CZ297397A3 - DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL) - Google Patents
DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL) Download PDFInfo
- Publication number
- CZ297397A3 CZ297397A3 CZ972973A CZ297397A CZ297397A3 CZ 297397 A3 CZ297397 A3 CZ 297397A3 CZ 972973 A CZ972973 A CZ 972973A CZ 297397 A CZ297397 A CZ 297397A CZ 297397 A3 CZ297397 A3 CZ 297397A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ala
- gly
- thr
- wall
- leu
- Prior art date
Links
- 102100035687 Bile salt-activated lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 108010087173 bile salt-stimulated lipase Proteins 0.000 title abstract description 78
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 101000715643 Homo sapiens Bile salt-activated lipase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000052905 human CEL Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 101100244726 Pisum sativum PPF-1 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000001573 invertase Substances 0.000 claims description 5
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 101710130200 Bile salt-activated lipase Proteins 0.000 claims 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N 0.000 description 32
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 20
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 15
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 14
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 11
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 10
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 10
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 10
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 10
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 7
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 6
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N Trp-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C)C([O-])=O)=CNC2=C1 OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N 0.000 description 6
- LVFZXRQQQDTBQH-IRIUXVKKSA-N Tyr-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LVFZXRQQQDTBQH-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 6
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 6
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 6
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 5
- TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N Glu-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- LCNXZQROPKFGQK-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LCNXZQROPKFGQK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 5
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N Ala-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 4
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- QPOARHANPULOTM-GMOBBJLQSA-N Arg-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N QPOARHANPULOTM-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 4
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- IOTKDTZEEBZNCM-UGYAYLCHSA-N Asn-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOTKDTZEEBZNCM-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 4
- BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- MYVBTYXSWILFCG-BQBZGAKWSA-N Asn-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MYVBTYXSWILFCG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N Asn-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- OTKUAVXGMREHRX-CFMVVWHZSA-N Asp-Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OTKUAVXGMREHRX-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 4
- NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N Gly-Asp-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- HHSOPSCKAZKQHQ-PEXQALLHSA-N Gly-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)CN HHSOPSCKAZKQHQ-PEXQALLHSA-N 0.000 description 4
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 4
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- XENGULNPUDGALZ-ZPFDUUQYSA-N Ile-Asn-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N XENGULNPUDGALZ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 4
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 4
- PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N Leu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N 0.000 description 4
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 4
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 4
- LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- JYPITOUIQVSCKM-IHRRRGAJSA-N Met-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N JYPITOUIQVSCKM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LXVFHIBXOWJTKZ-BZSNNMDCSA-N Phe-Asn-Tyr Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O LXVFHIBXOWJTKZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 4
- ZLGQEBCCANLYRA-RYUDHWBXSA-N Phe-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZLGQEBCCANLYRA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 4
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N Phe-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 4
- FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N Phe-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N 0.000 description 4
- RZUOXAKGNHXZTB-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O RZUOXAKGNHXZTB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- GZBKRJVCRMZAST-XKBZYTNZSA-N Ser-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZBKRJVCRMZAST-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 4
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- JBHMLZSKIXMVFS-XVSYOHENSA-N Thr-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JBHMLZSKIXMVFS-XVSYOHENSA-N 0.000 description 4
- NCGUQWSJUKYCIT-SZZJOZGLSA-N Thr-His-Trp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O NCGUQWSJUKYCIT-SZZJOZGLSA-N 0.000 description 4
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 4
- QJIODPFLAASXJC-JHYOHUSXSA-N Thr-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O QJIODPFLAASXJC-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 4
- LXXCHJKHJYRMIY-FQPOAREZSA-N Thr-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LXXCHJKHJYRMIY-FQPOAREZSA-N 0.000 description 4
- GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N Tyr-Leu-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 4
- WDGDKHLSDIOXQC-ACRUOGEOSA-N Tyr-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WDGDKHLSDIOXQC-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 4
- KLQPIEVIKOQRAW-IZPVPAKOSA-N Tyr-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O KLQPIEVIKOQRAW-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 4
- MQUYPYFPHIPVHJ-MNSWYVGCSA-N Tyr-Trp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N)O MQUYPYFPHIPVHJ-MNSWYVGCSA-N 0.000 description 4
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 4
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 4
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 4
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 4
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 4
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 description 4
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N Ala-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- IFKQPMZRDQZSHI-GHCJXIJMSA-N Ala-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IFKQPMZRDQZSHI-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 3
- IHRGVZXPTIQNIP-NAKRPEOUSA-N Ala-Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](C)N IHRGVZXPTIQNIP-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 3
- VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N Ala-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N 0.000 description 3
- YNDLOUMBVDVALC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N YNDLOUMBVDVALC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- NYLBGYLHBDFRHL-VEVYYDQMSA-N Asp-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NYLBGYLHBDFRHL-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 3
- PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N Asp-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 3
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- BRRPVTUFESPTCP-ACZMJKKPSA-N Asp-Ser-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BRRPVTUFESPTCP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N Asp-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- YIDFBWRHIYOYAA-LKXGYXEUSA-N Asp-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YIDFBWRHIYOYAA-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 3
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 3
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 3
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N Gly-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- WZPIKDWQVRTATP-SYWGBEHUSA-N Ile-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 WZPIKDWQVRTATP-SYWGBEHUSA-N 0.000 description 3
- NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N Ile-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 3
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 3
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- PPHLBTXVBJNKOB-FDARSICLSA-N Met-Ile-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O PPHLBTXVBJNKOB-FDARSICLSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- OQPNSDWGAMFJNU-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Tyr Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OQPNSDWGAMFJNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- BKZYBLLIBOBOOW-GHCJXIJMSA-N Ser-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BKZYBLLIBOBOOW-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 3
- VIBXMCZWVUOZLA-OLHMAJIHSA-N Thr-Asn-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O VIBXMCZWVUOZLA-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 3
- YOSLMIPKOUAHKI-OLHMAJIHSA-N Thr-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YOSLMIPKOUAHKI-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 3
- JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N Thr-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 3
- ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 101100004044 Vigna radiata var. radiata AUX22B gene Proteins 0.000 description 3
- 108010058834 acylcarnitine hydrolase Proteins 0.000 description 3
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 2
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- VNFSAYFQLXPHPY-CIQUZCHMSA-N Ala-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNFSAYFQLXPHPY-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 2
- QOIGKCBMXUCDQU-KDXUFGMBSA-N Ala-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O QOIGKCBMXUCDQU-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 2
- DEAGTWNKODHUIY-MRFFXTKBSA-N Ala-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O DEAGTWNKODHUIY-MRFFXTKBSA-N 0.000 description 2
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008791 Antiaris toxicaria Species 0.000 description 2
- OSASDIVHOSJVII-WDSKDSINSA-N Arg-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OSASDIVHOSJVII-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 101150015280 Cel gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N Glu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 2
- SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N Glu-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- YVCGJPIKRMGNPA-LSJOCFKGSA-N His-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YVCGJPIKRMGNPA-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 2
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- URHJPNHRQMQGOZ-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O URHJPNHRQMQGOZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N Thr-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SHYYAQLDNVHPFT-DLOVCJGASA-N Ala-Asn-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SHYYAQLDNVHPFT-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- LZRNYBIJOSKKRJ-XVYDVKMFSA-N Ala-Asp-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N LZRNYBIJOSKKRJ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- GWFSQQNGMPGBEF-GHCJXIJMSA-N Ala-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N GWFSQQNGMPGBEF-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CCCCN PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- IGULQRCJLQQPSM-DCAQKATOSA-N Arg-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IGULQRCJLQQPSM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JOADBFCFJGNIKF-GUBZILKMSA-N Arg-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JOADBFCFJGNIKF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JYHIVHINLJUIEG-BVSLBCMMSA-N Arg-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O JYHIVHINLJUIEG-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DXZNJWFECGJCQR-FXQIFTODSA-N Asn-Asn-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DXZNJWFECGJCQR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MQLZLIYPFDIDMZ-HAFWLYHUSA-N Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZYPWIUFLYMQZBS-SRVKXCTJSA-N Asn-Lys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ZYPWIUFLYMQZBS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N Asn-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- HPNDBHLITCHRSO-WHFBIAKZSA-N Asp-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O HPNDBHLITCHRSO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N Asp-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GWIJZUVQVDJHDI-AVGNSLFASA-N Asp-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GWIJZUVQVDJHDI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- NONWUQAWAANERO-BZSNNMDCSA-N Asp-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NONWUQAWAANERO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 241001421154 Azeta Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUUVFIAZIOIEIN-UBHSHLNASA-N Cys-Cys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)N BUUVFIAZIOIEIN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N Glu-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- RDDSZZJOKDVPAE-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RDDSZZJOKDVPAE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZSWGJYOZWBHROQ-RWRJDSDZSA-N Glu-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSWGJYOZWBHROQ-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N Gly-Ala-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Phe Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- VDCRBJACQKOSMS-JSGCOSHPSA-N Gly-Phe-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VDCRBJACQKOSMS-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- GWNIGUKSRJBIHX-STQMWFEESA-N Gly-Tyr-Arg Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)CN)O GWNIGUKSRJBIHX-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N Gly-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 101001018100 Homo sapiens Lysozyme C Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VZIFYHYNQDIPLI-HJWJTTGWSA-N Ile-Arg-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N VZIFYHYNQDIPLI-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- CIJLNXXMDUOFPH-HJWJTTGWSA-N Ile-Pro-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 CIJLNXXMDUOFPH-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- XVUAQNRNFMVWBR-BLMTYFJBSA-N Ile-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N XVUAQNRNFMVWBR-BLMTYFJBSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- AVEGDIAXTDVBJS-XUXIUFHCSA-N Leu-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AVEGDIAXTDVBJS-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N Leu-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- MDSUKZSLOATHMH-IUCAKERBSA-N Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C(C)C)C([O-])=O MDSUKZSLOATHMH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZTPWXNOOKAXPPE-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N ZTPWXNOOKAXPPE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LECIJRIRMVOFMH-ULQDDVLXSA-N Lys-Pro-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LECIJRIRMVOFMH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N N-L-leucyl-L-valine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101150051118 PTM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- AABIBDJHSKIMJK-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O AABIBDJHSKIMJK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N Thr-Asn Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N Thr-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N Thr-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BIJDDZBDSJLWJY-PJODQICGSA-N Trp-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BIJDDZBDSJLWJY-PJODQICGSA-N 0.000 description 1
- HHPSUFUXXBOFQY-AQZXSJQPSA-N Trp-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O HHPSUFUXXBOFQY-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 1
- PALLCTDPFINNMM-JQHSSLGASA-N Trp-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N PALLCTDPFINNMM-JQHSSLGASA-N 0.000 description 1
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- CKTMJBPRVQWPHU-JSGCOSHPSA-N Val-Phe-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)O)N CKTMJBPRVQWPHU-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N Val-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N Valyl-Serine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N aluminum;silicic acid;hydrate Chemical compound O.[Al].[Al].O[Si](O)(O)O INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108010006664 gamma-glutamyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 1
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- BULVZWIRKLYCBC-UHFFFAOYSA-N phorate Chemical compound CCOP(=S)(OCC)SCSCC BULVZWIRKLYCBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL)
Oblast techniky
Vynález se týká DNA molekul, rekombinantních vektorů a buněčných kultur pro použití v metodách pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL) v methylotrofické kvasince Pichia pastoris.
Dosavadní stav techniky
Žlučovými solemi stimulované lipase (BSSL) (viz Wang and Hartsuck, 1993) se přičítá většina lipolytické aktivity lidského mléka. Charakteristickou vlastností této lipasy je to, že vyžaduje primární žlučové sole pro aktivitu proti emulsifikovaným triacylglycerolům s dlouhým řetězcem. BSSL byla doposud nalezena pouze v mléku od lidí, goril, koček a psů (Hernell et al., 1989) .
BSSL byla přisouzena zásadní role pro trávení mléčných lipidů ve střevě kojených dětí (Fredrikzon et al., 1978). BSSL syntetizována u lidí v laktující mléčné žláze a je secernována s mlékem (Blacberg et al., 1987). Tvoří asi 1% celkových mléčných proteinů (Blackberg and Hernell, 1981).
Bylo předpokládáno, že BSS1 je hlavním limitujícím faktorem při absorpci tuků a následném růstu, zejména nezralých, dětí, které mají deficientní jejich vlastní produkci BSSL, a že suplementace přípravky s purifikovaným enzymem signifikantně zlepšuje trávení a růst těchto dětí (US 4944944; Oklahoma Medical Research Foundation). Toto je klinicky významné pro přípravu • Λ
dětských přípravků, které obsahují relativně vysoké procento triglyceridů a které jsou založeny na rostliných proteinech nebo na proteinech jiných než z lidského mléka, protože děti krmené těmito přípravky nejsou schopné trávit tuk za nepřítomnosti přidané BSSL.
cDNA struktury jak pro mléčnou BSSL, tak pro pankreatickou karboxylickou ester hydrolasu (CEH) byly charakterizovány (Baba et al., 1991; Hui and Kissel, 1991; Nilsson et al., 1991; Reue et al., 1991) a byl vyvozen závěr, že mléčný enzym a pankreatický enzym jsou produkty stejného genu, CEL genu. cDNA sekvence (SEQ ID NO: 1) CEL genu je popsána v US 5200183 (Oklahoma Medical Research Foundation); WO 91/18293 (Aktiebolaget Astra); Nilsson et al., (1990); a Baba et al., (1991). Dedukovaná aminokyselinová sekvence BSSL, včetně signální sekvence o 23 aminokyselinách, je ukázána jako SEQ ID NO: 2 v Seznamu sekvencí, zatímco sekvence nativního proteinu o 722 aminokyselinách je ukázána jako SEQ ID NO: 3 .
C-terminální region proteinu obsahuje 16 repeatů každý o 11 aminokyselinách, po kterých následuje 11 aminokyselin konzervovaného úseku. Nativní protein je vysoce glykosylován a byl popsán velký rozsah pozorovaných molekulových hmotností. Toto může pravděpodobně být vysvětleno různým rozsahem glykosylace (Abouakil et al., 1988). N-terminální polovina proteinu je homologní k acetylcholin esterase a některým jiným esterasám (Nilsson et al., 1990).
Rekombinantní BSSL může být produkován expresí ve vhodných hostitelých jako je E. coli, Saccharomyces cerevisiae, nebo v savčích buněčných liniích. Pro zvýšení BSSL expresního systému • · • · · · • · pro dosažení komerčně uplatnitelné produkce může být počítáno s použitím heterologních expresních systémů. Jak bylo uvedeno výše, lidský BSSL má 11 repeatů o 11 aminokyselinách na C-terminálním konci. Pro určení biologické signifikance těchto opakujících se regionů byly konstruovány různé mutanty lidského BSSL, které postrádaly část nebo všechny tyto opakující se regiony (Hansson et al., 1993). Varianta BSSL-C (SEQ ID NO: 4), například,má delece od aminokyselinového zbytku 536 do 568 a od aminokyselinového zbytku 591 do 711. Expresní studie, za použití savčí buněčné linie C127 jako hostitele a expresního vektoru hovězího papilloma viru, ukázaly, že různé varianty mohou být exprivovány v aktivní formě )Hansson et al., 1993). Z expresních studií bylo také odvozeno, že na prolin bohaté repeaty v lidském BSSL nejsou zásadní pro katalytickou aktivitu nebo aktivaci BSSL žlučovými solemi. Nicméně, produkce BSSL nebo jeho mutantů v savčích expresních systémech by mohla být příliš nákladná pro rutiní terapeutické použití.
Eukaryotické systémy, jako jsou kvasinky, mohou poskytnout signifikantní výhody ve srovnání s prokaryotickými systémy, pro produkci jistých polypeptidů kódovaných rekombinantní DNA. Například, kvasinky mohou být obecně kultivovány ve vyšších buněčných hustotách než bakterie a mohou být schopné glykosylace exprivovaných polypeptidů tam, kde je taková glykosylace významná pro biologickou aktivitu. Nicméně, použití kvasinky Saccharomyces cerevisiae jako hostitelského organismu často vede k nízkým hladinám exprese a slabé sekreci rekombinantního proteinu (Cregg et al., 1987). Maximální hladiny heterologních proteinů jsou u S. cerevisiae v oblasti 5% celkového buněčného proteinu (Kingsman et al., 1985). Další nevýhodou použití Saccharomyces cerevisiae jako hostitele je to, že rekombinantní proteiny mají tendenci být • · · « • · • · • · · · « « · · · « « • · · • · · · · • · «
Λ* · · ^ · · · · · · nadměrně glykosylovány, což může ovlivnit aktivitu glykosylovaných savčích proteinů.
Pichia pastoris je methylotrofní kvasinka, která může růst na methanolu jako jediném zdroji uhlíku a energie, protože obsahuje vysoce regulovanou dráhu využití methanolu (Ellis et al., 1985) .
P. pastoris je také přístupná účinné fermetační technologii s vysokou hustotou buněk. Proto rekombinantní DNA technologie a účinné metody pro transformaci kvasinek umožňují vyvinout P. pastoris jako hostitele pro expresi heterologních proteinů ve velkém množství, s expresním systémem založeným na promotoru methanol oxidasy (Cregg et al., 1987).
V oboru je známé použití Pichia pastoris jako hostitele pro expresi např. následujících heterologních proteinů: lidského tumor nekrosis faktoru (EP-A-0263311); Bordetella pertactin antigenů (WO 91/15571); povrchového antigenu hepatitidy B (Cregg et al., 1987); lidského lysozymového proteinu (WO 92/04441); aprotininu (WO 92/01048). Nicméně, úspěšná exprese heterologních proteinů v aktivní, solubilní a secernované formě závisí na mnoha faktorech, např. správné volbě signálního peptidů, správné konstrukci fúsního spojení mezi signálním peptidem a zralým proteinem, kultivačních podmínkách, atd.
Podstata vynálezu
Účelem vynálezu je překonat výše uvedené nedostatky dříve uvedených systémů a poskytnout metodu pro produkci lidské BSSL, která by byla finančně efektivní a která by dávala výnos srovnatelný, nebo vyšší, než produkce v jiných organismech. Tento účel byl dosažen poskytnutím metody pro expresi BSSL v buňkách • · • · * • ·
Pichia pastoris.
Tímto vynáezem je proto ukázáno, že lidská BSSL a variantní BSSL-C mohou být exprivovány v aktivní formě secernované z P. pastoris. Nativní signální peptid, stejně jako heterologní signální peptid odvozený od S. cerevisiae invertasového proteinu, byly použity pro translokaci zralého proteinu do kultivačního media v aktivní, zprávně zpracované formě.
V prvním aspektu poskytuje vynález DNA molekulu obsahující:
a) region kódující polypeptid, který je lidská BSSL nebo její biologicky aktivní varianta;
b) spojený 5'-konec uvedeného polypeptid kódujícího regionu, regionu kódujícího signální peptid schopný řízení sekrece uvedeného polypeptidů z buněk Pichia pastoris transformovaných uvedenou molekulou DNA; a
c) promotor methanol oxidasy Pichia pastoris nebo funkčně ekvivalentní promotor operativně navázaný na uedené kódující regiony definované v (a) a (b).
Termínem biologicky aktivní varianta BSSL je míně polypeptid mající BSSL aktivitu a obsahující část aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID NO: 3 v Seznamu sekvencí. Termínem polypeptid mající BSSL aktivitu je v tomto kontextu míněn polypeptid mající následující vastnosti: (a) je vhodný pro orální podání; (b) je aktivovaný specifickými žlučovými solemi; a (c) účinkuje jako nespecifická lipasa v obsahu tenkého střeva, t.j. je schopen ·· ··· ······· ·· · hydrolyzovat lipidy relativně nezávisle na jejich chemické struktuře a fyzikálním stavu (emulsifikované, micelární, solubilní).
Uvedená BSSL varianta může být např. varianta, která obsahuje méně než 16 opakujících se jednotek, kde opakující se jednotkou je míněna opakující se jednotka o 11 aminokyselinách, kódovaná nukleotidovou sekvencí ukázanou jako opakující se jednotka pod nadpisem (ix) Vlastnosti v Informace pro SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí. Jednotlivě, variantou BSSL může být varianta BSSL-C, ve které jsou aminokyseliny 536 až 568 a 591 až
711deletovány (SEQ ID NO: 4 v Seznamu sekvencí). V souladu s tím je DNA molekula podle vynálezu preferovaně DNA molekula, která kóduje BSSL (SEQ ID NO: 3) nebo BSSL-C (SEQ ID NO: 4).
Nicméně, DNA molekuly podle vynálezu nejsou přísně omezeny na DNA molekuly, které kódují polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí identickou k SEQ ID NO: 3 nebo 4 v Seznamu sekvencí. Spíše vynález zahrnuje DNA molekuly, které kódují polypeptidy nesoucí modifikace jako jsou substituce, malé delece, inserce nebo inverse, kde tyto polypeptidy mají nicméně biologické aktivity BSSL.Ve vynálezu jsou následně obsaženy DNA molekuly kódující varianty BSSL jak byly uvedeny výše a také DNA molekuly odující polypeptidy, jejichž aminokyselinová sekvence je z alespoň 90% homologní, lépe z alespoň 95% homologní, s aminokyselinovou sekvencí ukázanou jako SEQ ID NO: 3 nebo 4 v Seznamu sekvencí.
Signálním peptidem popsaným výše může být peptid, který je identický s, nebo významně podobný, peptidem s aminokyselinovou sekvencí ukázanou jako aminokyseliny -20 až -1 SEQ ID NO: 2 v • · • · · · • · · ·
Seznamu sekvencí. Alternativně, může to být peptid, který obsahuje invertasový signální peptid Saccharomyces cerevisiae.
V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález vektor obsahující DNA molekulu jak je definována výše. Preferovaně je takový vektor replikovatelný expresní vektor, který nese a je schopen zprostředkovat expresi DNA sekvence kódující lidskou BSSL nebo její biologicky aktivní variantu v buňkách rodu Pichia. Takovým vektorem může například být vektor pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) nebo pARC 5797 (NCIMB 40722).
V jiném aspektu poskytuje vynález kulturu hostitelských buněk obsahující buňky rodu Pichia transformované DNA molekulou nebo vektorem jak byly definovány výše. Preferovaně jsou uvedenými hostitelskými buňkami buňky Pichia pastoris kmenů jako je například PPF-1 nebo GS115. Uvedenými buněčnými kulturami mohou být například kultury PPF-l(pARC 5771) (NCIMB 40721), GS115 (pARC 5799) (NCIMB 40723) nebo GS115 (pARC 5797) (NCIMB 40722) .
V ještě jiném aspektu poskytuje vynález proces pro produkci polypeptidu, kterým je lidská BSSL, nebo její biologicky aktivní varianta, kde uvedený proces obsahuje kultivaci uedených hostitelských buněk podle vynálezu za podmínek, kdy je uvedený polypeptid secernován do kultivačního media a získání uvedeného polypeptidu z kultivačního media.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Exprese BSSL v Pichia pastoris PPF-1 • · · ·
1.1. Konstrukce pARC 0770 cDNA sekvence (SEQ ID NO: 1) kódující BSSL protein, obsahující nativní signální peptid (dále označovaný jako NSP) byl klonován v pTZ19R (Pharmacia) jako EcoRI-SacI fragment. Klonování NSP-BSSL cDNA do S. cerevisiae expresního vektoru pSCW 231 (získaného od profesora L. Prakashe, University of Rochester, NY, USA), který je kvasinkovým expresním vektorem s nízkým počtem kopií, kde je exprese pod kontrolou konstitutivního ADH1 promotoru, bylo dosaženo ve dvou krocích. Nejprve byla NSP BSSL cDNA klonována do pYES 2.0 (Invitrogen, USA) jako EcoRI-Sphl fragment z pTZ19R-SP-BSSL. Přebytečných 89 párů baží mezi EcoRI a Ncol v počátku signální peptid kódující sekvence bylo odstraněno vytvořením EcoRI/NcoI (89) fúse a regenerováním EcoRI místa. Vzniklý klon pARC 0770 obsahoval ATG kodon, původně kódovaný v Ncol místě, které bylo ihned následováno regenerovaným EcoRI místem v rámečku ze zbývající NSP-BSSL sekvencí.
1.2. Konstrukce pARC 5771 plasmidu
Pro konstrukci vhodného expresního vektoru pro expresi BSSL byl cDNA fragment kódující BSSL protein spolu s nativním signálním peptidem klonován do P. pastoris expresního vektoru pDM 148. Vektor pDM 148 (získaný od Dr. S. Subramani, UCSD) byl konstruován následujícím způsobem: upstream netranslatovaný region (5'-UTR) a downstream netranslatovaný region (3'-UTR) methanol oxidasového (MOX1) genu byly izolovány PCR a umíztěny v tandemu v mnohotné klonovací sekvenci (MCS) E. coli vektoru pSK* (dostupného od Stratagene, USA).
Pro správnou selekci putativních P. pastoris transformantů byla DNA sekvence kódující S. cerevisiae ARG4 gen spolu s její vlastní promotorovou sekvencí insertována mezi 5'- a 3' UTR v pSK-. Vzniklý konstrukt pDM148 měl následující vlastnosti: v MCS regionu pSK- 5'-UTR MOX, S. cerevisiae ARG4 genomovou sekvenci a 3'-UTR MOX byly kloovány. Mezi 5'-UTR MOX a ARG4 genomovou sekvencí byla umístěna serie jediněčných restrikčních míst (Sáli, Clal, EcoRI, Pstl, Smál a BamHI), do kterých může být klonována jakákoliv heterologní protein kódující sekvence pro expresi pod kontrolou MOX promotoru v P. pastoris. Pro usnadnění integrace této expresní azety do M0X1 lokusu v chromosomu P. pastoris, může být expresní kazeta štěpena ze zbytku pSK- vektoru trávením Notl restrikčním enzymem.
5'-UTR M0X1 P. pastoris klonovaný do pDM 148 byl délky asi 500 bp, zatímco 3' UTR MOX1 z P. pastoris klonovaný do pDM148 byl délky asi 1000 bp. Pro inserci NSP BSSL cDNA sekvence mezi 5'-UTR MOX1 a S. cerevisiae ARG4 kódující sekvence v pDM148 byl cDNA insert (SP-BSSL) izolován z pARC 0770 trávením EcoRI a BamHI (přibližně 2,2 kb DNA fragment) a byl klonován mezi EcoRI a BamHI místa v pDM 148.
Vzniklý konstrukt pARC 5771 (NCIMB 40721) obsahoval P. pastoris MOX1 5'-UTR následovaný NSP BSSL kódující sekvencí následovanou S. cerevisiae ARG4 genovou sekvencí a 31 UTR M0X1 genu P. pastoris, zatímco celý DNA segment z od 5'-UTR MOX1 do 3'-UTR MOX1 byl klonován do MCS pSK-.
1.3. Transformace BSSL v P. pastoris hostiteli PPF-1.
Pro expresi BSSL v P. pastoris hostiteli PPF-1 (his4, arg4; získána od Phillips Petroleum Co.), byl plasmid pARC 5771 tráven ‘1®·
Notl a celá trávená směs (10 μ<3 celkové DNA bylo použito pro transformace PPF-1. Použitý transformační protokol byla v podstatě kvasinková sferoplastová metoda popsaná Creggem et al., (1987) . Transformanty byly regenerovány na minimálním mediu postrádajícím arginin, takže Arg+ kolonie mohly být selektovány.Regenerační vrchní agar obsahující transformanty byl přenesen a homogenizován ve vodě a kvasinkové buňkyb byly umístěny v asi 250 koloniích na plotnu na minimálních glukosových plotnách postrádajících arginin. Mutantní kolonie byly potom identifikovány opětovným umístěním na minimální methanolové plotny. Asi 15% všech transformantů vykazovalo Muts (methanol pomalu rostoucí) fenotyp.
1.4. Vyšetření transformantů exprivujících BSSL
Pro rychlé vyšetření velkého množství transformantů na expresi lipasy byla vyvinuta metoda Upasového testu na plotně. Postup pro přípravu těchto ploten byl následující: do roztoku 2% agarosy (konečného) bylo přidáno 10 x Na-cholát roztok ve vodě do konečné koncentrace 1%. Lipidový substrát tributin byl přidán ve směsi do konečné koncentrace 1% (objem/objem). Pro podpoření růstu transformantů byla směs dále doplněna 0,25% kvasinkovou dusíkatou basí (konečnou) a 0,5% methanolem (konečným). Přísady byly řádně zamíchány a vylity na plotny do tloušťky 3 - 5 mm. Jakmie se směs stala pevnou, byly transformanty umístěny na plotny a plotny byly dále inkubovány při 37 °C po 12 hodin. Lipasu produkujíc klony vykazovaly jasné haló okolo klonu. V typickém experimentu bylo identifikováno 7 z celkem 93 transformantů jako BSSL produkující transformanty. Dva klony (č. 39 a 86) produkující největší haló okolo umístěných kolonií byly seškrábnuty pro další charakterizaci.
1.5. Exprese BSSL z PPF-l(pARC 5771)
Dva transformanty č. 39 a 86 popsané v sekci 1.4. byly seškrábnuty a kultivovány v BMGY kapalném mediu (1% kvasinkový extrakt, 2% bactopepton, 1,34% kvasinková dusíkatá base bez aminokyselin, 100 mM KPO4 pufru, pH 6,0, 400 /zg/ml a 2% glycerol) po 24 hodin při 30 °C dokud kultury nedosáhly Αβθθ těsně k 40. Kultury byly peletovány a resuspendovány v BMMY (2% glycerol nahrazen 0,5% methanolem v BMY) mediu při Αβθθ= 300. Indukované kultury byly inkubovány při 30 °C se třepáním po 120 hodin. Supernatanty kultur byly odebrány v různou dobu pro analýzu exprese BSSL testem aktivity enzymu, SDS-PAGE analýzou a western blotingem.
1.6. Detekce BSSL enzymové aktivity v supernatantech kultur klonů č. 39 a 86
Pro určení enzymové aktivity v buněk prostých supernatantech indukovaných kultur č. 39 a 86 jak jsou popsány v sekci 1.5., byly kultury odstředěny a buněk prostý supernatant byl testován na BSSL enzymovou aktivitu podle metody, kterou popsal Hernell a Olivecrona (1974). Jak je ukázáno v tabulce 1, u obou kultur bylo zjištěno, že obsahují BSSL enzymovou aktivitu s maximem aktivity v 96 hodině po indukci.
1.7. Western blot analýza supernatantů kultur PPF-l:pARC 5771 transformantů (č. 39 a 86) .
Pro určení přítomnosti rekombinantní BSSL v supernatantech kultur č. 39 a 86 PPF-l(pARC 5771) transformantů byly kultury kultivovány a indukovány jak je popsáno v sekci 1.5. Kultury byly • · • · · · ··· odebrány v různou dobu po indukci a byly podrobeny Western blot analýze za použití anti-BSSL polyklonální protilátky. Výsledky ukazují přítomnost BSSL v supernatantu kultury jako 116 kDa proužek.
Příklad 2: Exprese BSSL v Pichia pastoris GS115
2.1. Konstrukce pARC 5799
Protože 5'-MOX UTR a 3' MOX UTR nebyly správně definovány a protože pDM 148 vektor postrádá jakýkoliv jiný vhodný markér (např. gen resistence na G418) pro monitorování počtu kopií BSSL integrovaných v chromosomu Pichia, byl cDNA insert nativní BSSL spolu se signálním peptidem klonován do jiného P. pastoris expresního vektoru, pHIL D4. Integrativní plasmid pHIL D4 byl získán od Philips Petroleum Company. Plasmid obsahoval 5'-M0Xl, přibližně 1000 bp segment alkohol oxidasového promotoru a jedinečné EcoRI klonovací místo. Také obsahoval přibližně 250 bp 3' MOX1 regionu obsahuj ícího alkohol oxidasovou terminační sekvenci, následovanou EcoRI místem. Terminační region byl následován P. pastoris histidinol dehydrogenasovým genem HIS4 obsaženým na 2,8 kb fragmentu pro doplnění defektního HIS4 genu u hstitele GS115 (viz níže). 650 bp region obsahující 3'-M0X1 DNA byl fušován v 3'-konci HIS4 genu, který byl spolu s 5'-M0X1 regionem nezbytný pro místně řízenou integraci. Bakteriální gen resistence na kanamycin z pUC-4K (PL-Biochemicals) byl insertován do jedinečného Nael místa mezi HIS4 a 3'-MOX1 region ve 3' HIS4 genu.
Klon NSP-BSSL kódující cDNA fragment v jedinečném EcoRI místě pHIL D4, dvouřetězcový oligolinker mající BamHI-EcoRI štěpenou • · ► · » · • · ·
1·ϊ pozici byl ligován do BamHI tráveného plasmidu pArc 5771 a celá NSP-BSSL kódující sekvence byla vytržena jako 2,2 kb EcoRI fragment. Tento fragment byl klonován do EcoRI místa pHIL D-4 a správně orientovaný plasmid byl označen jako pARC 5799 (NCIMB 40723).
2.2. Transformace pARC 5799
Pro usnadnění integrace NSP-BSSL kódující sekvence v genomovém lokusu MOX1 v P. pastoris byl plamsid pARC 5799 tráven Bglll a použit pro transformaci P. pastoris kmene GS115(his4) (Philips Petroleum Company) podle protokolu popsaném v sekci 1.5. V tomto případě, nicméně, se jednalo o selekci His prototrofů. Transformanty byly seškrábnuty po sériovém ředění ploten regenerovaného vrchního agaru a testovány přímo v lipasovém plotnové testu jak je popsáno v sekci 1.4. Dva klony transformanů (č. 9 a 21) byly seškrábnuty na základě velikosti jejich haló na lipasové testovací plotně a byly dále testovány na expresi BSSL. Klony byly shledány jako Mut*.
2.3. Detekce BSSL enzymové aktivity v supernatantech kultur GS115(pARC 5799) transformantů č. 9 a 21.
Dva transformované klony č. 9 a 21 GS115(pARC 5799) byly kutivovány v podstatě podle protokou popsaného v sekci 1.5. Supernatanty kultur byly různou dobu po indukci testovány na BSSL enzymovou aktivitu jak je popsáno v sekci 1.6. Jak je ukázáno v tabulce 1, obsahovaly oba supernatanty kultur BSSL enzymovou aktivitu a enzymová aktivita byla nejvyšší 72 hodin po indukci. Oba klony vykazovaly vyšší expresi BSSL ve srovnání s klony PPF-1(pARC 5771).
2.4. SDS-PAGE a western blot analýzy supernatantů kultur GS115(pARC 5799) transformantů č. 9 a 21.
Supernatanty kultur odebrané v různou dobu, jak je popsáno v sekci 2.3., byly podrobeny SDS-PAGE a western blot analýze. Z SDS-PAGE profilu bylo zhodnoceno, že asi 60-75% celkoého proteinu přítomného v supernatantech indukovaných kultur byl BSSL. Molekulová hmotnost proteinu byla okolo 116 kDa. Western blot data také potvrdila, že hlavní protein přítomný v supernatantu kultury byl BSSL. Protein měl zjevně stejnou molekulovou hmotnost jako nativní BSSL.
Příklad 3: Zvýšení BSSL exprese
3.1. Zvýšení BSSL exprese z transformovaného klonu GS115(pARC 5799) (Č. 21) .
Byl použit B. Braun fermenter s kapacitou 23 1. Pět litrů media obsahujícího 1% YE, 2% pepton, 1,34 YNB a 4% hmotnost/objem gycerol bylo autoklavováno při 121 °C po 30 minut a biotin (400 /zg/l konečná koncentrace) byl přidán během inokulace po sterilizaci na filtru. Pro inokulum byl použit glycerolový zásobník GS115(pARC 5799) (č. 21) inokulovaný do syntetického media obsahujícího YNB (67%) plus 2% glycerol (150 ml) a byl kultivován při +30 °C po 36 hodin. Fermentační podmínky byly následující: teplota byla +30 °C; pH 5,0 bylo udržováno za použití 3,5 N NH^OH a 2 N HCI; rozpuštěný kyslík od 20 do 40% saturace; polypropylenglykol 2000 byl použit jako protipěnivá látka.
ífr· φφφ <
ΦΦΦ
Kultura byla monitorována v pravidelných intervalech měřením OD při 600 nm. A dosáhla maxima 50 - 60 ve 24 hodinách.
V tomto bodě byla vsádková růstová fáze překonána jak je ukázáno zvýšenými hladinami rozpuštěného kyslíku.
Růstová fáze byla ihned následována indukční fází. Během této fáze byl použit jako krmivo methanol osahující 12 ml/1 PTM1 solí. Stupeň podávání methanolu by 6 μΐ/hod. během prvních 10 - 12 hodin, po kterých byl postupně zvyšován o 6 ml/h každých 7-8 hodin do maxima 36 ml/hod. Amoniak použitý pro kontrolu pH účinkovala jako zdroj dusíku. Akumulace methanolu byla testována každých 6-8 hodin za použití stanovení obsahu rozpuštěného kyslíku a bylo objeveno, že je limitován během celé fáze indukce. OD při 600 nm se zvýšilo z 50 - 60 na 150 - 170 během 86 hod. podávání methanolu. Kvasinkový extrakt a pepton byly přidány každých 24 hodin pro vytvoření konečné koncentrace 0,25% a 0,5%, v příslušném pořadí.
Vzorky byly odebrány ve 24 hodinovém intervalu a byly testovány na BSSL enzymovou aktivitu v buněk prostém bujónu.
Bujón byl také podroben SDS-PAGE a western bloting analýze.
3.2. Proteinová analýza secernovaného BSSL z ve fermentoru kultivované kultury GS115(pARC 5799) (č. 21) .
BSSL enzymová aktivita v buněk prostém bujónu se zvýšila ze 40 - 71 mg/1 (ekvivalentů nativního proteinu) ve 24 hodině na 200 227,7 mg/1 (ekvivalentů nativního proteinu) v konci 86 - 90 hodiny. SDS-PAGE analýza buněk prostého buonu ukázala prominentní Coomasie modří barvený proužek o molekulové hmotnosti 116 kDa. Identita proužku byla potvrzena Western blotem provedeným jak
1*6 ·
99 bylo popsáno v sekci 1.7. pro nativní BSSL.
3.3. Purifikace rekombinantního BSSL secernovaného v supernatantu kultury GS115(pARC 5799) (č. 21) klonů.
P. pastoris klon GS115(pARC 5799) byl kultivován a indukován ve fermentoru jak je popsáno v sekci 3.1. Pro purifikaci rekombinantního BSSL bylo 250 ml kultivačního media (indukovaného po 90 hodin) centrifugováno při 12000 x g po 30 minut pro odstranění všech částic. Buněk prostý supernatant kultury byl ultrafiltrován na Amicon setu za použití membrány s rozlišovací schopností 10 kDa. Soli a proteiny a peptidy s nízkou molekulovou hmotností z kultivačního supernatantu byly odstraněny opakovaným ředěním během filtrace. Pufr použitý pro taková ředění byl 5 mM Barbitol pH 7,4. po koncentrování supernatantu kultur byl retentát rekonstituován na 250 ml za použití 5mM Barbitolu, pH 7,4 a 50 mM NaCl a byl zaveden do Heparin-Sepharosové kolony (15 ml objem lůžka, která byla preekvilibrována stejným pufrem. Zavádění vzorku bylo provedeno průtokem 10 ml/hod. Po zavedení byla kolona promyta 5 mM barbitolem, pH 7,4 a 0,1 M NaCl (200 μΐ promývací pufr) dokudabsorbance při 250 nm nedosáhla pod hladinu detekce. BSSL byla eluována 200 ml Barbitol pufru (2 mM, pH 7,4) a lineárním gradientem NaCl v rozsahu od 0,1 M do 0,7 M. Frakce (2,5 ml) byly odebrány a testovány na eluovaný protein monitorováním absorbance 260 nm. Frakce obsahující protein byly testovány na BSSL enzymatickou aktivitu. Vhodné frakce byly analyzovány na 8,0% SDS-PAGE pro vyšetření jejich purifikačního profilu.
3.4. Charakterizace purifikovaného rekombinantního BSSL secernovaného v supernatantu kultur GS115(pARC 5799)
SDS-PAGE a Western blot analýzy frakcí (popsané v sekci 3.3) ukazující maximální enzymatickou aktivitu BSSL enzymu ukázaly, že rekombinantní protein byl z přibližně 90% čistý. Molekulová hmotnost purifikovaného proteinu byla okolo 116 kDa jak je určeno SDS-PAGE a western blot analýzami. Pokud byly vzorky podrobeny SDS-PAGE analýze, pak mohl být detekován proteinový proužek o nízké molekulové hmotnosti barvením Coomasie Brilliant Blue, který nebyl znázorněn na western blotu. Purifikovaný protein byl podroben N-terminální analýze na automatizovaném proteinovém sekvenátoru. Výsledky ukázaly, že protein byl správně zpracován z nativního signálního peptidů a že rekombinantní protein měl N-terminální sekvenci A K L G A V Y. Specifická aktivita purifikovaného rekombinantního proteinu byla nalezena podobná jako aktivita nativního proteinu.
Příklad 4: Exprese BSSL-C v Pichia pastoris GS115
4.1. Konstrukce pARC 5797 cDNA kódující sekvence pro BSSL variantu BSSL-C byla fúsována ve svém 5'-konci se signální peptid kódující sekvencí S. cerevisiae SUC2 genovým produktem (invertasou), zazachování integrity otevřeného čtecího rámečku začínajícího v prvním ATG kodonu invertasového signálního peptidů. Tento fúsní genový konstrukt byl nejprve klonován do S. cerevisiae expresního vektoru pSCW 231 (pSCW 231 kvasinkový expresní vektor o nízkém počtu kopií a exprese je pod kontrolou konstitutivního ADH1 promotoru) mezi EcoRI a BamHI místo pro generování expresního vektoru pARC 0788.
cDNA fúsního genu byla dále subklonována do P. pastoris ·· ··· · expresního vektoru pDM 148 (popsaného v sekci 1.2) uvolněním vhodného 1,8 kb fragmentu EcoRI a BamHI trávením pARC 0788 a subklonováním fragmentu do pDM 148 tráveného EcoRI a BamHI. Vzniklý konstrukt pARC 5790 byl tráven BamHI a dvouřetězcový oligonukleotidový linker fyzikální struktury BamHI-EcoRI-BamHI byl ligován do konstruktu pARC 5796 v podstatě pro izolaci cDNA fragmentu fúsního genu, podle strategie popsané v sekci 2.1.
Nakonec byl 1,8 kb fragment obsahující invertasový signální peptid/BSSL-C fúsní gen uvolněn z pARC 5796 trávením EcoRI a byl klonován do pHIL D4 v EcoRI místě. Vhodnou restrikční analýzou byl identifikován expresní vektor obsahující insert ve správné orientaci a byl označen pARC 5797 (NCIMB 40722) .
4.2. Exprese rekombinantního BSSL-C z P. pastoris pro expresi rekombinantního BSSL-C z P. pastoris byla P. pastoris hostitel GS115 transformována pARC 5797 podle metody popsané v sekcích 1.3 a 2.2. Transformanty byly vyšetřovány na produkci lipasy metodou popsanou v sekcích 1.4 a 2.2. Jeden transformant (č. 3) byl seškrábnut na základě vysoké lipasu produkující schopnosti podle detekční metody Upasového testu na plotně a byl dále analyzován na produkci BSSL enzymatické aktivity v kultivačním supernatantu v podstatě podle metody popsané v sekcích 1.6 a 2.3. Jak je ukázáno v tabulce 1, supernatant GS115(pARC 5797) (č.3) obsahoval BSSL enzymatickou aktivitu a množství, které se progresivně zvyšovalo do 72 hodiny po indukci.
4.3. SDS-PAGE a western blot analýzy supernatantu kultur GS115(pARC 5797) transformantu (č. 3).
• · • ··· ·· ··*· • · • ··· ··
• * · · » • ·
Supernatanty kultur odebrané v různou dobu, jak je popsáno v sekci 4.2., byly podrobeny SDS-PAGE a western blot analýze jak je popsáno v sekcích 1.7 a 2.4. Z SDS-PAGE profilu bylo zhodnoceno, že asi 75 - 80% celkového extracelulárního proteinu BSSL-C. Molekulová hmotnost proteinu byla okolo 66 kDa, jak bylo zhodnoceno SDS-PAGE analýzou. Na Western blot analýze byly nalezeny pouze dva proužky (dublet) okolo 66 kDa, které byly imunoreaktivní a tak potvrzovaly expresi rekombinantního BSSL-C.
Příklad pro srovnání: Exprese BSSL v S. cerevisiae
Byly provedeny pokusy o expresi BSSL v Saccharomyces cerevisiae. BSSL byl slabě secernován v S. cerevisiae a nativní signální peptid nepracoval účinně. Kromě toho, nativní signální peptid nebyl štěpen ze zralého proteinu v S. cerevisiae.
Odkazy:
Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. a Lombardo, D. (1988) Biochim. Biophys. Acta. 961,299-308.
Baba, T., Downs, D., Jackson, K.W., Tang, J. a? . Wang, C-S (1991) Biochemistry 30, 500-510.
• · · · · ·
• · * · • 4 · .20..·
Bláckberg, L. ar Hemell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221-225.
Bláckberg, L., Ángquist, K.A. a’ Hemell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41.
Cregg, J.M. et al. (1987) Bio/Technology 5, 479-485.
EUis, S.B. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5,1111-1121.
Fredrikzon, B., Hemell, O., Bláckberg, L. a* i Olivecrona, T. (1978) Pediatrie Res. 12, 1048-1052.
Hansson, L., Bláckberg, L., Edlund, M., Lundberg, L., Strómqvist, M. a r Hernell, O. (1993) J. Biol. Chem. 268, 26692-26698.
Hemell, O. a Olivecrona, T. (1974) Biochim. Biophys. Acta 369, 234244.
Hemell, O., Bláckberg, L an< Olivecrona, T. (1989) in: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E., ed.) 347-354, Raven Press, NY.
Hemell, O. a Bláckberg, L. (1982) Pediatrie Res. 16, 882-885.
Hui, D. Y. a Kissel, J. A (1990) FEBS Letters 276,131-134.
Kingsman, etal. (1985) Biotechnology and Genetíc Engineering Reviews 3, 377-416.
Nilsson, J., Bláckberg, L., Carlsson, P., Enerbáck, S., Hemell, O. ari Bjursell, G. (1990) Eur. J. Biochem. 192, 543-550.
·« ···· · ·· «· ···· ··· ···« · · · ····· · · · · · • · -·· · · · ···· ·,.·22ΐ· ..* :
Reue, Κ., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, ΤΉ., Ronk, M., Shively, Λ
J.E., Stemby, B., Borgstróm, B., Ameis, D. ai Scholtz, M.C. (1991)
J. Lipid. Res. 32, 267-276.
Wang, C-S, ai ( Hartsuck, J.A. (1993) Biochim. Biphys Acta 1166,1-19.
Depozita mikroorganismů
Následující plasmidy, transformované do kultur Pichia pastoris, byly deponovány podle Budaešúské smlouvy v National Collections of Industrial and Marině Bacteria (NCIMB), Aberdeen, Scotland, UK. Datum deponování je 2.5.1995.
Kmen (plasmid) NCIMB č.
PPF-l(pARC 5771) GS115(pARC 5799) GS115(pARC 5797)
40721 40723
40722
- 22 · • · Ί| · · • · • · · Φ
• · · · · · ·
Tabulka 1
Enzymatická aktivita supernatantů kultur Pichia pastoris transformantů
Enzymatická aktivita v mg/1 ekvivalentů nativního BSSL
Hodiny PPF-l(pARC 5771) GS115(pARC 5799) GS115(pARC 5797)
| po indukci | č. 39 | č.86 | č.9 | Č. 21 | c. 3 |
| 24 | 0,254 | 0,135 | 1,53 | 1,72 | 0,37 |
| 48 | 2,69 | 3,12 | 17,28 | 34,70 | 40,9 |
| 72 | 3,96 | 8,25 | 37,37 | 50,60 | 44,9 |
| 96 | 11,26 | 13,60 | 26,34 | 50,60 | 35,6 |
| 120 | 8,42 | 13,13 | 13,60 | 22,30 | 17,8 |
tttt £3 :
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) Přihlašovatel:
| (A) | Jméno: ASTRA AB |
| (B) | Ulice: Vastra Malarehamnen |
| (C) | Město: Sodertalje |
| (E) | Země: Sweden |
| (F) | Poštovní kod (ZIP): S-151 |
| (G) | Telefon: +46-8-553 260 00 |
| (H) | Telefax: +46-8-553 288 20 |
| (I) | Telex: 19237 astra s |
(ii) Název vynálezu: DNA sekvence pro expresi polypeptidů (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (EPC (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 2428 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý
Í24 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Homo sapiens (B) Typ tkáně: prsní žláza (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 82...2319 (D) Jiné informace: /produkt = žlučovými solemi stimulovaná lipasa (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: exon (B) Umístění: 985...1173 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: exon (B) Umístění: 1174...1377 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: exon (B) Umístění: 1378...1575 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: exon (B) Umístění: 1576...2415 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: mat_peptid (B) Umístění: 151...2316 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: póly A_signál (B) Umístění: 2397...2402 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat region (B) Umístění: 1756...2283 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: 5' UTR (B) Umístění: 1...81 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1756...1788 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1789...1821 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1822...1854
Φ · ·· ···· • t * · · (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1855...1887 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1888...1920 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1921...1953 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1954...1986 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2020...2052 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2053...2085 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2086...2118 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka •· ···· · ·· ·· ···· ·· ······ · • · · · · · ··· • A « · 499999 (B) Umístění: 2119...2151 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2152...2184 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2185...2217 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2218...2250 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2251...2283 (x) Publikační informace:
(A) Autoři: Nilsson, Jeanette Blacberg, Lars Carlsson, Peter Enerback, Sven Hernell, Olle Bjursell, Gunnar (B) Titul: cDNA klonující žlučovými solemi stimulovanou lipasu lidského mléka a důkazy pro její identitu s pankreatickou karboxylovou esterovou hydrolasou (C) Časopis: Eur.
(D) Svazek: 192 (F) Strany: 543 - 550 (G) Datum: Září - 1990
J. Biochem.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGCCCCAAGA TAATGCAAAG 60
| AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG Met | CTC ACC ATG GGG CGC | . _r * | CAA CTG GTT Gin Leu Val -15 | 111 | |||
| Leu | Thr Met -20 | Gly Arg | |||||
| -23 | |||||||
| GTG TTG | GGC CTC ACC TGC TGC | TGG | GCA GTG | GCG AGT | GCG AAG CTG | 159 | |
| Val Leu | Gly Leu Thr Cys Cys -10 | Trp | Ala Val -5 | Ala Ser | kl* | Ala Lys Leu 1 | |
| GGC GCC | GTG TAC ACA GAA GGT | GGG | TTC GIG | GAA GGC | j·— — | AAT AAG AAG | 207 |
| Gly Ala 5 | Val Tyr Thr Glu Gly 10 | Gly | Phe Val | Glu Gly 15 | Asn Lys Lys | ||
| CTC GGC | CTC CTG GGT GAC TCT | GTG | GAC ATC | TTC AAG | ATC CCC TTC | 255 | |
| Leu Gly 20 | Leu Leu Gly Asp Ser 25 | Val | Asp Ile | Phe Lys 30 | j·—v | Ile Pro Phe 35 | |
| GCA GCT | CCC ACC AAG GCC CTG | GAA | AAT CCT | CAG CCA | — Λ — | CCT GGC TGG | - -303 |
| Ala Ala | Pro Thr Lys Ala Leu 40 | Glu | Asn Pro 45 | Gin Pro | Pro Gly Trp 50 | ||
| CAA GGG | ACC CTG AAG CCC AAG | AAC | TTC AAG | AAG ACA | CTG CAG GCC | 351 | |
| Gin Gly | Thr Leu Lys Ala Lys 55 | Asn | Phe Lys 60 | Lys Arg | Cys | Leu Gin Ala 65 | |
| ACC ATC | ACC CAG GAC AGC ACC | TAC | GGG GAT | GAA GAC | TGC | CTG TAC CTC | 399 |
| Thr Ile | Thr Gin Asp Ser Thr 70 | Tyr 75 | Gly Asp | Glu Asp | cys 80 | Leu Tyr Leu | |
| AAC ATT | TGG GTG CCC CAG GGC | AGG | AAG CAA | CTC TCC | CGG | GAC CTG CCC | 447 |
| Asn Ile 85 | Trp Val Pro Gin Gly 90 | Arg | Lys Gin | Val Ser 95 | Arg Asp Leu Pro | ||
| GTT ATG | ATC TGG ATC TAT GGA | GGC | GCC TTC | CTC ATG | GGG | TCC GGC CAT | 495 |
| Val Met 100 | Ile Trp Ile Tyr Gly 105 | Gly | Ala Phe | Leu Met 110 | Cly Ser Cly His 115 |
| GGG | GCC | AAC | TTC | CTC | AAC | AAC | TAC | CTG |
| Cly | Ala | Asn | Phe | Leu 120 | Asn | Asn | Tyr | Leu |
| ACA | CGC | GGA | AAC | GTC | ATC | GTC | GTC | ACC |
| Thr | Arg | Gly | Asn 135 | Val | Ile | Val | Val | Thr 140 |
| CTT | GGG | TTC | CTC | AGC | ACT | GGG | GAC | GCC |
| Leu | Gly | Phe 150 | Leu | Ser | Thr | Gly | Asp 155 | Ala |
| CTT | CGG | GAT | CAG | CAC | ATC | GCC | ATT | GCT |
| Leu | Arg 165 | Asp | Gin | His | Met | Ala 170 | Ile | Ala |
| GCC | TTC | GGG | GGG | GAC | CCC | AAC | AAC | ATC |
| Ala 180 | Phe | Gly | Gly | Asp | Pro 185 | Asn | Asn | Ile |
| CGA | GGT | GCC | AGC | GTC | TCT | CTC | CAG | ACC |
| Gly | Gly | Ala | Ser | Val 200 | Ser | Leu | Gin | Thr |
| CTC | ATC | CGG | CGA | GCC | ATC | AGC | CAG | AGC |
| Leu | Ile | Arg | Arg 215 | Ala | Ile | Ser | Gin | Ser 220 |
| GTC | ATC | CAG | AÁA | AAC | CCA | CTC | TTC | TCG |
| Val | Ile | Gin 230 | Lys | Asn | Pro | Leu | Phe 235 | Trp |
| GTC | GGT | TCC | CCT | GTG | GGT | GAT | GCC | GCC |
| Val | Glv 245 | Cys | Pro | Val | Gly | Asp 250 | Ala | Ala |
| GTT | ACT | GAT | CCC | CGA | GCC | CTC | ACG | CTG |
| Val 260 | Thr | Asp | Pro | Arg | Ala 265 | Leu | Thr | Leu |
| GGC | CTG | GAG | TAC | CCC | ATC | CTC | CAC | TAT |
| Gly | Leu | Glu | Tyr | Pro 280 | Met | Leu | His | Tyr |
| GAT | GGA | GAC | TTC | ATC | CCC | GCT | GAC | CCG |
| Asp | Gly | Asp | Phe 295 | Ile | Pro | Ala | Asp | Pro 300 |
| GCC | GAC | ATC | GAC | TAT | ATA | GCA | GGC | ACC |
| Ala | Asp | Ile 310 | Asp | Tyr | Ile | Ala | Gly 315 | Thr |
| TTC | GCC | AGC | ATC -GAC | ATC | CCT | GCC | ATC | |
| Phe | Ala 325 | Ser | Ile | Asp | Met | Pro 330 | Ala | Ile |
| ACG | GAG | GAG | GAC | TTC | TAC | AAG | CTC | GTC |
| Thr 340 | Glu | Glu | Asp | Phe | Tyr 345 | Lys | Leu | Val |
| GGG | CTC | AGA | GGC | GCC | AAG | ACG | ACC | TTT |
| Gly | Leu | Arg | Gly | Ala 360 | Lys | Thr | Thr | Phe |
| GCC | CAG | GAC | CCA | TCC | CAG | GAG | AAT | AAG |
| Ala | Gin | Asp | Pro 375 | Ser | Gin | Glu | Asn | Lys 380 |
| • · • · • · | • ·· · • • · · | • | • · • | • · » · | • · · · · · • · • · | ||
| • · • · | 29· | • | 9 • | • | • · · « • i | k | |
| • · | • · · | • | • · · · | • | • · < | ||
| TAT | GAC | CGC | GAG | GAG | ATC | GCC | 543 |
| Tyr 125 | Asp | Gly | Glu | GlU | Ile 130 | Ala | |
| TTC | AAC | TAC | CGT | GTC | GGC | CCC | 591 |
| Phe | Asn | Tyr | Arg | Val 145 | Gly | Pro | |
| AAT | CTC | CCA | GGT | AAC | TAT | GGC | 639 |
| Asn | Leu | Pro | Gly 160 | Asn | Tyr | Gly | |
| TCG | GTC | AAG | AGG | AAT | ATC | GCG | 687 |
| Trp | Val | Lys 175 | Arg | Asn | Ile | Ala | |
| ACG | CTC | TTC | GGG | GAG | TCT | GCT | 735 |
| Thr | Leu 190 | Phe | Gly | Glu | Ser | Ala 195 | |
| CTC | TCC | CCC | TAC | AAC | AAG | GGC | 783 |
| Leu 20S | Ser | Pro | Tyr | Asn | Lys 210 | Gly | |
| GGC | GTC | GCC | CTC | AGT | CCC | TCG | 831 |
| Gly | Val | Ala | Leu | Ser 225 | Pro | Trp | |
| GCC | AAA | AAG | GTC | GCT | GAG | AAG | 879 |
| Ala | Lys | Lys | Val 240 | Ala | Glu | Lys | |
| AGG | ATC | GCC | CAG | TCT | CTC | AAG | 927 |
| Arg | Met | Ala 255 | Gin | Cys | Leu | Lys | |
| GCC | TAT | AAG | GTC | CCG | CTC | GCA | 975 |
| Ala | Tyr 270 | Lys | Val | Pro | Leu | Ala 275 | |
| GTC | GGC | TTC | GTC | CCT | GTC | ATT | 1023 |
| Val 285 | Gly | Phe | Val | Pro | Val 290 | Ile | |
| ATC | AAC | CTG | TAC | GCC | AAC | GCC | 1071 |
| Ile | Asn | Leu | Tyr | Ala 305 | Asn | Ala | |
| AAC | AAC | ATC | GAC | GGC | CAC | ATC | 1119 |
| Asn | Asn | Met | Asp 320 | Gly | His | Ile | |
| AAC | AAG | GGC | AAC | AAG | AAA | GTC | 1167 |
| Asn | Lys | Gly 335 | Asn | Lys | Lys | Val | |
| AGT | GAG | TTC | ACA | ATC | ACC | AAG | 1215 |
| Ser | Glu 350 | Phe | Thr | Ile | Thr | Lys 355 | |
| GAT | GTC | TAC | ACC | GAG | TCC | TCG | 1263 |
| Asp 365 | Val | Tyr | Thr | Glu | Ser 370 | Trp | |
| AAG | AAG | ACT | GTC | GTG | GAC | TTT | 1311 |
| Lys | Lys | Thr | Val | Val 385 | Asp | Phe |
• ·
| GAG | ACC | GAT | GTC | CTC | TTC | CTG | CTG | CCC | ACC | GAG | ATT | CCC | CTA | GCC | CAG | 1359 |
| Clu | Thr | Asp 390 | Val | Leu | Phe | Leu | Val 395 | Pro | Thr | Glu | lis | Ala 400 | Leu | Ala | Gin | |
| CAC | AGA | GCC | AAT | GCC | AAG | AGT | GCC | AAG | ACC | TAC | GCC | TAC | CTG | TTT | TCC | 1407 |
| His | Arg 405 | Ala | Asn | Ala | Lys | Ser 410 | Ala | Lys | Thr | Tyr | Ala 415 | Tyr | Leu | Phe | Ser | |
| CAT | CCC | TCT | CGG | ATG | CCC | GTC | TAC | CCC | AAA | TGG | GTG | GGG | GCC | GAC | CAT | 1455 |
| His 420 | Pro | Ser | Arg | Met | Pro 425 | Val | Tyr | Pro | Lys | Trp 430 | Val | Gly | Ala | Asp | His 435 | |
| GCA | GAT | GAC | ATT | CAG | TAC | GTT | TTC | GGG | AAG | CCC | TTC | GCC | ACC | CCC | ACG | 1503 |
| Ala | Asp | Asp | Ile | Gin 440 | Tyr | Val | Phe | Gly | Lys 445 | Pro | Phe | Ala | Thr | Pro 450 | Thr | |
| GGC | TAC | CGG | CCC | CAA | GAC | AGG | ACA | GTC | TCT | AAG | GCC | ATG | ATC | GCC | TAC | 1551 |
| Gly | Tyr | Arg | Pro 455 | Gin | Asp | Arg | Thr | Val 460 | Ser | Lys | Ala | Met | Ile 465 | Ala | Tyr | |
| TGG | ACC | AAC | TTT | GCC | AAA | ACA | GGG | GAC | CCC | AAC | ATG | GGC | GAC | TCG | GCT | 1599 |
| Trp | Thr | Asn 470 | Phe | Ala | Lys | Thr | Gly 475 | Asp | Pro | Asn | Met | Gly 480 | Asp | Ser | Ala | |
| GTG | CCC | ACA | CAC | TGG | GAA | CCC | TAC | ACT | ACG | GAA | AAC | AGC | GGC | TAC | CTC | 1647 |
| Val | Pro 485 | Thr | His | Trp | Glu | Pro 490 | Tyr | Thr | Thr | Glu | Asn 495 | Ser | Gly | Tyr | Leu | |
| GAG | ATC | ACC | AAG | AAG | ATG | GGC | AGC | AGC | TCC | ATG | AAG | CGG | AGC | CTG | AGA | 1695 |
| Glu 500 | Ile | Thr | Lys | Lys | Met 505 | Gly | Ser | Ser | Ser | Met 510 | Lys | Arg | Ser | Leu | Arg 515 | |
| ACC | AAC | TTC | CTG | CGC | TAC | TGG | ACC | CTC | ACC | TAT | CTG | GCG | CTG | CCC | ACA | 1743 |
| Thr | Asn | Phe | Leu | Arg 520 | Tyr | Trp | Thr | Leu | Thr 525 | Tyr | Leu | Ala | Leu | Pro 530 | Thr | |
| GTC | ACC | GAC | CAG | GAG | GCC | ACC | CCT | GTG | CCC | CCC | ACA | GGG | GAC | TCC | GAG | 1791 |
| Val | Thr | Asp | Gin 535 | Glu | Ala | Thr | Pro | Val 540 | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp 545 | Ser | Glu | |
| GCC | ACT | CCC | GTG | CCC | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GAG | ACC | GCC | CCC | GTG | CCG | 1839 |
| Ala | Thr | Pro 550 | Val | Pro | Pro | Thr | Gly 555 | Asp | Ser | Glu | Thr | Ala 560 | Pro | Val | Pro | |
| CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GGG | GCC | CCC | CCC | GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | 1887 |
| Pro | Thr 565 | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala 570 | Pro | Pro | Val | Pro | Pro 575 | Thr | Gly | Asp | Ser | |
| GGG | GCC | CCC | CCC | GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GGG | GCC | CCC | CCC | GTC | 1935 |
| Gly 580 | Ala | Pro | Pro | Val | Pro 585 | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser 590 | Gly | Ala | Pro | Pro | Val 595 | |
| CCG | CCC | ACG | GGT | GAC. | TCC | GGG | GCC | CCC | CCC | GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | GAC | 1983 |
| Pro | Pro | Thr | Gly | Asp 600 | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro 605 | Val | Pro | Pro | Thr | Gly 610 | Asp | |
| TCC | GGG | GCC | CCC | CCC | GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GGG | GCC | CCC | CCC | 2031 |
| Ser | Gly | Ala | Pro 615 | Pro | Val | Pro | Pro | Thr 620 | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala 625 | Pro | Pro | |
| GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | CAC | TCC | GGC | GCC | CCC | CCC | GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | 2079 |
| Val | Pro | Pro 630 | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly 635 | Ala | Pro | Pro | Val | Pro 640 | Pro | Thr | Gly | |
| CAC | CCC | GGG | CCC | CCC | CCC | CTG | CCG | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GGC | GCC | CCC | 2127 |
| Asp | Ala | Gly | Pro | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro |
645 650 655
3Í *
| ccc | GTG | CCC | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC |
| Pro 660 | Val | Pro | Pro | Thr | Gly 665 | Asp | Ser |
| GGT | GAC | TCC | GAG | ACC | GCC | CCC | GTG |
| Gly | Asp | Ser | Glu | Thr 680 | Ala | Pro | Val |
| GGG GCC CCC CCC | GTG ACC CCC ACG | |||
| Gly | Ala Pro 670 | Pro | Val | Thr Pro Thr 675 |
| CCG | CCC ACG | GGT | GAC | TCC GGG GCC |
| Pro | Pro Thr | Gly | Asp | Ser Gly Ala |
| 685 |
| CCC | CCT | GTG | CCC | CCC | ACG | GGT | GAC |
| Pro | Pro | Val | Pro 695 | Pro | Thr | Gly | Asp |
| ACA | GAT | GAC | TCC | AAG | GAA | GCT | CAG |
| Thr | Asp | Asp 710 | Ser | Lys | Glu | Ala | Gin 715 |
CGTCCCATGA GCCTTGGTAT
| TCT Ser 700 | GAG Glu | GCT Ala | GCC Ala | CCT Pro | GTG Val 705 | CCC Pro | CCC Pro |
| ATG Met | CCT Pro | GCA Ala | GTC Val | ATT Ile 720 | AGG Arg | Phe | TAG • |
ACCCCAGGGG
CAAGAGGCCA CAAGAGTGGG
CTCCC
ATCTTGAGCT
CTTCCTGAAT
AAAGCCTCAT ACCCCTAAAA
AAAAAAAAA
2175
2223
2271
2319
2379
2428 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 746 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
| Met -23 | Leu | Thr | Met -20 | Gly | Arg | Leu | Gin | Leu -15 | Val | Val | Leu | Gly | Leu -1C | cys | |
| Cys | Trp | Ala -5 | Val | Ala | Ser | Ala | Ala 1 | Lys | Leu | Gly | Ala 5 | Val | Tyr | Chr | Glu |
| Gly 10 | Gly | Phe | Val | Glu | Gly 15 | Val | Asn | Lys | Lys | Leu 20 | Gly | Leu | Leu | S—v | Asp 25 |
| Ser | Val | Asp | Ile | Phe 30 | Lys | Gly | Ile | Pro | Phe 35 | Ala | Ala | Pro | Thr | Lvs 40 | Ala |
| Leu | Glu | Asn | Pro 45 | Gin | Pro | His | Pro | Gly 50 | Trp | Gin | Gly | Thr | Leu 55 | Lys | Ala |
| Lys | Asn | Phe 60 | Lys | Lys | Arg | Cys | Leu 65 | Gin | Ala | Thr | Ile | Thr 70 | Gin | Asp | Ser |
| • · · • 4 4 4 4 | 4 · 4 • • 4 · 4 | • 4 4 4 4 4 4 4 4 | 4 • • 4 • | 4 4 • 4 4 4 4 • 4 | 4 • | ||||||||||
| • · • 4 4 4 4 | * | ||||||||||||||
| Thr | Tyr 75 | Gly | Asp | Glu | Asp | Cys 80 | Leu | Tyr | Leu | Asn | Ile 85 | Trp | Val | Pro | Gin |
| Gly 90 | Arg | Lys | Gin | Val | Ser 95 | Arg | Asp | Leu | Pro | Val 100 | Met | Ile | Trp | Ile | Tyr 105 |
| Gly | Gly | Ala | Phe | Leu 110 | Met | Gly | Ser | Gly | His 115 | Gly | Ala | Asn | Phe | Leu 120 | Asn |
| Asn | Tyr | Leu | Tyr 125 | Asp | Gly | Glu | Glu | Ile 130 | Ala | Thr | Arg | Gly | Asn 135 | Val | Ile |
| Val | Val | Thr 140 | Phe | Asn | Tyr | Arg | Val 145 | Gly | Pro | Leu | Gly | Phe 150 | Leu | Ser | Thr |
| Gly | Asp 155 | Ala | Asn | Leu | Pro | Cly 160 | Asn | Tyr | Gly | Leu | Arg 165 | Asp | Gin | His | Met |
| Ala 170 | Ile | Ala | Trp | Val | Lys 175 | Arg | Asn | Ile | Ala | Ala 180 | Phe | Gly | Gly | Asp | Pro 18S |
| Asn | Asn | Ile | Thr | Leu 190 | Phe | Gly | Glu | Ser | Ala 195 | Gly | Gly | Ala | Ser | Val 200 | Ser |
| Leu | Gin | Thr | Leu 205 | Ser | Pro | Tyr | Asn | Lys 210 | Gly | Leu | Ile | Arg | Arg 215 | Ala | Ile |
| Ser | Gin | Ser 220 | Gly | Val | Ala | Leu | Ser 225 | Pro | Trp | Val | Ile | Gin 230 | Lys | Asn | Pro |
| Leu ' | Phe 235 | Trp | Ala | Lys | Lys | Val 240 | Ala | Glu | Lys | Val | Gly 245 | Cys | Pro | Val | Gly |
| Asp 250 | Ala | Ala | Arg | Met | Ala 255 | Gin | Cys | Leu | Lys | Val 260 | Thr | Asp | Pro | Arg | Ala 265 |
| Leu | Thr | Leu | Ala | Tyr 270 | Lys | Val | Pro | Leu | Ala 275 | Gly | Leu | Glu | Tyr | Pro 280 | Met |
| Leu | His | Tyr | Val 285 | Gly | Phe | Val | Pro | Val 290 | Ile | Asp | Gly | Asp | Phe 295 | Ile | Pro |
| Ala | Asp | Pro 300 | Ile | Asn | Leu | Tyr | Ala 305 | Asn | Ala | Ala | Asp | Ile 310 | Asp | Tyr | Ile |
| Ala | Gly 315 | Thr | Asn | Asn | Met | Asp 320 | Gly | His | Ile | Phe | Ala 32S | Ser | Ile | Asp | Met |
| Pro 330 | Ala | Ile | Asn | Lys | Gly 335 | Asn | Lys | Lys | Val | Thr 340 | Glu | Glu | Asp | Phe | Tyr 345 |
| Lys | Leu | Val | Ser | Glu 350 | Phe | Thr | Ile | Thr | Lys 355 | Gly | Leu | Arg | Gly | Ala 360 | Lys |
| Thr | Thr | Phe | Asp 365 | Val | Tyr | Thr | Glu | Ser 370 | Trp | Ala | Gin | Asp | Pro 375 | Ser | Gin |
| Glu | Asn | Lys 380 | Lys | Lys | Thr | Val | Val 385 | Asp | Phe | Glu | Thr | Asp 390 | Val | Leu | Phe |
| Leu | Val 395 | Pro | Thr | Glu | Ile | Ala 400 | Leu | Ala | Gin | His | Arg 405 | Ala | Asn | Ala | Lys |
| Ser 410 | Ala | Lys | Thr | Tyr | Ala 415 | Tyr | Leu | Phe | Ser | His 420 | Pro | Ser | Arg | Met | Pro 425 |
| Val | Tyr | Pro | Lys | Trp 430 | Val | Gly | Ala | Asp | His 435 | Ala | Asp | Asp | Ile | Gin 440 | Tyr |
Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gin Asp 445 450 455 : :.3.5-
• · · · ·
| Ařg | Thr | Val 460 | Ser | Lys | Ala | Met | Ile Ala 465 | Tyr | Trp | Thr | Asn 470 | Phe | Ala | Lys |
| Thr | Gly 475 | Asp | Pro | Asn | Met | Gly 480 | Asp Ser | Ala | Val | Pro 485 | Thr | His | Trp | Glu |
| Pro 490 | Tyr | Thr | Thr | Glu | Asn 495 | Ser | Gly Tyr | Leu | Glu 500 | Ile | Thr | Lys | Lys | Met 505 |
| Cly | Ser | Ser | Ser | Met 510 | Lye | Arg | Ser Leu | Arg 515 | Thr | Asn | Phe | Leu | Arg 520 | Tyr |
| Trp | Thr | Leu | Thr 525 | Tyr | Leu | Ala | Leu Pro 530 | Thr | Val | Thr | Asp | Gin 535 | Glu | Ala |
| Thr | Pro | Val 540 | Pro | Pro Thr | Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val | Pro | Pro | ||||||||
| S45 | 550 | ||||||||||||||
| Thr | Gly | Asp | Ser | Glu | Thr | Ala | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly |
| 555 | 560 | 565 | |||||||||||||
| Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro |
| 57 0 | 57 5 | 580 | 585 | ||||||||||||
| Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser |
| 590 | 595 | 600 | |||||||||||||
| Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val |
| 605 | 610 | 615 | |||||||||||||
| Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp |
| 620 | 625 | 630 | |||||||||||||
| Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ala | Gly | Pro | Pro | Pro |
| 635 | 640 | 645 | |||||||||||||
| Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly |
| 650 | 655 | 660 | 665 | ||||||||||||
| Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Thr | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Glu | Thr | Ala |
| 670 | 675 | 680 | |||||||||||||
| Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr |
| 685 | 690 | 695 | |||||||||||||
| Gly | Asp | Ser | Glu | Ala | Ala | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Asp | Asp | Ser | Lys | Glu |
| 700 | 705 | 710 | |||||||||||||
| Ala | Gin | Met | Pro | Ala | Val | Ile | Arg | Phe | * | ||||||
| 715 | 77.0 |
• · · · « • « • · · · · · · (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 722 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:
(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Homo sapiens (F) Typ tkáně: Prsní žláza (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
| Ala | Lys | Leu | Gly | Ala | Val | Tyr | Thr | Glu | Gly | Gly | Phe | Val | Glu | Gly | Val |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Asn | Lys | Ly» | Leu | Gly | Leu | Leu | Gly | Asp | Ser | Val | Asp | 11· | Phe | Ly» | Gly |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| 11« | Pro | Phe | Ala | Ala | Pro | Thr | Ly» | Ala | Leu | Glu | Asn | Pro | Gin | Pro | His |
| 35 | 40 | 45 |
Pro Cly Trp Gin Gly Thr Leu Ly» Ala Ly» A»n Phe Ly» Ly» Arg Cys 50 55 60 ·· ····
| Leu 65 | Gin | Ala | Thr | 11« | Thr 70 | Gin | Asp | Ser | Thr | Tyr 75 | Gly | Asp | Glu | Asp | Cys 80 |
| Leu | Tyr | Leu | Asn | Ile 85 | Trp | Val | Pro | Gin | Gly 90 | Arg | Lys | Gin | Val | Ser 95 | Arg |
| Asp | Leu | Pro | Val 100 | Met | Ile | Trp | Ile | Tyr 105 | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu 110 | Met | Gly |
| Ser | Gly | His 115 | Gly | Ala | Asn | Phe | Leu 120 | Asn | Asn | Tyr | Leu | Tyr 125 | Asp | Gly | Glu |
| Glu | Ile 130 | Ala | Thr | Arg | Gly | Asn 135 | Val | Ile | Val | Val | Thr 140 | Phe | Asn | Tyr | Arg |
| Val 145 | Gly | Pro | Leu | Gly | Phe 150 | Leu | Ser | Thr | Gly | Asp 155 | Ala | Asn | Leu | Pro | Gly 160 |
| Asn | Tyr | Gly | Leu | Arg 165 | Asp | Gin | H4s | Met | Ala 170 | Ile | Ala | Trp | Val | Lys 175 | Arg |
| Asn | Ile | Ala | Ala 180 | Phe | Gly | Gly | Asp | Pro 185 | Asn | Asn | Ile | Thr | Leu 190 | Phe | Gly |
| Glu | Ser | Ala 195 | Gly | Gly | Ala | Ser | Val 200 | Ser | Leu | Gin | Thr | Leu 205 | Ser | Pro | Tyr |
| Asn | Lys 210 | Gly | Leu | Ile | Arg | Arg 215 | Ala | Ile | Ser | Gin | Ser 220 | Gly | Val | Ala | Leu |
| Ser 225 | Pro | Trp | Val | Ile | Gin 230 | Lys | Asn | Pro | Leu | Phe 235 | Trp | Ala | Lys | Lys | Val 240 |
| Ala | Glu | Lys | Val | Gly 245 | Cys | Pro | Val | Gly | Asp 250 | Ala | Ala | Arg | Met | Ala 255 | Gin |
| Cys | Leu | Lys | Val 260 | Thr | Asp | Pro | Arg | Ala 265 | Leu | Thr | Leu | Ala | Tyr 270 | Lys | Val |
| Pro | Leu | Ala 275 | Gly | Leu | Glu | Tyr | Pro 280 | Met | Leu | His | Tyr | Val 285 | Gly | Phe | Val |
| Pro | Val 290 | Ile | Asp | Gly | Asp | Phe 295 | Ile | Pro | Ala | Asp | Pro 300 | Ile | Asn | Leu | Tyr |
| Ala 305 | Asn | Ala | Ala | Asp | Ile 310 | Asp | Tyr | Ile | Ala | Gly 315 | Thr | Asn | Asn | Met | Asp 320 |
| Gly | His | Ile | Phe | Ala 325 | Ser | Ile | Asp | Met | Pro 330 | Ala | Ile | Asn | Lys | Gly 335 | Asn |
| Lys | Lys | Val | Thr 340 | Glu | Glu | Asp | Phe | Tyr 345 | Lys | Leu | Val | Ser | Glu 350 | Phe | Thr |
| Ile | Thr | Lys 3S5 | Gly | Leu | Arg | Gly | Ala 360 | Lys | Thr | Thr | Phe | Asp 365 | Val | Tyr | Thr |
| Glu | Ser 370 | Trp | Ala | Gin | Asp | Pro 375 | Ser | Gin | Glu | Asn | Lys 380 | Lys | Lys | Thr | Val |
| Val 385 | Asp | Ph· | Glu | Thr | Asp 390 | Val | Leu | Phe | Leu | Val 395 | Pro | Thr | Glu | Ile | Ala 400 |
| Leu | Ala | Gin | His | Arg 405 | Ala | Asn | Ala | Lys | Ser 410 | Ala | Lys | Thr | Tyr | Ala 415 | Tyr |
| Leu | Phe | Ser | His 420 | Pro | Ser | Arg | Met | Pro 425 | Val | Tyr | Pro | Lys | Trp 430 | Val | Gly |
| Ala | Asp | His 435 | Ala | Asp | Asp | Ile | Gin 440 | Tyr | • · • · • · • · • · • · Val | • · · · • • · · Phe | • · • · Gly | • · • • • | • · • · • Pro | ·· ·· • • ·· · « • · • · · Phe | • · • • Ala |
| Lys 445 | |||||||||||||||
| thr | Pro | Thr | Gly | Tyr | Arg | Pro | Gin | Asp | Arg | Thr | Val | Ser | Lys | Ala | Met |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Zle | Ala | Tyr | Trp | Thr | Asn | Phe | Ala | Lys | Thr | Gly | Asp | Pro | Asn | Met | Gly |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Asp | Ser | Ala | Val | Pro | Thr | His | Trp | Glu | Pro | Tyr | Thr | Thr | Glu | Asn | Ser |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Gly | Tyr | Leu | Glu | Ile | Thr | Lys | Lys | Met | Gly | Ser | Ser | Ser | Met | Lys | Arg |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Ser | Leu | Arg | Thr | Asn | Phe | Leu | Arg | Tyr | Trp | Thr | Leu | Thr | Tyr | Leu | Ala |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Leu | Prc | Thr | Val | Thr | Asp | Gin | Glu | Ala | Thr | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly |
| 53 0 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Asp | Ser | Glu | Ala | Thr | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Glu | Thr | Ala |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| ?ro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| ?ro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| A—& | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro |
| = 25 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| Pro | Thr | Gly | Asp | Ala | Gly | Pro | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | |
| 660 | 655 | 670 | |||||||||||||
| Thr | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Glu | Thr | Ala | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp |
| 575 | 680 | 685 | |||||||||||||
| Sex | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Glu | Ala | Ala | Pro |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| Val | Pro | Pro | Thr | Asp | Asp | Ser | Lys | Glu | Ala | Gin | Met | Pro | Ala | Val | Ile |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| Arg | Ph· | ||||||||||||||
| (2) | Informace pro SEQ ID NO: | 4 : |
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 568 aminokyselin
Λ?
(B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:
(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Homo sapiens (F) Typ tkáně: Prsní žláza (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: peptid (B) Umístění: 1...568 (D) Jiné informace: /značka = Variant_C (x) Publikační informace:
(A) Autoři: Hansson, Lennart Blacberg, Lars Edludn, Michael Lundberg, Lennart Stromqvist, Mats Hernell, Olle (B) Titul: Rekombinantní žlučovými solemi stimulovaná lipasa lidského mléka (C) Časopis: Eur. J. Biochem.
(D) Svazek: 268 (E) Ročník: 35 (F) Strany: 26692 - 26698 (G) Datum: 15.12.1993 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
| Ala 1 | Lys | Leu | Gly | Ala 5 | Val | Tyr | Thr | Glu | Gly 10 | Gly | Phe | Val | Glu | Gly 15 | Val |
| Asn | Lys | Lys | Leu 20 | Gly | Leu | Leu | Gly | Asp 25 | Ser | Val | Asp | Ile | Phe 30 | Lys | Gly |
| Ile | Pro | Phe 35 | Ala | Ala | Pro | Thr | Lys 40 | Ala | Leu | Glu | Asn | Pro 45 | Gin | Pro | His |
| Pro | Gly 50 | Trp | Gin | Gly | Thr | Leu 55 | Lys | Ala | Lys | Asn | Phe 60 | Lys | Lys | Arg | Cys |
| Leu 65 | Gin | Ala | Thr | Ile | Thr 70 | Gin | Asp | Ser | Thr | Tyr 75 | Gly | Asp | Glu | Asp | Cys 80 |
| Leu | Tyr | Leu | Asn | Ile 85 | Trp | Val | Pro | Gin | Gly 90 | Arg | Lys | Gin | Val | Ser 95 | Arg |
| Asp | Leu | Pro | Val 100 | Met | Ile | Trp | Ile | Tyr 105 | Gly | Gly | Ala | Phe | Leu 110 | Met | Gly |
| Ser | Gly | His 115 | Gly | Ala | Asn | Phe | Leu 120 | Asn | Asn | Tyr | Leu | Tyr 125 | Asp | Gly | Glu |
| Glu | Ile 130 | Ala | Thr | Arg | Gly | Asn 135 | Val | Ile | Val | Val | Thr 140 | Phe | Asn | Tyr | Arg |
| Val 145 | Gly | Pro | Leu | Gly | Phe 150 | Leu | Ser | Thr | Gly | Asp 155 | Ala | Asn | Leu | Pro | Cly 160 |
| Asn | Tyr | Gly | Leu | Arg 165 | Asp | Gin | His | Met | Ala 170 | Ile | Ala | Trp | Val | Lys 175 | Arg |
| Asn | Ile | Ala | Ala 180 | Phe | Gly | Gly | Asp | Pro 185 | Asn | Asn | Ile | Thr | Leu 190 | Phe | Gly |
| Glu | Ser | Ala 195 | Gly | Gly | Ala | Ser | Val 200 | Ser | Leu | Gin | Thr | Leu 205 | Ser | Pro | Tyr |
| • · • · • · • · | • • · · 3.2/ | • • • | • • • • · · « | • 1 • < • • | » · » · • · · • • · | • • • • • | |||||||||
| Asn | Lys 210 | Gly | Leu | Ile | Arg | Arg 215 | Ala | Ile | Ser | Gin | Ser 220 | Gly | Val | Ala | Leu |
| Ser 225 | Pro | Trp | Val | Ile | Gin 230 | Lys | Asn | Pro | Leu | Ph· 235 | Trp | Ala | Lys | Lys | Val 240 |
| Ala | Glu | Lys | Val | Gly 245 | Cys | Pro | Val | Gly | Asp 250 | Ala | Ala | Arg | Met | Ala 255 | Gin |
| Cys | Leu | Lys | Val 260 | Thr | Asp | Pro | Arg | Ala 265 | Leu | Thr | Leu | Ala | Tyr 270 | Lys | Val |
| Pro | Leu | Ala 275 | Gly | Leu | Glu | Tyr | Pro 280 | Met | Leu | His | Tyr | Val 285 | Gly | Phe | Val |
| Pro | Val 290 | Ile | Asp | Gly | Asp | Phe 295 | Ile | Pro | Ala | Asp | Pro 300 | Ile | Asn | Leu | Tyr |
| Ala 305 | Asn | Ala | Ala | Asp | Ile 310 | Asp | Tyr | Ile | Ala | Gly 315 | Thr | Asn | Asn | Met | Asp 320 |
| Gly | His | Ile | Phe | Ala 325 | Ser | Ile | Asp | Met | Pro 330 | Ala | Ile | Asn | Lys | Gly 335 | Asn |
| Lys | Lys | Val | Thr 340 | Glu | Clu | Asp | Phe | Tyr 345 | Lys | Leu | Val | Ser | Glu 350 | Phe | Thr |
| Ile | Thr | Lys 355 | Gly | Leu | Arg | Gly | Ala 360 | Lys | Thr | Thr | Phe | Asp 365 | Val | Tyr | Thr |
| Glu | Ser 370 | Trp | Ala | Gin | Asp | Pro 375 | Ser | Gin | Glu | Asn | Lys 380 | Lys | Lys | Thr | Val |
| Val 385 | Asp | Ph· | Glu | Thr | Asp 390 | Val | Leu | Phe | L-su | Val 395 | Pro | Thr | Glu | Ile | Ala 400 |
| Leu | Ala | Gin | His | Arg 405 | Ala | Asn | Ala | Lys | Ser 410 | Ala | Lys | Thr | Tyr | Ala 415 | Tyr |
| Leu | Phe | Ser | His 420 | Pro | Ser | Arg | Met | Pro 425 | Val | Tyr | Pro | Lys | Trp 430 | Val | Gly |
| Ala | Asp | His 435 | Ala | Asp | Asp | Ile | Gin 440 | Tyr | Val | Phe | Gly | Lys 445 | Pro | Phe | Ala |
| Thr | Pro 450 | Thr | Gly | Tyr | Arg | Pro 455 | Gin | Asp | Arg | Thr | Val 460 | Ser | Lys | Ala | Met |
| Ile 465 | Ala | Tyr | Trp | Thr | Asn 470 | Phe | Ala | Lys | Thr | Gly 475 | Asp | Pro | Asn | Met | Gly 480 |
| Asp | Ser | Ala | Val | Prc 485 | Thr | His | Trp | Glu | Pro 490 | Tyr | Thr | Thr | Glu | Asn 495 | Ser |
| Gly | Tyr | Leu | Glu 500 | Ile | Thr | Lys | Lys | Met 505 | Gly | Ser | Ser | Ser | Met 510 | Lys | Arg |
| Ser | Leu | Arg 515 | Thr | Asn | Phe | Leu | Arg 520 | Tyr | Trp | Thr | Leu | Thr 525 | Tyr | Leu | Ala |
| Leu | Pro 530 | Thr | Val | Thr | Asp | Gin 535 | Cly | Ala | Pro | Pro | Val 540 | Pro | Pro | Thr | Gly |
| Asp 545 | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro 550 | Val | Pro | Pro | Thr | Gly 555 | Asp | Ser | Ly« | Glu | Ala 560 |
Gin Met Pro XI* Val II· Arg Ph·
Claims (14)
1. DNA molekula obsahující:
(a) region kódující polypeptid, který je lidská BSSL nebo její biologicky aktivní varianta.
(b) region kódující signální peptid schopný řízení sekrece uvedeného polypeptidu z Pichia pastoris transformované uvedenou DNA molekulou připojený na 5'-konec uvedeného polypeptidu; a (c) methanol oxidasový promotor Pichia pastoris nebo funkčně ekvivalentní promotor operativně navázaný na uvedené kódující regiony definované v (a) a (b).
2. DNA molekula podle nároku 1, kde uvedený signální peptid je identický k, nebo významně podobný s, peptidem s aminokyselinovou sekvencí ukázanou jako aminokyseliny -20 až -1 SEQ ID NO: lv Seznamu sekvencí.
3. DNA molekula podle nároku 1, kde uvedený signální peptid obsahuje invertasový signální peptid Saccharomyces cerevisiae.
4. DNA molekula podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 kódující biologicky aktivní variantu BSSL, ve které je alespoň jedna z opakujících se jednotek o 11 aminokyselinách deletována, kde uvedené opakující se jednotky jsou ukázány v SEQ ID NO: 1.
5. DNA molekula podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 kódující polypeptid, který má BSSL aktivitu a aminokyselinovou sekvenci, které je z alespoň z 95% homologní se sekvencí podle SEQ ID NO:
···· ··· ·· · · · A • A A A · · · · * • ·..„·* · · » ·· · · • · 41· · · ··
AA A·· A· · · ·β· · · ·
3 nebo SEQ ID NO: 4.
6. DNA molekula podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 kódující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4.
7. Vektor obsahující DNA molekulu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6.
8. Replikovatelný expresní vektor podle nároku 7, který je schopný zprostředkování exprese lidské BSSL, nebo její biologicky aktivní varianty, v buňkách Pichia pastoris.
9. Vektor podle nároku 8, který je plasmidový vektor pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) nebo pARC 5797 (NCIMB 40722) .
10. Hostitelské buňky rodu Pichia transformované vektorem podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9.
11. Hostitelské buňky podle nároku 10, které jsou Pichia pastoris buňky.
12 .
Hostitelské buňky podle nároku
11, které jsou Pichia pastoris buňky kmene GS115.
13. Hostitelské buňky podle nároku 12, které jsou PPF-l(pARC 5771) (NCIMB 40721), GS115(pARC 5799)(NCIMB 40723) nebo GS115(pARC 5797) (NCIMB 40722).
14. Způsob pro produkci polypeptidu, který je lidská BSSL, ·· ···· » · ·
I · · · · : : 43* ·· ·· · • · · • · α »»· · • · • · · nebo její biologicky aktivní varianta, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje kultivaci hostitelských buněk podle jakéhokoliv z nároků 10 až 13 za podmínek, kdy je uvedený polypeptid secernován do kultivačního media, a získání uvedeného polypeptidů z kultivačního media.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9501939A SE9501939D0 (sv) | 1995-05-24 | 1995-05-24 | DNA molecules for expression of polypeptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ297397A3 true CZ297397A3 (cs) | 1998-03-18 |
Family
ID=20398427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ972973A CZ297397A3 (cs) | 1995-05-24 | 1996-03-12 | DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL) |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0832257A1 (cs) |
| JP (1) | JP2000510683A (cs) |
| KR (1) | KR19980703238A (cs) |
| CN (1) | CN1185812A (cs) |
| AU (1) | AU5165696A (cs) |
| CZ (1) | CZ297397A3 (cs) |
| EE (1) | EE9700321A (cs) |
| HU (1) | HUP9802388A3 (cs) |
| IL (1) | IL118335A0 (cs) |
| PL (1) | PL322848A1 (cs) |
| RU (1) | RU2157847C2 (cs) |
| SE (1) | SE9501939D0 (cs) |
| TR (1) | TR199701010T1 (cs) |
| TW (1) | TW434314B (cs) |
| WO (1) | WO1996037622A1 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001255501A1 (en) * | 2000-04-21 | 2001-11-07 | Monsanto Technology Llc | Blood-pressure reducing polypeptides containing vpp derived from microorganisms |
| KR100717353B1 (ko) * | 2006-04-12 | 2007-05-11 | 한국생명공학연구원 | 피키아 파스토리스 유래의 자동 유도성 ｎｐｓ 프로모터 및이를 이용한 이종 단백질의 제조방법 |
| CN103952386A (zh) * | 2014-03-31 | 2014-07-30 | 四川农业大学 | 利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶ppl的方法 |
| RU2697218C1 (ru) * | 2018-07-11 | 2019-08-13 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae |
| CA3146193A1 (en) * | 2019-07-12 | 2021-01-21 | Lipum Ab | Novel bssl antibodies |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200183A (en) * | 1987-11-19 | 1993-04-06 | Oklahoma Medical Research Foundation | Recombinant bile salt activated lipases |
| NO177065C (no) * | 1988-09-26 | 1995-07-12 | Labofina Sa | Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym |
| EP0438200B1 (en) * | 1990-01-16 | 2002-07-17 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia | Method for the expression of heterologous genes in the yeast Pichia pastoris, expression vectors and transformed microorganisms |
| EP0443063A1 (en) * | 1990-02-22 | 1991-08-28 | Henkel Research Corporation | Pseudomonas lipase gene, vectors for the expression thereof, production of the lipase by transformed microorganisms and uses of this enzyme |
| WO1991016422A1 (de) * | 1990-04-14 | 1991-10-31 | Kali-Chemie Aktiengesellschaft | Alkalische bacillus-lipasen, hierfür codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren |
| JPH074256B2 (ja) * | 1990-10-31 | 1995-01-25 | 栗田工業株式会社 | リパーゼの活性発現を調節する遺伝子、ベクターおよびリパーゼの生産方法 |
| IS4130A (is) * | 1993-03-01 | 1994-09-02 | Ab Astra | Ný fjölpeptíð |
-
1995
- 1995-05-24 SE SE9501939A patent/SE9501939D0/xx unknown
-
1996
- 1996-03-12 EP EP96908415A patent/EP0832257A1/en not_active Withdrawn
- 1996-03-12 HU HU9802388A patent/HUP9802388A3/hu unknown
- 1996-03-12 WO PCT/SE1996/000318 patent/WO1996037622A1/en not_active Ceased
- 1996-03-12 CZ CZ972973A patent/CZ297397A3/cs unknown
- 1996-03-12 KR KR1019970706642A patent/KR19980703238A/ko not_active Ceased
- 1996-03-12 RU RU97117367/13A patent/RU2157847C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-03-12 JP JP08535592A patent/JP2000510683A/ja not_active Abandoned
- 1996-03-12 AU AU51656/96A patent/AU5165696A/en not_active Abandoned
- 1996-03-12 PL PL96322848A patent/PL322848A1/xx unknown
- 1996-03-12 CN CN96194083A patent/CN1185812A/zh active Pending
- 1996-03-12 EE EE9700321A patent/EE9700321A/xx unknown
- 1996-03-12 TR TR97/01010T patent/TR199701010T1/xx unknown
- 1996-04-10 TW TW085104253A patent/TW434314B/zh active
- 1996-05-20 IL IL11833596A patent/IL118335A0/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EE9700321A (et) | 1998-06-15 |
| CN1185812A (zh) | 1998-06-24 |
| HUP9802388A2 (hu) | 1999-02-01 |
| TW434314B (en) | 2001-05-16 |
| HUP9802388A3 (en) | 2000-10-30 |
| JP2000510683A (ja) | 2000-08-22 |
| SE9501939D0 (sv) | 1995-05-24 |
| TR199701010T1 (xx) | 1998-01-21 |
| IL118335A0 (en) | 1996-09-12 |
| PL322848A1 (en) | 1998-02-16 |
| EP0832257A1 (en) | 1998-04-01 |
| WO1996037622A1 (en) | 1996-11-28 |
| KR19980703238A (ko) | 1998-10-15 |
| RU2157847C2 (ru) | 2000-10-20 |
| AU5165696A (en) | 1996-12-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3795073B2 (ja) | 酵母株および修飾アルブミン | |
| EP0481008B1 (en) | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector | |
| FI104497B (fi) | DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta | |
| US5795776A (en) | Expression plasmids regulated by an OSMB promoter | |
| NZ243782A (en) | Kluyveromyces host/vector couple and its use | |
| NZ249153A (en) | Human serum albumin, preparation and pharmaceutical compositions | |
| HK1053145A1 (en) | Cloning and expressing an acid-resistant extracellular lipase of yarrowia lipolytica | |
| EP1002095B1 (en) | Improved protein expression strains | |
| US5627046A (en) | Yeast promoter and its use | |
| US5516679A (en) | Penicillin V amidohydrolase gene from Fusarium oxysporum | |
| CZ297397A3 (cs) | DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL) | |
| Rodriguez et al. | Invertase secretion in Hansenula polymorpha under the AOX1 promoter from Pichia pastoris | |
| Phongdara et al. | Cloning and characterization of the gene encoding a repressible acid phosphatase (PHO1) from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha | |
| EP0362183A2 (en) | Process for the production of human lysozyme | |
| EP0570096B1 (en) | Ornithine carbamoyl transferase gene and its use as a marker gene in a host-vector system for the production of proteins in basidiomycetes | |
| AU715297B2 (en) | DNA molecules for expression of polypeptides | |
| JP3794760B2 (ja) | フィターゼ生産酵母 | |
| JPH04229188A (ja) | 融合タンパク質の試験管内プロセシング | |
| US6004776A (en) | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector | |
| EP0154350A2 (en) | Novel expression plasmids containing the full cDNA sequence of calf prochymosin | |
| JP2752092B2 (ja) | Ｄｅｏプロモーターを有する発現プラスミド及び該プラスミドを含む細菌宿主 | |
| KR970005584B1 (ko) | 폴리 펩타이드의 개선된 제조방법 | |
| JPH06503718A (ja) | メチロトローフ酵母細胞におけるヒトリゾチムの産生とその効率的な分泌 | |
| MXPA97006853A (en) | A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl) | |
| JP3379133B2 (ja) | オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子およびその利用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |