適切には、上記一塩基性アミノ酸はアルギニンである。好ましくは、修飾アルブミンは天然アルブミンに存在する一対の塩基性アミノ酸、特にLys、Lys;Lys、Arg;Arg、Lys;またはArg、Argのいずれかを更に欠いている。このため、1つの具体的態様において、天然アルブミンはヒトアルブミンであり、修飾タンパク質はArg410と場合によりLys413Lys414リジンの一方または双方を欠いている。例えば、修飾アルブミンはアミノ酸置換(change)R410A、K413Q、K414Qを有するヒトアルブミンである。牛血清アルブミンにおける等価修飾は、Arg408および/またはArg411Lyss412の一方または双方を置換する。当業者であれば、他のアルブミンで一塩基性部位と塩基性残基の対を容易に特定することができる。
残基の番号付けは正常成熟ヒトアルブミンの配列に相当する。アルブミンが特定された位置のN末端側で残基の正味欠失または付加を有した変種(例えば多型体)であるならば、番号付けは2つの配列が見掛け相同性を最大にするように並べられたときに正常アルブミンの番号位置と整合させた変種アルブミンの残基に関する。
本発明の第三面では、このような修飾アルブミンをコードしたポリヌクレオチドを提供する。
DNAはアルブミンを産生するために適切な酵母(そのDNAが修飾アルブミンに関するものか、またはYap3p機能を欠いた酵母)で発現される。このため、アルブミンをコードするDNAは公知技術に従い用いられ、発現ベクターを構築するためにここに含まれた開示から適切に修飾され、その後アルブミンの発現および産生のため適切な酵母細胞を形質転換させるために用いられる。
アルブミンをコードするDNAは、適切な宿主中に導入のため様々な他のDNA配列に結合させてもよい。他のDNAは宿主の性質、宿主中へのDNAの導入方式と、エピソーム保持または組込みが望まれるかどうかに依存する。
通常、DNAは発現のため適正な向きおよび正しい読み枠でプラスミドのような発現ベクター中に挿入される。対いでベクターは標準技術で宿主中に導入されるが、通常形質転換される宿主細胞と合うように選択することが必要である。
次いで、本発明の組換えDNAで形質転換された宿主細胞は、アルブミンを発現および分泌させるために、ここで開示された教示から当業者に知られる適切な条件下で十分な時間にわたり培養され、次いで公知のように回収することができる。
有用な酵母プラスミドベクターはpRS403-406およびpRS413-416であり、通常Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA 92037,USAから入手できる。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406はYeast Integratingプラスミド(YIp)であり、酵母選択マーカーHIS3、TRP1、LEU2およびURA3を組込む。プラスミドpRS413-416はYeast Centromereプラスミド(YCp)である。他の酵母発現プラスミドはEP-A-258 067、EP-A-286 424およびEP-A-424 117に開示されている。
本発明の修飾アルブミンをコードするポリヌクレオチドコード配列は、修飾アルブミンを産生する上で必要な追加の相違を加えてもよい。例えば、原コドンと同様のアミノ酸をコードする異なるコドンに代えることができる。一方、置換コドンはアルブミンの活性または免疫原性に影響を与えないか、あるいはその活性または免疫原性を改善し、しかもYap3pプロテアーゼ活性に対するその感受性を減少させる、異なるアミノ酸をコードしていてもよい。例えば、部位特異的変異誘発または他の技術もBotstein and Shortle(1985)に記載されたように、置換、挿入、欠失および転位のような単一または複数変異を作るために用いることができる。このような修飾コード配列はここに含まれる教示への公知技術の適用により得られるため、このような修飾コード配列は本発明の範囲内に属する。
本発明の実施に有用と考えられる例示酵母属はPichia、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torulopsis、Hansenula(現在Pichiaに再分類されている)、Histoplasma、Schizosaccharomyces、Citeromyces、Pachysolen、Debaromyces、Metschunikowia、Rhodosporidium、Leucosporidium、Botryoascus、Sporidiobolus、Endomycopsisなどである。好ましい属はPichia、Saccharomyces、Kluyveromyces、YarrowiaおよびHansenulaからなる群より選択されるものである。Saccharomyces sp.の例はS.cerevisiae、S.italicusおよびS.rouxiiである。Kluyveromyces sp.の例はK.fragilisおよびK.lactisである。Hansenula(Pichia)sp.の例はH.polymorpha(現在Pichia angusta)、H.anomala(現在P.anomala)およびP.pastorisである。Y.lipolyticaが適切なYarrowia種の例である。
S.cerevisiaeの形質転換方法はEP 251 744、EP 258 067およびWO 90/01063で概説されており、それらすべてが引用することにより本明細書の開示の一部とされる。S.cerevisiaeに適したプロモーターには、PGK1遺伝子、GAL1またはGAL10遺伝子、CYC1、PHO5、TRP1、ADH1、ADH2、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α-接合因子フェロモン、α-接合因子フェロモンに関する遺伝子に伴うプロモーター、PRB1プロモーター、GPD1プロモーター、および5′調節領域の一部と他のプロモーターの5′調節領域の一部または上流活性化部位とのハイブリッドからなるハイブリッドプロモーター(例えば、EP-A-258 067のプロモーター)がある。
Schizosaccharomyces pombeで使用上便利な調節プロモーターは、Maundrell(1990)で記載されたようなnmt遺伝子からのチアミン抑制プロモーターと、Hoffman & Winston(1990)で記載されたようなグルコース抑制fbp1遺伝子プロモーターである。
外来遺伝子の発現のためにPichiaを形質転換させる方法は例えばCregg et al(1993)および様々なPhillips特許(例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされるUS 4 857 467)で開示され、Pichia発現キットはInvitrogen BV,Leek,NetherlandsおよびInvitrogen Corp.San Diego,Californiaから市販されている。適切なプロモーターにはAOX1およびAOX2がある。
上記Gellissen et al(1992)論文とGleeson et al(1986)J.Gen.Microbiol.,132,3459-3465にはHansenulaベクターの情報と形質転換を含んでいて、適切なプロモーターはMOX1およびFMD1であり、一方EP 361 919、Fleer et al(1991)とRhone-Poulenc Rorerの他の公開文献ではKluyveromyces spp.で外来タンパク質を発現させる方法について開示していて、適切なプロモーターはPGK1である。
転写終結シグナルは、好ましくは、転写終結およびポリアデニル化に適したシグナルを含む真核細胞遺伝子の3′フランキング配列である。適切な3′フランキング配列は、例えば用いられる発現コントロール配列と天然で結合される遺伝子の配列、即ちプロモーターに相当する。一方、それらは異なっていてもよく、その場合にはS.cerevisiae ADH1遺伝子の終結シグナルが好ましい。
アルブミンは最初に分泌リーダー配列で発現されるが、それは選択された酵母で有効ないかなるリーダーであつてもよい。S.cerevisiaeで有用なリーダーには接合因子αポリペプチド(MFα-1)からのものと、EP-A-387 319のハイブリッドリーダーがある。このようなリーダー(またはシグナル)は、成熟アルブミンが周囲培地中に放出される前に酵母で開裂される。酵母株がKex2p活性(または相当物)を欠いている場合とyap3である場合には、Kex2pによりアルブミンから開裂される必要のない分泌リーダーを選択することが有利である。このようなリーダーには特開昭62-096086(91/036516として特許)に開示されたS.cerevisiaeインベルターゼ(SUC2)、酸ホスファターゼ(PHO5)、MFα-1のプレ配列、β-グルカナーゼ(BGL2)およびキラー毒素;S.diastaticusグルコアミラーゼII;S.carlsbergensis α-ガラクトシダーゼ(MEL1);K.lactisキラー毒素;Candidaグルコアミラーゼのものがある。
本発明の様々な非制限態様は例により、しかも添付図面を参考にして記載される:
図1は変異rHA発現プラスミドの構築に関する全体スキームであり、HAはヒトアルブミンコード配列、Lは分泌リーダーをコードする配列、PはPRB1プロモーター、TはADH1ターミネーター、ampはアンピシリン耐性遺伝子、およびLEU2はロイシン選択マーカーである。
図2はS.cerevisiaeにより分泌される変異rHAのWesternブロット分析を表した図であり、トラックAはDB1 cir°pAYE316(正常rHA)からの培養上澄を表し、トラックBはDB1 cir+pAYE464(改変1)からの培養上澄を表し、トラックCはDB1 cir+pAYE468(改変3)からの培養上澄を表す。
図3はpAYE515の構築スキームである。
図4は非還元10%SDS/PAGEにより分離された振盪フラスコ培養物からの培養上澄の抗HSAWesternブロットの図として表された野生型およびプロテアーゼ破壊株によるrHA断片産生の比較であり、トラックAはDB1 cir°pAYE316に相当し、トラックBはDXY10 cir°pAYE316(yap3株)に相当し、トラックCはABB50 cir°pAYE316)yap3、kex2株)に相当する。
図5は図4と同様であるが、フィードバッチ発酵からの培養上澄のCoomassie Brilliant Blue染色12.5%SDS Phastgel(Pharmacia)について示し、即ちトラックDはHSA標準、トラックEはDB1 cir°pAYE316、トラックFはDB1 Δkex2 cir°pAYE522、およびトラックGはDXY10 cir°pAYE522に関する。
図6はpAYE519の構築スキームである。
発明の具体的な説明
すべての標準組換えDNA操作は、他で指摘されないかぎりSambrook et al(1989)に記載された通りである。HSAをコードするDNA配列は、EP 201 239に開示されたcDNAに由来している。
例1:HSA cDNAの修飾
rHA断片の作製でエンドプロテアーゼの役割を調べるために、HSA cDNA〔SEQ1(WO 90/01063の人工分泌リーダー配列をコードする配列を含んでいる)〕を部位特異的変異誘発により修飾した。3つの別々な変化をHSA配列(SEQ2)に加えた。変異原性プライマーFOG1を用いた第一の場合ではArg410コドンだけを変化させ、それをAlaコドンに代えて、二塩基性部位Lys413Lys414をそのままに残した。プライマーFOG2を用いた第二の変化では、LeuLeuValからAlaValAlaに、断片のC末端残基を含めた残基407-409を変化させた。プライマーFOG3を用いた第三の変化では、ArgTyrThrLysLys(SEQ3)からAlaTyrThrGlnGln(SEQ4)に、残基410-414を変化させた。そのオリゴヌクレオチドはそうしたアミノ酸変化だけでなく、変化した配列の検出を容易にするために変異体でPvuIIまたはSpeI制限部位を作る保存的塩基変化についてもコードしていた。
HSA cDNAを含んだM13mp19クローン、mp19.7(EP 201 239;図2)の一本鎖DNAを、製造業者の指図に従いIn Vitro Mutagenesis System,Version 2(Amersham International plc)を用いて変異誘発反応用の鋳型として用いた。個々のプラークを選択および配列決定して、変異の存在について確認した。次いで二本鎖RF DNAを予想された変化のあるクローンから作り、変異のあるDNAをXbaI/SacI断片で切り出した(図1)。これはpAYE309(EP 431 880;図2)の対応野生型断片を置換するために用いた。プラスミド内における変異XbaI/SacI断片の存在は、適宜にPvuIIまたはSpeIで切断することによりチェックした。これらのHindIII断片を切り出し、発現ベクターpAYE219(図1)中に挿入して、プラスミドpAYE64(改変1、R410A)、pAYE470(改変2、L407A、L408VおよびV409A)およびpAYE468(改変3、R410A、K413Q、K414Q)を作製した。これらの発現プラスミドは、後にADH1転写ターミネーターを続けた変異HAコード配列と枠内で融合されたHSA/MFα1リーダー配列(WO 90/01063)の発現を行うS.cerevisiae PRB1プロモーター(WO 91/02057)を含んでいる。プラスミドは、複製機能を示す2μmプラスミドの部分と、形質転換株選択用のLEU2遺伝子も含んでいる。
pAYE464、pAYE470およびpAYE468を形質転換によりS.cerevisiae DB1 cir+(a、leu2;Sleep et al,1990)中に導入し、個々の形質転換株をYEPS(1%w/v酵母抽出物、2%w/vペプトン、2%w/vスクロース)10ml中30℃で3日間増殖させ、その後上澄をrHA断片の存在について抗HSAWesternブロットにより試験した。Westernブロットでは断片がpAYE464保有株によりなお産生されることを明らかに示したが、そのレベルは野生型rHAを発現するコントロールと比較してやや減少していた。プラスミドpAYE470における変異は、断片の形成に影響を有しないようであった。しかしながら、DB1 Cir+pAYE468ではHSA関連バンドの新たなパターンを示し、断片がほとんどまたは全くない。
DB1 cir+pAYE464およびDB1 cir+pAYE468の各々の1例について、醗酵槽中最少培地でフィードバッチ培養により高細胞密度まで増殖させた(Collins,1990)。簡単に言えば、10l作業容量の醗酵槽に50ml/lの濃縮塩混合液(表1)、10ml/lの微量元素溶液(表2)、50ml/lのビタミン混合液(表3)および20g/lのスクロースを含有した初期バッチ培地で5lまで満たした。100ml/lの塩混合液、20ml/lの微量元素溶液、100ml/lのビタミン溶液および500g/lのスクロースを含有した等容量のフィード培地を計量ポンプで醗酵槽に接続された別のリザーバーに保った。pHは水酸化アンモニウムまたは硫酸の自動添加により5.7±0.2で維持し、温度は30℃に維持する。スターラー速度は1v/v/min空気流速度で>20%空気飽和の溶解酸素率を示すように調整した。
醗酵槽に緩衝最少培地〔Yeast窒素ベース(アミノ酸なし、硫酸アンモニウムなし、Difco)1.7g/l、(NH4)2SO45g/l、クエン酸一水和物6.09g/l、Na2HPO420.16g/l、スクロース20g/l、pH6.5〕で増殖させたS.cerevisiaeの一夜培養物100mlを接種した。初期バッチ発酵を炭素源が消費されるまで進行させてから、計量ポンプのスイッチを入れ、フィードの添加をWang et al(1979)により開発されたものに基づくアルゴリズムを用いてコンピューター制御した(マイクロMFCSシステム、B.Braun,Melsungen,Germany)。質量分析器は、発酵からの排ガスをモニターして、セットした増殖速度(例えば0.1h-1)を維持するようにフィードの添加をコントロールするために、コンピューターコントロールシステムと併用した。バイオマスへの炭素基質の最大変換は呼吸係数を1.2以下に維持することで行い(Collins,1990)、こうすると約100g/l細胞乾燥重量の細胞密度が得られる。培養上澄をCoomassie染色SDS/PAGEおよびWesternブロットにより野生型rHA産生株の場合と比較した。これらは、一塩基性Arg410の除去(pAYE464)が有用な量まで断片のレベルを減少させるが、双方の存在しうるプロテアーゼ部位の除去(pAYE468)だと45kDa断片をほぼ消失させることを示した(図2)。
存在しうるKex2p部位Lys413Lys414の除去効果の不在(Sleep et al,1990およびここで記載されていない他の研究でも確認)はArg410の除去と組み合わされていないので複雑な原因であることを示唆したが、上記データはrHA断片の生成が内部タンパク質分解攻撃によることを示唆した。変異rHAと共に断片の量の減少は、原則として、プロテアーゼ開裂部位の除去によるのではなく、分子の折りたたみの動力学上における変化の影響によるものであった。
例2:YAP3遺伝子の破壊
酵母アスパルチルプロテアーゼ3をコードするYAP3遺伝子はYAP3コード配列の部分を効果的に欠失させる遺伝子破壊プロセス(Rothstein,1983)により変異させ、それにより活性YAP3pの産生を妨げた。
YAP3遺伝子の5′および3′末端のPCR増幅に適した4種のオリゴヌクレオチド(Egel-Mitani et al,1990)を、Applied Biosystems 380B Oligonucleotide Synthesiserを用いて合成した。読者を助けるために、我々はSEQ15としてYAP3遺伝子の配列を含めたが、その541-2250はコード配列である。
PCR反応を行って、S.cerevisiaeゲノムcDNA(Clontech Laboratories Inc.)からのYAP3遺伝子の5′および3′末端を個別に増幅させた。条件は次の通りであった:2.5μg/mlゲノムDNA、5μg/mlの各プライマーで40サイクルにわたり、94℃で61秒間変性、37℃で121秒間アニーリング、72℃で181秒間伸長させ、その後4℃浸漬し、製造業者の勧めに従いPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus PCRキットを使用した。産物はゲル電気泳動で分析したところ、予想サイズであることがわかった。5′断片をSphIで切断し、pUC19HX(HindIIIを欠いたpUC19)のSphI部位中にクローニングして、pAYE511(図3)を得たが、その方向はYAP3がpUC19HXポリリンカーのKpnI部位に転写されるようになっている。3′YAP3断片をHindIIIおよびAsp718(KpnIのアイソシゾマー)で切断し、HindIII/Asp718で切断されたpUC19中に結合させて、pAYE512を得た。プラスミドDNA配列決定をインサートで行って、望ましい配列がクローニングされたことを確認した。次いでpAYE512のHindIII/Asp718をpAYE511の対応部位中にサブクローニングしてpAYE513(図3)を得たが、YAP3の5′および3′領域はそれらの間にユニークHindIII部位を有して正しい向きをとっている。URA3遺伝子をHindIII断片としてYEp24(Botstein et al,1979)から単離し、その後この部位中に挿入して、pAYE515(図3)を得たが、そこではURA3がYAP3の5′および3′領域に隣接していて、YAP3の反対方向に転写される。
株DB1 cir°pAYE316(Sleep et al,1991)のura3誘導体をランダム化学的変異誘発と5-フルオロオロチン酸耐性の選択により得た(Boeke et al,1987)。その株を緩衝最少培地100mlで一夜増殖させ、細胞を遠心により集め、その後滅菌水で1回洗浄した。次いで細胞を滅菌水10mlに再懸濁し、そのうち2mlを別の15ml Falcon管に入れた。次いでN-メチル-N′-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)の5mg/ml溶液を次のように管に加えた:0μl、20μl、40μl、80μlまたは160μl。次いで細胞を30℃で30分間インキュベートし、その後遠心して、滅菌水で3回洗浄した。最後に、細胞を1mlYEP(1%w/v酵母抽出物、2%w/vBactoペプトン)に再懸濁し、4℃で貯蔵した。変異原性処理から生き延びた細胞のパーセンテージは、2%w/vスクロース含有YEPプレート上にサンプルの希釈物を塗布して、30℃で3日間インキュベートすることにより決定した。約50%生存率を示した処理からの細胞を2%w/vスクロース含有YEPプレート上で増殖させ、その後2%w/vスクロース含有YNB最少培地上でレプリカ培養し、5-フルオロオロチン酸(1mg/ml)およびウラシル(50μg/ml)で補充した。この培地で増殖できるコロニーを精製し、それらがウラシル補充なしだと増殖できずに、この欠陥が形質転換によるURA3遺伝子の導入で直せることを試験して確かめた。1つのこのような株、DBU3 cir°pAYE316をpAYE515のSphI/Asp718 YAP3-URA3-YAP3断片で形質転換し、Ura+コロニーについて選択した。いくつかの形質転換株の切断ゲノムDNAのサザンブロットをYAP3遺伝子の5′および3′末端でプロービングして、YAP3遺伝子の破壊を確かめた。2形質転換株のYEPS振盪フラスコ上澄の抗HSA Westernブロットでは、YAP3の破壊がrHA断片レベルを著しく減少させることを示した。
DXY10 cir°pAYE316と表示される、DBU3 cir°pAYE316の1つのyap3誘導体を、最少培地で高細胞乾燥重量までフィードバッチ発酵により数回増殖させた。上澄をCoomassie染色PAGEおよび抗HSA Westernブロットで試験したところ(図4および5)、rHA 45kDa断片レベルの減少は明白であり、分解産物の量の評価はYAP3親でみられたレベルの1/3〜1/5である。産生されたrHAの量はyap3変異で悪影響をうけず、実際にDXY10 cir°pAYE316はYAP3相当物、DB1 cir°pAYE316よりも30〜50%多くrHAを産生することがわかった。HA配列からのリーダー配列の開裂が1対の塩基性残基に対してC末端側にあるという事実にもかかわらず、rHAは正しいN末端を有することがわかった。
発酵ブロスを遠心して細胞を除去し、その後次のようにアフィニティクロマトグラフィー精製に付した。培養上澄をCibacron Blue F3GA Sepharoseカラム(Pharmacia)に通して、その後pH8.0の0.1Mリン酸グリシン緩衝液で洗浄した。次いでrHAを2M NaCl、0.1Mリン酸グリシン、pH8.0でカラムから溶出させたところ、それは純度>95%であった。それは当業界で知られる技術により更に精製してもよい。
一方、アルブミンは血清または発酵培地からアルブミンを精製するための様々な公知技術、例えばWO 92/04367、Maurel et al(1989)、Curling(1980)およびEP 524 681に開示された技術により培地から精製してもよい。
例3:yap3株におけるKEX2遺伝子の破壊
Yap3およびKex2p活性を双方とも欠いた株を作製するために、酵母株DXY10 cir°(pAYE316)のlys2誘導体をランダム化学的変異誘発とα-アミノアジペート耐性の選択により得た(Barnes and Thorner,1985)。細胞を例2のように変異誘発させ、その後2%w/vスクロース含有YNB最少培地に塗布し、唯一窒素源として2mg/mlDL-α-アミノアジペートおよび30μg/mlリジンで補充した。この培地で増殖できるコロニーを精製し、それらがリジン補充なしだと増殖できずに、この欠陥が形質転換によるLYS2遺伝子の導入で直せることを試験して確かめた。次いでこの株はKEX2コード配列の部分を効果的に破壊する遺伝子破壊のプロセスにより変異させ、それにより活性Kex2pの産生を妨げた。KEX2遺伝子の配列をSEQ14としてここに再現しているが、その1329-3773はコード配列である。
KEX2遺伝子の5′および3′末端のPCR増幅に適した4種のオリゴヌクレオチド(Fuller et al,1989)を、Applied Biosystems 380B Oligonucleotide Synthesiserを用いて合成した。
PCR反応を行って、S.cerevisiaeゲノムcDNA(Clontech Laboratories Inc.)からのKEX2遺伝子の5′および3′末端を個別に増幅させた。条件は次の通りであった:2.5μg/mlゲノムDNA、5μg/mlの各プライマーで40サイクルにわたり、94℃で61秒間変性、37℃で121秒間アニーリング、72℃で181秒間伸長させ、その後4℃浸漬し、製造業者の勧めに従いPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus PCRキットを使用した。産物はゲル電気泳動で分析したところ、予想サイズであることがわかった(5′産物の場合0.9kbおよび3′産物の場合0.62kb)。5′産物をBamHIおよびHindIIIで切断し、3′産物をHindIIIおよびSalIで切断して、その後2つの断片をBamHIおよびSalIで切断されたpUC19HX中に一緒にクローニングした。次いでS.cerevisiae LYS2遺伝子(Barnes & Thorner,1985)を含んだ4.8kbHindIII断片を得られたプラスミド中にHindIII(即ち2つのKEX2断片間)のところで挿入して、pAYE519(図6)を形成させた。
DXY10 cir°(pAYE316)のlys2誘導体、lys2-16をpAYE519の6.0kb KEX2-LYS2-KEX2断片で形質転換し、Lys+コロニーについて選択した。いくつかの形質転換株の切断ゲノムDNAのSouthernブロットをKEX2遺伝子の5′および3′末端でプロービングして、KEX2遺伝子の破壊を確かめた。これら形質転換株のYEPS振盪フラスコ培養上澄の抗HSA Westernブロットでは、下記例4でKEX2のみの破壊効果の欠如にもかかわらず、yap3株におけるKEX2の破壊がrHA断片レベルを更になお減少させることを示した。1つのこのような株ABB50で産生されるrHAの分析では、リーダー配列が不正確にプロセッシングされて、異常N末端になることを示した。
株ABB50(pAYE316)をそのプラスミドから直して(Sleep et al,1991)、類似プラスミドpAYE522で形質転換させたところ、ハイブリッドリーダー配列はS.cerevisiaeインベルターゼ(SUC2)リーダー配列に置き換わって、コードされるリーダーおよびHSA配列とのジャンクションが下記の通りになった:
この構築体では、HSAからリーダー配列の開裂がKex2プロテアーゼの活性に依存していない。株ABB50(pAYE522)は同様に非常に低いレベルのrHA断片と共にrHAを産生することがわかったが、この場合だとN末端は血清由来HSAのものに相当しており、即ちリーダー配列の効率的で正確な除去があった。
例4:KEX2遺伝子単独の破壊(比較例)
例3に開示された場合と同様の方法により、KEX2遺伝子をS.cerevisiaeで破壊した。この株はYap3pタンパク質分解活性を有しており、したがって本発明の範囲内に属さなかった。この株をフィードバッチ発酵で増殖させたとき、産生されたrHAは完全KEX2遺伝子を有する株で産生された場合と同様の断片量を含有していた。加えて、rHAの全体レベルも減少しており、リーダー配列は正確にプロセッシングされずに、異常N末端を生じた。
例5:Pichiaで相当プロテアーゼの同定
前記のように、非Saccharomyces酵母も同様にrHAの望ましくない断片を産生し、したがってYap3pタンパク質分解活性を有している。我々はプローブとしてS.cerevisiae YAP3遺伝子を用いてPichia angusta DNAのSouthernハイブリッド形成を行うことによりこれを確認した。特異的DNA断片を同定したところ、P.angustaにYap3pタンパク質分解活性が存在するだけでなく、YAP3遺伝子の特異的ホモローグも存在することを示した。
YAP3ホモローグの検出に用いられたSouthernハイブリッド形成の方法は、標準操作(Sambrook et al,1989)を用いてPichia DNAのゲノムDNAライブラリーから遺伝子配列をクローニングするために応用することができる。Pichia sp.におけるYAP3ホモローグの破壊も、Saccharomycesについて上記で用いられた場合と同様の技術を用いて行うことができる(cregg and Madden,1987)。
配列表
配列情報 NO:1:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1830塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA to mRNA
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起源:
(A)生物名:Homo sapiens
(ix)配列の特徴:
(A)NAME/KEY:CDS
(B)存在位置 73..1827
(xi)配列:NO:1:
配列情報 NO:2:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:585アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:NO:2:
配列情報 NO:3:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:5アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型:中間部
(xi)配列:NO:3:
配列情報 NO:4:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:5アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型:中間部
(xi)配列:NO:4:
配列情報 NO:5:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:NO:5:
配列情報 NO:6:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:YES
(xi)配列:NO:6:
配列情報 NO:7:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:NO:7:
配列情報 NO:8:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:YES
(xi)配列:NO:8:
配列情報 NO:9:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:NO:9:
配列情報 NO:10:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:YES
(xi)配列:NO:10:
配列情報 NO:11:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(xi)配列:NO:11:
配列情報 NO:12:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:YES
(xi)配列:NO:12:
配列情報 NO:13:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(v)フラグメント型
(xi)配列:NO:13:
配列情報 NO:14:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:4106塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起源:
(A)生物名:Saccharomyces cerevisiae
(xi)配列:NO:14:
配列情報 NO:15:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2526塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(Genomic)
(iii)ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起源:
(A)生物名:Saccharomyces cerevisiae
(xi)配列:NO:15:
Claims (21)
- アルブミンが培地中に分泌されるように培地で酵母を培養することを含む、アルブミンを産生および分泌するように遺伝子修飾された酵母からの分泌によりアルブミンを製造する方法であって、該酵母細胞が野生型の50%以下のレベルの酵母アスパルチルプロテアーゼ3タンパク質分解活性を有することを特徴とする方法。
- タンパク質分解活性が、ポリペプチドにおける一塩基性部位におよび一対の塩基性アミノ酸に特異的なエンドプロテアーゼ活性である、請求項1に記載の方法。
- 酵母がS.cerevisiaeである、請求項1または2に記載の方法。
- 酵母が機能性YAP3遺伝子を欠く、請求項1、2または3に記載の方法。
- 酵母細胞が減少したレベルのS.cerevisiae Kex2pタンパク質分解活性を更に有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- アルブミンがヒトアルブミンである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- アルブミンをコードするポリヌクレオチド配列と、第一ポリヌクレオチド配列から発現されたアルブミンを酵母から分泌させる分泌シグナルをコードする第二ポリヌクレオチド配列とを含んだ酵母細胞の培養物であって、該酵母細胞が減少したレベルの酵母アスパルチルプロテアーゼ3タンパク質分解活性を有することを特徴とする培養物。
- アルブミンがヒトアルブミンである、請求項7に記載の培養物。
- 酵母がS.cerevisiaeである、請求項7または8に記載の培養物。
- シグナルが、酵母からアルブミンの放出前に、酵母により開裂される、請求項7〜9のいずれか一項に記載の培養物。
- 酵母細胞が減少したレベルのKex2pタンパク質分解活性を更に有する、請求項7〜10のいずれか一項に記載の培養物。
- 分泌シグナルがKex2p以外のプロテアーゼによりアルブミンから開裂される、請求項11に記載の培養物。
- 天然ヒトアルブミンと少くとも90%の配列同一性を有する修飾ヒトアルブミンであって、410番目のアルギニンが存在しないか、あるいは非塩基性アミノ酸に置換されたことを特徴とする、修飾ヒトアルブミン。
- 天然ウシアルブミンと少くとも90%の配列同一性を有する修飾ウシアルブミンであって、408番目のアルギニンが存在しないか、あるいは非塩基性アミノ酸に置換されたことを特徴とする、修飾ウシアルブミン。
- アルギニンがアラニンに置換された、請求項13または14に記載の修飾アルブミン。
- 天然アルブミンに存在する一対の塩基性アミノ酸を更に欠く、請求項13〜15のいずれか一項に記載の修飾アルブミン。
- 一対のアミノ酸がLys、Lys;Lys、Arg;Arg、Lys;またはArg、Argである、請求項16に記載の修飾アルブミン。
- ヒトアルブミンの場合には残基413および414が、ウシアルブミンの場合には残基411および412が、それぞれリジンまたはアルギニンではない、請求項17に記載の修飾アルブミン。
- アミノ酸置換R410A、K413Q、K414Qを有するヒトアルブミンである、請求項18に記載の修飾アルブミン。
- 請求項13〜19のいずれか一項に記載の修飾アルブミンをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項20に記載されたポリヌクレオチドと、修飾アルブミンが酵母で発現されるような転写シグナルと、そして修飾アルブミンが酵母から分泌されるように上記ポリヌクレオチドと隣接する更なるポリヌクレオチドとを含む酵母。
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