JP2000510683A

JP2000510683A - 胆汁塩刺激リパーゼ（ｂｓｓｌ）発現のためのｄｎａ分子

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Publication number: JP2000510683A
Application number: JP08535592A
Authority: JP
Inventors: ダース，ガウタム
Original assignee: アストラ・アクチエボラーグ
Priority date: 1995-05-24
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 2000-08-22
Also published as: HUP9802388A3; EP0832257A1; AU5165696A; PL322848A1; EE9700321A; WO1996037622A1; CN1185812A; TW434314B; SE9501939D0; CZ297397A3; TR199701010T1; RU2157847C2; HUP9802388A2; IL118335A0; KR19980703238A

Abstract

(57)【要約】本発明はメチロトローフ酵母ピチア・パストリス（Pichia pastoris）において胆汁塩刺激リパーゼ(BSSL)を発現させる方法に用いられるDNA分子、組換えベクターおよび培養細胞に関する。DNA分子は、(ａ)ヒトBSSLまたはその生物学的に活性な変異体であるポリペプチドをコードする領域、(ｂ)上記DNA分子でトランスフォームされたピチア・パストリス細胞から上記ポリペプチドの分泌を指示できるシグナルペプチドをコードし、上記ポリペプチドのコード領域の5'-末端に連結した領域ならびに(ｃ)(ａ)および(ｂ)で定義された上記コード領域に操作性に連結したピチア・パストリスのメタノールオキシダーゼプロモーターまたはその機能的に均等なプロモーターからなる。

Description

【発明の詳細な説明】胆汁塩刺激リパーゼ（BSSL）発現のためのDNA分子発明の分野本発明は、メチロトローフ酵母のピチア・パストリス（Pichia pastoris）における胆汁塩刺激リパーゼ（BSSL）の発現方法に使用するDNA分子、組換えベクターおよび培養細胞に関する。本願は優先権主張の基礎出願としてインド国特許出願第351／MAS／95(出願日1995年３月23日)及びスウェーデン国特許出願第9501 939-4(出願日1995年５月24日)を主張する。発明の背景胆汁塩刺激リパーゼ（BSSL；EC 3.1.1.1）(総説はWang & Hartsuck，1993参照 )は人乳の脂質分解活性の主要部分を担っている。このリパーゼの特徴的な性質は、乳化された長鎖トリアシルグリセロールに対する活性に一次胆汁塩を要求することである。BSSLはこれまで、ヒト、ゴリラ、ネコおよびイヌの乳汁中にしか見出されていない（Hernellら，1989）。 BSSLはこれまで、母乳で育てられている乳児の腸内で乳脂質の消化のため重要な役割をもつと考えられてきた（Fredrikzonら，1987）。BSSLはヒトでは授乳期の乳腺で合成され、乳汁とともに分泌される BSSLは、BSSLの自己産生が欠損しているとくに早期の小児では、脂肪吸収および以後の生育の主要な律速因子であり、精製したこの酵素を小児用流動食に補給するとこれらの小児の消化および生育が改善される(US 4,944,944；Oklahoma Me dical Research Foundation)。これは、比較的高率のトリグリセライドを含有し植物または非ヒト乳タンパク質源をベースとした小児用流動食製品では、これらの流動食を給餌されてもBSSLが添加されていないと小児は脂肪を消化できないので、臨床的に重要である。乳汁中のBSSLおよび膵臓カルボン酸エステルヒドロラーゼ(CEH)について両者のcDNA構造の特徴が明らかにされ(Babaら，1991;Hui & Kissel，1991;Nilssonら，1991;Reueら，1991)、乳汁中の酵素と膵臓酵素とは同一の遺伝子のCEL遺伝子の産物であるとの結論が導かれた。CEL遺伝子のcDNA配列は（配列番号：１）US 5,200,183(Oklahoma MedicalResearch Foundation)；WO 91／18293(Aktiebolage t Astra)；Nilssonら(1991)；Babaら（1991）に開示されている。BSSLタンパク質の推定アミノ酸配列は、23アミノ酸のシグナル配列を含めて、配列表の配列番号：２に示し、一方、722アミノ酸のネイティブなタンパク質の配列は配列番号：３として示す。このタンパク質のＣ‐末端領域は、それぞれ11アミノ酸残基からなる16個のリピートを含有し、これに続いて11アミノ酸の保存されたストレッチが存在する。ネイティブなタンパク質は高度にグリコシル化されていて、報告されている測定分子量値は広い範囲に及んでいる。これは多分、グリコシル化の程度の変動によって説明できるものと思われる（Abouakilら，1988）。このタンパク質のＮ‐末端ハーフはアセチルコリンエステラーゼや他の一部のエステラーゼと相同性である(Nilssonら，1990)。組換えBSSLは、適当な宿主、たとえば大腸菌、出芽酵母（Saccharomyces cer evisiae）、または哺乳動物細胞系での発現によって製造できる。BSSLの発現系をスケールアップして製造コストを商業ベースに乗せるためには、異種発現系の利用が想定できる。上述のように、ヒトBS SLはＣ‐末端に11アミノ酸の16個のリピートを有する。このリピート領域の生物学的意義を決定するため、リピート領域の一部または全部を欠くヒトBSSLの様々な突然変異体が構築された(Hanssonら，1993)。たとえば、変異体BSSL-C（配列番号：４）ではアミノ酸残基536〜568およびアミノ酸残基591〜711が欠失している。哺乳動物細胞系Ｃ127宿主およびウシパピローマウイルス発現ベクターを使用した発現試験では、様々な変異体が活性型として発現できることが明らかにされた(Hanssonら，1993)。発現試験から、ヒトBSSL内のプロリンに富んだリピートは触媒活性またはBSSLの胆汁塩活性化には必須ではないとも結論された。しかしながら、哺乳動物発現系におけるBSSLまたはその突然変異体の製造は、治療へのルーチンな使用には高価につきすぎる。酵母のような真核細胞系は、組換えDNAによってコードされたポリペプチドの製造には、原核細胞系の使用に比べて、有意な利点を提供する可能性がある。たとえば、酵母は一般的に細菌の場合より高い細胞密度まで増殖が可能で、発現したポリペプチドをグリコシル化できることがわかっており、そしてこのようなグリコシル化は生物活性に重要である。しかしながら、出芽酵母を宿主生物として使用した場合には、発現レベルは低く、組換えタンパク質の分泌は少ないことが多い（Creggら，1987）。出芽酵母内の異種タンパク質の最高レベルは細胞総タンパク質の５％前後である（Kingsmanら，1985）。宿主として出芽酵母を用いた場合の更なる欠点は、組換えタンパク質が過剰にグリコシル化される傾向があり、グリコシル化哺乳動物タンパク質の活性に影響する可能性があることである。ピチア・パストリスは、高度に調整されたメタノール利用経路を含有し、メタノールを唯一の炭素源およびエネルギー源として増殖できるメチロトローフ酵母である(Ellisら，1985)。このピチア・パストリスはまた効率的な高細胞密度発酵法に適用可能である。すなわち、組換えDNA技術および効率的な酵母トランスフォーメーション法は、メタノールオキシダーゼプロモーターをベースとした発現系と相まって、大量の異種タンパク質の発現用宿主としてのピチア・パストリスの開発を可能にしたのである（Creggら，1987）。ピチア・パストリスはたとえば以下の異種タンパク質、すなわちヒト腫瘍壊死因子(EP-A-0263311)、百日咳ペルタクチン抗原(WO 91／15571)、Ｂ型肝炎表面抗原（Creggら，1987）、ヒトヒトリゾチームタンパク質(WO 92／04441)、アプロチニン（WO 92／01048）の発現の宿主としての使用が本技術分野で知られている。しかしながら、活性な、可溶性の、分泌型での異種タンパク質の発現の成功は様々な因子、たとえばシグナルペプチドの正しい選択、シグナルペプチドと成熟タンパク質の間の融合接合部の適切な構築、生育条件等に依存する。発明の目的本発明の目的は、従来の系に伴う上述の欠点を克服し、費用効果が優れ、他の生物体における産生の場合に匹敵するまたはより高収率でのヒトBSSLの製造方法を提供することにある。この目的はピチア・パストリス細胞内でBSSLを発現させる方法を提供することによって達成された。すなわち、本発明により、ヒトBSSLおよび変異体BSSL-Cはピチア・パストリスから活性型として発現、分泌されることが明らかにされた。ネイティブなシグナルペプチド、ならびに出芽酵母インベルターゼタンパク質に由来する異種シグナルペプチドが、成熟タンパク質を培養培地中に活性な適切にプロセッシングされた形態として輸送するために使用された。発明の説明第一の態様においては、本発明は、DNA分子すなわち、（a）ヒトBSSLまたはその生物学的に活性な変異体であるポリペプチドをコードする領域、（b）上記DNA分子でトランスフォームされたピチア・パストリスから上記ポリペプチドの分泌を指示できるシグナルペプチドをコードし、上述のポリペプチドのコード領域の5'-末端に連結された領域、ならびに（c）（a）および（b）で定義された上記コード領域に操作性に連結した、ピチア・パストリスのメタノールオキシダーゼプロモーターまたはその機能的に均等なプロモーター、からなるDNA分子を提供する。 BSSLの「生物学的に活性な変異体」の語は、BSSL活性を有し、配列表の配列番号：３に示すアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドを意味するものとして理解すべきである。この関連での「BSSL活性を有するポリペプチド」の語は、以下の性質、すなわち、（a）経口投与に適している、（b）特定の胆汁塩によって活性化される、および（c）小腸内容物中で非特異的リパーゼとして作用する、すなわち脂質をそれらの化学的構造および物理的状態（乳化、ミセル化、可溶化）には比較的無関係に加水分解できる、という性質を有するポリペプチドを意味するものとして理解すべきである。上記BSSL変異体はたとえば16個未満のリピート単位からなる変異体とすることができる。この場合の「リピート単位」は、配列表の配列番号：１の「特徴を表す記号」の項に“repeat unit”として指示されたヌクレオチド配列によってコードされる11アミノ酸の反復単位として理解すべきである。BSSL変異体としてはとくに、アミノ酸536〜568およびアミノ酸591〜711が欠失している変異体 BSSL-C（配列表の配列番号：４）がある。したがって、本発明のDNA分子は好ましくは、BSSL(配列番号：３)またはBSSL- C（配列番号：４）をコードするDNA分子である。しかしながら、本発明のDNA分子は、配列表の配列番号：３または４と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA分子に厳密に限定されるものではない。むしろ、本発明は、置換、小欠失、挿入または逆位のような修飾を有するが、実質的にBSSLの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするDNA 分子を包含するものである。本発明は、したがって上述のように、BSSL変異体をコードするDNA分子、また配列表の配列番号：３または４に示されたアミノ酸配列と少なくとも90％のホモロジー、好ましくは少なくとも95％のホモロジーを有するアミノ酸配列のポリペプチドをコードするDNA分子を包含する。上述のシグナルペプチドは配列表の配列番号：２にアミノ酸−20〜−１として示したアミノ酸配列を有するペプチドと同一または実質的に同じペプチドとすることができる。また、それは出芽酵母のインベルターゼのシグナルペプチドからなるペプチドとすることもできる。さらに他の態様において、本発明は上に定義したDNA分子からなるベクターを提供する。このようなベクターは好ましくは、ヒトBSSLまたはその生物学的に活性な変異体をコードするDNA配列の、ピチア属酵母の細胞内での発現を誘導できる複製可能な発現ベクターである。このようなベクターは、たとえば、プラスミドベクタ−pARC 5771(NCIMB 40721)、pARC 5 799(NCIMB 40723)またはpARC 5797(NCIMB 40722)でありうる。本発明はまた、他の態様において、上に定義したDNA分子またはベクターでトランスフォームされたピチア属酵母の細胞からなる培養宿主細胞を提供する。宿主細胞は、好ましくはPPF-1またはGS115のような株のピチア・パストリス細胞である。上述の培養細胞は、たとえば、培養PPF-1［pARC 5771］(NCIMB 40721)、G S115［pARC 5799］(NCIMB 40723)もしくはGS115［pARC 5797］（NCIMB 40722）でありうる。本発明はさらに他の態様において、ヒトBSSLまたはその生物学的に活性な変異体であるポリペプチドの製造方法において、本発明の宿主細胞を上記ポリペプチドが培養培地中に分泌される条件下に培養し、培養培地から上記ポリペプチドを回収することからなる方法を提供する。実施例実施例１：ピチア・パストリスPPF-1におけるBSSLの発現 1.1. pARC 0770の構築 BSSLタンパク質をネイティブなシグナルペプチド（以下、NSPという）を含めてコードするcDNA配列（配列番号：１）をEcoR I-Sac IフラグメントとしてpTZ1 9R(Pharmacia)中にクローン化した。低コピー数酵母発現ベクターでありその発現は構成的ADH１プロモーターの制御下にある出芽酵母発現ベクターpSCW 231(Un iversity of Rochester，NY，USAのL．Prakash教授より入手)へのNSP-BSSL cDNA のクローニングは、２工程で達成された。最初に、NSP-BSSL cDNAをpTZ19R-SP-B SSLからのEcoR I-Sph IフラグメントとしてpYES2.0(Invitrogen，USA)にクローン化した。EcoR Iとシグナルペプチドコード配列の最初に位置するNco Iの間の余分の89塩基対は、EcoR I／Nco I(89)融合体を創成させて除去し、ついで EcoR I部位を再生することによって除去した。得られたクローンpARC 0770は元来Nco I部位内にコードされていたATGコドンを含有し、この直後に再生されたEc oR I部位が残りのNSP-BSSL配列とインフレームに存在した。 1.2. pARC 5771プラスミドの構築 BSSLの発現に適当な発現ベクターの構築には、BSSLタンパク質をそのネイティブなシグナルペプチドとともにコードするcDNAフラグメントをピチア・パストリス発現ベクターpDM 148でクローン化した。ベクターpDM 148(UCSDのS．Subraman i博士から受領)は次のようにして構築された。すなわちメタノールオキシダーゼ (MOX１)遺伝子の上流非翻訳領域（5'-UTR）ならびに下流非翻訳領域（3'-UTR）をPCRによって単離し、大腸菌ベクターpSK⁺(Stratagene，USAから入手)の多重クローニング配列（MCS）中に縦列に配置した。ピチア・パストリスのトランスフォーマント候補の適切な選択には、出芽酵母のARG４遺伝子をコードするDNA配列をそれ自身のプロモーター配列とともにpSK^- 中の5'-と3'-UTRの間に挿入した。得られた構築体pDM 148は以下の特性を有する。すなわち、pSK^-のMCS内に、MOXの5'-UTR、出芽酵母のARG４ゲノム配列およびM OXの3'-UTRがクローン化された。MOXの5'-UTRとARG４ゲノム配列の間には、一連のユニークな制限部位（Sal I,EcoR I，Pst I，Sma IおよびBamH I）が配置され、ここには任意の異種タンパク質のコード配列を、ピチア・パストリスのMOXプロモーターの制御下に発現させるために、クローン化できる。この発現カセットのピチア・パストリスの染色体MOX１遺伝子座への組込みを促進するため、発現カセットはNco I制限酵素で消化しpSK^-ベクターの残部から切断することができる。 pDM 148にクローン化されたピチア・パストリスのMOX１の5'-UTRは長さ約500b pであり、一方、pDM 148にクローン化されたピチア・パストリスからのMOX１の3 '-UTRの長さは約1000bpであった。NSP-BSSL cDNAをpDM 148中のMOX１の5'-UTRと出芽酵母ARG４コード配列の間に挿入するためにはcDNAインサート（SP-BSSL）を pARC 0770からEcoR IとBamH Iによって消化して単離し(約2.2kbのDNAフラグメント)、pDM 148のEcoR IとBamH I部位の間にクローン化した。得られた構築体pARC 5771（NCIMB 40721）は、ピチア・パストリスのMOX１ 5' -UTR、ついでNSP-BSSLコード配列、ついで出芽酵母ARG４遺伝子配列、およびピチア・パストリスのMOX１遺伝子の3'-UTRを含有し、一方、MOX１の5'-UTRからMO X１の3'-UTRまでの全DNAセグメントはpSK^-のMCSにクローン化された。 1.3. BSSLのピチア・パストリス宿主PPF-1へのトランスフォーメーションピチア・パストリス宿主PPF-1（his4，arg4;Phillips Petroleum Co．から入手）内でのBSSLの発現には、プラスミドpARC 5771をNco Iで消化し、全消化混合物（総DNA 10μｇ）を用いてPPF-1をトランスフォームした。トランスフォーメーションのプロトコールはCreggら(1987)によって記載された酵母スフェロプラスト法にほぼ従った。トランスフォーマントは、Arg＋コロニーが選択できるようにアルギニン欠乏最小培地上で再生した。トランスフォーマントを含む再生上面アガールを採取し、水中でホモジナイズし、酵母細胞をアルギニンを欠く最小グルコースプレートに各プレートあたり約250コロニーになるようにプレーティングした。突然変異体コロニーをついで最小メタノールプレート上レプリカ平板法によって同定した。全トランスフォーマントの約15％がMut^S（メタノールスロー増殖）表現型であることがわかった。 1.4. BSSLを発現するトランスフォーマントのスクリーニング多数のトランスフォーマントをリパーゼの発現について迅速にスクリーニングするために、リパーゼプレートアッセイ法を開発した。これらのプレートの調製操作は以下の通りとした。２％アガロース溶液(最終)に、10×コール酸Na水溶液を最終濃度１％に加えた。この混合物に脂質基質トリブチンを最終濃度１％(v/v )に加えた。トランスフォーマントの生育を維持するため、混合物にさらに0.25 ％酵母窒素ベース（最終）と0.5％メタノール(最終)を補充した。成分を適当に混合し、プレートに３〜５mm厚まで注いだ。混合物が固化したならばトランスフォーマントをプレート上に線条接種し、ついでプレートを＋37℃で12時間インキュベートした。リパーゼ産生クローンはクローンの周囲に明瞭なハローを示した。典型的な実験では全部で93のトランスフォーマント中７個がBSSL産生トランスフォーマントとして同定された。線条接種したコロニーの周囲に最強の輪光を生じた２つのクローン(No.39および86)を採取してさらに特徴を調べた。 1.5. PPF-1［pARC 5771］からのBSSLの発現前項1.4.に記載した２個のトランスフォーマントNo.39および86を採取し、BMG Y液体培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、アミノ酸を含まない1.34％酵母窒素ベース、100mM KPO₄緩衝液、pH6.0、400μｇ／ｌのビオチン、および２％グリセロール）中30℃で24時間、培養液のＡ₆₀₀が40近くに達するまで増殖させた。培養体をペレットとして沈降させBMMY(BMGY中の２％グリセロールを0.5％メタノールで置換)培地にＡ₆₀₀＝300で再懸濁した。誘導された培養液を振盪しながら30℃で120時間インキュベートした。培養上清を様々な時点で採取し、BSS Lの発現を酵素活性アッセイ、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングによって分析した。 1.6. クローンNo.39および86の培養上清中のBSSL酵素活性の検出前項1.5.に記載の誘導培養体No.39および86の細胞を含まない培養上清中のの酵素活性の測定には、培養液を遠心分離して沈降させて、細胞を含まない上清２ μｌについて、Hernell & Olivecrona(1974)により記載された方法に従い、BSSL の酵素活性をアッセイした。表１に示すように、両培養液ともBSSLの酵素活性を含有し、誘導後96時間に最大活性を示すことが見出された。 1.7. PPF-1：pARC 5771トランスフォーマント(No.39および86)の培養上清のウエスタンブロット分析 No.39および86のPPF-1[pARC 5771］トランスフォーマントの培養上清中における組換えBSSLの存在を確認するために、培養体を項1.5.に記載のように増殖させ、誘導した。誘導後、様々な時点で培養液を採取し、抗BSSLポリクローナル抗体を用いウエスタンブロット分析に付した。結果は培養上清中における116kDaバンドとしてのBSSLの存在を示した。実施例２：ピチア・パストリスGS 115におけるBSSLの発現 2.1. pARC 5799の構築 5'-MOX UTRおよび3'-MOX UTRは正確に定義されなかったこと、およびpDM 148 ベクターにはピチアの染色体に組込まれたBSSLのコピー数をモニターする他の適当なマーカー（たとえばG418抵抗性遺伝子）がないことから、ネイティブなBSSL とそのシグナルペプチドのcDNAインサートを他のピチア・パストリス発現ベクターpHIL D4にクローン化した。組込み可能なプラスミドpHIL D4はPhillips Petro leum Companyから入手した。このプラスミドは5'-MOX１、約1000bpのアルコールオキシダーゼプロモーターのセグメントおよびユニークなEcoR Iクローニング部位を含有した。これはまたEcoR I部位に続くアルコールオキシダーゼ終結配列を含む約250bpの3 '-MOX１領域を含有した。この「終結」領域に続き宿主GS 115における欠損HIS４遺伝子を補足し2.8kbフラグメント上に含まれるピチア・パストリスのヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子HIS４が存在する（下記参照）。5'-MOX１領域とともに特定部位への組込みに必要な3'-MOX１ DNAを含有する650bp領域は、HIS４遺伝子の3'-末端に融合した。pUC-4K(PL-Biochemicals)からの細菌性カナマイシン抵抗性遺伝子はHIS４とHIS４遺伝子の3'における3'-MOX１領域の間のユニークな Nae I部位に挿入した。 NSP-BSSLをコードするcDNAフラグメントをpHIL D4のユニークなEcoR I部位にクローン化するためには、BamH I-EcoR I切断位置を有する二本鎖オリゴリンカーをBamH I消化プラスミドpARC 5771にライゲートし、全NSP-BSSLコード配列を2 .2kb EcoR Iフラグメントとして引出した。このフラグメントをpHIL D4のEcoR I 部位にクローン化し、正しい方向性をもつプラスミドをpARC 5799（NCIMB 40723 ）と命名した。 2.2. pARC 5799のトランスフォーメーション NSP-BSSLコード配列の、ピチア・パストリスのMOX Iのゲノム遺伝子座における組込みを容易にするために、プラスミドpARC 5799をBgl IIで消化し、ピチア・パストリス株GS 115（his4）(Phillips Petroleum Company)の項1.5.記載のプロトコールによるトランスフォーメーションに使用した。この場合はしかしながら、選択はHis原栄養性によった。再生上面アガールの系列希釈プレーティング後にトランスフォーマントを採取して、項1.4.に記載のようにリパーゼプレートアッセイにより直接試験した。２つのトランスフォーマントクローン(No.９および21)をリパーゼアッセイプレートにおけるハローのサイズに基づいて採取し、BSSLの発現についてさらにチェックした。これらのクローンはMut⁺であることが見出された。 2.3. GS 115［pARC 5799］トランスフォーマントNo.９および21の培養上清におけるBSSL酵素活性の測定 GS 115［pARC 5799］の２つのトランスフォームされたクローンNo.９および21 を項1.5.に記載のプロトコールにほぼ従い増殖させた。誘導後様々な時点で、項 1.6.に記載のようにして培養上清のBSSL酵素活性をアッセイした。表１に示したように、いずれの培養上清もBSSLの酵素活性を含有し、誘導72時間後に酵素活性は最大になることが見出された。いずれのクローンもPPF１［pARC 5771］のクローンに比較して優れたBSSLの発現を示した。 2.4. GS 115［pARC 5799］トランスフォーマントNo.９および21の培養上清のSD S-PAGEおよびウエスタンブロット分析項2.3.の記載のように、様々な時点で収集した培養上清をSDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析に付した。SDS-PAGEプロフィルからは、誘導培養液の上清中に存在する総タンパク質の約60〜75％がBSSLであると評価された。このタンパク質の分子量は約116kDaであった。ウエスタンブロットのデータからも、培養上清中に存在する主要なタンパク質はBSSLであることが確認された。このタンパク質はネイティブなBSSLと見掛け上同一の分子量を示した。実施例３：BSSLの発現のスケールアップ 3.1. トランスフォームされたクローンGS 115［pARC 5799］（No.21）からのB SSLの発現のスケールアップ容量23ｌのB．Braunファーメンターを用いた。１％YE，２％ペプトン、 1.34 YNBおよび４％w/vグリセロールを含有する培地５ｌを121℃で30分間オートクレーブ処理し、ついで滅菌ろ過後の接種時にビオチン（400μｇ／ｌ最終濃度）を添加した。接種には、YNB（67％）＋２％グリセロール(150ml)を含有する合成培地に接種し、30℃で36時間増殖させたGS115［pARC 5799］（No.21）のグリセロール保存株用いた。発酵条件は、温度＋30℃、pHは3.5Ｎ NH₄OHおよび２Ｎ HClを用いて5.0に維持し、溶存酸素は空気飽和の20〜40％、消泡剤としてポリエチレングリコール2000使用とした。増殖は規則的な間隔で600nmにおけるODを測定してモニターした。Ａ₆₀₀は24時間で最大の50〜60に達した。この時点で、溶存酸素レベルの上昇によって指示されるように、バッチの増殖期は終了した。増殖期は直ちに誘導期に続いた。この時期には、12ml／ｌのPTM１塩を含有するメタノールを供給した。メタノールの供給速度は最初の10〜12時間は６μｌ／時とし、以後７〜８時間毎に６ml／時ずつ徐々に増加させ、最大36ml／時とした。pHの調節に使用したアンモニアは窒素源としても作用した。メタノールの蓄積は６〜８時間毎に溶存酸素スパイキングを用いてチェックし、全誘導期を通じて限界であることが見出された。86時間のメタノール供給時に600nmにおけるODは5 6〜60から150〜170に上昇した。酵母エキスおよびペプトンは24時間毎に添加し、最終濃度をそれぞれ0.25％および0.5％とした。サンプルを24時間間隔で抜き取り、細胞を含まない培地中のBSSL酵素活性をチェックした。培地はまた、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング分析に付した。 3.2. ファーメンターで増殖させた培養GS 115［pARC 5799］（No.21）からの分泌BSSLのタンパク質分析細胞を含まない培地中のBSSL酵素活性は24時間の40〜70mg／ｌ(ネイティブなタンパク質の当量)から86〜90時間の終了時における最大200〜227.0mg／l（ネイティブなタンパク質の当量）に上昇した。細胞を含まない培地のSDS-PAGE分析では、顕著にクーマッシーブルー染色される分子量116kDaのバンドが見られる。このバンドの同一性は、項1.7.にネイティブなBSSLについて記載したように実施したウエスタンブロットによって確認した。 3.3. GS 115［pARC 5799］（No.21）クローンの培養上清中に分泌される組換え BSSLの精製ピチア・パストリスクローンGS 115[pARC 5799］を項3.1.に記載のようにファーメンター内で増殖させ、誘導した。組換えBSSLの精製には、培養培地(90時間誘導）250mlを12.000×ｇで30分間遠心分離し、粒状物質をすべて除去した。細胞を含まない培養上清を10kDaカットオフ膜を用いてセットしたAmiconで限外ろ過した。培養上清の塩ならびに低分子量タンパク質およびペプチドはろ過時に反復希釈して除去した。この希釈には５mMバルビトール緩衝液pH7.4を用いた。培養上清を濃縮後、残留物を５mMバルビトールpH7.4および50mM NaClを用いて250m lに再構築し、同じ緩衝液で予め平衡化したHeparin-Sepharoseカラム（床容量15 ml）に負荷した。サンプルの負荷は流速10ml／時で行った。負荷後、カラムを５ mMバルビトールpH7.4および0.1mM NaCl(200μl洗浄緩衝液)で250nmの吸収が検出レベル以下になるまで洗浄した。BSSLはバルビトール緩衝液（５mM、pH7.4）および0.1Ｍから0.7ＭまでのNaClの直線勾配200mlで溶出した。各分画(2.5ml)を集め、260nmの吸収をモニターして溶出するタンパク質をチェックした。タンパク質を含む分画のBSSL酵素活性をアッセイした。適当な分画を8.0％SDS-PAGE上で分析し、その精製プロフィルをチェックした。 3.4. GS 115[pARC 5799］の培養上清に分泌される精製組換えBSSLの特性最大のBSSL酵素活性を示す分画（項3.3.に記載）のSDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析により、組換えタンパク質は約90％の純度であることが明らかにされた。精製されたタンパク質の分子量はSDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析で測定して約116kDaであった。SDS-PAGE分析でサンプルを過剰に負荷した場合には、ウエスタンブロット上には認められなかった低分子量タンパク質のバンドがクーマッシー・ブリリアント・ブルー染色によって検出できた。精製タンパク質を自動タンパク質シーケンサーによりＮ‐末端分析に付した。結果は、タンパク質がネイティブなシグナルペプチドから適切にプロセッシングされ、組換えタンパク質はＮ‐末端配列：AKLGAVYをもつことを示した。精製された組換えタンパク質の比活性はネイティブなタンパク質の値に類似することが見出された。実施例４：ピチア・パストリスGS 115におけるBSSL-Cの発現 4.1. pARC 5797の構築 BSSLの変異体BSSL-CのcDNAコード配列をその5'-末端で、出芽酵母（S.cerevis iae）SUC２遺伝子産物(インベルターゼ)のシグナルペプチドコード配列と、インベルターゼシグナルペプチドの最初のATGコドンに始まるオープンリーディングフレームの統合性を維持して融合した。この融合遺伝子構築体は最初に、出芽酵母発現ベクターpSCW 231（pSCW 231は低コピー数の酵母発現ベクターであり、その発現は構成的ADH１プロモーターの制御下にある）のEcoR IとBamH I部位の間にクローン化して、発現ベクターpARC 0788を発生させた。融合遺伝子のcDNAは、pARC 0788のEcoR IおよびBamH I消化により適当な1.8kb フラグメントを放出させ、このフラグメントをEcoR IおよびBamH Iで消化したpD M 148にサブクローニングすることによって、ピチア・パストリス発現ベクターp DM 148(項1.2.に記載)にさらにサブクローニングした。得られた構築体pARC 579 0をBamH Iで消化し、物理構造BamH I-EcoR I-BamH Iの二本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをライゲートして構築体pARC 5796を発生させ、項2.1.記載の戦略に従い融合遺伝子のcDNAフラグメントを実質的に単離した。最後に、インベルターゼシグナルペプチド／BSSL-C融合遺伝子を含む1.8kbフラグメントをEcoR I消化によってpARC 5796から放出させ、pHILD4のEcoR I部位にクローン化した。このインサートを適当な方向性にて含有する発現ベクターを適当な制限分析によって同定し、pARC5796（NCIMB 40722）と命名した。 4.2. ピチア・パストリスからBSSL-Cの発現組換えBSSL-Cをピチア・パストリスから発現させるためには、ピチア・パストリス宿主GS 115を項1.3.および2.2に記載の方法によってpARC 5796でトランスフォームした。トランスフォーマントを項1.4.および2.2.に記載の方法によりリパーゼの産生についてチェックした。リパーゼ平板アッセイ検出法による高いリパーゼ産生能に基づいて１個のトランスフォーマント(No.３)を取り上げ、項1.6. および2.3.に記載の方法にほぼ従い培養上清中におけるBSSL酵素活性の産生についてさらに分析した。表１に示すように、GS 115［pARC5797］(No.3)の培養上清はBSSL酵素活性を含有し、誘導後72時間までその量は次第に増加した。 4.3. GS 115［pARC 5797］トランスフォーマント(No.3)の培養上清のSDS-PAGE およびウエスタンブロット分析項4.2.に記載の様々な時点で収集した培養上清を項1.7.およびに2.4.に記載のようにSDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析に付した。SDS-PAGEのプロフィルから総細胞外タンパク質の約75〜80％はBSSL-Cであると評価された。このタンパク質の分子量はSDS-PAGE分析から評価して約66kDaであった。ウエスタンブロット分析では、66kDaの付近の２個のバンド（ダブレット）のみに免疫反応性が認められ、組換えBSSL-Cの発現が確認された。比較例：BSSLの出芽酵母における発現出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）においてBSSLの発現を試みた。出芽酵母ではBSSLの分泌はわずかで、ネイティブなシグナルペプチドは効率的に作動しなかった。さらに、ネイティブなシグナルペプチドは出芽酵母内では成熟タンパク質から切断されなかった。引用文献 Abouakil，N.，Rogalska，E.，Bonicel，J．and Lombardo，D.(1988)Biochim ．Biophys．Acta．961，299-308。 Baba，T.，Downs，D.，Jackson，K.W.，Tang，J．and Wang，C-S（1991）Bioc hemistry 30，5000-510。 225。 217，37-41。 Cregg，J.M．et al．（1987）Bio/Technology 5，479-485。 Ellis，S.B．et al．（1985）Mol．Cell．Biol．5，1111-1121。（1978）Pediatric Res．12，1048-1052。 26698。 Hernell，O．and Olivecrona，T．（1974）Biochim．Biophys．Acta 369，234 -244。 Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy（Lebenthal，E，ed. ）347-354，Raven Press，NY。 885。 Hui，D.Y．and Kissel，J.A．（1990）FEBS Letters 276，131-134。 Kingsman，et．al．（1985）Biotechnology and Genetic EngineeringReviews 3，377-416。 Hernell，O．and Bjursell，G．（1990）Eur．J．Biochem．192，543-550。 Reue，K.，Zambaux，J.，Wong，H.，Lee，G.，Leete，T.H.，Ronk， Scholtz，M.C．（1991）J．Lipid Res．32，267-276。 Wang，C-S，and Hartsuck，J.A．（1993）Biochim．Biphys Acta 1166，1-19 。微生物の寄託培養ピチア・パストリスにトランスフォームされた以下のプラスミドはブダペスト条約に基づき、National Collections of Industrial and Marine Bacteria （NCIMB），Aberdeen，Scotland，UKに1995年５月２日付で寄託された。株［プラスミド］ NCIMB受入番号 PPF-1［pARC 5771] 40721 GS115［pARC 5799] 40723 GS115［pARC 5797] 40722 表１ピチア・パストリスのトランスフォーマントの培養上清中の酵素活性

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．DNA分子であって、（ａ）ヒトBSSLまたはその生物学的に活性な変異体であるポリペプチドをコードする領域、（ｂ）上記DNA分子でトランスフォームされたピチア・パストリス（Pichiap astoris）から上記ポリペプチドの分泌を指示できるシグナルペプチドをコードし、上記ポリペプチドのコード領域の5'-末端に連結した領域、ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）で定義された上記コード領域に操作性に連結した、ピチア・パストリスのメタノールオキシダーゼプロモーターまたはその機能的に均等なプロモーター、からなるDNA分子。２．シグナルペプチドは、配列表の配列番号：２にアミノ酸−20〜−１として示したアミノ酸配列を有するペプチドと同一または実質的に同一である請求項１記載のDNA分子。３．シグナルペプチドは、出芽酵母のインベルターゼシグナルペプチドからなる請求項１記載のDNA分子。４．配列番号：１に示す11アミノ酸のリピート単位の少なくとも１個が欠失しているヒトBSSLの生物学的に活性な変異体をコードする請求項１〜３のいずれかに記載のDNA分子。５．BSSL活性を有し、配列番号：３または配列番号：４の配列と少なくとも95％のホモロジーを示すポリペプチドをコードする請求項１〜４のいずれかに記載の DNA分子。６．配列番号：３または配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項１〜５のいずれかに記載のDNA分子。７．請求項１〜６のいずれかに記載のDNA分子からなるベクター。８．ピチア・パストリスの細胞内でヒトBSSLまたはその生物学的に活性な変異体の発現を誘発できる請求項７記載の複製可能な発現ベクター。９．プラスミドベクターpARC 5771（NCIMB 40721）、pARC 5799（NCIMB 40723）またはpARC 5797（NCIMB 40722）である請求項８記載のベクター。 10．請求項７〜９のいずれかに記載のベクターでトランスフォームされたピチア（Pichia）属の宿主細胞。 11．ピチア・パストリス細胞である請求項10記載の宿主細胞。 12．ピチア・パストリス細胞は株GS115の細胞である請求項11記載の宿主細胞。 13．PPF-1［pARC 5771］(NCIMB 40721)、GS115［pARC 5799］（NCIMB 40723）またはGS115［pARC 5797］（NCIMB 40722）である請求項12記載の宿主細胞。 14．ヒトBSSLまたはその生物学的に活性な変異体であるポリペプチドを製造する方法において、請求項10〜13のいずれかに記載の宿主細胞を上記ポリペプチドが培養培地中に分泌される条件下に培養し、培養培地から上記ポリペプチドを回収することからなる方法。