CZ297397A3 - DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL) - Google Patents

DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL) Download PDF

Info

Publication number
CZ297397A3
CZ297397A3 CZ972973A CZ297397A CZ297397A3 CZ 297397 A3 CZ297397 A3 CZ 297397A3 CZ 972973 A CZ972973 A CZ 972973A CZ 297397 A CZ297397 A CZ 297397A CZ 297397 A3 CZ297397 A3 CZ 297397A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ala
gly
thr
wall
leu
Prior art date
Application number
CZ972973A
Other languages
English (en)
Inventor
Goutam Das
Original Assignee
Astra Aktiebolag (Publ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20398427&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ297397(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Astra Aktiebolag (Publ) filed Critical Astra Aktiebolag (Publ)
Publication of CZ297397A3 publication Critical patent/CZ297397A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL)
Oblast techniky
Vynález se týká DNA molekul, rekombinantních vektorů a buněčných kultur pro použití v metodách pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL) v methylotrofické kvasince Pichia pastoris.
Dosavadní stav techniky
Žlučovými solemi stimulované lipase (BSSL) (viz Wang and Hartsuck, 1993) se přičítá většina lipolytické aktivity lidského mléka. Charakteristickou vlastností této lipasy je to, že vyžaduje primární žlučové sole pro aktivitu proti emulsifikovaným triacylglycerolům s dlouhým řetězcem. BSSL byla doposud nalezena pouze v mléku od lidí, goril, koček a psů (Hernell et al., 1989) .
BSSL byla přisouzena zásadní role pro trávení mléčných lipidů ve střevě kojených dětí (Fredrikzon et al., 1978). BSSL syntetizována u lidí v laktující mléčné žláze a je secernována s mlékem (Blacberg et al., 1987). Tvoří asi 1% celkových mléčných proteinů (Blackberg and Hernell, 1981).
Bylo předpokládáno, že BSS1 je hlavním limitujícím faktorem při absorpci tuků a následném růstu, zejména nezralých, dětí, které mají deficientní jejich vlastní produkci BSSL, a že suplementace přípravky s purifikovaným enzymem signifikantně zlepšuje trávení a růst těchto dětí (US 4944944; Oklahoma Medical Research Foundation). Toto je klinicky významné pro přípravu • Λ
dětských přípravků, které obsahují relativně vysoké procento triglyceridů a které jsou založeny na rostliných proteinech nebo na proteinech jiných než z lidského mléka, protože děti krmené těmito přípravky nejsou schopné trávit tuk za nepřítomnosti přidané BSSL.
cDNA struktury jak pro mléčnou BSSL, tak pro pankreatickou karboxylickou ester hydrolasu (CEH) byly charakterizovány (Baba et al., 1991; Hui and Kissel, 1991; Nilsson et al., 1991; Reue et al., 1991) a byl vyvozen závěr, že mléčný enzym a pankreatický enzym jsou produkty stejného genu, CEL genu. cDNA sekvence (SEQ ID NO: 1) CEL genu je popsána v US 5200183 (Oklahoma Medical Research Foundation); WO 91/18293 (Aktiebolaget Astra); Nilsson et al., (1990); a Baba et al., (1991). Dedukovaná aminokyselinová sekvence BSSL, včetně signální sekvence o 23 aminokyselinách, je ukázána jako SEQ ID NO: 2 v Seznamu sekvencí, zatímco sekvence nativního proteinu o 722 aminokyselinách je ukázána jako SEQ ID NO: 3 .
C-terminální region proteinu obsahuje 16 repeatů každý o 11 aminokyselinách, po kterých následuje 11 aminokyselin konzervovaného úseku. Nativní protein je vysoce glykosylován a byl popsán velký rozsah pozorovaných molekulových hmotností. Toto může pravděpodobně být vysvětleno různým rozsahem glykosylace (Abouakil et al., 1988). N-terminální polovina proteinu je homologní k acetylcholin esterase a některým jiným esterasám (Nilsson et al., 1990).
Rekombinantní BSSL může být produkován expresí ve vhodných hostitelých jako je E. coli, Saccharomyces cerevisiae, nebo v savčích buněčných liniích. Pro zvýšení BSSL expresního systému • · • · · · • · pro dosažení komerčně uplatnitelné produkce může být počítáno s použitím heterologních expresních systémů. Jak bylo uvedeno výše, lidský BSSL má 11 repeatů o 11 aminokyselinách na C-terminálním konci. Pro určení biologické signifikance těchto opakujících se regionů byly konstruovány různé mutanty lidského BSSL, které postrádaly část nebo všechny tyto opakující se regiony (Hansson et al., 1993). Varianta BSSL-C (SEQ ID NO: 4), například,má delece od aminokyselinového zbytku 536 do 568 a od aminokyselinového zbytku 591 do 711. Expresní studie, za použití savčí buněčné linie C127 jako hostitele a expresního vektoru hovězího papilloma viru, ukázaly, že různé varianty mohou být exprivovány v aktivní formě )Hansson et al., 1993). Z expresních studií bylo také odvozeno, že na prolin bohaté repeaty v lidském BSSL nejsou zásadní pro katalytickou aktivitu nebo aktivaci BSSL žlučovými solemi. Nicméně, produkce BSSL nebo jeho mutantů v savčích expresních systémech by mohla být příliš nákladná pro rutiní terapeutické použití.
Eukaryotické systémy, jako jsou kvasinky, mohou poskytnout signifikantní výhody ve srovnání s prokaryotickými systémy, pro produkci jistých polypeptidů kódovaných rekombinantní DNA. Například, kvasinky mohou být obecně kultivovány ve vyšších buněčných hustotách než bakterie a mohou být schopné glykosylace exprivovaných polypeptidů tam, kde je taková glykosylace významná pro biologickou aktivitu. Nicméně, použití kvasinky Saccharomyces cerevisiae jako hostitelského organismu často vede k nízkým hladinám exprese a slabé sekreci rekombinantního proteinu (Cregg et al., 1987). Maximální hladiny heterologních proteinů jsou u S. cerevisiae v oblasti 5% celkového buněčného proteinu (Kingsman et al., 1985). Další nevýhodou použití Saccharomyces cerevisiae jako hostitele je to, že rekombinantní proteiny mají tendenci být • · · « • · • · • · · · « « · · · « « • · · • · · · · • · «
Λ* · · ^ · · · · · · nadměrně glykosylovány, což může ovlivnit aktivitu glykosylovaných savčích proteinů.
Pichia pastoris je methylotrofní kvasinka, která může růst na methanolu jako jediném zdroji uhlíku a energie, protože obsahuje vysoce regulovanou dráhu využití methanolu (Ellis et al., 1985) .
P. pastoris je také přístupná účinné fermetační technologii s vysokou hustotou buněk. Proto rekombinantní DNA technologie a účinné metody pro transformaci kvasinek umožňují vyvinout P. pastoris jako hostitele pro expresi heterologních proteinů ve velkém množství, s expresním systémem založeným na promotoru methanol oxidasy (Cregg et al., 1987).
V oboru je známé použití Pichia pastoris jako hostitele pro expresi např. následujících heterologních proteinů: lidského tumor nekrosis faktoru (EP-A-0263311); Bordetella pertactin antigenů (WO 91/15571); povrchového antigenu hepatitidy B (Cregg et al., 1987); lidského lysozymového proteinu (WO 92/04441); aprotininu (WO 92/01048). Nicméně, úspěšná exprese heterologních proteinů v aktivní, solubilní a secernované formě závisí na mnoha faktorech, např. správné volbě signálního peptidů, správné konstrukci fúsního spojení mezi signálním peptidem a zralým proteinem, kultivačních podmínkách, atd.
Podstata vynálezu
Účelem vynálezu je překonat výše uvedené nedostatky dříve uvedených systémů a poskytnout metodu pro produkci lidské BSSL, která by byla finančně efektivní a která by dávala výnos srovnatelný, nebo vyšší, než produkce v jiných organismech. Tento účel byl dosažen poskytnutím metody pro expresi BSSL v buňkách • · • · * • ·
Pichia pastoris.
Tímto vynáezem je proto ukázáno, že lidská BSSL a variantní BSSL-C mohou být exprivovány v aktivní formě secernované z P. pastoris. Nativní signální peptid, stejně jako heterologní signální peptid odvozený od S. cerevisiae invertasového proteinu, byly použity pro translokaci zralého proteinu do kultivačního media v aktivní, zprávně zpracované formě.
V prvním aspektu poskytuje vynález DNA molekulu obsahující:
a) region kódující polypeptid, který je lidská BSSL nebo její biologicky aktivní varianta;
b) spojený 5'-konec uvedeného polypeptid kódujícího regionu, regionu kódujícího signální peptid schopný řízení sekrece uvedeného polypeptidů z buněk Pichia pastoris transformovaných uvedenou molekulou DNA; a
c) promotor methanol oxidasy Pichia pastoris nebo funkčně ekvivalentní promotor operativně navázaný na uedené kódující regiony definované v (a) a (b).
Termínem biologicky aktivní varianta BSSL je míně polypeptid mající BSSL aktivitu a obsahující část aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID NO: 3 v Seznamu sekvencí. Termínem polypeptid mající BSSL aktivitu je v tomto kontextu míněn polypeptid mající následující vastnosti: (a) je vhodný pro orální podání; (b) je aktivovaný specifickými žlučovými solemi; a (c) účinkuje jako nespecifická lipasa v obsahu tenkého střeva, t.j. je schopen ·· ··· ······· ·· · hydrolyzovat lipidy relativně nezávisle na jejich chemické struktuře a fyzikálním stavu (emulsifikované, micelární, solubilní).
Uvedená BSSL varianta může být např. varianta, která obsahuje méně než 16 opakujících se jednotek, kde opakující se jednotkou je míněna opakující se jednotka o 11 aminokyselinách, kódovaná nukleotidovou sekvencí ukázanou jako opakující se jednotka pod nadpisem (ix) Vlastnosti v Informace pro SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí. Jednotlivě, variantou BSSL může být varianta BSSL-C, ve které jsou aminokyseliny 536 až 568 a 591 až
711deletovány (SEQ ID NO: 4 v Seznamu sekvencí). V souladu s tím je DNA molekula podle vynálezu preferovaně DNA molekula, která kóduje BSSL (SEQ ID NO: 3) nebo BSSL-C (SEQ ID NO: 4).
Nicméně, DNA molekuly podle vynálezu nejsou přísně omezeny na DNA molekuly, které kódují polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí identickou k SEQ ID NO: 3 nebo 4 v Seznamu sekvencí. Spíše vynález zahrnuje DNA molekuly, které kódují polypeptidy nesoucí modifikace jako jsou substituce, malé delece, inserce nebo inverse, kde tyto polypeptidy mají nicméně biologické aktivity BSSL.Ve vynálezu jsou následně obsaženy DNA molekuly kódující varianty BSSL jak byly uvedeny výše a také DNA molekuly odující polypeptidy, jejichž aminokyselinová sekvence je z alespoň 90% homologní, lépe z alespoň 95% homologní, s aminokyselinovou sekvencí ukázanou jako SEQ ID NO: 3 nebo 4 v Seznamu sekvencí.
Signálním peptidem popsaným výše může být peptid, který je identický s, nebo významně podobný, peptidem s aminokyselinovou sekvencí ukázanou jako aminokyseliny -20 až -1 SEQ ID NO: 2 v • · • · · · • · · ·
Seznamu sekvencí. Alternativně, může to být peptid, který obsahuje invertasový signální peptid Saccharomyces cerevisiae.
V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález vektor obsahující DNA molekulu jak je definována výše. Preferovaně je takový vektor replikovatelný expresní vektor, který nese a je schopen zprostředkovat expresi DNA sekvence kódující lidskou BSSL nebo její biologicky aktivní variantu v buňkách rodu Pichia. Takovým vektorem může například být vektor pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) nebo pARC 5797 (NCIMB 40722).
V jiném aspektu poskytuje vynález kulturu hostitelských buněk obsahující buňky rodu Pichia transformované DNA molekulou nebo vektorem jak byly definovány výše. Preferovaně jsou uvedenými hostitelskými buňkami buňky Pichia pastoris kmenů jako je například PPF-1 nebo GS115. Uvedenými buněčnými kulturami mohou být například kultury PPF-l(pARC 5771) (NCIMB 40721), GS115 (pARC 5799) (NCIMB 40723) nebo GS115 (pARC 5797) (NCIMB 40722) .
V ještě jiném aspektu poskytuje vynález proces pro produkci polypeptidu, kterým je lidská BSSL, nebo její biologicky aktivní varianta, kde uvedený proces obsahuje kultivaci uedených hostitelských buněk podle vynálezu za podmínek, kdy je uvedený polypeptid secernován do kultivačního media a získání uvedeného polypeptidu z kultivačního media.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Exprese BSSL v Pichia pastoris PPF-1 • · · ·
1.1. Konstrukce pARC 0770 cDNA sekvence (SEQ ID NO: 1) kódující BSSL protein, obsahující nativní signální peptid (dále označovaný jako NSP) byl klonován v pTZ19R (Pharmacia) jako EcoRI-SacI fragment. Klonování NSP-BSSL cDNA do S. cerevisiae expresního vektoru pSCW 231 (získaného od profesora L. Prakashe, University of Rochester, NY, USA), který je kvasinkovým expresním vektorem s nízkým počtem kopií, kde je exprese pod kontrolou konstitutivního ADH1 promotoru, bylo dosaženo ve dvou krocích. Nejprve byla NSP BSSL cDNA klonována do pYES 2.0 (Invitrogen, USA) jako EcoRI-Sphl fragment z pTZ19R-SP-BSSL. Přebytečných 89 párů baží mezi EcoRI a Ncol v počátku signální peptid kódující sekvence bylo odstraněno vytvořením EcoRI/NcoI (89) fúse a regenerováním EcoRI místa. Vzniklý klon pARC 0770 obsahoval ATG kodon, původně kódovaný v Ncol místě, které bylo ihned následováno regenerovaným EcoRI místem v rámečku ze zbývající NSP-BSSL sekvencí.
1.2. Konstrukce pARC 5771 plasmidu
Pro konstrukci vhodného expresního vektoru pro expresi BSSL byl cDNA fragment kódující BSSL protein spolu s nativním signálním peptidem klonován do P. pastoris expresního vektoru pDM 148. Vektor pDM 148 (získaný od Dr. S. Subramani, UCSD) byl konstruován následujícím způsobem: upstream netranslatovaný region (5'-UTR) a downstream netranslatovaný region (3'-UTR) methanol oxidasového (MOX1) genu byly izolovány PCR a umíztěny v tandemu v mnohotné klonovací sekvenci (MCS) E. coli vektoru pSK* (dostupného od Stratagene, USA).
Pro správnou selekci putativních P. pastoris transformantů byla DNA sekvence kódující S. cerevisiae ARG4 gen spolu s její vlastní promotorovou sekvencí insertována mezi 5'- a 3' UTR v pSK-. Vzniklý konstrukt pDM148 měl následující vlastnosti: v MCS regionu pSK- 5'-UTR MOX, S. cerevisiae ARG4 genomovou sekvenci a 3'-UTR MOX byly kloovány. Mezi 5'-UTR MOX a ARG4 genomovou sekvencí byla umístěna serie jediněčných restrikčních míst (Sáli, Clal, EcoRI, Pstl, Smál a BamHI), do kterých může být klonována jakákoliv heterologní protein kódující sekvence pro expresi pod kontrolou MOX promotoru v P. pastoris. Pro usnadnění integrace této expresní azety do M0X1 lokusu v chromosomu P. pastoris, může být expresní kazeta štěpena ze zbytku pSK- vektoru trávením Notl restrikčním enzymem.
5'-UTR M0X1 P. pastoris klonovaný do pDM 148 byl délky asi 500 bp, zatímco 3' UTR MOX1 z P. pastoris klonovaný do pDM148 byl délky asi 1000 bp. Pro inserci NSP BSSL cDNA sekvence mezi 5'-UTR MOX1 a S. cerevisiae ARG4 kódující sekvence v pDM148 byl cDNA insert (SP-BSSL) izolován z pARC 0770 trávením EcoRI a BamHI (přibližně 2,2 kb DNA fragment) a byl klonován mezi EcoRI a BamHI místa v pDM 148.
Vzniklý konstrukt pARC 5771 (NCIMB 40721) obsahoval P. pastoris MOX1 5'-UTR následovaný NSP BSSL kódující sekvencí následovanou S. cerevisiae ARG4 genovou sekvencí a 31 UTR M0X1 genu P. pastoris, zatímco celý DNA segment z od 5'-UTR MOX1 do 3'-UTR MOX1 byl klonován do MCS pSK-.
1.3. Transformace BSSL v P. pastoris hostiteli PPF-1.
Pro expresi BSSL v P. pastoris hostiteli PPF-1 (his4, arg4; získána od Phillips Petroleum Co.), byl plasmid pARC 5771 tráven ‘1®·
Notl a celá trávená směs (10 μ<3 celkové DNA bylo použito pro transformace PPF-1. Použitý transformační protokol byla v podstatě kvasinková sferoplastová metoda popsaná Creggem et al., (1987) . Transformanty byly regenerovány na minimálním mediu postrádajícím arginin, takže Arg+ kolonie mohly být selektovány.Regenerační vrchní agar obsahující transformanty byl přenesen a homogenizován ve vodě a kvasinkové buňkyb byly umístěny v asi 250 koloniích na plotnu na minimálních glukosových plotnách postrádajících arginin. Mutantní kolonie byly potom identifikovány opětovným umístěním na minimální methanolové plotny. Asi 15% všech transformantů vykazovalo Muts (methanol pomalu rostoucí) fenotyp.
1.4. Vyšetření transformantů exprivujících BSSL
Pro rychlé vyšetření velkého množství transformantů na expresi lipasy byla vyvinuta metoda Upasového testu na plotně. Postup pro přípravu těchto ploten byl následující: do roztoku 2% agarosy (konečného) bylo přidáno 10 x Na-cholát roztok ve vodě do konečné koncentrace 1%. Lipidový substrát tributin byl přidán ve směsi do konečné koncentrace 1% (objem/objem). Pro podpoření růstu transformantů byla směs dále doplněna 0,25% kvasinkovou dusíkatou basí (konečnou) a 0,5% methanolem (konečným). Přísady byly řádně zamíchány a vylity na plotny do tloušťky 3 - 5 mm. Jakmie se směs stala pevnou, byly transformanty umístěny na plotny a plotny byly dále inkubovány při 37 °C po 12 hodin. Lipasu produkujíc klony vykazovaly jasné haló okolo klonu. V typickém experimentu bylo identifikováno 7 z celkem 93 transformantů jako BSSL produkující transformanty. Dva klony (č. 39 a 86) produkující největší haló okolo umístěných kolonií byly seškrábnuty pro další charakterizaci.
1.5. Exprese BSSL z PPF-l(pARC 5771)
Dva transformanty č. 39 a 86 popsané v sekci 1.4. byly seškrábnuty a kultivovány v BMGY kapalném mediu (1% kvasinkový extrakt, 2% bactopepton, 1,34% kvasinková dusíkatá base bez aminokyselin, 100 mM KPO4 pufru, pH 6,0, 400 /zg/ml a 2% glycerol) po 24 hodin při 30 °C dokud kultury nedosáhly Αβθθ těsně k 40. Kultury byly peletovány a resuspendovány v BMMY (2% glycerol nahrazen 0,5% methanolem v BMY) mediu při Αβθθ= 300. Indukované kultury byly inkubovány při 30 °C se třepáním po 120 hodin. Supernatanty kultur byly odebrány v různou dobu pro analýzu exprese BSSL testem aktivity enzymu, SDS-PAGE analýzou a western blotingem.
1.6. Detekce BSSL enzymové aktivity v supernatantech kultur klonů č. 39 a 86
Pro určení enzymové aktivity v buněk prostých supernatantech indukovaných kultur č. 39 a 86 jak jsou popsány v sekci 1.5., byly kultury odstředěny a buněk prostý supernatant byl testován na BSSL enzymovou aktivitu podle metody, kterou popsal Hernell a Olivecrona (1974). Jak je ukázáno v tabulce 1, u obou kultur bylo zjištěno, že obsahují BSSL enzymovou aktivitu s maximem aktivity v 96 hodině po indukci.
1.7. Western blot analýza supernatantů kultur PPF-l:pARC 5771 transformantů (č. 39 a 86) .
Pro určení přítomnosti rekombinantní BSSL v supernatantech kultur č. 39 a 86 PPF-l(pARC 5771) transformantů byly kultury kultivovány a indukovány jak je popsáno v sekci 1.5. Kultury byly • · • · · · ··· odebrány v různou dobu po indukci a byly podrobeny Western blot analýze za použití anti-BSSL polyklonální protilátky. Výsledky ukazují přítomnost BSSL v supernatantu kultury jako 116 kDa proužek.
Příklad 2: Exprese BSSL v Pichia pastoris GS115
2.1. Konstrukce pARC 5799
Protože 5'-MOX UTR a 3' MOX UTR nebyly správně definovány a protože pDM 148 vektor postrádá jakýkoliv jiný vhodný markér (např. gen resistence na G418) pro monitorování počtu kopií BSSL integrovaných v chromosomu Pichia, byl cDNA insert nativní BSSL spolu se signálním peptidem klonován do jiného P. pastoris expresního vektoru, pHIL D4. Integrativní plasmid pHIL D4 byl získán od Philips Petroleum Company. Plasmid obsahoval 5'-M0Xl, přibližně 1000 bp segment alkohol oxidasového promotoru a jedinečné EcoRI klonovací místo. Také obsahoval přibližně 250 bp 3' MOX1 regionu obsahuj ícího alkohol oxidasovou terminační sekvenci, následovanou EcoRI místem. Terminační region byl následován P. pastoris histidinol dehydrogenasovým genem HIS4 obsaženým na 2,8 kb fragmentu pro doplnění defektního HIS4 genu u hstitele GS115 (viz níže). 650 bp region obsahující 3'-M0X1 DNA byl fušován v 3'-konci HIS4 genu, který byl spolu s 5'-M0X1 regionem nezbytný pro místně řízenou integraci. Bakteriální gen resistence na kanamycin z pUC-4K (PL-Biochemicals) byl insertován do jedinečného Nael místa mezi HIS4 a 3'-MOX1 region ve 3' HIS4 genu.
Klon NSP-BSSL kódující cDNA fragment v jedinečném EcoRI místě pHIL D4, dvouřetězcový oligolinker mající BamHI-EcoRI štěpenou • · ► · » · • · ·
1·ϊ pozici byl ligován do BamHI tráveného plasmidu pArc 5771 a celá NSP-BSSL kódující sekvence byla vytržena jako 2,2 kb EcoRI fragment. Tento fragment byl klonován do EcoRI místa pHIL D-4 a správně orientovaný plasmid byl označen jako pARC 5799 (NCIMB 40723).
2.2. Transformace pARC 5799
Pro usnadnění integrace NSP-BSSL kódující sekvence v genomovém lokusu MOX1 v P. pastoris byl plamsid pARC 5799 tráven Bglll a použit pro transformaci P. pastoris kmene GS115(his4) (Philips Petroleum Company) podle protokolu popsaném v sekci 1.5. V tomto případě, nicméně, se jednalo o selekci His prototrofů. Transformanty byly seškrábnuty po sériovém ředění ploten regenerovaného vrchního agaru a testovány přímo v lipasovém plotnové testu jak je popsáno v sekci 1.4. Dva klony transformanů (č. 9 a 21) byly seškrábnuty na základě velikosti jejich haló na lipasové testovací plotně a byly dále testovány na expresi BSSL. Klony byly shledány jako Mut*.
2.3. Detekce BSSL enzymové aktivity v supernatantech kultur GS115(pARC 5799) transformantů č. 9 a 21.
Dva transformované klony č. 9 a 21 GS115(pARC 5799) byly kutivovány v podstatě podle protokou popsaného v sekci 1.5. Supernatanty kultur byly různou dobu po indukci testovány na BSSL enzymovou aktivitu jak je popsáno v sekci 1.6. Jak je ukázáno v tabulce 1, obsahovaly oba supernatanty kultur BSSL enzymovou aktivitu a enzymová aktivita byla nejvyšší 72 hodin po indukci. Oba klony vykazovaly vyšší expresi BSSL ve srovnání s klony PPF-1(pARC 5771).
2.4. SDS-PAGE a western blot analýzy supernatantů kultur GS115(pARC 5799) transformantů č. 9 a 21.
Supernatanty kultur odebrané v různou dobu, jak je popsáno v sekci 2.3., byly podrobeny SDS-PAGE a western blot analýze. Z SDS-PAGE profilu bylo zhodnoceno, že asi 60-75% celkoého proteinu přítomného v supernatantech indukovaných kultur byl BSSL. Molekulová hmotnost proteinu byla okolo 116 kDa. Western blot data také potvrdila, že hlavní protein přítomný v supernatantu kultury byl BSSL. Protein měl zjevně stejnou molekulovou hmotnost jako nativní BSSL.
Příklad 3: Zvýšení BSSL exprese
3.1. Zvýšení BSSL exprese z transformovaného klonu GS115(pARC 5799) (Č. 21) .
Byl použit B. Braun fermenter s kapacitou 23 1. Pět litrů media obsahujícího 1% YE, 2% pepton, 1,34 YNB a 4% hmotnost/objem gycerol bylo autoklavováno při 121 °C po 30 minut a biotin (400 /zg/l konečná koncentrace) byl přidán během inokulace po sterilizaci na filtru. Pro inokulum byl použit glycerolový zásobník GS115(pARC 5799) (č. 21) inokulovaný do syntetického media obsahujícího YNB (67%) plus 2% glycerol (150 ml) a byl kultivován při +30 °C po 36 hodin. Fermentační podmínky byly následující: teplota byla +30 °C; pH 5,0 bylo udržováno za použití 3,5 N NH^OH a 2 N HCI; rozpuštěný kyslík od 20 do 40% saturace; polypropylenglykol 2000 byl použit jako protipěnivá látka.
ífr· φφφ <
ΦΦΦ
Kultura byla monitorována v pravidelných intervalech měřením OD při 600 nm. A dosáhla maxima 50 - 60 ve 24 hodinách.
V tomto bodě byla vsádková růstová fáze překonána jak je ukázáno zvýšenými hladinami rozpuštěného kyslíku.
Růstová fáze byla ihned následována indukční fází. Během této fáze byl použit jako krmivo methanol osahující 12 ml/1 PTM1 solí. Stupeň podávání methanolu by 6 μΐ/hod. během prvních 10 - 12 hodin, po kterých byl postupně zvyšován o 6 ml/h každých 7-8 hodin do maxima 36 ml/hod. Amoniak použitý pro kontrolu pH účinkovala jako zdroj dusíku. Akumulace methanolu byla testována každých 6-8 hodin za použití stanovení obsahu rozpuštěného kyslíku a bylo objeveno, že je limitován během celé fáze indukce. OD při 600 nm se zvýšilo z 50 - 60 na 150 - 170 během 86 hod. podávání methanolu. Kvasinkový extrakt a pepton byly přidány každých 24 hodin pro vytvoření konečné koncentrace 0,25% a 0,5%, v příslušném pořadí.
Vzorky byly odebrány ve 24 hodinovém intervalu a byly testovány na BSSL enzymovou aktivitu v buněk prostém bujónu.
Bujón byl také podroben SDS-PAGE a western bloting analýze.
3.2. Proteinová analýza secernovaného BSSL z ve fermentoru kultivované kultury GS115(pARC 5799) (č. 21) .
BSSL enzymová aktivita v buněk prostém bujónu se zvýšila ze 40 - 71 mg/1 (ekvivalentů nativního proteinu) ve 24 hodině na 200 227,7 mg/1 (ekvivalentů nativního proteinu) v konci 86 - 90 hodiny. SDS-PAGE analýza buněk prostého buonu ukázala prominentní Coomasie modří barvený proužek o molekulové hmotnosti 116 kDa. Identita proužku byla potvrzena Western blotem provedeným jak
1*6 ·
99 bylo popsáno v sekci 1.7. pro nativní BSSL.
3.3. Purifikace rekombinantního BSSL secernovaného v supernatantu kultury GS115(pARC 5799) (č. 21) klonů.
P. pastoris klon GS115(pARC 5799) byl kultivován a indukován ve fermentoru jak je popsáno v sekci 3.1. Pro purifikaci rekombinantního BSSL bylo 250 ml kultivačního media (indukovaného po 90 hodin) centrifugováno při 12000 x g po 30 minut pro odstranění všech částic. Buněk prostý supernatant kultury byl ultrafiltrován na Amicon setu za použití membrány s rozlišovací schopností 10 kDa. Soli a proteiny a peptidy s nízkou molekulovou hmotností z kultivačního supernatantu byly odstraněny opakovaným ředěním během filtrace. Pufr použitý pro taková ředění byl 5 mM Barbitol pH 7,4. po koncentrování supernatantu kultur byl retentát rekonstituován na 250 ml za použití 5mM Barbitolu, pH 7,4 a 50 mM NaCl a byl zaveden do Heparin-Sepharosové kolony (15 ml objem lůžka, která byla preekvilibrována stejným pufrem. Zavádění vzorku bylo provedeno průtokem 10 ml/hod. Po zavedení byla kolona promyta 5 mM barbitolem, pH 7,4 a 0,1 M NaCl (200 μΐ promývací pufr) dokudabsorbance při 250 nm nedosáhla pod hladinu detekce. BSSL byla eluována 200 ml Barbitol pufru (2 mM, pH 7,4) a lineárním gradientem NaCl v rozsahu od 0,1 M do 0,7 M. Frakce (2,5 ml) byly odebrány a testovány na eluovaný protein monitorováním absorbance 260 nm. Frakce obsahující protein byly testovány na BSSL enzymatickou aktivitu. Vhodné frakce byly analyzovány na 8,0% SDS-PAGE pro vyšetření jejich purifikačního profilu.
3.4. Charakterizace purifikovaného rekombinantního BSSL secernovaného v supernatantu kultur GS115(pARC 5799)
SDS-PAGE a Western blot analýzy frakcí (popsané v sekci 3.3) ukazující maximální enzymatickou aktivitu BSSL enzymu ukázaly, že rekombinantní protein byl z přibližně 90% čistý. Molekulová hmotnost purifikovaného proteinu byla okolo 116 kDa jak je určeno SDS-PAGE a western blot analýzami. Pokud byly vzorky podrobeny SDS-PAGE analýze, pak mohl být detekován proteinový proužek o nízké molekulové hmotnosti barvením Coomasie Brilliant Blue, který nebyl znázorněn na western blotu. Purifikovaný protein byl podroben N-terminální analýze na automatizovaném proteinovém sekvenátoru. Výsledky ukázaly, že protein byl správně zpracován z nativního signálního peptidů a že rekombinantní protein měl N-terminální sekvenci A K L G A V Y. Specifická aktivita purifikovaného rekombinantního proteinu byla nalezena podobná jako aktivita nativního proteinu.
Příklad 4: Exprese BSSL-C v Pichia pastoris GS115
4.1. Konstrukce pARC 5797 cDNA kódující sekvence pro BSSL variantu BSSL-C byla fúsována ve svém 5'-konci se signální peptid kódující sekvencí S. cerevisiae SUC2 genovým produktem (invertasou), zazachování integrity otevřeného čtecího rámečku začínajícího v prvním ATG kodonu invertasového signálního peptidů. Tento fúsní genový konstrukt byl nejprve klonován do S. cerevisiae expresního vektoru pSCW 231 (pSCW 231 kvasinkový expresní vektor o nízkém počtu kopií a exprese je pod kontrolou konstitutivního ADH1 promotoru) mezi EcoRI a BamHI místo pro generování expresního vektoru pARC 0788.
cDNA fúsního genu byla dále subklonována do P. pastoris ·· ··· · expresního vektoru pDM 148 (popsaného v sekci 1.2) uvolněním vhodného 1,8 kb fragmentu EcoRI a BamHI trávením pARC 0788 a subklonováním fragmentu do pDM 148 tráveného EcoRI a BamHI. Vzniklý konstrukt pARC 5790 byl tráven BamHI a dvouřetězcový oligonukleotidový linker fyzikální struktury BamHI-EcoRI-BamHI byl ligován do konstruktu pARC 5796 v podstatě pro izolaci cDNA fragmentu fúsního genu, podle strategie popsané v sekci 2.1.
Nakonec byl 1,8 kb fragment obsahující invertasový signální peptid/BSSL-C fúsní gen uvolněn z pARC 5796 trávením EcoRI a byl klonován do pHIL D4 v EcoRI místě. Vhodnou restrikční analýzou byl identifikován expresní vektor obsahující insert ve správné orientaci a byl označen pARC 5797 (NCIMB 40722) .
4.2. Exprese rekombinantního BSSL-C z P. pastoris pro expresi rekombinantního BSSL-C z P. pastoris byla P. pastoris hostitel GS115 transformována pARC 5797 podle metody popsané v sekcích 1.3 a 2.2. Transformanty byly vyšetřovány na produkci lipasy metodou popsanou v sekcích 1.4 a 2.2. Jeden transformant (č. 3) byl seškrábnut na základě vysoké lipasu produkující schopnosti podle detekční metody Upasového testu na plotně a byl dále analyzován na produkci BSSL enzymatické aktivity v kultivačním supernatantu v podstatě podle metody popsané v sekcích 1.6 a 2.3. Jak je ukázáno v tabulce 1, supernatant GS115(pARC 5797) (č.3) obsahoval BSSL enzymatickou aktivitu a množství, které se progresivně zvyšovalo do 72 hodiny po indukci.
4.3. SDS-PAGE a western blot analýzy supernatantu kultur GS115(pARC 5797) transformantu (č. 3).
• · • ··· ·· ··*· • · • ··· ··
• * · · » • ·
Supernatanty kultur odebrané v různou dobu, jak je popsáno v sekci 4.2., byly podrobeny SDS-PAGE a western blot analýze jak je popsáno v sekcích 1.7 a 2.4. Z SDS-PAGE profilu bylo zhodnoceno, že asi 75 - 80% celkového extracelulárního proteinu BSSL-C. Molekulová hmotnost proteinu byla okolo 66 kDa, jak bylo zhodnoceno SDS-PAGE analýzou. Na Western blot analýze byly nalezeny pouze dva proužky (dublet) okolo 66 kDa, které byly imunoreaktivní a tak potvrzovaly expresi rekombinantního BSSL-C.
Příklad pro srovnání: Exprese BSSL v S. cerevisiae
Byly provedeny pokusy o expresi BSSL v Saccharomyces cerevisiae. BSSL byl slabě secernován v S. cerevisiae a nativní signální peptid nepracoval účinně. Kromě toho, nativní signální peptid nebyl štěpen ze zralého proteinu v S. cerevisiae.
Odkazy:
Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. a Lombardo, D. (1988) Biochim. Biophys. Acta. 961,299-308.
Baba, T., Downs, D., Jackson, K.W., Tang, J. a? . Wang, C-S (1991) Biochemistry 30, 500-510.
• · · · · ·
• · * · • 4 · .20..·
Bláckberg, L. ar Hemell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221-225.
Bláckberg, L., Ángquist, K.A. a’ Hemell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41.
Cregg, J.M. et al. (1987) Bio/Technology 5, 479-485.
EUis, S.B. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5,1111-1121.
Fredrikzon, B., Hemell, O., Bláckberg, L. a* i Olivecrona, T. (1978) Pediatrie Res. 12, 1048-1052.
Hansson, L., Bláckberg, L., Edlund, M., Lundberg, L., Strómqvist, M. a r Hernell, O. (1993) J. Biol. Chem. 268, 26692-26698.
Hemell, O. a Olivecrona, T. (1974) Biochim. Biophys. Acta 369, 234244.
Hemell, O., Bláckberg, L an< Olivecrona, T. (1989) in: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E., ed.) 347-354, Raven Press, NY.
Hemell, O. a Bláckberg, L. (1982) Pediatrie Res. 16, 882-885.
Hui, D. Y. a Kissel, J. A (1990) FEBS Letters 276,131-134.
Kingsman, etal. (1985) Biotechnology and Genetíc Engineering Reviews 3, 377-416.
Nilsson, J., Bláckberg, L., Carlsson, P., Enerbáck, S., Hemell, O. ari Bjursell, G. (1990) Eur. J. Biochem. 192, 543-550.
·« ···· · ·· «· ···· ··· ···« · · · ····· · · · · · • · -·· · · · ···· ·,.·22ΐ· ..* :
Reue, Κ., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, ΤΉ., Ronk, M., Shively, Λ
J.E., Stemby, B., Borgstróm, B., Ameis, D. ai Scholtz, M.C. (1991)
J. Lipid. Res. 32, 267-276.
Wang, C-S, ai ( Hartsuck, J.A. (1993) Biochim. Biphys Acta 1166,1-19.
Depozita mikroorganismů
Následující plasmidy, transformované do kultur Pichia pastoris, byly deponovány podle Budaešúské smlouvy v National Collections of Industrial and Marině Bacteria (NCIMB), Aberdeen, Scotland, UK. Datum deponování je 2.5.1995.
Kmen (plasmid) NCIMB č.
PPF-l(pARC 5771) GS115(pARC 5799) GS115(pARC 5797)
40721 40723
40722
- 22 · • · Ί| · · • · • · · Φ
• · · · · · ·
Tabulka 1
Enzymatická aktivita supernatantů kultur Pichia pastoris transformantů
Enzymatická aktivita v mg/1 ekvivalentů nativního BSSL
Hodiny PPF-l(pARC 5771) GS115(pARC 5799) GS115(pARC 5797)
po indukci č. 39 č.86 č.9 Č. 21 c. 3
24 0,254 0,135 1,53 1,72 0,37
48 2,69 3,12 17,28 34,70 40,9
72 3,96 8,25 37,37 50,60 44,9
96 11,26 13,60 26,34 50,60 35,6
120 8,42 13,13 13,60 22,30 17,8
tttt £3 :
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: ASTRA AB
(B) Ulice: Vastra Malarehamnen
(C) Město: Sodertalje
(E) Země: Sweden
(F) Poštovní kod (ZIP): S-151
(G) Telefon: +46-8-553 260 00
(H) Telefax: +46-8-553 288 20
(I) Telex: 19237 astra s
(ii) Název vynálezu: DNA sekvence pro expresi polypeptidů (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (EPC (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 2428 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý
Í24 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisense: ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Homo sapiens (B) Typ tkáně: prsní žláza (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 82...2319 (D) Jiné informace: /produkt = žlučovými solemi stimulovaná lipasa (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: exon (B) Umístění: 985...1173 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: exon (B) Umístění: 1174...1377 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: exon (B) Umístění: 1378...1575 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: exon (B) Umístění: 1576...2415 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: mat_peptid (B) Umístění: 151...2316 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: póly A_signál (B) Umístění: 2397...2402 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat region (B) Umístění: 1756...2283 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: 5' UTR (B) Umístění: 1...81 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1756...1788 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1789...1821 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1822...1854
Φ · ·· ···· • t * · · (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1855...1887 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1888...1920 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1921...1953 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 1954...1986 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2020...2052 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2053...2085 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2086...2118 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka •· ···· · ·· ·· ···· ·· ······ · • · · · · · ··· • A « · 499999 (B) Umístění: 2119...2151 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2152...2184 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2185...2217 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2218...2250 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: repeat_jednotka (B) Umístění: 2251...2283 (x) Publikační informace:
(A) Autoři: Nilsson, Jeanette Blacberg, Lars Carlsson, Peter Enerback, Sven Hernell, Olle Bjursell, Gunnar (B) Titul: cDNA klonující žlučovými solemi stimulovanou lipasu lidského mléka a důkazy pro její identitu s pankreatickou karboxylovou esterovou hydrolasou (C) Časopis: Eur.
(D) Svazek: 192 (F) Strany: 543 - 550 (G) Datum: Září - 1990
J. Biochem.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGCCCCAAGA TAATGCAAAG 60
AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG Met CTC ACC ATG GGG CGC . _r * CAA CTG GTT Gin Leu Val -15 111
Leu Thr Met -20 Gly Arg
-23
GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCG AAG CTG 159
Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys -10 Trp Ala Val -5 Ala Ser kl* Ala Lys Leu 1
GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GIG GAA GGC j·— — AAT AAG AAG 207
Gly Ala 5 Val Tyr Thr Glu Gly 10 Gly Phe Val Glu Gly 15 Asn Lys Lys
CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG ATC CCC TTC 255
Leu Gly 20 Leu Leu Gly Asp Ser 25 Val Asp Ile Phe Lys 30 j·—v Ile Pro Phe 35
GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA — Λ — CCT GGC TGG - -303
Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu 40 Glu Asn Pro 45 Gin Pro Pro Gly Trp 50
CAA GGG ACC CTG AAG CCC AAG AAC TTC AAG AAG ACA CTG CAG GCC 351
Gin Gly Thr Leu Lys Ala Lys 55 Asn Phe Lys 60 Lys Arg Cys Leu Gin Ala 65
ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC 399
Thr Ile Thr Gin Asp Ser Thr 70 Tyr 75 Gly Asp Glu Asp cys 80 Leu Tyr Leu
AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA CTC TCC CGG GAC CTG CCC 447
Asn Ile 85 Trp Val Pro Gin Gly 90 Arg Lys Gin Val Ser 95 Arg Asp Leu Pro
GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT 495
Val Met 100 Ile Trp Ile Tyr Gly 105 Gly Ala Phe Leu Met 110 Cly Ser Cly His 115
GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG
Cly Ala Asn Phe Leu 120 Asn Asn Tyr Leu
ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTC GTC ACC
Thr Arg Gly Asn 135 Val Ile Val Val Thr 140
CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC
Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp 155 Ala
CTT CGG GAT CAG CAC ATC GCC ATT GCT
Leu Arg 165 Asp Gin His Met Ala 170 Ile Ala
GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC
Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn Ile
CGA GGT GCC AGC GTC TCT CTC CAG ACC
Gly Gly Ala Ser Val 200 Ser Leu Gin Thr
CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC
Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile Ser Gin Ser 220
GTC ATC CAG AÁA AAC CCA CTC TTC TCG
Val Ile Gin 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp
GTC GGT TCC CCT GTG GGT GAT GCC GCC
Val Glv 245 Cys Pro Val Gly Asp 250 Ala Ala
GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTC ACG CTG
Val 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265 Leu Thr Leu
GGC CTG GAG TAC CCC ATC CTC CAC TAT
Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr
GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG
Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro Ala Asp Pro 300
GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC
Ala Asp Ile 310 Asp Tyr Ile Ala Gly 315 Thr
TTC GCC AGC ATC -GAC ATC CCT GCC ATC
Phe Ala 325 Ser Ile Asp Met Pro 330 Ala Ile
ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTC GTC
Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Val
GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT
Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr Thr Phe
GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG
Ala Gin Asp Pro 375 Ser Gin Glu Asn Lys 380
• · • · • · • ·· · • • · · • • · • • · » · • · · · · · • · • ·
• · • · 29· • 9 • • • · · « • i k
• · • · · • • · · · • • · <
TAT GAC CGC GAG GAG ATC GCC 543
Tyr 125 Asp Gly Glu GlU Ile 130 Ala
TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC 591
Phe Asn Tyr Arg Val 145 Gly Pro
AAT CTC CCA GGT AAC TAT GGC 639
Asn Leu Pro Gly 160 Asn Tyr Gly
TCG GTC AAG AGG AAT ATC GCG 687
Trp Val Lys 175 Arg Asn Ile Ala
ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT 735
Thr Leu 190 Phe Gly Glu Ser Ala 195
CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC 783
Leu 20S Ser Pro Tyr Asn Lys 210 Gly
GGC GTC GCC CTC AGT CCC TCG 831
Gly Val Ala Leu Ser 225 Pro Trp
GCC AAA AAG GTC GCT GAG AAG 879
Ala Lys Lys Val 240 Ala Glu Lys
AGG ATC GCC CAG TCT CTC AAG 927
Arg Met Ala 255 Gin Cys Leu Lys
GCC TAT AAG GTC CCG CTC GCA 975
Ala Tyr 270 Lys Val Pro Leu Ala 275
GTC GGC TTC GTC CCT GTC ATT 1023
Val 285 Gly Phe Val Pro Val 290 Ile
ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC 1071
Ile Asn Leu Tyr Ala 305 Asn Ala
AAC AAC ATC GAC GGC CAC ATC 1119
Asn Asn Met Asp 320 Gly His Ile
AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC 1167
Asn Lys Gly 335 Asn Lys Lys Val
AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG 1215
Ser Glu 350 Phe Thr Ile Thr Lys 355
GAT GTC TAC ACC GAG TCC TCG 1263
Asp 365 Val Tyr Thr Glu Ser 370 Trp
AAG AAG ACT GTC GTG GAC TTT 1311
Lys Lys Thr Val Val 385 Asp Phe
• ·
GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG CTG CCC ACC GAG ATT CCC CTA GCC CAG 1359
Clu Thr Asp 390 Val Leu Phe Leu Val 395 Pro Thr Glu lis Ala 400 Leu Ala Gin
CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC 1407
His Arg 405 Ala Asn Ala Lys Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr Leu Phe Ser
CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT 1455
His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Val Tyr Pro Lys Trp 430 Val Gly Ala Asp His 435
GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG 1503
Ala Asp Asp Ile Gin 440 Tyr Val Phe Gly Lys 445 Pro Phe Ala Thr Pro 450 Thr
GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC 1551
Gly Tyr Arg Pro 455 Gin Asp Arg Thr Val 460 Ser Lys Ala Met Ile 465 Ala Tyr
TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT 1599
Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480 Asp Ser Ala
GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTC 1647
Val Pro 485 Thr His Trp Glu Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser Gly Tyr Leu
GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA 1695
Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met 505 Gly Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg Ser Leu Arg 515
ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA 1743
Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala Leu Pro 530 Thr
GTC ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG 1791
Val Thr Asp Gin 535 Glu Ala Thr Pro Val 540 Pro Pro Thr Gly Asp 545 Ser Glu
GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG 1839
Ala Thr Pro 550 Val Pro Pro Thr Gly 555 Asp Ser Glu Thr Ala 560 Pro Val Pro
CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC 1887
Pro Thr 565 Gly Asp Ser Gly Ala 570 Pro Pro Val Pro Pro 575 Thr Gly Asp Ser
GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTC 1935
Gly 580 Ala Pro Pro Val Pro 585 Pro Thr Gly Asp Ser 590 Gly Ala Pro Pro Val 595
CCG CCC ACG GGT GAC. TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC 1983
Pro Pro Thr Gly Asp 600 Ser Gly Ala Pro Pro 605 Val Pro Pro Thr Gly 610 Asp
TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC 2031
Ser Gly Ala Pro 615 Pro Val Pro Pro Thr 620 Gly Asp Ser Gly Ala 625 Pro Pro
GTG CCG CCC ACG GGT CAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT 2079
Val Pro Pro 630 Thr Gly Asp Ser Gly 635 Ala Pro Pro Val Pro 640 Pro Thr Gly
CAC CCC GGG CCC CCC CCC CTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC 2127
Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro
645 650 655
3Í *
ccc GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC
Pro 660 Val Pro Pro Thr Gly 665 Asp Ser
GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG
Gly Asp Ser Glu Thr 680 Ala Pro Val
GGG GCC CCC CCC GTG ACC CCC ACG
Gly Ala Pro 670 Pro Val Thr Pro Thr 675
CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC
Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
685
CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC
Pro Pro Val Pro 695 Pro Thr Gly Asp
ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG
Thr Asp Asp 710 Ser Lys Glu Ala Gin 715
CGTCCCATGA GCCTTGGTAT
TCT Ser 700 GAG Glu GCT Ala GCC Ala CCT Pro GTG Val 705 CCC Pro CCC Pro
ATG Met CCT Pro GCA Ala GTC Val ATT Ile 720 AGG Arg Phe TAG •
ACCCCAGGGG
CAAGAGGCCA CAAGAGTGGG
CTCCC
ATCTTGAGCT
CTTCCTGAAT
AAAGCCTCAT ACCCCTAAAA
AAAAAAAAA
2175
2223
2271
2319
2379
2428 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 746 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Met -23 Leu Thr Met -20 Gly Arg Leu Gin Leu -15 Val Val Leu Gly Leu -1C cys
Cys Trp Ala -5 Val Ala Ser Ala Ala 1 Lys Leu Gly Ala 5 Val Tyr Chr Glu
Gly 10 Gly Phe Val Glu Gly 15 Val Asn Lys Lys Leu 20 Gly Leu Leu S—v Asp 25
Ser Val Asp Ile Phe 30 Lys Gly Ile Pro Phe 35 Ala Ala Pro Thr Lvs 40 Ala
Leu Glu Asn Pro 45 Gin Pro His Pro Gly 50 Trp Gin Gly Thr Leu 55 Lys Ala
Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg Cys Leu 65 Gin Ala Thr Ile Thr 70 Gin Asp Ser
• · · • 4 4 4 4 4 · 4 • • 4 · 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • • 4 • 4 4 • 4 4 4 4 • 4 4 •
• · • 4 4 4 4 *
Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80 Leu Tyr Leu Asn Ile 85 Trp Val Pro Gin
Gly 90 Arg Lys Gin Val Ser 95 Arg Asp Leu Pro Val 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105
Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 Asn
Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu Glu Ile 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Val Ile
Val Val Thr 140 Phe Asn Tyr Arg Val 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr
Gly Asp 155 Ala Asn Leu Pro Cly 160 Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gin His Met
Ala 170 Ile Ala Trp Val Lys 175 Arg Asn Ile Ala Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 18S
Asn Asn Ile Thr Leu 190 Phe Gly Glu Ser Ala 195 Gly Gly Ala Ser Val 200 Ser
Leu Gin Thr Leu 205 Ser Pro Tyr Asn Lys 210 Gly Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile
Ser Gin Ser 220 Gly Val Ala Leu Ser 225 Pro Trp Val Ile Gin 230 Lys Asn Pro
Leu ' Phe 235 Trp Ala Lys Lys Val 240 Ala Glu Lys Val Gly 245 Cys Pro Val Gly
Asp 250 Ala Ala Arg Met Ala 255 Gin Cys Leu Lys Val 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265
Leu Thr Leu Ala Tyr 270 Lys Val Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met
Leu His Tyr Val 285 Gly Phe Val Pro Val 290 Ile Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro
Ala Asp Pro 300 Ile Asn Leu Tyr Ala 305 Asn Ala Ala Asp Ile 310 Asp Tyr Ile
Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320 Gly His Ile Phe Ala 32S Ser Ile Asp Met
Pro 330 Ala Ile Asn Lys Gly 335 Asn Lys Lys Val Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345
Lys Leu Val Ser Glu 350 Phe Thr Ile Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys
Thr Thr Phe Asp 365 Val Tyr Thr Glu Ser 370 Trp Ala Gin Asp Pro 375 Ser Gin
Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Val Val 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Val Leu Phe
Leu Val 395 Pro Thr Glu Ile Ala 400 Leu Ala Gin His Arg 405 Ala Asn Ala Lys
Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425
Val Tyr Pro Lys Trp 430 Val Gly Ala Asp His 435 Ala Asp Asp Ile Gin 440 Tyr
Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gin Asp 445 450 455 : :.3.5-
• · · · ·
Ařg Thr Val 460 Ser Lys Ala Met Ile Ala 465 Tyr Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys
Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480 Asp Ser Ala Val Pro 485 Thr His Trp Glu
Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser Gly Tyr Leu Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met 505
Cly Ser Ser Ser Met 510 Lye Arg Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr
Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala Leu Pro 530 Thr Val Thr Asp Gin 535 Glu Ala
Thr Pro Val 540 Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro
S45 550
Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
555 560 565
Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro
57 0 57 5 580 585
Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
590 595 600
Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
605 610 615
Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
620 625 630
Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro
635 640 645
Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
650 655 660 665
Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala
670 675 680
Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
685 690 695
Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu
700 705 710
Ala Gin Met Pro Ala Val Ile Arg Phe *
715 77.0
• · · · « • « • · · · · · · (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 722 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:
(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Homo sapiens (F) Typ tkáně: Prsní žláza (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
1 5 10 15
Asn Lys Ly» Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp 11· Phe Ly» Gly
20 25 30
11« Pro Phe Ala Ala Pro Thr Ly» Ala Leu Glu Asn Pro Gin Pro His
35 40 45
Pro Cly Trp Gin Gly Thr Leu Ly» Ala Ly» A»n Phe Ly» Ly» Arg Cys 50 55 60 ·· ····
Leu 65 Gin Ala Thr 11« Thr 70 Gin Asp Ser Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80
Leu Tyr Leu Asn Ile 85 Trp Val Pro Gin Gly 90 Arg Lys Gin Val Ser 95 Arg
Asp Leu Pro Val 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105 Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly
Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 Asn Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu
Glu Ile 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Val Ile Val Val Thr 140 Phe Asn Tyr Arg
Val 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp 155 Ala Asn Leu Pro Gly 160
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gin H4s Met Ala 170 Ile Ala Trp Val Lys 175 Arg
Asn Ile Ala Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn Ile Thr Leu 190 Phe Gly
Glu Ser Ala 195 Gly Gly Ala Ser Val 200 Ser Leu Gin Thr Leu 205 Ser Pro Tyr
Asn Lys 210 Gly Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile Ser Gin Ser 220 Gly Val Ala Leu
Ser 225 Pro Trp Val Ile Gin 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp Ala Lys Lys Val 240
Ala Glu Lys Val Gly 245 Cys Pro Val Gly Asp 250 Ala Ala Arg Met Ala 255 Gin
Cys Leu Lys Val 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265 Leu Thr Leu Ala Tyr 270 Lys Val
Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Val 285 Gly Phe Val
Pro Val 290 Ile Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro Ala Asp Pro 300 Ile Asn Leu Tyr
Ala 305 Asn Ala Ala Asp Ile 310 Asp Tyr Ile Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His Ile Phe Ala 325 Ser Ile Asp Met Pro 330 Ala Ile Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Val Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Val Ser Glu 350 Phe Thr
Ile Thr Lys 3S5 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr Thr Phe Asp 365 Val Tyr Thr
Glu Ser 370 Trp Ala Gin Asp Pro 375 Ser Gin Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Val
Val 385 Asp Ph· Glu Thr Asp 390 Val Leu Phe Leu Val 395 Pro Thr Glu Ile Ala 400
Leu Ala Gin His Arg 405 Ala Asn Ala Lys Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr
Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Val Tyr Pro Lys Trp 430 Val Gly
Ala Asp His 435 Ala Asp Asp Ile Gin 440 Tyr • · • · • · • · • · • · Val • · · · • • · · Phe • · • · Gly • · • • • • · • · • Pro ·· ·· • • ·· · « • · • · · Phe • · • • Ala
Lys 445
thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450 455 460
Zle Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly
465 470 475 480
Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
485 490 495
Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
500 505 510
Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
515 520 525
Leu Prc Thr Val Thr Asp Gin Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly
53 0 535 540
Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala
545 550 555 560
?ro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
565 570 575
Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
580 585 590
?ro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro
595 600 605
Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
610 615 620
A—& Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro
= 25 630 635 640
Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
645 650 655
Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
660 655 670
Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
575 680 685
Sex Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro
690 695 700
Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gin Met Pro Ala Val Ile
705 710 715 720
Arg Ph·
(2) Informace pro SEQ ID NO: 4 :
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 568 aminokyselin
Λ?
(B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:
(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Homo sapiens (F) Typ tkáně: Prsní žláza (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: peptid (B) Umístění: 1...568 (D) Jiné informace: /značka = Variant_C (x) Publikační informace:
(A) Autoři: Hansson, Lennart Blacberg, Lars Edludn, Michael Lundberg, Lennart Stromqvist, Mats Hernell, Olle (B) Titul: Rekombinantní žlučovými solemi stimulovaná lipasa lidského mléka (C) Časopis: Eur. J. Biochem.
(D) Svazek: 268 (E) Ročník: 35 (F) Strany: 26692 - 26698 (G) Datum: 15.12.1993 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Ala 1 Lys Leu Gly Ala 5 Val Tyr Thr Glu Gly 10 Gly Phe Val Glu Gly 15 Val
Asn Lys Lys Leu 20 Gly Leu Leu Gly Asp 25 Ser Val Asp Ile Phe 30 Lys Gly
Ile Pro Phe 35 Ala Ala Pro Thr Lys 40 Ala Leu Glu Asn Pro 45 Gin Pro His
Pro Gly 50 Trp Gin Gly Thr Leu 55 Lys Ala Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg Cys
Leu 65 Gin Ala Thr Ile Thr 70 Gin Asp Ser Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80
Leu Tyr Leu Asn Ile 85 Trp Val Pro Gin Gly 90 Arg Lys Gin Val Ser 95 Arg
Asp Leu Pro Val 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105 Gly Gly Ala Phe Leu 110 Met Gly
Ser Gly His 115 Gly Ala Asn Phe Leu 120 Asn Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu
Glu Ile 130 Ala Thr Arg Gly Asn 135 Val Ile Val Val Thr 140 Phe Asn Tyr Arg
Val 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp 155 Ala Asn Leu Pro Cly 160
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gin His Met Ala 170 Ile Ala Trp Val Lys 175 Arg
Asn Ile Ala Ala 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn Ile Thr Leu 190 Phe Gly
Glu Ser Ala 195 Gly Gly Ala Ser Val 200 Ser Leu Gin Thr Leu 205 Ser Pro Tyr
• · • · • · • · • • · · 3.2/ • • • • • • • · · « • 1 • < • • » · » · • · · • • · • • • • •
Asn Lys 210 Gly Leu Ile Arg Arg 215 Ala Ile Ser Gin Ser 220 Gly Val Ala Leu
Ser 225 Pro Trp Val Ile Gin 230 Lys Asn Pro Leu Ph· 235 Trp Ala Lys Lys Val 240
Ala Glu Lys Val Gly 245 Cys Pro Val Gly Asp 250 Ala Ala Arg Met Ala 255 Gin
Cys Leu Lys Val 260 Thr Asp Pro Arg Ala 265 Leu Thr Leu Ala Tyr 270 Lys Val
Pro Leu Ala 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Val 285 Gly Phe Val
Pro Val 290 Ile Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro Ala Asp Pro 300 Ile Asn Leu Tyr
Ala 305 Asn Ala Ala Asp Ile 310 Asp Tyr Ile Ala Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His Ile Phe Ala 325 Ser Ile Asp Met Pro 330 Ala Ile Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Val Thr 340 Glu Clu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Val Ser Glu 350 Phe Thr
Ile Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr Thr Phe Asp 365 Val Tyr Thr
Glu Ser 370 Trp Ala Gin Asp Pro 375 Ser Gin Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Val
Val 385 Asp Ph· Glu Thr Asp 390 Val Leu Phe L-su Val 395 Pro Thr Glu Ile Ala 400
Leu Ala Gin His Arg 405 Ala Asn Ala Lys Ser 410 Ala Lys Thr Tyr Ala 415 Tyr
Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Val Tyr Pro Lys Trp 430 Val Gly
Ala Asp His 435 Ala Asp Asp Ile Gin 440 Tyr Val Phe Gly Lys 445 Pro Phe Ala
Thr Pro 450 Thr Gly Tyr Arg Pro 455 Gin Asp Arg Thr Val 460 Ser Lys Ala Met
Ile 465 Ala Tyr Trp Thr Asn 470 Phe Ala Lys Thr Gly 475 Asp Pro Asn Met Gly 480
Asp Ser Ala Val Prc 485 Thr His Trp Glu Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser
Gly Tyr Leu Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met 505 Gly Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg
Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Ala
Leu Pro 530 Thr Val Thr Asp Gin 535 Cly Ala Pro Pro Val 540 Pro Pro Thr Gly
Asp 545 Ser Gly Ala Pro Pro 550 Val Pro Pro Thr Gly 555 Asp Ser Ly« Glu Ala 560
Gin Met Pro XI* Val II· Arg Ph·

Claims (14)

1. DNA molekula obsahující:
(a) region kódující polypeptid, který je lidská BSSL nebo její biologicky aktivní varianta.
(b) region kódující signální peptid schopný řízení sekrece uvedeného polypeptidu z Pichia pastoris transformované uvedenou DNA molekulou připojený na 5'-konec uvedeného polypeptidu; a (c) methanol oxidasový promotor Pichia pastoris nebo funkčně ekvivalentní promotor operativně navázaný na uvedené kódující regiony definované v (a) a (b).
2. DNA molekula podle nároku 1, kde uvedený signální peptid je identický k, nebo významně podobný s, peptidem s aminokyselinovou sekvencí ukázanou jako aminokyseliny -20 až -1 SEQ ID NO: lv Seznamu sekvencí.
3. DNA molekula podle nároku 1, kde uvedený signální peptid obsahuje invertasový signální peptid Saccharomyces cerevisiae.
4. DNA molekula podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 kódující biologicky aktivní variantu BSSL, ve které je alespoň jedna z opakujících se jednotek o 11 aminokyselinách deletována, kde uvedené opakující se jednotky jsou ukázány v SEQ ID NO: 1.
5. DNA molekula podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 kódující polypeptid, který má BSSL aktivitu a aminokyselinovou sekvenci, které je z alespoň z 95% homologní se sekvencí podle SEQ ID NO:
···· ··· ·· · · · A • A A A · · · · * • ·..„·* · · » ·· · · • · 41· · · ··
AA A·· A· · · ·β· · · ·
3 nebo SEQ ID NO: 4.
6. DNA molekula podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 kódující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4.
7. Vektor obsahující DNA molekulu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6.
8. Replikovatelný expresní vektor podle nároku 7, který je schopný zprostředkování exprese lidské BSSL, nebo její biologicky aktivní varianty, v buňkách Pichia pastoris.
9. Vektor podle nároku 8, který je plasmidový vektor pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) nebo pARC 5797 (NCIMB 40722) .
10. Hostitelské buňky rodu Pichia transformované vektorem podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9.
11. Hostitelské buňky podle nároku 10, které jsou Pichia pastoris buňky.
12 .
Hostitelské buňky podle nároku
11, které jsou Pichia pastoris buňky kmene GS115.
13. Hostitelské buňky podle nároku 12, které jsou PPF-l(pARC 5771) (NCIMB 40721), GS115(pARC 5799)(NCIMB 40723) nebo GS115(pARC 5797) (NCIMB 40722).
14. Způsob pro produkci polypeptidu, který je lidská BSSL, ·· ···· » · ·
I · · · · : : 43* ·· ·· · • · · • · α »»· · • · • · · nebo její biologicky aktivní varianta, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje kultivaci hostitelských buněk podle jakéhokoliv z nároků 10 až 13 za podmínek, kdy je uvedený polypeptid secernován do kultivačního media, a získání uvedeného polypeptidů z kultivačního media.
CZ972973A 1995-05-24 1996-03-12 DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL) CZ297397A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9501939A SE9501939D0 (sv) 1995-05-24 1995-05-24 DNA molecules for expression of polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ297397A3 true CZ297397A3 (cs) 1998-03-18

Family

ID=20398427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ972973A CZ297397A3 (cs) 1995-05-24 1996-03-12 DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL)

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0832257A1 (cs)
JP (1) JP2000510683A (cs)
KR (1) KR19980703238A (cs)
CN (1) CN1185812A (cs)
AU (1) AU5165696A (cs)
CZ (1) CZ297397A3 (cs)
EE (1) EE9700321A (cs)
HU (1) HUP9802388A3 (cs)
IL (1) IL118335A0 (cs)
PL (1) PL322848A1 (cs)
RU (1) RU2157847C2 (cs)
SE (1) SE9501939D0 (cs)
TR (1) TR199701010T1 (cs)
TW (1) TW434314B (cs)
WO (1) WO1996037622A1 (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001255501A1 (en) * 2000-04-21 2001-11-07 Monsanto Technology Llc Blood-pressure reducing polypeptides containing vpp derived from microorganisms
KR100717353B1 (ko) * 2006-04-12 2007-05-11 한국생명공학연구원 피키아 파스토리스 유래의 자동 유도성 ｎｐｓ 프로모터 및이를 이용한 이종 단백질의 제조방법
CN103952386A (zh) * 2014-03-31 2014-07-30 四川农业大学 利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶ppl的方法
RU2697218C1 (ru) * 2018-07-11 2019-08-13 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae
BR112022000391A2 (pt) * 2019-07-12 2022-03-03 Lipum Ab Novos anticorpos bssl

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0438200B1 (en) * 1990-01-16 2002-07-17 Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Method for the expression of heterologous genes in the yeast Pichia pastoris, expression vectors and transformed microorganisms
IS4130A (is) * 1993-03-01 1994-09-02 Ab Astra Ný fjölpeptíð

Also Published As

Publication number Publication date
SE9501939D0 (sv) 1995-05-24
HUP9802388A3 (en) 2000-10-30
JP2000510683A (ja) 2000-08-22
IL118335A0 (en) 1996-09-12
WO1996037622A1 (en) 1996-11-28
RU2157847C2 (ru) 2000-10-20
EP0832257A1 (en) 1998-04-01
HUP9802388A2 (hu) 1999-02-01
EE9700321A (et) 1998-06-15
KR19980703238A (ko) 1998-10-15
TR199701010T1 (xx) 1998-01-21
CN1185812A (zh) 1998-06-24
AU5165696A (en) 1996-12-11
TW434314B (en) 2001-05-16
PL322848A1 (en) 1998-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3795073B2 (ja) 酵母株および修飾アルブミン
EP0481008B1 (en) Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector
FI104497B (fi) DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta
US5795776A (en) Expression plasmids regulated by an OSMB promoter
NZ243782A (en) Kluyveromyces host/vector couple and its use
NZ249153A (en) Human serum albumin, preparation and pharmaceutical compositions
PT1276874E (pt) Clonagem e expressão de uma lipase extracelular resistente aos ácidos de yarrowia lipolytica
US5627046A (en) Yeast promoter and its use
EP1002095B1 (en) Improved protein expression strains
Rodriguez et al. Invertase secretion in Hansenula polymorpha under the AOX1 promoter from Pichia pastoris
US5516679A (en) Penicillin V amidohydrolase gene from Fusarium oxysporum
CZ297397A3 (cs) DNA molekula pro expresi žlučovými solemi stimulované lipasy (BSSL)
Phongdara et al. Cloning and characterization of the gene encoding a repressible acid phosphatase (PHO1) from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha
EP0362183A2 (en) Process for the production of human lysozyme
IE904481A1 (en) Novel Fungal Expression System
EP0570096B1 (en) Ornithine carbamoyl transferase gene and its use as a marker gene in a host-vector system for the production of proteins in basidiomycetes
AU715297B2 (en) DNA molecules for expression of polypeptides
JP2752092B2 (ja) Ｄｅｏプロモーターを有する発現プラスミド及び該プラスミドを含む細菌宿主
JPH04229188A (ja) 融合タンパク質の試験管内プロセシング
EP0154350A2 (en) Novel expression plasmids containing the full cDNA sequence of calf prochymosin
JPH06503718A (ja) メチロトローフ酵母細胞におけるヒトリゾチムの産生とその効率的な分泌
US6004776A (en) Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector
KR970005584B1 (ko) 폴리 펩타이드의 개선된 제조방법
MXPA97006853A (en) A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl)
JP3379133B2 (ja) オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子およびその利用

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic