RU2697218C1 - Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae - Google Patents
Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae Download PDFInfo
- Publication number
- RU2697218C1 RU2697218C1 RU2018125360A RU2018125360A RU2697218C1 RU 2697218 C1 RU2697218 C1 RU 2697218C1 RU 2018125360 A RU2018125360 A RU 2018125360A RU 2018125360 A RU2018125360 A RU 2018125360A RU 2697218 C1 RU2697218 C1 RU 2697218C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- proteins
- signal peptides
- pichia pastoris
- saccharomyces cerevisiae
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Описаны сигнальные пептиды митохондриальной локализации (последовательности представлены в табл. 1: SEQ ID 1, SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6, SEQ ID 7, SEQ ID 8, SEQ ID 9, SEQ ID 10). При использовании указанных пептидов в слитной полипептидной цепи с целевыми рекомбинантными белками увеличивается уровень выхода целевых рекомбинантных белков, изменяется качество их фолдинга при их экспрессии с использованием штаммов-продуцентов на основе дрожжей, в частности P.pastoris и S.cerevisiae. Изобретение может быть использовано для увеличения уровня выхода рекомбинантных белков и изменения качества их фолдинга при их экспрессии с использованием штаммов-продуцентов на основе дрожжей, в частности P.pastoris и S.cerevisiae. 2 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии и может быть использовано для увеличения уровня выхода рекомбинантных белков и изменения качества их фолдинга при их экспрессии с использованием штаммов-продуцентов на основе дрожжей, в частности P. pastoris и S. cerevisiae.
Штаммы-продуценты на основе прокариотического организма бактерии E. coli часто не пригодны для гетерологической экспрессии белков, которым требуются посттрансляционные модификации, эукариотические шапероны и процессинг для образования биологически активного состояния. Белки эукариотических организмов как правило имеют более сложную структуру, чем у прокариотических. Правильный фолдинг и процессинг является необходимым условием для их функционирования. Для синтеза сложных белков используют системы экспрессии, созданные на основе многоклеточных эукариотических организмов (культуры клеток млекопитающих, трансгенные растения и животные), которые позволяют получать гетерологичные белки. Существенным недостатком этих систем является достаточная сложность работы с такими культурами клеток, особенные требования к стерильности, аэрации биомассы, механическая непрочность клеток, дороговизна и трудоемкость получения трансгенных растений и животных, при недостаточном выходе целевых белков. Для рекомбинантного синтеза некоторых белков достаточно использовать штаммы-продуценты на основе дрожжей, такие как S. cerevisiae и P. pastoris. Данные штаммы-продуценты имеют ряд преимуществ. У дрожжей так же подробно как у E. coli изучены процессы метаболизма, при работе с ними используются стандартные методы генетической инженерии, дрожжи легко культивировать на относительно дешевых субстратах, все это делает возможным масштабирование процесса культивирования штаммов-продуцентов на основе дрожжей. Применение данной системы экспрессии позволяет сочетать простоту бактериальных систем экспрессии и возможности пострансляционных модификаций и фолдинга рекомбинантных белков [1]. Еще одни достоинством этой системы гетерологичной экспрессии является возможность осуществления процессинга целевого рекомбинантного белка. Использование лидерных пептидов в слитной полипептидной цепи с целевыми белками позволяет задать их направления их транспорта и процессинга внутри клетки штамма продуцента [2]. Например, данный подход необходим для белков со сложной структурой, а также для различных ферментов, обладающих токсичностью внутри клетки, в последнем случае используются секреторные лидерные пептиды направляющие рекомбинантные белки из цитоплазмы в культуральную жидкость. Культуральная жидкость после культивирования P. pastoris, содержит относительно небольшое количество собственных белков штамма-продуцента, поэтому секретированный целевой белок можно достаточно легко очистить от примесных белков и компонентов питательной среды. Так же возможно использовать для экспрессии не секреторные сигнальные пептиды, а сигналы внутриклеточной локализации. В значительной степени изучены сигнальные пептиды митохондриальной локализации. На данный момент известно 3 варианта встраивания белков во внутреннюю мембрану митохондрий [3]: 1) путь через белковый комплекс TIM22 («TIM22 pathway»): используется для некоторых белков, имеющих мотивы распознавания внутри своей структуры или последовательности иминокислотных остатков. Этот путь не задействует лидерные пептиды. 2) Путь остановки транспорта («Stop transfer pathway»): присущ белкам с одной трансмембранной спиралью. Данные белки экспрессируются с лидерной последовательностью, которая удаляется комплексом протеаз сразу после встраивания во внутреннюю мембрану митохондрий. 3) Консервативная сортировка («Conservative sorting))): белки транслируются с лидерным сигнальным пептидом, транспортируются в митохондриальный матрикс, затем сигнальный пептид отщепляется митондриальной пептидазой [4] и белок претерпевает фолдинг и, если это мембранный белок, встраивается в мембрану при помощи фермента Oxa1 [6]. Данный способ используется преимущественно для белков, кодируемых митохондриальной ДНК, а также для белков, кодируемых ядерными генами, но имеющих прокариотические аналоги [6], например, субъединица 9 F0F1 ATPase N. crassa, Oxa1, Сох18/Оха2, Mrs2.
Решение задачи увеличения уровня экспрессии генов рекомбинантных белков при использовании штаммов-продуцентов на основе дрожжей актуально с момента разработки технологии их культивирования. Предлагаемый нами способ увеличения уровня экспрессии генов целевых рекомбинантных белков заключается в добавлении на 5"-конец генов, кодирующих данные рекомбинантные белки, - генов, кодирующих последовательности лидерных пептидов митохондриальной локализации (при сохранении рамки считывания). Аминокислотные последовательности данных лидерных пептидов представлены в таблице 1. Таким образом, при экспрессии генов целевых рекомбинантных белков с генами, кодирующими лидерные пептиды, целевые рекомбинантные белки будут нести на своем N-конце пептиды митохондриальной локализации в слитной полипептидной цепи. Данные сигнальные пептиды будут приводить к транспорту целевых полипептидов (белков) в митохондрии (в некоторых случаях через эндоплазматический ретикулум, в зависимости от выбранного сигнального пептида), что приведет: 1) к задействованию митохондриальных пептидаз в специфическом гидролизе слитной последовательности аминокислотных остатков после сигнальных пептидов, 2) процессингу целевых полипептидов в соответствии с выбранным сигнальным пептидом, при этом отличном от процессинга, которому подвергается целевой полипептид без сигнального пептида, 3) участию в фолдинге целевых полипептидов шаперонов (митохондриальных и эндоплазматического ретикулума) соответствующих данному сигнальному пептиду. Процессы 2 и 3, вызванные использованием сигнальных пептидов, для некоторых рекомбинантных белков приводят к увеличению общего уровня их экспрессии, то есть приводят к увеличению их количества содержащегося в цитоплазме и мембранах клеток штамма-продуцента. Это вероятно обусловлено изменениями в процессах внутриклеточного процессинга полипептидов (2) и фолдинга (3) происходящими при наличии пептидов митохондриальной локализации на N-конце белков.
При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующем примере, используются хорошо известные специалистам методики, описанные в руководствах по молекулярной биологии и генетической инженерии [7].
Пример 1. Выбор сигнальных лидерных пептидов.
Были проанализированы аминокислотные последовательности белков, имеющих митохондриальную локализацию, а также для белков, кодируемых ядерными генами, но имеющих прокариотические аналоги. Их последовательности и идентификационные номера в базе данных белков приведены в Таблица 2. Данные последовательности аминокислотных остатков построены автоматически по кДНК белков, соответствуют последовательности мРНК белков, согласно принципам формирования базы данных. Таким образом, последовательности аминокислотных остатков белков содержат полную последовательность незрелых белков до их посттрансляционного процессинга и модификаций. В частности, данные последовательности аминокислотных остатков включают в себя последовательности лидерных сигнальных пептидов. Данные лидерные пептиды и были выбраны для использования.
Источники информации.
1. J.M. Cregg, Higgins D.R. 1995. Production of foreign proteins in the yeast Pichia pastoris. // Canadian J. Botany Supp.73, 5981-5987.
2. Герасимов A.C., Шульга A.A., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Синтез гетерологичных рецепторов, связанных с G-белком, в клетках метилотрофных дрожжей P. pastoris. Доклады Академии Наук. Т.441 (5), с. 1-4, 2011. Pichia pastoris. Nat Biotechnol. 27: 561-566, 2009
3. Mossmann, D., Meisinger, C, F. N. 2012. Processing of mitochondrial presequences. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 1819(9), 1098-1106.
4. F.N., Wortelkamp, S., Zahedi, R.P., Becker, D., Leidhold, C., Gevaert, K., … & Meisinger, C. 2009. Global analysis of the mitochondrial N-proteome identifies a processing peptidase critical for protein stability. Cell, 139(2), 428-439.
5. Stuart, Rosemary A. 2002. Insertion of proteins into the inner membrane of mitochondria: the role of the Oxal complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research 1592.1: 79-87.
6. Rojo, E.E., Stuart, R.A., & Neupert, W. (1995). Conservative sorting of F0-ATPase subunit 9: export from matrix requires delta pH across inner membrane and matrix ATP. The EMBO journal, 14(14), 3445.
7. Ausubel F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. (1997) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York.
Claims (1)
- Использование одного из сигнальных пептидов SEQ ID 1, SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6, SEQ ID 7, SEQ ID 8, SEQ ID 9, SEQ ID 10 для гетерологической экспрессии в слитной полипептидной цепи с рекомбинантным белком в штаммах-продуцентах на основе P.pastoris и S. cerevisiae для увеличения уровня экспрессии рекомбинантных белков.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018125360A RU2697218C1 (ru) | 2018-07-11 | 2018-07-11 | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018125360A RU2697218C1 (ru) | 2018-07-11 | 2018-07-11 | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2697218C1 true RU2697218C1 (ru) | 2019-08-13 |
Family
ID=67640535
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018125360A RU2697218C1 (ru) | 2018-07-11 | 2018-07-11 | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2697218C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2157847C2 (ru) * | 1995-05-24 | 2000-10-20 | Астра Актиеболаг (пабл) | Молекула днк для экспрессии, стимулируемой солями желчи липазы (bssl) |
EA022946B1 (ru) * | 2009-07-15 | 2016-03-31 | ЛАБОРАТОРИОС БЕТА Эс.Эй. | Способ получения инсулина аспарт при помощи штамма дрожжей pichia pastoris |
-
2018
- 2018-07-11 RU RU2018125360A patent/RU2697218C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2157847C2 (ru) * | 1995-05-24 | 2000-10-20 | Астра Актиеболаг (пабл) | Молекула днк для экспрессии, стимулируемой солями желчи липазы (bssl) |
EA022946B1 (ru) * | 2009-07-15 | 2016-03-31 | ЛАБОРАТОРИОС БЕТА Эс.Эй. | Способ получения инсулина аспарт при помощи штамма дрожжей pichia pastoris |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Borst | How proteins get into microbodies (peroxisomes, glyoxysomes, glycosomes) | |
Dyall et al. | Presence of a member of the mitochondrial carrier family in hydrogenosomes: conservation of membrane-targeting pathways between hydrogenosomes and mitochondria | |
CA2589164C (en) | Production of proteins | |
US8119369B2 (en) | Human SUMO-3 for enhancing protein expression | |
US10752931B2 (en) | Designing an enzymatic peptide fragment condensation strategy | |
Braun et al. | The protein-import apparatus of plant mitochondria | |
US10174304B2 (en) | Expression vector and method for producing protein | |
CN103819546A (zh) | 一种以水蛭素为融合伴侣制备重组小分子蛋白或多肽的方法 | |
RU2697218C1 (ru) | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae | |
CN104195157A (zh) | 生物活性肽在原核细胞中的高效率重组表达和纯化方法 | |
Razzak et al. | Expression of seven carbonic anhydrases in red alga Gracilariopsis chorda and their subcellular localization in a heterologous system, Arabidopsis thaliana | |
CN109439643A (zh) | 一种新型赖氨酸特异性内切酶及其制备方法 | |
CN111378047A (zh) | 一种提高蛋白表达的融合标签蛋白及其应用 | |
CN109055339A (zh) | Tev蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用 | |
Wang et al. | The small ubiquitin-like modifier (SUMO) and SUMO-conjugating system of Chlamydomonas reinhardtii | |
US20060099689A1 (en) | Use of caspase enzymes for maturation of engineered recombinant polypeptide fusions | |
CN113249352B (zh) | 一种n糖基转移酶突变体p1及其应用 | |
Altamura et al. | Systems for production of proteins for biomimetic membrane devices | |
WO2021104482A1 (zh) | 一种多肽标签及其在体外蛋白合成中的应用 | |
Huang et al. | Expression of recombinant human octamer-binding transcription factor 4 in rice suspension cells | |
KR20070029630A (ko) | 단리된 광단백질 엠티클리틴 및 그의 용도 | |
Reyes-Ruiz et al. | Proteins in a DNA world: expression systems for their study | |
Uemura et al. | Mtc6/Ehg2 is a novel endoplasmic reticulum-resident glycoprotein essential for high-pressure tolerance | |
CN110577958A (zh) | 核酸、重组质粒、转化株、乙酰胆碱酯酶及其制备方法 | |
CN102654504A (zh) | 一种快速检测重组蛋白表达量的方法 |