JPH10327870A - 新規組換えヒトキマーゼおよび酵母を用いたその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 成熟ヒトキマーゼをコードするＤＮＡを
含有する酵母用分泌発現ベクターで形質転換された酵母
宿主を培養し、得られる培養物から活性ヒトキマーゼを
採取することを特徴とする活性ヒトキマーゼの製造方
法、特に、培養物から活性ヒトキマーゼを採取する方法
が、培養菌体内タンパク質の可溶化・再生を含むことを
特徴とする上記方法。ヒトキマーゼをコードするＤＮＡ
を担持する酵母宿主由来として得ることができる新規組
換えヒトキマーゼ。 【効果】 本発明の方法は、プロ配列の切断処理工程を
必要とせず、容易に且つ安価に活性ヒトキマーゼを製造
することが可能であり、ヒトキマーゼの商業的規模での
組換え生産に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵母宿主由来の活
性な組換えヒトキマーゼ、およびその製造方法、特に、
プロ酵素のプロ配列切断工程を含まないことを特徴とす
る該活性ヒトキマーゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトキマーゼは、マスト細胞（肥満細
胞）の分泌顆粒中に主に見出されるセリンプロテアーゼ
であり、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンIIに変
換する活性を有しており、局所組織、特に心組織におけ
るアンジオテンシンIIの生成に中心的役割を果たしてい
る。この酵素の生化学的性状や一次構造、組織学的局在
性などは既に明らかにされており、現在はその病態生理
学的な意義の究明が盛んに行われている。但し、そのた
めには該酵素の標品を大量に調製することが必要となる
が、ヒト由来の該酵素を天然から大量に取得することは
容易ではない。

【０００３】そこで、ヒトキマーゼを遺伝子工学的手法
を用いて人工的に生産する試みがこれまでに幾つか行わ
れてきた。ヒトキマーゼは、まず１９アミノ酸残基から
なるシグナルペプチドとジペプチド（Gly-Glu ）のプロ
配列を有するチモーゲンとして合成され、シグナルペプ
チドのプロセシングの後分泌顆粒に輸送され、さらにプ
ロ配列がプロセシングされて活性型の成熟キマーゼとな
る。Urata ら［J. Biol. Chem., 268(32): 24318-24322
(1993) ］は、ＣＯＳ−１細胞を宿主として用い、プレ
プロ配列を有する野生型ヒトキマーゼ、プロ配列を欠く
ヒトキマーゼ、およびプレプロ配列を欠くヒトキマーゼ
（すなわち、成熟キマーゼ）をそれぞれコードするＤＮ
Ａを導入してその一過的発現を調べたところ、野生型ヒ
トキマーゼを導入した細胞からはプロキマーゼが得ら
れ、これをプロ配列を切断する酵素を含む細胞抽出物と
反応させることにより活性化させることに成功した。し
かしながら、その発現量は極めて少ないものであり、商
業的生産に利用できるものではなかった。さらに、プロ
配列を欠く２種類のヒトキマーゼＤＮＡを導入した細胞
からは、活性なヒトキマーゼを得ることができなかっ
た。

【０００４】Urata ら［J. Biol. Chem., 270(5): 2218
-2223 (1995)］は、バキュロウイルスの発現系を用いて
プレプロヒトキマーゼＤＮＡを導入したが、分泌発現産
物はプロキマーゼであり、活性化にはジペプチジルペプ
チダーゼＩの酵素処理によるプロ配列の切断が必要であ
った。

【０００５】Wangら［Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 376:
681-684 (1995) ］は、大腸菌を宿主として、ユビキチ
ンとの融合タンパク質として成熟ヒトキマーゼを発現さ
せたが、酵素処理によりユビキチン部分を切断した後活
性化されたのは約２．５％にすぎなかった。また、大腸
菌で生産される組換えキマーゼは糖鎖を有しないが、糖
鎖は分子識別やタンパク質の構造維持などの様々な生理
的役割を担っていることから、天然のヒトキマーゼの薬
理学的意義の研究材料には適さない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このように、従来の組
換えヒトキマーゼの生産方法では、(1) 活性な成熟キマ
ーゼを得るためにプロ配列の切断処理工程を要する、
(2) 発現量が少なく商業的生産に利用できない、といっ
た問題点があった。また、プロ配列の切断処理に用いら
れる酵素は比較的高価であるため、生産コストが高くな
り安価なヒトキマーゼ標品を提供できないという欠点も
あった。したがって、本発明の目的は、プロ配列の切断
処理工程を含まず、且つ大量に活性なヒトキマーゼを生
産することができる新規な組換えヒトキマーゼの製造方
法を提供することである。また、本発明の別の目的は、
簡易且つ大量に製造することができる新規組換えヒトキ
マーゼの提供である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】ところで、酵母を用いた
物質生産は、生産コストの低さや発酵工業として古くか
ら培われてきた培養技術等多くの面で、動物細胞を用い
た物質生産に比べて有利である。また、細菌と異なり、
酵母は動物細胞と同様に糖鎖付加などの翻訳後修飾を行
うので、糖タンパク質の組換え生産のための宿主として
特に有用であると考えられる。そこで、本発明者らは、
酵母発現系を用いて上記の目的を達成すべく種々検討を
重ねた結果、ピキア属に属する酵母を宿主として用い、
これを成熟ヒトキマーゼをコードするＤＮＡを含む酵母
用分泌発現ベクターで形質転換し、該形質転換細胞を培
養して得られる培養物の培養上清から活性なヒトキマー
ゼを採取することに成功した。さらに、本発明者らは、
培養菌体中に培養上清中の約１０倍のヒトキマーゼが不
溶化して蓄積していることを見出し、該菌体内の不溶性
タンパク質の可溶化および再生（リフォールディング）
処理を行うことによって、大量の活性型ヒトキマーゼを
取得することに成功して本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、成熟ヒトキマーゼ
（または生理機能的に等価なその変異体）をコードする
ＤＮＡを含有する酵母用分泌発現ベクターで形質転換さ
れた酵母宿主を培養し、得られる培養物から活性ヒトキ
マーゼを採取することを特徴とする活性ヒトキマーゼの
製造方法である。特に、本発明は、培養物から活性ヒト
キマーゼを採取する方法が、培養菌体内タンパク質の可
溶化・再生を含むことを特徴とする上記の活性ヒトキマ
ーゼの製造方法である。就中、本発明は、酵母用分泌発
現ベクターが、パン酵母由来のＳＵＣ２シグナルコドン
を有するものであり、また、酵母宿主がピキア属に属す
る酵母である上記の活性ヒトキマーゼの製造方法であ
る。また、本発明は、ヒトキマーゼをコードするＤＮＡ
を担持する酵母宿主由来として得ることができ、且つ分
子量が約３５〜約４０ｋＤである活性な組換えヒトキマ
ーゼ、特に天然の成熟ヒトキマーゼと同一のアミノ酸配
列または該アミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が
欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる組
換えヒトキマーゼである。就中、本発明は、上記のいず
れかの製造方法により得ることができる当該組換えヒト
キマーゼである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明において、成熟ヒトキマー
ゼをコードするＤＮＡとは、その転写翻訳産物であるポ
リペプチドが活性ヒトキマーゼとしての特性を有するも
のであれば特に制限されず、天然の成熟ヒトキマーゼＤ
ＮＡの他、天然の成熟ヒトキマーゼのアミノ酸配列、す
なわち配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ、並びに該アミノ酸配列において少なくと
も１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列からなるヒトキマーゼ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡも全て包含される。好ましくは天然
の成熟ヒトキマーゼＤＮＡ、就中、天然の成熟ヒトキマ
ーゼｃＤＮＡである。

【００１０】本発明の成熟ヒトキマーゼをコードするＤ
ＮＡを含有する酵母用分泌発現ベクターとは、酵母細胞
内で自律的に複製されるか酵母ゲノム内に組み込まれる
ことにより遺伝的に安定に維持され、且つ酵母細胞内で
ヒトキマーゼを発現し、しかも成熟キマーゼを細胞外に
分泌させ得るように設計された組換えベクターを意味す
る。具体的には、少なくとも該ベクターは、酵母細胞内
で機能し得る（すなわち、その下流に連結された遺伝子
を酵母細胞内で発現させ得る）プロモーター、酵母細胞
で機能し得る（すなわち、産生された目的タンパク質を
酵母細胞外に分泌させ得る）シグナルペプチドをコード
するＤＮＡ配列（以下、シグナルコドンという場合もあ
る）、成熟キマーゼをコードするＤＮＡおよび常用の終
止コドン（例えば、ＴＧＡ、ＴＡＧ、ＴＡＡ等）を含有
し、しかも該シグナルコドンの直後に成熟ヒトキマーゼ
をコードするＤＮＡ、さらにその直後に終止コドンが配
置され、且つ該プロモーターから転写されるｍＲＮＡの
翻訳が該シグナルコドンの最初に位置する開始コドン
（好適にはＡＴＧ）より開始され、該終止コドンで終結
するように配置されなければならない。結果として該ベ
クターにより発現する初期翻訳産物は、該シグナルペプ
チドをアミノ末端に含むキメラプレヒトキマーゼであ
る。

【００１１】酵母細胞内で機能し得るプロモーターとし
ては、好ましくは酵母由来のプロモーター、例えば、サ
ッカロマイセス・セレビシエ由来のＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
プロモーター等、ピキア・パストリス由来のＡＯＸ１プ
ロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ジヒドロキシアセ
トンシンターゼプロモーター、Ｐ４０プロモーター、Ａ
ＤＨプロモーター、葉酸デヒドロゲナーゼプロモーター
等が挙げられる。また、上記酵母由来プロモーターが、
遺伝子発現効率がさらに向上するように修飾された変異
型プロモーター、例えば、変異型ＡＯＸ２（ｍＡＯＸ
２）プロモーター[Ohi et al., Mol. Gen.Genet., 243,
489-499 (1994); 特開平4-299984号公報] 等がより好
ましく例示される。

【００１２】酵母細胞で機能し得るシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列は特に制限されるものではない
が、好ましくは、酵母由来の分泌タンパク質のシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列、例えば、Ｓ．セレビ
シエ由来のインベルターゼ（ＳＵＣ２）シグナルコド
ン、接合フェロモンα因子（ＭＦ−α）シグナルコドン
（さらにプロ配列をコードするＤＮＡを含んでいてもよ
い）、キラー毒素シグナルコドン、酸性ホスファターゼ
シグナルコドン等、クリベロマイセス・ラクティス由来
のキラー毒素シグナルコドン（さらにプロ配列をコード
するＤＮＡを含んでいてもよい）等が挙げられる。より
好ましくはＳ．セレビシエ由来のＳＵＣ２シグナルコド
ンが例示される。

【００１３】本発明の成熟ヒトキマーゼをコードするＤ
ＮＡを含有する酵母用分泌発現ベクターは、さらに酵母
で機能し得るターミネーター配列、エンハンサー配列、
酵母の選択に利用できる選択マーカー遺伝子（栄養要求
性遺伝子、例えば、Ｓ．セレビシエまたはＰ．パストリ
スのＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＵＲＡ３遺伝子等、または抗
生物質耐性遺伝子、例えば、Ｇ４１８耐性遺伝子等）な
どを含んでいることが好ましく、また、所望により酵母
で機能し得る複製可能単位を含んでいてもよい。さら
に、該ベクターの大量調製のために、大腸菌で機能し得
る複製可能単位および大腸菌の選択に利用できる選択マ
ーカー遺伝子を含んでいることがより好ましい。

【００１４】本発明の成熟ヒトキマーゼをコードするＤ
ＮＡを含有する酵母用分泌発現ベクターは、当該技術分
野において通常用いられる任意の手法を組み合わせるこ
とにより調製することができる。例えば、ＰＣＲ法を用
いて、シグナルコドンおよび成熟ヒトキマーゼＤＮＡの
５’末端からその近傍に存在するユニークな制限酵素切
断部位（例えば、ＢｓｍＩ部位）を含む成熟ヒトキマー
ゼＤＮＡ部分配列からなるＤＮＡ断片を合成し、該制限
酵素で切断した後、同じく該制限酵素で切断したヒトキ
マーゼｃＤＮＡの成熟ヒトキマーゼのカルボキシル末端
側をコードするＤＮＡ断片とライゲーションすることに
よりキメラプレヒトキマーゼをコードするＤＮＡを作製
し、次いでこれを上記の酵母細胞内で機能し得るプロモ
ーターを含む発現ベクター内に挿入することによって作
製することができる。本法のより具体的な実施態様は、
後記実施例１に記載されている。

【００１５】本発明の成熟ヒトキマーゼをコードするＤ
ＮＡを含有する酵母用分泌発現ベクターは、例えば、ポ
リエチレングリコール法、リチウム法、エレクトロポー
レーション法、マイクロインジェクション法等、公知の
形質転換技術を用いて、標的酵母細胞内に導入すること
ができる。

【００１６】本発明で用いられる宿主酵母は特に限定さ
れないが、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、ク
リベロマイセス属等に属する酵母が挙げられる。好まし
くはピキア属に属する酵母、より好ましくはＰ．パスト
リス、就中、栄養要求性変異Ｐ．パストリス株（例え
ば、Ｐ．パストリスＧＴＳ１１５株（ＨＩＳ４^- ）［Ｎ
ＮＲＬ Ｙ−１５８５１］、Ｐ．パストリスＧＳ１９０
株（ＡＲＧ４^- ）［ＮＮＲＬＹ−１８０１４）、Ｐ．パ
ストリスＰＰＦ１（ＨＩＳ４^- ，ＵＲＡ４^- ）［ＮＮＲ
Ｌ Ｙ−１８０１７］など）である。

【００１７】形質転換された酵母細胞は、当該技術分野
で通常使用される方法で培養することにより、ヒトキマ
ーゼを産生することができる。用いられる培地には、宿
主細胞の生育に必要な炭素源および無機または有機窒素
源が少なくとも含まれる必要がある。炭素源としては、
グルコース、ショ糖、グリセロール、デキストラン、可
溶性デンプン等が例示される。宿主としてＰ．パストリ
スなどのメタノール資化性酵母を用いる場合には、メタ
ノールも好ましい炭素源として例示される。また無機ま
たは有機窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩
類、アミノ酸、コーンスチープリカー、ペプトン、カゼ
イン、肉エキス、酵母エキス、大豆粕、バレイショ抽出
液等が例示される。さらに、所望により他の栄養素、例
えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化
マグネシウム等の無機塩、ビオチン等のビタミン類、抗
生物質などを含んでいてもよい。

【００１８】用いられる培地としては、例えば、通常の
天然培地（例えば、ＹＰＤ培地、ＹＰＭ培地、ＹＰＧ培
地等）または合成培地が挙げられる。培地のｐＨおよび
培養温度は、酵母の増殖およびヒトキマーゼの産生に適
した温度が適宜採用されるが、例えば、ｐＨ５〜８、培
養温度約２０〜３０℃が好ましく例示される。また、必
要に応じて通気や攪拌を行うこともできる。

【００１９】例えば、宿主としてＰ．パストリス、酵母
細胞内で機能し得るプロモーターとしてＡＯＸ１プロモ
ーター、ｍＡＯＸ２プロモーターなどのメタノールによ
り発現誘導されるプロモーターを使用する場合、菌体の
増殖のための炭素源としてグリセロールを含み、ヒトキ
マーゼの発現誘導因子としてメタノールを含む、ｐＨ約
６．０に制御された天然培地を用いて液体通気攪拌培養
を行う方法が最も好ましく例示される。ヒトキマーゼの
発現が菌体の生育にとって好ましくない場合には、まず
メタノール以外の炭素源で菌体量を増加させた後でメタ
ノールを添加してヒトキマーゼの発現を誘導する培養方
法がより好ましい。また、ジャーファーメンターでの培
養においては、高密度培養法がヒトキマーゼの産生に好
適な方法として例示される。

【００２０】上記培養の過程において、ヒトキマーゼ
は、まず成熟ヒトキマーゼのアミノ末端に酵母で機能し
得るシグナルペプチドを付加されたキメラプレヒトキマ
ーゼとして産生され、次いで宿主酵母のプロセシング機
構により該シグナルペプチドが切断除去され成熟ヒトキ
マーゼとなる。生成した成熟ヒトキマーゼの一部は、酵
母の分泌経路を通って培地中に分泌される。培地中に分
泌された成熟ヒトキマーゼは、培養終了後の培養物を遠
心分離および／または濾過して上清を回収し、次いで当
該上清から自体公知の方法、例えば、分画法、イオン交
換、ゲル濾過、アフィニティーカラムまたは疎水性クロ
マトグラフィー等により精製取得することができる。こ
のようにして取得された成熟ヒトキマーゼは、アンジオ
テンシンＩをアンジオテンシンIIに変換する酵素活性を
有する。さらに、Ｋｍ値、至適ｐＨおよび活性に対する
阻害剤の影響等は天然のヒトキマーゼとよく一致する。
また、該ヒトキマーゼは糖鎖が付加された糖タンパク質
である。

【００２１】異種タンパク質の組換え生産において、特
に細菌宿主で高等真核生物タンパク質を産生させた場合
には、しばしば封入体と呼ばれる不溶性タンパク質凝集
塊を形成する。これは、異種タンパク質分子間や異種タ
ンパク質と他の夾雑物質との間で不適当な結合が形成さ
れて、異種タンパク質が本来の構造に折り畳まれないこ
とに起因する。酵母細胞内で発現およびプロセシングさ
れて生成した成熟ヒトキマーゼの一部も、培地中に分泌
されずに不溶性のタンパク質凝集塊として細胞内に蓄積
される場合がある。酵母細胞内に蓄積した不溶性成熟ヒ
トキマーゼは、培養終了後の培養物を遠心分離および／
または濾過して培養菌体を回収し、次いで、当該培養菌
体を当技術分野で通常用いられる可溶化・再生処理に付
すことにより活性を有するタンパク質として精製取得す
ることができる。ここで可溶化とは、可溶化剤の添加に
より不溶性タンパク質を水溶液中に安定に存在させるよ
うにすることであり、再生とは、可溶化により変性した
タンパク質を本来の生理活性を有する分子構造に再度折
り畳み直す（リフォールディングさせる）ことをいう。
可溶化剤としては、イオン性または非イオン性の界面活
性剤、塩酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、尿素
などの変性剤、アルカリなどが例示される。好ましくは
約４〜９Ｍの塩酸グアニジンなどである。可溶化処理
は、菌体自体に可溶化剤を加えて溶解してもよいし、ま
た、一旦浸透圧ショックなどにより細胞を破砕し、得ら
れる不溶性画分を単離してから可溶化剤を加えて行って
もよい。

【００２２】可溶化・再生は、一般的に、不溶性タンパ
ク質を可溶化剤として強力な変性剤を添加することによ
り溶解させて不適当なジスルフィド結合をほぐし、次い
で、還元条件下で強力な変性剤を弱い変性剤と交換する
かもしくは希釈することでタンパク質を適切に折り畳ま
せ、空気または他の酸化剤の存在下で適切なジスルフィ
ド結合を再形成させる工程を含む。弱い変性剤として
は、可溶化剤として用いられる変性剤をより低濃度で用
いることができる。例えば、０．５〜２Ｍの塩酸グアニ
ジン、１〜４Ｍの尿素などが例示される。弱い変性剤へ
の変換は、可溶化処理した溶液を弱い変性剤を含む緩衝
液に対して透析を行うことなどにより実施される。該緩
衝液中に加える還元剤としては、例えば２−メルカプト
エタノール、還元型グルタチオン、ジチオスレイトール
が挙げられる。ジスルフィド結合の再形成のために加え
る酸化剤としては上記還元剤の対応する酸化型が例示さ
れる。

【００２３】また、可溶化剤を弱い変性剤と交換する工
程で、上記の還元剤とそれより少量の対応する酸化型化
合物とを弱い変性剤を含む緩衝液中に混在させた酸化還
元緩衝液を用いることにより、タンパク質の折り畳みと
ジスルフィド結合の再形成を一工程で行うこともでき
る。

【００２４】本発明の組換えヒトキマーゼは、天然のヒ
トキマーゼと同様、アンジオテンシンＩをアンジオテン
シンIIに変換する本来の酵素活性を有する。さらに、Ｋ
ｍ値、至適ｐＨおよび活性に対する阻害剤の影響等にお
いても天然のヒトキマーゼとよく一致する。また、該活
性ヒトキマーゼは糖鎖が付加された糖タンパク質として
得られるが、その分子量は約３５〜約４０ｋＤであり、
酵素処理による糖鎖除去後の分子量は約３１ｋＤで天然
のヒトキマーゼのそれと一致する。

【００２５】本発明の組換えヒトキマーゼは、上記の物
性を有する限りその一次構造に特に制限はなく、天然の
成熟ヒトキマーゼと同一のアミノ酸配列、すなわち配列
表配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるものであ
っても、あるいは該アミノ酸配列において少なくとも１
個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列からなるものであってもよい。なお、ヒトキマーゼ
の触媒活性および他の生理機能に重要と考えられるアミ
ノ酸領域が数多く報告されている。すなわち、Urata ら
[J. Biol. Chem., 266(26): 17173-17179 (1991)] は、
ヒトキマーゼの触媒部位、すなわちセリンプロテアーゼ
活性中心は４５位のＨｉｓ（Ｈｉｓ₄₅；以下同様に表記
する）、Ａｓｎ₈₂およびＳｅｒ₁₈₂ から形成されている
こと、並びにＡｓｎ₅₉およびＡｓｎ₈₂がＮ−結合グリコ
シル化部位であることを報告している。また、ラットキ
マーゼとヒトキマーゼの立体構造解析により６つのＣｙ
ｓ残基（Ｃｙｓ₃₀，Ｃｙｓ₄₆，Ｃｙｓ₁₂₃ ，Ｃｙ
ｓ₁₅₄ ，Ｃｙｓ₁₆₇ およびＣｙｓ ₁₈₈ ）が保存されてい
ることが明らかとなっている［山本ら，血圧，2(2): 17
0-178 (1995)］。さらに、ヒトキマーゼの活性化メカニ
ズムの研究により、ヒトキマーゼのＮ末側の１８アミノ
酸残基とＡｓｐ₁₈₁ が活性発現に重要な役割を果たすこ
とが示された[Husain ら，J. Biol. Chem., 270(5): 22
18-2223 (1995)] 。また、ヒトキマーゼはヘパリンと結
合して生体内で安定化することから、３つのヘパリン結
合部位にある正荷電のアミノ酸［ヘパリン結合部位Ｉ：
Ｌｙｓ₈ ，Ｈｉｓ₁₀，Ａｒｇ₁₂，Ａｒｇ₁₂₁ ，Ａｒｇ
₁₂₄ ，Ｌｙｓ₁₄₅ ，Ａｒｇ₁₄₇ ，Ａｒｇ ₁₇₂ ，Ｌｙｓ
₁₇₃ ，Ｌｙｓ₁₇₅ ，Ａｒｇ₂₀₀ およびＬｙｓ₂₀₄ ；ヘパ
リン結合部位II：Ｌｙｓ₈₀，Ｈｉｓ₈₇，Ｈｉｓ₈₈，Ｈｉ
ｓ₁₅₆ ，Ａｒｇ₁₅₈ ，Ｈｉｓ₂₁₄ およびＡｒｇ₂₁₆ ；ヘ
パリン結合部位III ：Ａｒｇ₃₆，Ａｒｇ₃₇，Ｌｙｓ₇₄，
Ｌｙｓ₉₄，Ｌｙｓ₉₆およびＬｙｓ₉₈］の役割も重要であ
ると考えられている。

【００２６】本発明の活性な組換えヒトキマーゼは、ヒ
トキマーゼをコードするＤＮＡを担持する組換え酵母に
より産生され得るが、上記の物性を有する限りその由来
に特に制限はなく、一般に遺伝子組換え技術により製造
されるいかなるヒトキマーゼであってもよい。このよう
な組換えヒトキマーゼは、例えば、上記の活性ヒトキマ
ーゼ製造方法によって得ることができるが、製法はそれ
に限定されるわけではない。

【００２７】

【実施例】以下に、実施例を示して本発明をより具体的
に説明するが、これらは単なる例示であって本発明を何
ら限定するものではない。

【００２８】実施例１ ヒトキマーゼをコードするＤＮ
Ａを含有する酵母用分泌発現ベクターの構築 （１）ヒトキマーゼｃＤＮＡのクローニング Urata らの報告[J. Biol. Chem., 266(26): 17173-1717
9 (1991)] に準じ、下記のようにＰＣＲ法を用いてヒト
キマーゼｃＤＮＡをクローニングした。ヒト左心室から
調製したｍＲＮＡにオリゴｄＴプライマーを加え、逆転
写酵素（宝酒造）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
ヒトキマーゼをコードするＤＮＡの５’側部分配列を有
するオリゴヌクレオチドＣＨ−１（配列表配列番号１）
と、ヒトキマーゼをコードするＤＮＡの３’側部分配列
の相補鎖ＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドＡＣＨ
−１（配列表配列番号２）を、全自動ＤＮＡ合成機（ア
プライドバイオシステムズ社）を用いて合成し、これら
をそれぞれセンスおよびアンチセンスプライマーとして
用い、前記一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行
うことにより、プレプロ配列を有するヒトキマーゼをコ
ードするＤＮＡ配列を含む７６９ｂｐ断片（配列表配列
番号４）を調製した。 センスプライマー（ＣＨ−１）： 5'-AGCCTCTCTGGGAAGATGCTGCTT-3' （配列表配列番号１） アンチセンスプライマー（ＣＨ−１）： 5'-GGATCCAGGATTAATTTGCCTGCAG-3' （配列表配列番号２） ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ２０００
（パーキン・エルマー・シータス社）を用いて以下の条
件にて実施した。 ＰＣＲ反応液組成： 鋳型一本鎖ｃＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ） １μＬ ＣＨ−１（５２．５μＭ） １μＬ ＡＣＨ−１（５４．３μＭ） １μＬ １０×ＰＣＲバッファー¹⁾ １０μＬ ｄＮＴＰｓ¹⁾ ８μＬＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ¹⁾ １μＬ 蒸留水で全量１００μＬとする¹⁾ PCR amprification kit （宝酒造）に添付の試薬を使
用 反応条件： 変性： ９４℃，１分 アニーリング： ５５℃，２分 （４０サイクル） 伸長： ７２℃，３分 DNA Blunting Kit（宝酒造）を用いて該７６９ｂｐＤＮ
Ａ断片を末端平滑化し、ｐＵＣ１１９（宝酒造）の制限
酵素ＳｍａＩ切断部位にクローニングしてｐＳＵ０１０
を得た。このｐＳＵ０１０のＳａｌＩ部位を、部位特異
的突然変異誘発によりＡｓｕＩＩ部位に改変したｐＳＵ
０１１を作製した。 （２）ＳＵＣ２をコードするＤＮＡのクローニング サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）のインベルターゼ（ＳＵＣ２）をコードする全ＤＮ
Ａ配列はすでに報告されている（特開昭６０−４１４８
８号）。Smith らの方法[Methods in Enzymology, 12:
538-541 (1967)] を用いてＳ．セレビシエＧＲＦ１８株
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６４６６７：MAT α, leu2, his3）
から単離した全染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃIIおよ
びＢａｍＨＩで消化し、その２．３〜３．２ｋｂ断片を
ｐＵＣ１８（宝酒造）に挿入してＳ．セレビシエゲノミ
ックＤＮＡライブラリーを作製した。該ライブラリーか
ら、ＳＵＣ２の開始Ｍｅｔから数えて２５番目から４１
番目のアミノ酸配列をコードする下記ＤＮＡ配列を有す
るオリゴヌクレオチドＳＵＣ２−１（配列表配列番号
５）をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼー
ション法により、ＳＵＣ２プロモーター領域−ＳＵＣ２
シグナルコドン−ＳＵＣ２のＮ末端側領域をコードする
２５５８ｂｐのＤＮＡ配列が挿入されたプラスミドｐＹ
Ｉ０１１を有するクローンを得た。 プローブ（ＳＵＣ２−１）： 5'-ACTAGCGATAGACCTTTGGTCCACTTCACACCCAACAAGGGCTGGATGAAT-3' （配列表配列番号５） （３）シグナルコドンと成熟ヒトキマーゼＤＮＡの接合
部の合成 ＳＵＣ２シグナルコドンの下流に成熟ヒトキマーゼＤＮ
Ａを連結するために、ＳＵＣ２シグナルコドンの５’側
配列および制限酵素ＡｓｕＩＩ切断部位を有するオリゴ
ヌクレオチドＰ−１（配列表配列番号６）と、ＳＵＣ２
シグナルコドンの３’側配列および成熟ヒトキマーゼＤ
ＮＡの５’側部分配列（制限酵素ＢｓｍＩ切断部位を含
む）の相補鎖ＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドＳ
ＵＣ２／ＣＨ−Ｍ１（配列表配列番号７）を全自動ＤＮ
Ａ合成機（アプライドバイオシステムズ社）を用いて合
成し、ＳＵＣ２シグナルコドンを有するプラスミドｐＹ
Ｉ０１１を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ＳＵＣ２シグ
ナルコドンおよび成熟ヒトキマーゼＤＮＡの５’側部分
配列を含む９２ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。ＰＣＲ反
応は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ２０００（パーキ
ン・エルマー・シータス社）を用いて以下の条件にて実
施した。 センスプライマー（Ｐ−１）： 5'-CGTTCGAAGCTATGCTTTTGCAAGCTTTCCT-3' （配列表配列番号６） アンチセンスプライマー（ＳＵＣ２／ＣＨ−Ｍ１）： 5'-CTTGCATTCTGTGCCCCCGATGATTGCAGATATTTTGGCTGC-3' （配列表配列番号７） ＰＣＲ反応液組成： ｐＫＭ０４１（１ｎｇ／μＬ） １μＬ Ｐ−１（５８．７μＭ） ２μＬ ＳＵＣ２／ＣＨ−Ｍ１（６５．９μＭ） １μＬ １０×ＰＣＲバッファー¹⁾ １０μＬ ｄＮＴＰｓ¹⁾ ８μＬＴａｑＤＮＡポリメラーゼ¹⁾ １μＬ 蒸留水で全量１００μＬとする¹⁾ PCR amprification kit （宝酒造）に添付の試薬を使
用 反応条件： 初回変性： ９４℃，３分 変性： ９４℃，１分 アニーリング： ５０℃，１分 （３０サイクル） 伸張： ７２℃，３０秒 最終伸張： ７２℃，７分

【００２９】（４）シグナルコドンとプロヒトキマーゼ
ＤＮＡの接合部の合成 アンチセンスプライマーとして、ＳＵＣ２／ＣＨ−Ｍ１
の代わりに、ＳＵＣ２シグナルコドンの３’側配列およ
びプロヒトキマーゼＤＮＡの５’側部分配列（制限酵素
ＢｓｍＩ切断部位を含む）の相補鎖ＤＮＡ配列を有する
オリゴヌクレオチドＳＵＣ２／ＣＨ−Ｐ１（配列表配列
番号８）を用いる以外は上記（３）と同様にして、ＳＵ
Ｃ２シグナルコドンおよびプロヒトキマーゼＤＮＡの
５’側部分配列を含む９８ｂｐのＤＮＡ断片を調製し
た。 ＳＵＣ２／ＣＨ−Ｐ１： 5'-CTTGCATTCTGTGCCCCCGATGATCTCCCCTGCAGATATTTTGGCTGC-3' （配列表配列番号８）

【００３０】（５）シグナルコドン／ヒトキマーゼＤＮ
Ａカセットの構築 上記（３）で得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｓｕＩＩ
およびＢｓｍＩで消化して得た８５ｂｐのＤＮＡ断片
を、同じくＡｓｕＩＩおよびＢｓｍＩで消化したｐＳＵ
０１１の３８１４ｂｐ断片とライゲーションさせて、Ｓ
ＵＣ２シグナルコドンの下流に成熟ヒトキマーゼＤＮＡ
が連結されたｐＨＮ００２（３８９９ｂｐ）を得た。ま
た、上記（４）で得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ａｓｕ
ＩＩおよびＢｓｍＩで消化して得た９１ｂｐのＤＮＡ断
片を同様に処理して、ＳＵＣ２シグナルコドンの下流に
プロヒトキマーゼＤＮＡが連結されたｐＨＮ００１（３
９０５ｂｐ）を得た（ここまでの構築の概略を図１に示
す）。

【００３１】（６）シグナルコドン／ヒトキマーゼＤＮ
Ａカセットの酵母用発現ベクターへのクローニング ｐＨＮ００１およびｐＨＮ００２をそれぞれＡｓｕＩＩ
消化およびＢａｍＨＩ部分消化して、ＳＵＣ２シグナル
コドンおよびプロヒトキマーゼＤＮＡを有する７５６ｂ
ｐ断片、並びにＳＵＣ２シグナルコドンおよび成熟ヒト
キマーゼＤＮＡを有する７５０ｂｐ断片を回収し、これ
らをそれぞれ、ｍＡＯＸ２プロモーター、ＡＯＸ１ター
ミネーターおよび選択マーカー遺伝子としてＨＩＳ４遺
伝子を有するプラスミドｐＹＩ０７０（特開平６−１８
９７６９号）のＡＳｕＩＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入し、
プロヒトキマーゼＤＮＡを含有する酵母用分泌発現ベク
ターｐＨＮ００３および成熟ヒトキマーゼＤＮＡを含有
する酵母用分泌発現ベクターｐＨＮ００４を構築した
（図２）。

【００３２】実施例２ Ｐ．パストリス形質転換株によ
る活性ヒトキマーゼの分泌発現 （１）Ｐ．パストリスの形質転換 市販のイースト・トランスフォーメーション・キット
（ＢＩＯ１０１，ＩＮＣ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ；ア
ルカリ−カチオン法）を用いて、Ｐ．パストリスＧＴＳ
１１５株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０８６４）を、実施例１
で得られたｐＨＮ００３およびｐＨＮ００４でそれぞれ
形質転換した。各プラスミドはＳａｌＩ消化で線状化し
て実験に供した。以下、各形質転換株は「ＧＴＳ１１５
（導入したプラスミド名）株」と称するものとする。

【００３３】（２）形質転換株の培養 ３００ｍＬのバッフル付き三角フラスコ中に３０ｍＬの
天然培地［３×ＹＰ，２％ＭｅＯＨ培地；３％ 酵母エ
キス（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂ．：０１２７−１７−９），
６％ ペプトン（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂ．：０１１８−１
７−０），２％メタノール（ナカライテスク：２１９−
１５）］を入れ、上記（１）で得られた各Ｐ．パストリ
ス形質転換株を植菌し、１２０ｒｐｍ、３０℃で３日間
培養した。

【００３４】（３）培養上清のウェスタンブロット分析 培養終了後、培養物を低速遠心処理して培養上清を回収
した。該上清各２５ｍＬを０．２２μｍのフィルターで
濾過滅菌した後、セントリプレップ−１０で濃縮した。
濃縮標品１５μＬに０．３Ｍ クエン酸／リン酸（ｐＨ
５．０）２０μＬを加え、さらに０．５Ｕ／ｍＬ エン
ドグリコシダーゼＨ（生化学工業製；Ｃｏｄｅ Ｎｏ．
１００４６５）５μＬを加えて軽く攪拌後、３７℃で一
夜インキュベートした。糖鎖除去酵素処理および未処理
の濃縮標品をそれぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動により分離した。各標品に１／３容量のサンプルバ
ッファー［２５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ６．８），２
％ ＳＤＳ，１０％ グリセロール，５％ メルカプト
エタノール，０．００１％ ブロモフェノールブルー］
を加えて１００℃で５分間インキュベートした後、プレ
ステインド分子量マーカー（低レンジ；バイオラッド
社）とともに、１５〜２５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
（マルチゲル１５／２０；第一化学薬品（株））中、定
電流（４０ｍＡ）下に約１時間電気泳動した。泳動終了
後、分離標品を２５ｍＭ トリス，１９２ｍＭ グリシ
ン，２０％ メタノール中、定電流（１８０ｍＡ）下に
約１時間かけてＰＶＤＦ膜（ミリポア社）上にエレクト
ロブロッティングした。ブロッティング終了後、ＡＢＣ
キット（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ Ｉ
ＮＣ．）を用いて添付のプロトコールに準拠してウェス
タンブロット分析を行った。一次抗体として、ウサギ抗
ヒトキマーゼ血清［Urata ら，J. Biol. Chem., 266:17
173-17179 (1991) ］を０．９％ ＮａＣｌ，０．１５
％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＴＢＳ）および０．
１％ ＮａＮ₃ を含む１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で５００倍希釈して用いた。また、二次
抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウ
サギＩｇＧ（バイオラッド；カタログＮｏ．１７０−６
５１５，コントロールＮｏ．３２８３１）を使用時にＴ
ＴＢＳで２０００倍希釈して用いた。ＰＶＤＦ膜をブロ
ッキング試薬（正常ヤギ血清を溶解したＴＴＢＳ）に３
０分間浸漬・振とうした後、一次抗体溶液中、室温で一
夜インキュベートした。膜をＴＴＢＳ中、室温で約１０
分間浸漬・振とうして洗浄した（３回）後、二次抗体溶
液中、室温で３０分間浸漬・振とうして反応させた。膜
をＴＴＢＳ中、室温で約１０分間浸漬・振とうして洗浄
した（３回）後、化学発光法（ＲＥＮＡＩＳＳＡＮＣ
Ｅ；ＮＥＮ／ＤｕＰｏｎｔ）により抗ヒトキマーゼ抗体
と交叉反応した物質を検出した。その結果、エンドグリ
コシダーゼＨ未処理の培養上清では、ＧＴＳ１１５（ｐ
ＨＮ００３）株、ＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）株の両
方で３５〜４０ｋＤのスメアなバンドが検出された。一
方、エンドグリコシダーゼＨ処理した場合、ＧＴＳ１１
５（ｐＨＮ００３）株の培養上清では、スメアなバンド
は消失し、糖鎖除去したヒトキマーゼ標品よりやや遅い
移動度を示すバンドが検出されたのに対し、ＧＴＳ１１
５（ｐＨＮ００４）株の培養上清では、スメアなバンド
が同様に消失し、糖鎖除去したヒトキマーゼ標品と同じ
移動度を示すバンドが検出された。すなわち、ＧＴＳ１
１５（ｐＨＮ００３）株はプロヒトキマーゼを、また、
ＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）株は成熟ヒトキマーゼを
培養上清中に分泌していることが強く示唆された。糖鎖
除去酵素未処理の場合にみられるスメアなバンドは、糖
鎖付加の不均一性によるものと推測される。尚、ウェス
タンブロットの結果、糖鎖除去酵素処理により移動度が
変化しない複数のバンドが両方の形質転換株で検出され
たが、これらはヒトキマーゼの発現に伴う一部の菌体融
解により培養上清中に放出された内因性の菌体内タンパ
ク質であることが、ＧＴＳ１１５非形質転換株の菌体内
タンパク質の分析により確認された。

【００３５】また、ｐＨＮ００４のＳＵＣ２シグナルコ
ドン領域をＭＦ−αシグナルコドン（特開昭５９−１３
２８９２号）に置換したプラスミドｐＳＵ０１３で形質
転換されたＰ．パストリスＧＴＳ１１５株について同様
の実験を行ったところ、エンドグリコシダーゼＨ未処理
の場合、泳動レーン全体に拡がるスメアなバンドが検出
され、ＭＦ−αシグナルコドンを分泌シグナルとして用
いた場合、ＳＵＣ２シグナルに比して糖鎖付加の不均一
性が増すことがわかった。さらに、ＡＯＸ１プロモータ
ー（特開昭６３−３９５８４号）の制御下にＳＵＣ２シ
グナル／プロヒトキマーゼおよびＳＵＣ２シグナル／成
熟ヒトキマーゼをそれぞれ発現するプラスミドｐＫＭ１
０４およびｐＫＭ１０５で形質転換したＰ．パストリス
ＧＴＳ１１５株について同様の実験を行ったところ、Ａ
ＯＸ１プロモーターはｍＡＯＸ２プロモーターに比して
ヒトキマーゼの発現効率が低いことが示された。したが
って、ヒトキマーゼの効率的な分泌発現には、ＳＵＣ２
シグナルコドンおよびｍＡＯＸ２プロモーターを有する
酵母分泌発現ベクターの使用が好ましいことが示唆され
た。しかしながら、ＡＯＸ１プロモーターを用いた場
合、抗ヒトキマーゼポリクローナル抗体と交叉反応する
宿主内因性タンパク質の発現量も少ないことから、ヒト
キマーゼの精製を考慮すれば、ＡＯＸ１プロモーターの
使用もまた有用である。

【００３６】（４）培養上清分画液のヒトキマーゼ活性 ＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）株の培養上清を０．２２
μｍのフィルターで濾過した後、セントリプレップ−１
０で約１０倍に濃縮した。該濃縮標品約３ｍＬ（２．３
７ｍｇタンパク質）をセファデックスＧ−７５カラム
（φ２．５ｃｍ，長さ４７ｃｍ）に添加し、２０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）／２Ｍ ＫＣｌ緩衝液（流速
０．１８３ｍＬ／分，４℃）で溶出させて、溶出液を約
３ｍＬずつ分取した。各分画液１２５μＬを９６穴マイ
クロタイタープレートにとり、０．２５Ｍ トリス塩酸
（ｐＨ９．０）１００μＬおよび２５ｍＭ Ｓｕｃ−Ａ
ＡＰＦ−ｐＮＡ（ヒトキマーゼの合成基質であるペプチ
ド誘導体；Ｓｉｇｍａ社，Ｓ７３８８）２５μＬを加え
て３７℃で４０分間反応させた後、４０５ｎｍの波長に
対する吸光度を測定して該合成基質の水解活性（ヒトキ
マーゼ活性）を調べた。各分画液中のタンパク量はブラ
ッドフォード法により５９５ｎｍでの吸光度を測定して
求めた。その結果を図３に示す。合成基質の水解活性は
ボイド（分離支持体の分画範囲外の物質溶出位置）より
やや遅れて溶出したが、主ピーク（ｐｅａｋ２）とそれ
に先立つショルダーピーク（ｐｅａｋ１）からなる二相
性を呈した。各分画液３００μＬをニトロセルロース膜
（Ｈｙｂｏｎｄ^TM−Ｃ Ｅｘｔｒａ，カタログＮｏ．Ｒ
ＰＮ．８２Ｅ．，ロット番号７０７７８；アマシャム）
上にブロッティングし、固定後上記のウェスタンブロッ
ト分析と同様の方法により、抗ヒトキマーゼ抗体と交叉
反応させたところ、ショルダーピークと一致する分画液
中に抗ヒトキマーゼ抗体と交叉反応する物質が同定され
たことから、該ショルダーピークが発現・分泌したヒト
キマーゼであることが示唆された。

【００３７】実施例３ Ｐ．パストリス形質転換株培養
物における成熟ヒトキマーゼの分布 （１）菌体内発現ヒトキマーゼの調製（可溶化・再生） ＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）株を３×ＹＰ，２％Ｍｅ
ＯＨ培地中、３０℃、１２０ｒｐｍで３日間培養した
後、４℃、２０００×ｇにて遠心し、培養上清および培
養菌体をそれぞれ回収した。培養上清は実施例２の
（３）と同様の方法により濃縮標品とした。菌体は、培
地の１／２容量の１．２Ｍ ソルビトールを含む５０ｍ
Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁し、
４℃、２０００×ｇにて遠心した。次いで菌体を培地の
１／６容量の細胞壁分解酵素溶液（１．２Ｍ ソルビト
ール，１４ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび０．
３ｍｇ／ｍＬ チモラーゼＴ−１００を含む５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁し、３０
℃で６０分間インキュベートした後、遠心して菌体を回
収し、１．２Ｍ ソルビトールを含む５０ｍＭ リン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で２回洗浄してプロト
プラストを単離した。該プロトプラストを２つに分け、
一方を培地の１／１５〜１／２０容量の可溶化剤溶液
（６Ｍ 塩酸グアニジンを含む５０ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ８．０））で溶解し、遠心して上清を回収した
（非浸透圧ショック可溶化画分）。もう一方は、１／１
０容量の低張液（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
を含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８））を加え
て激しく攪拌した後、氷中に１〜２時間静置して細胞を
破砕した（浸透圧ショック）。これを遠心して上清（浸
透圧ショック可溶性画分）および沈澱をそれぞれ回収
し、沈澱は上記の可溶化剤溶液で溶解して４℃で２４時
間以上放置した。４℃、１４，３００×ｇで３０分間遠
心して上清を回収した。該上清および上記非浸透圧ショ
ック可溶化画分をそれぞれ透析チューブ（８／３２セロ
ファン−チュービング シームレス；Ｕｎｉｏｎ Ｃａ
ｒｂｉｄｅ Ｃｏ．）に移し、１０倍容量の再生溶液
（０．５Ｍ 塩酸グアニジン，０．３Ｍ アルギニン，
５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン，
２ｍＭ 還元型グルタチオンおよび０．００５％ Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００）に対して４℃で６〜８時間透析
を行い、さらに、１０ｍＭ アルギニンおよび０．５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む２×ＰＢＳ（−）に対して４℃で２
４時間以上透析を行った。透析終了後、チューブの内容
物を４℃、１４，３００×ｇにて３０分間遠心して上清
を回収し、それぞれ浸透圧ショック可溶化・再生画分お
よび非浸透圧ショック可溶化・再生画分とした。

【００３８】（２）ウェスタンブロット分析 上記（１）にて調製された培養上清濃縮標品、非浸透圧
ショック可溶化・再生画分、浸透圧ショック可溶性画分
および浸透圧ショック可溶化・再生画分をそれぞれ２つ
に分け、一方は、実施例２の（３）に記載される方法に
よりエンドグリコシダーゼＨ処理した。各標品について
実施例２の（３）と同様の方法でウェスタンブロット分
析を行った。その結果、培養上清には、成熟ヒトキマー
ゼに相当するバンドがほとんど認められなかったのに対
し、非浸透圧ショック可溶化・再生画分および浸透圧シ
ョック可溶化・再生画分には、糖鎖除去酵素未処理で３
５〜４０ｋＤのスメアなバンドがはっきり観察され、糖
鎖除去後にはこのバンドは消失して、成熟ヒトキマーゼ
標品と同じ移動度を示すバンドが検出された。一方、浸
透圧ショック可溶性画分には、抗ヒトキマーゼポリクロ
ーナル抗体と交叉反応する多数の菌体内タンパク質のバ
ンドが検出されたが、成熟ヒトキマーゼに相当するバン
ドは検出されなかった。尚、可溶化・再生処理後の不溶
性画分についても界面活性剤存在下で可溶化し、組換え
Ｎ−グリカナーゼ（ＴａＫａＲａ；ロットＮｏ．Ｂ−４
２４７）で処理して同様にウェスタンブロットを行った
が、成熟ヒトキマーゼに相当するバンドは検出されなか
った。したがって、６Ｍ塩酸グアニジンにより菌体内発
現成熟ヒトキマーゼは完全に可溶化され、他の抗ヒトキ
マーゼ抗体と交叉反応性を有する宿主内因性タンパク質
は可溶化・再生の過程で他の画分に分離除去されること
が示された。

【００３９】（３）ヒトキマーゼ活性の分布 ＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）株およびＧＴＳ１１５非
形質転換株から上記（１）の方法により調製した菌体内
タンパク質の浸透圧ショック可溶化・再生画分および培
養上清濃縮標品各５０μＬを９６穴マイクロタイタープ
レートに入れ、０．２５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ９．０）
５０μＬおよび２５ｍＭ Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ２
５μＬを加えて攪拌後、３７℃でインキュベートし、１
００％氷酢酸１２５μＬを加えて反応を停止させ波長４
０５ｎｍの吸収を測定した。測定値を下式に代入して各
標品中のヒトキマーゼタンパク量を算出した。

【００４０】

【数１】

【００４１】その結果を図４に示す。ＧＴＳ１１５（ｐ
ＨＮ００４）株の菌体内タンパク質浸透圧ショック可溶
化・再生画分の合成基質水解活性は、培養上清濃縮標品
の活性の約１３倍であった。したがって、本宿主−ベク
ター系を利用する場合には、培養上清中に分泌されるよ
りも菌体内に蓄積される成熟ヒトキマーゼの割合が著し
く高いことが明らかとなった。

【００４２】（３）ヘパリンセファロースカラムクロマ
トグラフィーによる活性ヒトキマーゼの精製 ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（コードＮｏ．１７−
０４６７−０１；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）約４０ｍＬをφ
２．５ｃｍ×１０ｃｍカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｅｃｏ
ｎｏ ｃｏｌｕｍｎ）に詰め、２０ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ８．０）で平衡化した後、透析法により２０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）（第１バッファー）に対し
て平衡化したＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）株の菌体内
タンパク質浸透圧ショック可溶化・再生画分を添加して
吸着させた。該カラムを、カラム容量の５倍以上の第１
バッファーで洗浄した後、０〜１．８Ｍ ＫＣｌの直線
グラジエントをかけて吸着画分の溶出を行った。吸着お
よび溶出操作は４℃で行った。溶出した各画分について
実施例２の（４）の方法と同様にして合成基質水解活性
を測定したところ、図５に示すように２つの活性のピー
クが観察され、それぞれの溶出時のＫＣｌ濃度は約０．
６Ｍ（ｐｅａｋ１）および約０．７Ｍ（ｐｅａｋ２）で
あった。尚、培養上清中の合成基質水解活性を同様にヘ
パリンカラムで精製した場合、抗ヒトキマーゼ抗体と交
叉反応する合成基質水解活性はＫＣｌ濃度０．７〜０．
８Ｍで溶出した。後記試験例で２つのピークに含まれる
ヒトキマーゼ様物質の性質はいずれも天然のヒトキマー
ゼとよく一致することが示されることおよび２つのピー
クの量比が同一培養バッチを用いても可溶化・再生処理
ごとに変動することを考慮すると、両者の違いは可溶化
・再生処理過程での何らかの原因、例えば、プロトプラ
スト調製時の還元剤の残存により再生時にジスルフィド
結合が部分的に解離し、３次構造にずれを生じたことな
どが考えられる。培養上清から得られる合成基質水解活
性画分との相関から、後出の（約０．７ＭＫＣｌで溶出
する）合成基質水解活性画分が完全な活性ヒトキマーゼ
であることが示唆される。

【００４３】試験例１ ヘパリン親和性合成基質水解活
性を有する画分の解析 （１）銀染色およびウェスタンブロット分析 実施例３の（３）で得られた２つのヘパリン親和性合成
基質水解活性を有する画分をそれぞれ２つに分け、一方
は実施例２の（３）と同様の方法でウェスタンブロット
分析を行った。もう一方は、実施例２の（３）と同様に
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、市販の銀染色キット（和
光純薬工業（株）；銀染色キットワコー，２９１−５０
３０１）を用いて、添付のプロトコールにしたがって染
色した。それぞれの分析を還元条件下および非還元条件
下について実施した。その結果、銀染色では、還元条件
下および非還元条件下のいずれにおいても、ｐｅａｋ１
およびｐｅａｋ２の両方で成熟ヒトキマーゼに相当する
約３７ｋＤのバンドが観察され、ウェスタンブロットの
結果、このバンドは抗ヒトキマーゼ抗体と強い交叉反応
性を示した。タンパク量としてはｐｅａｋ１の方が高か
った。ｐｅａｋ２の方が合成基質水解活性が高いことを
考慮すると、ｐｅａｋ２に存在するヒトキマーゼの方が
比活性が高いものと推定される。またｐｅａｋ１では、
さらに低分子量域に多数のバンドが観察され、それらの
一部はウェスタンブロットの結果、抗ヒトキマーゼ抗体
と交叉反応した。ｐｅａｋ２にはこのような低分子のバ
ンドは検出されなかった。

【００４４】（２）ヒトキマーゼ活性のＫｍ値 実施例３の（３）で得られた２つのヘパリン親和性合成
基質水解活性を有する画分のヒトキマーゼ活性Ｋｍ値
を、合成基質水解活性を指標として測定した。０．１４
ｍＭ アンチパイン（ペプチド研究所；コードＮｏ．４
０６２）を含む反応バッファー（０．１Ｍ Ｎａ₂ Ｂ₄
Ｏ₇ ，０．０５Ｍ ＫＨ₂ ＰＯ₄ および０．１％ Ｔｗ
ｅｅｎ ８０）３４５μＬ、５％ ＢＳＡ５０μＬ、各
種濃度のＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ５０μＬおよび１０
ｍＭ キモスタチン５μＬを小試験管中で混合後、酵素
液５０μＬを加え、室温で反応を開始した。反応開始直
後に反応液を吸光度測定用キュベットに移し、３０秒ご
とに波長４０５ｎｍの吸収を測定した。その結果、ｐｅ
ａｋ１および２の合成基質に対するＫｍ値はそれぞれ
４．８３ｍＭおよび５．９３ｍＭと算出され、ヒトキマ
ーゼのそれとよく一致した。

【００４５】（３）アミノ末端のアミノ酸分析 ＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）株菌体内タンパク質の可
溶化・再生画分の濃縮標品約９４μｇを室温で遠心・乾
固後、Ｎ−グリカナーゼで糖鎖除去処理を行った。脱糖
鎖処理後、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦ
膜上へのトランスファーを行い、膜を染色した後風乾
し、膜上のバンドを切り出して、常用のアミノ酸分析に
供した。Ｎ末端より６残基までの同定を行った結果、Ｉ
ＩＧＧＴ（Ｄ／Ｅ）（配列表配列番号９）であり、報告
されている成熟ヒトキマーゼのＮ末端配列ＩＩＧＧＴＥ
（配列表配列番号１０）とよく一致した。

【００４６】（４）各種阻害剤に対する感受性 ＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）株菌体内タンパク質の可
溶化・再生画分の濃縮標品１０μＬ、各阻害剤１μＬ、
蒸留水２９μＬおよび６０μＬの反応バッファー（２Ｍ
ＫＣｌおよび０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を
含む４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０））を混合後、３
０℃で３０分間インキュベートし、次いで、２５ｍＭ
Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ２０μＬを加えて３７℃で３
０分間反応させた後、氷酢酸１００μＬを加えて反応を
停止させて波長４０５ｎｍの吸収を測定した。その結
果、セリンプロテアーゼ阻害剤では、１μＭ 大豆トリ
プシンインヒビター、１００μＭキモスタチン、１ｍＭ
ＰＭＳＦでほぼ完全に合成基質水解活性が阻害され
た。ジイソプロピルフルオロリン酸、ｐ−トルエンスル
フォニル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、
ｐ−トルエンスルフォニル−Ｌ−リジンクロロメチルケ
トンにも阻害傾向が観察されたが１ｍＭ存在下でも完全
に活性を阻害できなかった。また、アプロチニンには阻
害活性が認められなかった。セリンプロテアーゼ以外の
阻害剤では、高濃度のｏ−フェナントロリン、カプトリ
ール、Ｎ−メチルマレイミドに阻害傾向が観察された
が、ペプスタチンＡ、ＥＤＴＡ、ＰＣＭＢ、ロイペプチ
ンおよびインドール酢酸には阻害活性は観察されなかっ
た。これらの阻害剤に対する感受性は、Urata ら，J. B
iol.Chem., 265: 22348-22357 (1990) において精製ヒ
ト心臓キマーゼについて報告されている傾向とほぼ一致
するものであった。

【００４７】（５）酵素活性の至適ｐＨ ＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）株菌体内タンパク質の可
溶化・再生画分の濃縮標品を用い、キモスタチン存在下
および非存在下での生理的基質であるアンジオテンシン
ＩをアンジオテンシンIIに変換する活性を指標として、
ヒトキマーゼ活性に対する至適ｐＨを調べた。活性の測
定は、Urata ら［J. Biol. Chem., 265:22348-22357 (1
990) ］の方法に準じて行った。その結果、最大活性は
ｐＨ９において得られた。これはUrata らの報告とよく
一致するものであった。

【００４８】

【発明の効果】本発明の活性ヒトキマーゼの製造方法に
よれば、プロ配列の切断処理工程を経ずに活性型のヒト
キマーゼを取得できるので、ヒトキマーゼの安価で簡便
な商業的生産を可能にする点で極めて有用である。

【００４９】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴 存在位置：1..24 他の情報：配列番号 3に示される塩基配列中、塩基番号
1〜24で示される配列と同一である。 配列 AGCCTCTCTG GGAAGATGCT GCTT 24

【００５０】配列番号：2 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴 存在位置：1..25 他の情報：配列番号 4に示される塩基配列中、塩基番号
745〜 769で示される配列の相補鎖配列と同一である。 配列 GGATCCAGGA TTAATTTGCC TGCAG 25

【００５１】配列番号：3 配列の長さ：226 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..226 配列 Ile Ile Gly Gly Thr Glu Cys Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Glu Ile Val Thr Ser Asn Gly Pro Ser Lys Phe Cys Gly Gly 20 25 30 Phe Leu Ile Arg Arg Asn Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ala Gly 35 40 45 Arg Ser Ile Thr Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Thr Glu Glu Glu 50 55 60 Asp Thr Trp Gln Lys Leu Glu Val Ile Lys Gln Phe Arg His Pro Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Thr Ser Thr Leu His His Asp Ile Met Leu Leu Lys Leu Lys 85 90 95 Glu Lys Ala Ser Leu Thr Leu Ala Val Gly Thr Leu Pro Phe Pro Ser 100 105 110 Gln Phe Asn Phe Val Pro Pro Gly Arg Met Cys Arg Val Ala Gly Trp 115 120 125 Gly Arg Thr Gly Val Leu Lys Pro Gly Ser Asp Thr Leu Gln Glu Val 130 135 140 Lys Leu Arg Leu Met Asp Pro Gln Ala Cys Ser His Phe Arg Asp Phe 145 150 155 160 Asp His Asn Leu Gln Leu Cys Val Gly Asn Pro Arg Lys Thr Lys Ser 165 170 175 Ala Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Ala Gly Val Ala 180 185 190 Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Ser Asp Ala Lys Pro Pro Ala Val 195 200 205 Phe Thr Arg Ile Ser His Tyr Arg Pro Trp Ile Asn Gln Ile Leu Gln 210 215 220 Ala Asn 225

【００５２】配列番号：4 配列の長さ：769 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：16..759 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：16..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：79..756 特徴を決定した方法：S 存在位置：73..78 他の情報：プロ配列コード領域 配列 AGCCTCTCTG GGAAG ATG CTG CTT CTT CCT CTC CCC CTG CTG CTC TTT CTC 51 Met Leu Leu Leu Pro Leu Pro Leu Leu Leu Phe Leu -20 -15 -10 TTG TGC TCC AGA GCT GAA GCT GGG GAG ATC ATC GGG GGC ACA GAA TGC 99 Leu Cys Ser Arg Ala Glu Ala Gly Glu Ile Ile Gly Gly Thr Glu Cys -5 1 5 AAG CCA CAT TCC CGC CCC TAC ATG GCC TAC CTG GAA ATT GTA ACT TCC 147 Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Glu Ile Val Thr Ser 10 15 20 AAC GGT CCC TCA AAA TTT TGT GGT GGT TTC CTT ATA AGA CGG AAC TTT 195 Asn Gly Pro Ser Lys Phe Cys Gly Gly Phe Leu Ile Arg Arg Asn Phe 25 30 35 GTG CTG ACG GCT GCT CAT TGT GCA GGA AGG TCT ATA ACA GTC ACC CTT 243 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ala Gly Arg Ser Ile Thr Val Thr Leu 40 45 50 55 GGA GCC CAT AAC ATA ACA GAG GAA GAA GAC ACA TGG CAG AAG CTT GAG 291 Gly Ala His Asn Ile Thr Glu Glu Glu Asp Thr Trp Gln Lys Leu Glu 60 65 70 GTT ATA AAG CAA TTC CGT CAT CCA AAA TAT AAC ACT TCT ACT CTT CAC 339 Val Ile Lys Gln Phe Arg His Pro Lys Tyr Asn Thr Ser Thr Leu His 75 80 85 CAC GAT ATC ATG TTA CTA AAG TTG AAG GAG AAA GCC AGC CTG ACC CTG 387 His Asp Ile Met Leu Leu Lys Leu Lys Glu Lys Ala Ser Leu Thr Leu 90 95 100 GCT GTG GGG ACA CTC CCC TTC CCA TCA CAA TTC AAC TTT GTC CCA CCT 435 Ala Val Gly Thr Leu Pro Phe Pro Ser Gln Phe Asn Phe Val Pro Pro 105 110 115 GGG AGA ATG TGC CGG GTG GCT GGC TGG GGA AGA ACA GGT GTG TTG AAG 483 Gly Arg Met Cys Arg Val Ala Gly Trp Gly Arg Thr Gly Val Leu Lys 120 125 130 135 CCG GGC TCA GAC ACT CTG CAA GAG GTG AAG CTG AGA CTC ATG GAT CCC 531 Pro Gly Ser Asp Thr Leu Gln Glu Val Lys Leu Arg Leu Met Asp Pro 140 145 150 CAG GCC TGC AGC CAC TTC AGA GAC TTT GAC CAC AAT CTT CAG CTG TGT 579 Gln Ala Cys Ser His Phe Arg Asp Phe Asp His Asn Leu Gln Leu Cys 155 160 165 GTG GGC AAT CCC AGG AAG ACA AAA TCT GCA TTT AAG GGA GAC TCT GGG 627 Val Gly Asn Pro Arg Lys Thr Lys Ser Ala Phe Lys Gly Asp Ser Gly 170 175 180 GGC CCT CTT CTG TGT GCT GGG GTG GCC CAG GGC ATC GTA TCC TAT GGA 675 Gly Pro Leu Leu Cys Ala Gly Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly 185 190 195 CGG TCG GAT GCA AAG CCC CCT GCT GTC TTC ACC CGA ATC TCC CAT TAC 723 Arg Ser Asp Ala Lys Pro Pro Ala Val Phe Thr Arg Ile Ser His Tyr 200 205 210 215 CGG CCC TGG ATC AAC CAG ATC CTG CAG GCA AAT TAATCCTGGA TCC 769 Arg Pro Trp Ile Asn Gln Ile Leu Gln Ala Asn 220 225

【００５３】配列番号：5 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴 存在位置：1..51 他の情報：サッカロマイセス・セレビシエ由来ＳＵＣ２
遺伝子の翻訳開始コドンから数えて第25番目のコドン〜
第41番目のコドンまでのＤＮＡ配列と同一である。 配列 ACTAGCGATA GACCTTTGGT CCACTTCACA CCCAACAAGG GCTGGATGAA T 51

【００５４】配列番号：6 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 存在位置：3..8 他の情報：制限酵素AsuII 切断部位 存在位置：12..31 他の情報：サッカロマイセス・セレビシエ由来ＳＵＣ２
遺伝子のシグナルペプチドコード領域の第 1番目〜第17
番目の塩基配列と同一である。 配列 CGTTCGAAGC TATGCTTTTG CAAGCTTTCC T 31

【００５５】配列番号：7 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 存在位置：1..24 他の情報：配列番号 4に示される塩基配列中、塩基番号
79〜 102で示される配列の相補鎖配列と同一である。 存在位置：3..9 他の情報：制限酵素BsmI切断部位 存在位置：25..42 他の情報：サッカロマイセス・セレビシエ由来ＳＵＣ２
遺伝子のシグナルペプチドコード領域の3'末端から数え
て18塩基までの配列の相補鎖配列と同一である。 配列 CTTGCATTCT GTGCCCCCGA TGATTGCAGA TATTTTGGCT GC 42

【００５６】配列番号：8 配列の長さ：48 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴 存在位置：1..30 他の情報：配列番号 4に示される塩基配列中、塩基番号
73〜 102で示される配列の相補鎖配列と同一である。 存在位置：3..9 他の情報：制限酵素BsmI切断部位 存在位置：31..48 他の情報：サッカロマイセス・セレビシエ由来ＳＵＣ２
遺伝子のシグナルペプチドコード領域の3'末端から数え
て18塩基までの配列の相補鎖配列と同一である。 配列 CTTGCATTCT GTGCCCCCGA TGATCTCCCC TGCAGATATT TTGGCTGC 48

【００５７】配列番号：9 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列の特徴 他の情報：Xaa はAsp またはGLu

【００５８】配列番号：10 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント

【図面の簡単な説明】

【図１】プロヒトキマーゼＤＮＡおよび成熟ヒトキマー
ゼＤＮＡをそれぞれＳＵＣ２シグナルコドンの下流に連
結したカセットを有するクローニングベクターｐＨＮ０
０１およびｐＨＮ００２の構築の工程図である。

【図２】プロヒトキマーゼＤＮＡおよび成熟ヒトキマー
ゼＤＮＡをそれぞれＳＵＣ２シグナルコドンの下流に連
結したカセットを有する分泌発現ベクターｐＨＮ００３
およびｐＨＮ００４の物理的地図である。

【図３】Ｐ．パストリスＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）
株の培養上清のゲル濾過クロマトグラフィーの溶出曲線
を示す図である。□は合成基質水解活性、◇はタンパク
量を示している。

【図４】Ｐ．パストリスＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）
株およびＰ．パストリスＧＴＳ１１５非形質転換株の培
養上清濃縮標品および菌体内タンパク質可溶化・再生画
分の合成基質水解活性を示す図である。培養物１ｍＬか
ら得られる培養上清および培養菌体内タンパク質可溶化
・再生画分中の酵素活性をｍＵ数で表している（但し、
１単位は、１分間あたりにＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡが
加水分解されて生成するパラニトロアニリンのμｍｏｌ
数である）。

【図５】Ｐ．パストリスＧＴＳ１１５（ｐＨＮ００４）
株の菌体内タンパク質可溶化・再生画分のヘパリンセフ
ァロースカラムクロマトグラフィーの溶出曲線を示す図
である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 村上 弘次 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 成熟ヒトキマーゼをコードするＤＮＡを
   含有する酵母用分泌発現ベクターで形質転換された酵母
   宿主を培養し、得られる培養物から活性ヒトキマーゼを
   採取することを特徴とする活性ヒトキマーゼの製造方
   法。
2. 【請求項２】 成熟ヒトキマーゼが以下の（ａ）または
   （ｂ）のタンパク質である請求項１記載の活性ヒトキマ
   ーゼの製造方法。 （ａ）配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列からな
   るタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において少なくとも１個のア
   ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
   らなり、且つヒトキマーゼ活性を有するタンパク質
3. 【請求項３】 培養物から活性ヒトキマーゼを採取する
   方法が、培養菌体内タンパク質の可溶化・再生を含むこ
   とを特徴とする請求項１または２記載の活性ヒトキマー
   ゼの製造方法。
4. 【請求項４】 酵母用分泌発現ベクターが、パン酵母由
   来のＳＵＣ２シグナルコドンを含むものである請求項１
   〜３のいずれかに記載の活性ヒトキマーゼの製造方法。
5. 【請求項５】 酵母宿主がピキア属に属する酵母である
   請求項１〜４のいずれかに記載の活性ヒトキマーゼの製
   造方法。
6. 【請求項６】 ヒトキマーゼをコードするＤＮＡを担持
   する酵母宿主由来として得ることができ、且つ分子量が
   約３５〜約４０ｋＤである活性な組換えヒトキマーゼ。
7. 【請求項７】 さらに、以下の（ａ）または（ｂ）のア
   ミノ酸配列からなることを特徴とする請求項６記載の活
   性な組換えヒトキマーゼ。 （ａ）配列表配列番号３に示されるアミノ酸配列 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において少なくとも１個のア
   ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれかに記載の方法に
   より得ることができる請求項６または７記載の活性な組
   換えヒトキマーゼ。