KR20070029630A - 단리된 광단백질 엠티클리틴 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광단백질 엠티클리틴, 그의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 및 광단백질 엠티클리틴의 활성 및 용도에 관한 것이다.

광단백질, 엠티클리틴, 클리틴

Description

단리된 광단백질 엠티클리틴 및 그의 용도 {ISOLATED PHOTOPROTEIN MTCLYTIN, AND USE THEREOF}

본 발명은 광단백질 엠티클리틴, 그의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 및 광단백질 엠티클리틴의 활성 및 용도에 관한 것이다.

광단백질

살아 있는 유기체에 의한 빛의 발생 현상을 생물발광이라 지칭한다. 이는 세포에서의 생화학 반응의 결과이고, 이 반응에서 화학적 에너지가 광 양자 (화학발광에 의한 냉방출이라 명명되는 것)의 형태로 방출된다. 이러한 방식으로 생성되는 빛은 분리된 전자 이동과 관련되어 방출되기 때문에 단색이지만, 제2 발광 염료 (예를 들어 애쿠오리아(Aequoria) 속의 발광 해파리의 경우에는 형광 단백질)에 의해 보다 긴 파장의 스펙트럼 영역으로 이동될 수 있다.

생물발광은 다양한 생물학적 기능을 갖는데, 200 내지 1000 m (중심해) 깊이의 바다에서, 모든 살아 있는 유기체 중 약 90％가 발광한다. 이 경우, 발광 신호는 속임수로 및 유혹물로서 파트너를 유인하기 위해 사용된다. 글로웜(Glowworm) 및 반딧불이도 파트너를 찾기 위해 광 신호를 이용한다. 반면, 박테리아, 진균 및 단세포 조류의 발광의 의미는 명확하지 않다. 이는 많은 단일 개체들을 거대 인구로 통합하기 위해 사용되거나 일종의 생체 시계를 나타낸다고 추정된다.

매우 많은 수의 강장동물은 생물발광성이다 (Morin et al., 1974). 이들 유기체는 청색 또는 녹색 광을 방출한다. 단리된 단백질로서, 애쿠오리아 빅토리아(Aequoria victoria)로부터 유도되고 (Shimomura et al., 1969) 1962년에 최초의 광-생산 단백질로 확인된 애쿠오린은, 애쿠오리아 빅토리아의 경우에 표현형으로 관찰된 바에 따르면 녹색 광이 아닌 청색 광을 방출한다. 그 후에, 애쿠오린에 의해 활성화됨으로써 애쿠오리아 빅토리아로 하여금 표현형으로 녹색을 나타내도록 하는 녹색 형광 단백질 (GFP)이 상기 해파리로부터 단리되었다 (Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al., 1994). 또한 확인되어 기재되어 있는 다른 광단백질은 클리틴 (Inouye et al., 1993), 미트로코민 (Fagan et al., 1993) 및 오벨린 (Illarionov et al., 1995)이다.

몇몇 광단백질의 개요. 이 표는 명칭, 단백질이 단리된 유기체 및 데이타베이스 기입의 확인 번호 (Acc.No.)를 제공한다.

명칭	유기체	확인 번호
오벨린	오벨리아 제니쿨라타(Obelia geniculata)	AAL86372
클리틴	클리티아 그레가리아(Clytia gregaria)	CAA49754
애쿠오린	애쿠오레아 마크로닥틸라(Aequorea macrodactyla)	AAK02061
애쿠오린	애쿠오레아 파르바(Aequorea parva)	AAK02060
미트로코민	미트로코마 셀룰라리라(Mitrocoma cellularia)	AAA29298
폴라신	폴라스 닥틸루스(Pholas dactylus)	AAM18085
?	심플렉토테우티스 오우알라니엔시스(Symplectoteuthis oualaniensis)	AX305029

몇몇 광단백질의 개요. 이 표는 단백질이 단리된 유기체, 광단백질의 명칭 및 특허 또는 출원의 선택을 제공한다.

유기체	형광 단백질	특허/출원
오벨리아 제니쿨라타	오벨린	WO03006497
클리티아 그레가리아	클리틴	WO03006497
애쿠오리아 빅토리아	애쿠오린	WO200168824 US-0908909 US 6,152,358 JP-0176125
폴라스 닥틸루스	폴라신	WO0028025 GB-0024357

요즘 생물발광은 기술분야에서 매우 다양한 방법으로, 예를 들어 환경 오염의 생물 지표의 형태로 또는 생화학에서 단백질을 감도높게 검출하거나 특정 화합물을 정량하기 위해서, 또는 세포에서의 유전자 조절 연구와 관련된 리포터로 명명되는 것으로서 사용된다.

광단백질은 그의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 뿐만 아니라 그의 생화학적 성질 및 물성도 상이하다.

광단백질의 물성 및 생화학적 성질은 이들 단백질의 아미노산 서열을 변화시킴으로써 변화시킬 수 있음이 입증되어 있다. 돌연변이된 광단백질의 예는 문헌에 기재되어 있다 (US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986).

상기 기재한 광단백질은 코엘렌테라진을 산화시킴으로써 빛을 발생한다 (Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999).

리포터 시스템

일반적으로, 유전자 산물을 단순한 생화학적 또는 조직화학적 방법을 이용하여 쉽게 검출할 수 있는 유전자를 리포터 유전자 또는 지표 유전자라고 명명한다. 적어도 2개 유형의 리포터 유전자가 구분된다.

1. 내성 유전자. 이는 유전자의 발현으로 세포에서 항생제 또는 다른 물질에 대한 내성이 나타나는 유전자에 대해 사용되는 용어로서, 성장 배지에 항생제 또는 다른 물질이 존재할 때 내성 유전자가 없다면 세포의 죽음이 유도된다.

2. 리포터 유전자. 리포터 유전자의 산물은 유전적 조작에서 융합되거나 융합되지 않은 지표로서 사용된다. 가장 보편적인 리포터 유전자로는 베타-갈락토시다제 (Alam et al., 1990), 알칼리성 포스파타제 (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), 및 루시퍼라제 및 기타 광단백질 (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984)이 포함된다.

가시 스펙트럼 범위 내의 광자의 방출 (상기 방출은 여기된 방출물 분자에 의해 수행됨)을 발광이라 명명한다. 형광과 반대로, 이 경우에 에너지는 외부로부터 보다 짧은 파장의 방사 형태로 공급되지 않는다.

화학발광과 생물발광 사이에는 차이가 존재한다. 여기된 전자가 기저 상태로 되돌아올 때 그 자체가 발광하는, 여기된 분자를 유도하는 화학적 반응을 화학발광이라 명명한다. 상기 반응이 효소에 의해 촉매된다면, 이 현상은 생물발광이라고 언급된다. 상기 반응과 연관된 효소는 일반적으로 루시퍼라제라고 명명한다.

클리티아 그레가리아 종의 분류

크니다리아(Cnidaria) → 렙토메두사에(Leptomedusae) → 캄파눌라리이대(Campanulariidae) → 클리티아 그레가리아

클리티아 그레가리아 종은 크니다리아, 구체적으로는 메두사에(Medusae)에 속한다. 생물발광 및 형광 표현형은 각각 이미 1998년에 기재되어 있다 (Ward et al., 1998).

cDNA의 단리

클리티아 그레가리아 종의 생물발광 활성을 연구하기 위하여, 시편을 백해(White Sea) (카르테쉬 바이올로지컬 스테이션(Kartesh Biological Station, 러시아)에서 채취하여 액체 질소에 보관하였다. 클리티아 그레가리아 cDNA 라이브러리를 구축하기 위하여, 노바젠(Novagen) (USA)의 "스트레이트 A" 단리 방법을 이용하여 폴리(a)+ RNA를 단리하였다.

cDNA를 제조하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 이를 위해, 하기 반응식에 따라 RNA 1 ㎍을 역전사효소 (수퍼스크립트 골드 II)와 인큐베이션하였다:

PCR 1. 30초 95℃

2. 6분 68℃

3. 10초 95℃

4. 6분 68℃

단계 3 이후 단계 4의 17회 순환

폴리머라제를 불활성화시키기 위하여 반응 생성물을 프로티나제 K와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, cDNA를 에탄올로 침전시켰다. 클론테크 (USA) "스마트(SMART) cDNA" 라이브러리 구축 키트를 이용하여 제조사의 지시에 따라 cDNA 발현 라이브러리를 구축하였다. cDNA를 발현 벡터 pTriplEx2 (클론테크; USA)로 클로닝하였다. 발현 벡터를 전기천공법에 의해 균주 이. 콜라이 XL1 블루의 박테리아로 이동시켰다.

박테리아를 고체 LB 영양소 배지상에 플레이팅하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 니트로셀룰로스 필터를 이용하여 박테리아를 다른 고체 영양소 배지 플레이트로 이동시켜 복제 플레이팅을 수행하였다. 복제 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 차례로 인큐베이션하고, 성장한 박테리아 콜로니를 액체 LB 배지로 이동시켰다. IPTG (최종 농도, 0.1 mM)를 첨가한 후, 박테리아를 37℃에서 4시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 박테리아를 원심분리로 수거하고, 박테리아 덩어리를 0℃에서 붕괴 완충액 (5 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 9.0) 0.5 ml 중에 재현탁시켰다. 이어서, 박테리아를 초음파처리로 붕괴시켰다.

코엘렌테라진 (최종 농도, 10E-07 M)을 첨가한 후, 용균체를 4℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 염화칼슘 (최종 농도, 20 mM)을 첨가한 후 발광분석기에서 생물발광을 측정하였다.

광단백질을 확인하였다. 광단백질을 엠티클리틴으로 지칭하였다. 광단백질 엠티클리틴을 하기 상세하게 기재한다.

엠티클리틴

광단백질 엠티클리틴은 87％의 동일성으로 클리티아 그레가리아로부터의 클리틴과 아미노산 수치에서 가장 높은 상동성을 나타내고, 오벨리아 제니쿨라타로부터의 오벨린과 77％의 동일성을 나타낸다 (실시예 8; 도 8에 나타냄). 87％의 상동성 (클리틴에 대해)이 단백질의 C-말단에서 발생하며, 다중 아미노산 치환이 전체 단백질에 걸쳐 확인가능하게 분포된다. 핵산 수치에서, 동일성은 30％ 미만이다 (실시예 7; 도 7에 나타냄). 서열 비교를 위해 블라스트(BLAST) 방법을 사용하였다 (Altschul et al., 1997).

광단백질 클리틴-2는 클리티아 그레가리아로부터의 클리틴과 아미노산 수치에서 가장 높은 상동성을 나타낸다. 그러나, 서열은 아미노산 서열에서 많은 차이를 나타내며, 이들 차이점은 실시예 11 (도 9)에 서술되어 있다. 상기 차이점은 물리화학, 생화학 및 생물발광 성질에서의 변화를 유발시킬 수 있다. 광단백질 클리틴-2는 어떠한 신호 펩티드도 보유하지 않는다 (실시예 10에 나타낸 바와 같음).

광단백질 엠티클리틴은 광단백질을 미토콘드리아로 이동하게 할 수 있는 신호 펩티드를 보유한다. 신호 펩티드는 컴퓨터 프로그램 미토프로트(MITOPROT)로 확인하였다 (Claros et al., 1996) (실시예 10에 나타냄). 미토프로트에 의해 결정된 신호 펩티드를 서열 번호 3으로 제시하였다. 광단백질 엠티클리틴은 미토콘드리아로의 이동을 위한 자연적 신호 펩티드가 확인된 최초의 광단백질이다.

또한, 본 발명은 엠티클리틴의 기능적 등가물에 관한 것이다. 기능적 등가물은 유사한 물리화학적 성질을 갖고 서열 번호 2와 70％ 이상 상동인 단백질이다. 80％ 또는 90％ 이상 상동인 것이 바람직하다. 95％ 이상 상동인 것이 특히 바람직하다.

또한, 본 발명은 엠티클리틴 신호 펩티드의 기능적 등가물에 관한 것이다. 기능적 등가물은 유사한 물리화학적 성질을 갖고 서열 번호 3과 70％ 이상 상동인 단백질 또는 펩티드이다. 80％ 또는 90％ 이상 상동인 것이 바람직하다. 95％ 이상 상동인 것이 특히 바람직하다.

광단백질 엠티클리틴은 세포계, 특히 수용체, 이온 채널, 수송자, 전사 인자 또는 유도성 계에 대한 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드는 또한 세포계, 특히 수용체, 이온 채널, 수송자, 전사 인자 또는 유도성 계에 대한 융합된 리포터 유전자로서 사용되기 위하여, 리포터 유전자에 융합되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 또한 세포 기관, 특히 미토콘드리아를 표지, 확인 및 특성화함으로써 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드는 또한 세포 기관, 특히 미토콘드리아로의 이동을 위해 펩티드 또는 단백질에 융합되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 또한 세포 기관, 특히 미토콘드리아 내부 및 외부의 파라미터, 특히 칼슘 농도를 결정하기 위한 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드는 또한 융합 펩티드로서 세포 기관, 특히 미토콘드리아 내부 및 외부의 파라미터, 특히 칼슘 농도를 결정하기 위한 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 박테리아계 및 진핵생물계, 특히 포유동물 세포, 박테리아, 효모, 바큘로 및 식물에서 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 생물발광계 또는 화학발광계, 특히 루시퍼라제, 옥시게나제 또는 포스파타제를 이용하는 계와 공동으로 세포계에 대한 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드는 또한 융합 펩티드로서, 생물발광계 또는 화학발광계, 특히 루시퍼라제, 옥시게나제 또는 포스파타제를 이용하는 계와 공동으로 세포계에 대한 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 특히 수용체, 이온 채널, 수송자, 전사 인자, 프로티나제, 키나제, 포스포디에스테라제, 히드롤라제, 펩티다제, 트랜스퍼라제, 막 단백질 및 당단백질에 대한 융합 단백질로서 사용되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드는 융합 펩티드로서, 특히 수용체, 이온 채널, 수송자, 전사 인자, 프로티나제, 키나제, 포스포디에스테라제, 히드롤라제, 펩티다제, 트랜스퍼라제, 막 단백질 및 당단백질에 대한 융합 단백질로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 특히 항체, 비오틴, 또는 자기 또는 자화성 지지체에 의해 고정되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 에너지 전달 시스템, 특히 FRET (형광 공명 에너지 전달), BRET (생물발광 공명 에너지 전달), FET (전계 효과 트랜지스터), FP (형광 편광) 및 HTRF (균질 시간차 형광) 시스템에 대한 단백질로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 특히 프로테아제, 키나제 또는 트랜스퍼라제에 대한 기질 또는 리간드를 표지하기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 박테리아계에서 특히 역가 결정을 위해, 생화학 시스템, 특히 프로티나제 및 키나제에 대한 기질로서 발현되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 특히 항생제, 효소, 수용체 또는 이온 채널 및 다른 단백질에 커플링된 표지로서 사용되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드는 또한 융합 펩티드로서, 특히 항생제, 효소, 수용체 또는 이온 채널 및 다른 단백질에 커플링된 표지로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 특히 HTS (고 작업량 스크린)에서 약리학적 활성 화합물을 찾는 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드은 또한 특히 HTS (고 작업량 스크린)에서 약리학적 활성 화합물을 찾는 리포터 유전자로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 특히 ELISA (효소-결합 면역흡수 분석법), 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅 또는 공초점 현미경법에 대한 검출 시스템의 성분으로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 상호작용, 특히 단백질-단백질 상호작용, DNA-단백질 상호작용, DNA-RNA 상호작용, RNA-RNA 상호작용, 또는 RNA-단백질 상호작용 (DNA: 데옥시리보핵산; RNA: 리보핵산)을 분석하기 위한 표지로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 유전자도입 유기체, 특히 마우스, 래트, 햄스터 및 다른 포유동물, 영장류, 어류, 벌레 또는 식물에서의 발현에 대한 표지 또는 융합 단백질로서 사용되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드는 융합 펩티드로서, 유전자도입 유기체, 특히 마우스, 래트, 햄스터 및 다른 포유동물, 영장류, 어류, 벌레 또는 식물에서의 발현에 대한 표지 또는 융합 단백질로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 진핵생물 발달을 분석하기 위한 표지 또는 융합 단백질로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 커플링 매개체, 특히 비오틴, NHS (N-히드록시술포숙신이미드) 또는 CN-Br을 위한 표지로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 핵산, 특히 DNA 또는 RNA에 커플링되는 리포터로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 단백질 또는 펩티드에 커플링되는 리포터로서 사용되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드는 또한 융합 펩티드로서, 단백질 또는 펩티드에 커플링되는 리포터로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 세포내 또는 세포외 칼슘 농도를 측정하기 위한 리포터로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 세포계에서의 신호 단계반응을 특성화하기에 적합하다.

핵산 또는 펩티드에 커플링되는 광단백질 엠티클리틴은 특히 노던 블롯, 서던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA, 핵산 서열화, 단백질 분석 또는 칩 분석을 위한 프로브로서 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 약리학적 제제, 특히 전염성 물질, 항체 또는 "소분자"를 표지하기 위해 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 특히 해양, 지하수 및 강류에 대한 지질 연구를 위해 사용되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 발현계, 특히 시험관내 번역계, 박테리아계, 효모계, 바큘로계, 바이러스계 및 진핵생물계에서 발현되기에 적합하다.

엠티클리틴 신호 펩티드는 융합 펩티드로서, 발현계, 특히 시험관내 번역계, 박테리아계, 효모계, 바큘로계, 바이러스계 및 진핵생물계에서 발현되기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 수술적 개입, 특히 침습성, 비침습성 및 최소 침습성 개입과 관련하여 조직 또는 세포를 가시화하기에 적합하다.

광단백질 엠티클리틴은 또한 특히 조직학적 연구 및 수술적 개입과 관련하여 종양 조직 및 다른 표현형으로 변화된 조직을 표지하기에 적합하다.

본 발명은 또한 특히 야생형 단백질, 융합 단백질 및 돌연변이된 단백질로서의 광단백질 엠티클리틴의 정제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 특히 야생형 단백질, 융합 단백질 및 돌연변이된 단백질로서의 엠티클리틴 신호 펩티드의 정제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 화장품 분야, 특히 목욕 첨가제, 로션, 비누, 바디 염료, 치약 및 바디 파우더에서의 광단백질 엠티클리틴의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 염색, 특히 식품, 목욕 첨가제, 잉크, 직물 및 플라스틱의 염색을 위한 광단백질 엠티클리틴의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 종이, 특히 연하장, 종이 제품, 벽지 및 수공예 용품을 염색하기 위한 광단백질 엠티클리틴의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 액체, 특히 물총, 분수, 음료수 및 얼음용 액체를 염색하기 위한 광단백질 엠티클리틴의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 장난감, 특히 손가락 염료 및 분장용구를 제조하기 위한 광단백질 엠티클리틴의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 서열 번호 2로 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 서열 번호 3으로 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 서열 번호 6으로 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

a) 서열 번호 2로 기재된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

b) 서열 번호 1로 서술된 서열을 함유하는 핵산 분자;

c) 상보적 가닥이 엄격한 조건 하에서 a) 또는 b)로부터의 핵산 분자와 혼성화되며, 광단백질의 생물학적 기능을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

(핵산 분자의 엄격한 혼성화는 예를 들면, 68℃에서 0.2 × SSC (1× 표준 염수 시트르산염 = 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 삼나트륨)를 포함하는 수용액 중에서 수행할 수 있음 (Sambrook et al., 1989))

d) 유전 암호의 축퇴성으로 인해 c)에서 언급된 핵산 분자와 상이한 핵산 분자;

e) 서열 번호 1과 95％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 그의 단백질 산물이 광단백질의 생물학적 기능을 나타내는 핵산 분자; 및

f) 서열 번호 1과 65％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 그의 단백질 산물이 광단백질의 생물학적 기능을 나타내는 핵산 분자

로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열 번호 1 또는 서열 번호 5와 95％, 90％, 85％, 80％, 75％, 70％, 65％ 또는 60％ 이상의 서열 상동성을 나타내며 광단백질의 성질을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열 번호 4와 95％, 90％, 85％, 80％, 75％, 70％, 65％ 또는 60％ 이상의 서열 상동성을 나타내며 신호 또는 리더 펩티드의 성질을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 서열이 광단백질-코딩 서열 또는 리더- 또는 신호-서열-코딩 서열의 5'에 기능적 프로모터를 함유하는 상기 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 재조합 DNA 또는 RNA 벡터의 성분인 상기 기재한 바와 같은 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 이러한 벡터를 보유하는 유기체에 관한 것이다.

본 발명은 엠티클리틴 분자 또는 본 발명에 따른 다른 분자의 DNA 또는 RNA 서열과 동일하거나 상보적인 10개 초과의 연속적인 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명은 상기 기재한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 광단백질에 관한 것이다.

본 발명은 박테리아, 진핵생물 세포 또는 시험관내 발현계에서 본 발명에 따른 광단백질 폴리펩티드를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 광단백질 폴리펩티드를 정제/단리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 5개 초과의 연속적인 아미노산을 가지며 본 발명에 따른 광단백질에 대항하여 지시된 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 특히 약리학적 활성 화합물을 찾기 위한 및 진단을 위한 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 본 발명에 따른 광단백질 코딩 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 표지 또는 리포터로서 또는 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 본 발명에 따른 광단백질 또는 본 발명에 따른 광단백질 코딩 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 특히 약리학적 활성 화합물을 찾기 위한 및 진단을 위한 표지 또는 리포터로서, 또는 표지 또는 리포터 유전자로서의 광단백질 엠티클리틴 (서열 번호 2)의 용도 또는 광단백질 엠티클리틴을 코딩하는 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 특히 약리학적 활성 화합물을 찾기 위한 및 진단을 위한 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 서열 번호 1에 서술된 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 특히 약리학적 활성 화합물을 찾기 위한 및 진단을 위한 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 서열 번호 6에 서술된 펩티드 및 그의 근본적인 핵산 서열인 서열 번호 5의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인식하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 광단백질 엠티클리틴 (서열 번호 2) 또는 광단백질 클리틴-2 (서열 번호 6)를 인식하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 광단백질 엠티클리틴 (서열 번호 3)의 신호 펩티드를 인식하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

a) 서열 번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

b) 서열 번호 4로 서술된 서열을 함유하는 핵산 분자;

c) 상보적 가닥이 엄격한 조건 하에서 a) 또는 b)로부터의 핵산 분자와 혼성화되며, 신호 또는 리더 펩티드의 생물학적 기능을 나타내는 펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

d) 유전 암호의 축퇴성으로 인해 c)에서 언급된 핵산 분자와 상이한 핵산 분자;

e) 서열 번호 4와 95％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 신호 또는 리더 펩티드의 생물학적 기능을 갖는 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및

f) 서열 번호 4와 65％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 신호 또는 리더 펩티드의 생물학적 기능을 갖는 펩티드를 코딩하는 핵산 분자

로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

a) 서열 번호 6으로 기재된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

b) 서열 번호 5로 서술된 서열을 함유하는 핵산 분자;

c) 상보적 가닥이 엄격한 조건 하에서 a) 또는 b)로부터의 핵산 분자와 혼성화되며, 광단백질의 생물학적 기능을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

d) 유전 암호의 축퇴성으로 인해 c)에서 언급된 핵산 분자와 상이한 핵산 분자;

e) 서열 번호 5와 95％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 광단백질의 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및

f) 서열 번호 5와 80％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 광단백질의 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자

로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 단락에서 기재한 바와 같고 코딩 서열의 5'에 기능적 프로모터를 함유하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 상기 기재한 핵산을 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 벡터를 포함한다.

상기 기재한 바와 같은 벡터를 보유하는 유기체도 본 발명에 따른다.

본 발명은 또한 상기 기재한 바와 같은 핵산 분자의 구성 서열과 동일하거나 상보적인 10개 초과의 연속적인 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 기재한 바와 같은 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 박테리아, 바이러스 세포, 효모 또는 진핵생물 세포에서 또는 시험관내 발현계에서 상기 폴리펩티드를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 정제/단리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 광단백질 엠티클리틴에 대항하여 지시된 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 갖는 펩티드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 광단백질 광단백질 클리틴-2에 대항하여 지시된 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 갖는 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열 번호 3으로 기재된 신호 또는 리더 펩티드에 대항하여 지시된 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 갖는 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열 번호 6 (클리틴-2)으로 기재된 광단백질에 대항하여 지시된 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 갖는 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 본 발명에 따른 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 표지 또는 리포터로서의 본 발명에 따른 광단백질의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열 번호 4로 서술된 서열을 함유하거나 서열 번호 4와 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％ 또는 90％, 바람직하게는 95％의 서열 동일성을 갖는 서열을 함유하는 핵산의, 신호 또는 리더 서열로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열 번호 3으로 서술된 서열을 함유하거나 서열 번호 3과 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％ 또는 90％, 바람직하게는 95％의 서열 동일성을 갖는 서열을 함유하는 펩티드의, 신호 또는 리더 펩티드로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 신호 또는 리더 펩티드에 융합된 단백질을 세포 기관으로 수송하기 위한, 상기 두 단락에서 기재한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포 기관이 미토콘드리아인, 상기 단락에서 기재한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포 기관이 소포체 (ER)인, 상기 단락에서 기재한 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열 번호 4로서 서술된 핵산 서열의 신호 또는 리더 서열로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열 번호 3으로서 서술되고, 서술된 서열을 신호 또는 리더 펩티드로서 함유하는 펩티드의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 신호 또는 리더 펩티드에 융합된 단백질을 세포 기관으로 수송하기 위한, 상기 두 단락에서 기재한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포 기관이 미토콘드리아인, 상기 단락에서 기재한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포 기관이 소포체 (ER)인, 상기 단락에서 기재한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 약리학적 활성 화합물을 찾기 위한 리포터 단백질로서의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 또한 약리학적 활성 화합물을 찾기 위한 리포터 단백질로서의 본 발명에 따른 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 광단백질의 발현

유전자가 적합한 숙주 세포로 도입된 후, 발현 벡터로 클로닝된 외래 유전자를 전사시키고 번역시키는 분자의 생산을 발현이라 명명한다. 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 유전자를 발현시키기 위해 요구되는 조절 신호를 함유한다.

원칙적으로, 발현 벡터는 두가지 상이한 방법으로 구축될 수 있다. 전사 융합이라고 명명되는 방법의 경우, 클로닝되어 들어온 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질은 진정한 생물학적 활성 단백질로서 합성된다. 상기 목적을 위해, 발현 벡터는 발현을 위해 요구되는 모든 5' 및 3' 조절 신호를 보유한다.

번역 융합이라고 명명되는 방법의 경우, 클로닝되어 들어온 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질은 혼성 단백질로서 쉽게 검출될 수 있는 다른 단백질과 함께 발현된다. 시작 코돈을 포함하고 형성될 혼성 단백질의 N-말단 영역을 코딩하는 서열의 일부를 포함할 수 있는 발현에 요구되는 5' 및 3' 조절 신호는 벡터로부터 시작된다. 추가의 삽입된 단백질 잔기는, 많은 경우에, 클로닝되어 들어온 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질을 세포 프로테아제에 의한 파괴에 대항하여 안정화시킬 뿐 아니라, 형성된 혼성 단백질을 검출하고 단리하기 위해 사용될 수 있다. 발현은 일시적으로 또는 안정되게 일어날 수 있다. 적합한 숙주 유기체는 박테리아, 효모, 바이러스 또는 진핵생물계이다.

본 발명의 광단백질의 정제

단백질의 단리 (단백질이 과발현된 후에도 마찬가지)는 종종 단백질 정제라고 명명된다. 단백질 정제를 위해서는 확립된 다수의 방법을 이용할 수 있다.

고체/액체 분리는 단백질 단리와 관련된 기본적 작업이다. 배양 배지로부터 세포를 분리할 때, 세포를 붕괴시키고 세포 잔해를 제거한 후 조 추출물을 정화할 때, 그리고 침강 후 침전물을 분리해 낼 때 등에서 상기 절차상의 단계가 요구된다. 이는 원심분리 및 여과로 수행된다.

세포내 단백질을 수득하기 위하여, 세포벽은 파괴되거나 투과가능하게 되어야 한다. 규모 및 유기체에 따라, 고압 균질화기 또는 교반기 볼 밀 또는 유리 비드 밀을 상기 목적을 위해 사용한다. 특히 실험관 규모에서는 기계적 세포 통합 및 초음파 처리를 사용한다.

세포외 단백질의 경우와 세포내 단백질의 경우 모두에서 (세포 붕괴 후), 염 (특히 황산암모늄) 또는 유기 용매 (알콜 또는 아세톤)를 사용하는 다양한 침강 방법은 단백질 농축을 위한 신속하고 효율적인 방법을 대표한다. 세포내 단백질을 정제하는 경우, 가용성 핵산 (예를 들어, 황산스트렙토마이신 또는 황산프로타민과의 침전물)을 제거하는 것이 바람직하다. 세포외 단백질을 단리하는 경우, 취급하기 보다 용이한 침전물을 수득하기 위하여, 침강제를 첨가하기 전에 담체 (예를 들어, 전분 또는 규조토)를 종종 첨가한다.

수많은 색층분석 방법 및 분배 방법 (흡수 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 친화도 크로마토그래피 및 전기영동)이 고급의 정제를 위해 이용가능하다. 컬럼 크로마토그래피는 또한 산업적 규모에 사용된다. 단계 당 수백가지 이하의 정제 인자를 가능하게 하는 친화도 크로마토그래피가 실험실 규모에서 특히 중요하다.

세포외 단백질은 비교적 희석된 용액에서 생긴다. 세포외 단백질처럼, 이는 추가로 사용되기 전에 농축되어야 한다. 이미 언급한 방법 이외에, 초여과가 또한 산업적 규모에 가치있는 것으로 입증되었다.

단백질을 수반하는 무기염은 종종 특정 분야의 경우에 바람직하지 않다. 이는 특히 겔 여과, 투석 및 정용여과로 제거될 수 있다.

수많은 단백질이 건조 제형으로서 사용된다. 중요한 건조 방법은 진공 건조, 동결 건조 및 분무 건조이다.

뉴클레오티드 및 아미노산 서열

광단백질 엠티클리틴은 하기 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1)로 코딩된다:

이는 (서열 번호 2)의 아미노산 서열을 제공한다:

광단백질 엠티클리틴의 추정되는 신호 펩티드는 하기 서열 (서열 번호 3)을 보유한다:

그리고 하기 핵산 서열을 보유한다:

광단백질 클리틴-2는 하기 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 5)로 코딩된다:

이는 (서열 번호 6)의 아미노산 서열을 제공한다:

상기 서열은 서열 목록에서 재현된다.

도 1: 도 1은 벡터 pTriplEX2-엠티클리틴의 플라스미드 지도를 나타낸다.

도 2: 도 2는 벡터 pcDNA3-엠티클리틴의 플라스미드 지도를 나타낸다.

도 3: 도 3은 엠티클리틴의 박테리아 발현의 결과 및 박테리아 발현 후 엠티클리틴의 생물발광 활성을 나타낸다. (Y = RLU: 상대적 광 단위; X = 희석; 흑색 막대 = 엠티클리틴; 회색 막대 = 대조군 용균체).

도 4: 도 4는 엠티클리틴의 진핵생물 발현의 결과 및 CHO 세포에서 발현 후 엠티클리틴의 생물발광 활성을 나타낸다. (Y = RLU: 상대적 광 단위; X = ATP (mol/l 단위의 로그 표시)).

도 5: 도 5는 엠티클리틴의 생물발광의 동력학적 분석을 나타낸다. (Y = RLU: 상대적 광 단위; X = 시간 [초]).

도 6: 도 6은 오벨린의 생물발광의 동력학적 분석을 나타낸다. (Y = RLU: 상대적 광 단위; X = 시간 [초]).

도 7: 도 7은 아미노산 수치에 대한 클리틴 및 엠티클리틴의 정렬을 나타낸다.

도 8: 도 8은 핵산 수치에 대한 클리틴 및 엠티클리틴의 정렬을 나타낸다.

도 9: 도 9는 아미노산 수치에 대한 클리틴, 엠티클리틴 및 클리틴-2의 정렬을 나타낸다.

실시예 1

클론테크 플라스미드 pTriplEx2를 하기 기재하는 구조체를 제조하기 위한 벡터로서 사용하였다. 벡터의 유도체를 pTriplEx2-엠티클리틴이라 지칭하였다. 벡터 pTriplEx2-엠티클리틴을 박테리아계에서 엠티클리틴을 발현시키기 위해 사용하였다.

도 1은 벡터 pTriplEX2-엠티클리틴의 플라스미드 지도를 나타낸다.

실시예 2

클론테크 플라스미드 pcDNA3.1(+)을 하기 기재하는 구조체를 제조하기 위한 벡터로서 사용하였다. 벡터의 유도체를 pcDNA3-엠티클리틴이라 지칭하였다. 벡터 pcDNA3-엠티클리틴을 진핵생물계에서 엠티클리틴을 발현시키기 위해 사용하였다.

도 2는 벡터 pcDNA3-엠티클리틴의 플라스미드 지도를 나타낸다.

실시예 3

박테리아 발현

박테리아를 발현 플라스미드 pTriplEX2-엠티클리틴 및 pTriplEX2로 형질전환시킴으로써, 박테리아 발현을 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)에서 수행하였다. 형질전환된 박테리아를 37℃에서 3시간 동안 LB 배지에서 인큐베이션하고, IPTG를 최종 농도 1 mM까지 첨가하여 발현을 4시간 동안 유도하였다. 유도된 박테리아를 원심분리로 수거하고, 50 mM Tris/HCl (pH 9.0) + 5 mM EDTA 중에 재현탁시키고, 초음파처리로 붕괴시켰다. 그 후, 용균체를 13,000 rpm (16,000 ref)에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 상청액 (Tris/HCl (pH 9.0)로 1:5, 1:10; 1:20 및 1:50 희석)을 암소에서 3시간 동안 코엘렌테라진 (Tris/HCl (pH 9.0) 중 10E-07 M 코엘렌테라진)과 인큐베이션하였다. 5 mM 염화칼슘을 첨가한 직후 발광분석기로 생물발광을 측정하였다. 측정 통합 시간은 40 초이었다.

도 3은 박테리아에서 엠티클리틴의 생물발광의 측정 결과를 나타낸다.

실시예 4

진핵생물 발현

일시적 실험으로 세포를 발현 플라스미드 pcDNA3-엠티클리틴 및 pcDNA3.1(+)로 형질감염시킴으로써, 구조적 진핵생물 발현을 CHO 세포에서 수행하였다. 이를 위하여, 웰 당 10,000개의 세포를 DMEM-F12 배지 중에서 96-웰 미량역가 플레이트에 플레이팅하고, 플레이트를 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 푸진(Fugene) 6 키트 (로슈)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 형질감염을 수행하였다. 형질감염된 세포를 DMEM-F12 배지에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 코엘렌테라진 (PBS 중 10E-07 M 코엘렌테라진) 50 ㎕로 대체하였다. 세포를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, ATP (아데노신 트리포스페이트)를 최종 농도 1 μM로 첨가하였다. 첨가 직후 발광분석기로 측정을 시작하였다. 통합 시간은 1초이었고, 총 측정 시간은 60 초이었다.

도 4는 CHO 세포에서 엠티클리틴의 생물발광의 측정 결과를 나타낸다.

실시예 5

블라스트

아미노산 수치에 대한 엠티클리틴의 블라스트 분석 결과:

>emb|CAD87655.1| unnamed protein product [Clytia gregaria], Length = 198, Score = 368 bits (945), Expect = e-101, Identities = 171/195 (87％), Positives = 182/195 (92％)

>sp|Q08121|CLYT_CLYGR Clytin precursor (Phialidin), pir||S28860 clytin - hydromedusa (Clytia gregarium), emb|CAA49754.1| clytin [Clytia gregaria], gb|AAA28293.1| apoclytin, Length = 198, Score = 368 bits (945), Expect = e-101, Identities = 171/195 (87％), Positives = 182/195 (92％)

>emb|CAD87658.1| unnamed protein product [synthetic construct], Length = 198, Score = 367 bits (943), Expect = e-101, Identities = 170/195 (87％), Positives = 182/195 (93％)

>sp|Q27709|OBL_OBELO Obelin precursor (OBL), pdb|1EL4|A Chain A, Structure Of The Calcium-Regulated Photoprotein Obelin, Determined By Sulfur Sas, gb|AAA67708.1| unnamed protein product, Length = 195, Score = 327 bits (837), Expect = 1e-88, Identities = 150/193 (77％), Positives = 170/193 (87％)

>emb|CAD87674.1| unnamed protein product [synthetic construct], Length = 195, Score = 326 bits (835), Expect = 2e-88, Identities = 149/193 (77％), Positives = 170/193 (87％)

>emb|CAD87672.1| unnamed protein product [synthetic construct], Length = 195, Score = 325 bits (834), Expect = 3e-88, Identities = 149/193 (77％), positives = 170/193 (87％)

>emb|CAD87673.1| unnamed protein product [synthetic construct], Length = 195, Score = 325 bits (833), Expect = 4e-88, Identities = 149/193 (77％), Positives = 170/193 (87％)

>pdb|1JF0|A Chain A, The Crystal Structure Of Obelin From Obelia Geniculata At 1.82 A Resolution, gb|AAL86372.1|AF394688_1 apoobelin [Obelia geniculata], Length = 195, Score = 325 bits (833), Expect = 4e-88, Identities = 149/193 (77％), Positives = 168/193 (86％)

실시예 6

블라스트

핵산 수치에 대한 엠티클리틴의 블라스트 분석 결과:

>emb|AX702125.1| Sequence 23 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 669 bits (348), Expect = 0.0, Identities = 504/582 (86％)

>emb|AX702119.1| Sequence 17 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 669 bits (348), Expect = 0.0, Identities = 504/582 (86％)

>emb|X70221.1|CGCLYTIN C.gregaria mRNA for clytin, Length = 747, Score = 669 bits (348), Expect = 0.0, Identities = 504/582 (86％)

>gb|L13247.1|CY1APOCLYT Clytia gregarium apoclytin mRNA, complete cds, Length = 747, Score = 669 bits (348), Expect = 0.0, Identities = 504/582 (86％)

>emb|AX702187.1| Sequence 85 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86％)

>emb|AX702185.1| Sequence 83 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86％)

>emb|AX702183.1| Sequence 81 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86％)

>emb|AX702181.1| Sequence 79 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86％)

>emb|AX702179.1| Sequence 77 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86％)

>emb|AX702131.1| Sequence 29 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86％)

>emb|AX702129.1| Sequence 27 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86％)

실시예 7

도 7은 핵산 수치에 대한 엠티클리틴과 클리틴 (클리티아 그레가리아)의 정 렬을 나타낸다.

실시예 8

도 8은 아미노산 수치에 대한 엠티클리틴과 클리틴 (클리티아 그레가리아)의 정렬을 나타낸다.

실시예 9

엠티클리틴의 동력학적 분석

엠티클리틴의 생물발광의 동력학적 분석을 위해, CHO 세포를 pcDNA3 엠티클리틴 또는 pcDNA 오벨린 또는 pcDNA3 (통합된 cDNA가 전혀 없음)로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 및 측정을 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 판독은 1초의 통합 시간을 이용하여 60초의 기간 동안 수행하였다.

도 5 및 6은 엠티클리틴 및 오벨린의 동력학적 분석 결과를 나타낸다.

실시예 10

미토프로트 분석

컴퓨터 프로그램 미토프로트를 사용하여 엠티클리틴 신호 펩티드를 분석하였다 (Claros et al., 1996). 하기 광단백질을 분석하였다: 오벨린 (Q27709), 애쿠오린 (P07164), 클리틴 (Q08121) 및 엠티클리틴 (서열 번호 2).

분석 결과:

오벨린:

서열명: 오벨린

입력 서열 길이 : 195 aa

---------------------------------------------------------

산정된 파라미터의 값

의문 서열의 총 전하 : -11

분석 영역 : 11

표적 서열에서 염기성 잔기의 수 : 3

표적 서열에서 산성 잔기의 수 : 0

절단 부위 : 예측불가능

절단 서열 : -

---------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------

확률

미토콘드리아로 유출될 확률: 0.1479

애쿠오린:

서열명: 애쿠오린

입력 서열 길이 : 196 aa

---------------------------------------------------------

산정된 파라미터의 값

의문 서열의 총 전하 : -13

분석 영역 : 3

표적 서열에서 염기성 잔기의 수 : 0

표적 서열에서 산성 잔기의 수 : 0

절단 부위 : 예측불가능

절단 서열 : -

---------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------

확률

미토콘드리아로 유출될 확률: 0.0148

클리틴:

서열명: 클리틴

입력 서열 길이 : 198 aa

---------------------------------------------------------

산정된 파라미터의 값

의문 서열의 총 전하 : -9

분석 영역 : 32

표적 서열에서 염기성 잔기의 수 : 6

표적 서열에서 산성 잔기의 수 : 2

절단 부위 : 예측불가능

절단 서열 : -

---------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------

확률

미토콘드리아로 유출될 확률: 0.2047

클리틴-2:

서열명: 클리틴-2

입력 서열 길이 : 198 aa

---------------------------------------------------------

산정된 파라미터의 값

의문 서열의 총 전하 : -7

분석 영역 : 16

표적 서열에서 염기성 잔기의 수 : 3

표적 서열에서 산성 잔기의 수 : 1

절단 부위 : 예측불가능

절단 서열 : -

---------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------

확률

미토콘드리아로 유출될 확률: 0.3974

엠티클리틴:

서열명: 엠티클리틴

입력 서열 길이 : 228 aa

---------------------------------------------------------

산정된 파라미터의 값

의문 서열의 총 전하 : -8

분석 영역 : 34

표적 서열에서 염기성 잔기의 수 : 6

표적 서열에서 산성 잔기의 수 : 0

절단 부위 : 17

절단 서열 : MQRFTNRLLSMSALRA

---------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------

확률

미토콘드리아로 유출될 확률: 0.9974

분석된 펩티드가 미토콘드리아로 이동할 확률은 계산된 인자가 1에 가까워 질수록 증가한다.

오벨린, 애쿠오린, 클리틴, 클리틴-2 및 엠티클리틴의 단백질 서열의 분석은 오직 엠티클리틴만이 미토콘드리아로 수송될 수 있는 단백질의 성질을 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 11

도 9는 아미노산 수치에 대한 엠티클리틴, 클리틴 (클리티아 그레가리아) 및 클리틴-2형의 정렬을 나타낸다.

문헌/특허

SEQUENCE LISTING <110> Bayer AG, BHC <120> Isolated photoprotein mtClytin, and the use thereof <130> Le A 36 839 <160> 6 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 912 <212> DNA <213> Clytia gregaria <400> 1 gacagataaa aaattcactc cttagattat ttagtgaata agagaaaaaa aggataagaa 60 atcaagatgc aaaggtttac aaatcgtctt ctttccatgt cggctttacg tgcaagatca 120 agattgcaac gcacggcaaa ttttcacacc agcatactct tggctacaga ttcaaaatac 180 gcggtcaaac tcgatcctga ttttgcaaat ccaaaatgga tcaacagaca caaatttatg 240 ttcaactttt tggacataaa cggtaagggg aaaatcacat tagatgaaat cgtctccaaa 300 gcttcagacg acatttgtgc taaactggat gcaacaccag aacagaccaa acgtcaccag 360 gatgctgttg aagccttttt caagaaaatg ggcatggatt atggtaaaga agttgcattc 420 ccagaattta ttaagggatg ggaagagttg gccgaacacg acttggaact ctggtctcaa 480 aacaaaagta cattgatccg tgaatgggga gatgctgttt tcgacatttt cgacaaagac 540 gcaagtggct caatcagttt agacgaatgg aaggcttacg gacgaatctc tggaatctgt 600 ccatcagacg aagacgctga gaagacgttc aaacattgtg atttggacaa cagtggcaaa 660 cttgatgttg atgagatgac caggcaacat ttaggcttct ggtacacatt ggatccaact 720 tctgatggtc tttatggcaa ttttgttccc taagaagcgt tcagttaaaa acgctaaaca 780 ttgttcagtt gtaaaattat attcattttc atttcgtaaa attagtattt ataaatttgt 840 atcataaatt gtatccatgt tgtagactaa ataagactcg gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aa 912 <210> 2 <211> 228 <212> PRT <213> Clytia gregaria <400> 2 Met Gln Arg Phe Thr Asn Arg Leu Leu Ser Met Ser Ala Leu Arg Ala 1 5 10 15 Arg Ser Arg Leu Gln Arg Thr Ala Asn Phe His Thr Ser Ile Leu Leu 20 25 30 Ala Thr Asp Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Asp Pro Asp Phe Ala Asn 35 40 45 Pro Lys Trp Ile Asn Arg His Lys Phe Met Phe Asn Phe Leu Asp Ile 50 55 60 Asn Gly Lys Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Lys Ala Ser 65 70 75 80 Asp Asp Ile Cys Ala Lys Leu Asp Ala Thr Pro Glu Gln Thr Lys Arg 85 90 95 His Gln Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Lys Lys Met Gly Met Asp Tyr 100 105 110 Gly Lys Glu Val Ala Phe Pro Glu Phe Ile Lys Gly Trp Glu Glu Leu 115 120 125 Ala Glu His Asp Leu Glu Leu Trp Ser Gln Asn Lys Ser Thr Leu Ile 130 135 140 Arg Glu Trp Gly Asp Ala Val Phe Asp Ile Phe Asp Lys Asp Ala Ser 145 150 155 160 Gly Ser Ile Ser Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Gly Arg Ile Ser Gly 165 170 175 Ile Cys Pro Ser Asp Glu Asp Ala Glu Lys Thr Phe Lys His Cys Asp 180 185 190 Leu Asp Asn Ser Gly Lys Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His 195 200 205 Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Leu Asp Pro Thr Ser Asp Gly Leu Tyr Gly 210 215 220 Asn Phe Val Pro 225 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Clytia gregaria <400> 3 Met Gln Arg Phe Thr Asn Arg Leu Leu Ser Met Ser Ala Leu Arg Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Clytia gregaria <400> 4 atgcaaaggt ttacaaatcg tcttctttcc atgtcggctt tacgtgca 48 <210> 5 <211> 791 <212> DNA <213> Clytia gregaria <400> 5 gatctcagct caacttgcaa taagtatcag atcaaatttt gcaactcaaa gcaaatcatc 60 aacttcatca taatgactga cactgcttca aaatacgctg tcaaactcaa gaccaacttt 120 gaagatccaa aatgggtcaa cagacacaaa tttatgttca actttttgga cattaacggc 180 aacggaaaaa tcactttgga tgaaattgtc tccaaagctt cggatgacat ttgcgccaaa 240 cttggagcta caccagctca aacccaacgt catcaggaag ctgttgaagc tttcttcaag 300 aagattggtt tggattatgg caaagaagtc gaattcccag ctttcgttaa cggatggaaa 360 gaactggcca aacatgactt gaaactttgg tcccaaaaca agaaatcttt gatccgcaat 420 tggggagaag ctgtattcga cattttcgac aaggacggaa gtggctcaat cagtttggac 480 gaatggaaaa catacggagg aatctctgga atctgtccat cagacgaaga cgctgaaaag 540 accttcaaac attgcgattt ggacaacagt ggcaaacttg atgttgacga gatgaccaga 600 caacatttgg gattctggta caccttggac cctaacgctg atggtcttta tggcaacttt 660 gtcccttaaa aacttttttt gctgtaaatt ctttacgggt tattttttca taattgtcat 720 ttgattttaa ctttgtttcg gaaaatgaaa aatattcttt attcagaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa a 791 <210> 6 <211> 198 <212> PRT <213> Clytia gregaria <400> 6 Met Thr Asp Thr Ala Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asn Phe 1 5 10 15 Glu Asp Pro Lys Trp Val Asn Arg His Lys Phe Met Phe Asn Phe Leu 20 25 30 Asp Ile Asn Gly Asn Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Lys 35 40 45 Ala Ser Asp Asp Ile Cys Ala Lys Leu Gly Ala Thr Pro Ala Gln Thr 50 55 60 Gln Arg His Gln Glu Ala Val Glu Ala Phe Phe Lys Lys Ile Gly Leu 65 70 75 80 Asp Tyr Gly Lys Glu Val Glu Phe Pro Ala Phe Val Asn Gly Trp Lys 85 90 95 Glu Leu Ala Lys His Asp Leu Lys Leu Trp Ser Gln Asn Lys Lys Ser 100 105 110 Leu Ile Arg Asn Trp Gly Glu Ala Val Phe Asp Ile Phe Asp Lys Asp 115 120 125 Gly Ser Gly Ser Ile Ser Leu Asp Glu Trp Lys Thr Tyr Gly Gly Ile 130 135 140 Ser Gly Ile Cys Pro Ser Asp Glu Asp Ala Glu Lys Thr Phe Lys His 145 150 155 160 Cys Asp Leu Asp Asn Ser Gly Lys Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg 165 170 175 Gln His Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Leu Asp Pro Asn Ala Asp Gly Leu 180 185 190 Tyr Gly Asn Phe Val Pro 195

Claims (21)

1. a) 서열 번호 2로 기재된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

   b) 서열 번호 1로 서술된 서열을 함유하는 핵산 분자;

   c) 상보적 가닥이 엄격한 조건 하에서 a) 또는 b)로부터의 핵산 분자와 혼성화되며, 광단백질의 생물학적 기능을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

   d) 유전 암호의 축퇴성으로 인해 c)에서 언급된 핵산 분자와 상이한 핵산 분자;

   e) 서열 번호 1과 95％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 광단백질의 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및

   f) 서열 번호 1과 65％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 광단백질의 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자

   로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자.
2. a) 서열 번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

   b) 서열 번호 4로 서술된 서열을 함유하는 핵산 분자;

   c) 상보적 가닥이 엄격한 조건 하에서 a) 또는 b)로부터의 핵산 분자와 혼성화되며, 신호 또는 리더 펩티드의 생물학적 기능을 나타내는 펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

   d) 유전 암호의 축퇴성으로 인해 c)에서 언급된 핵산 분자와 상이한 핵산 분자;

   e) 서열 번호 4와 90％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 신호 또는 리더 펩티드의 생물학적 기능을 갖는 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및

   f) 서열 번호 4와 60％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 신호 또는 리더 펩티드의 생물학적 기능을 갖는 펩티드를 코딩하는 핵산 분자

   로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자.
3. a) 서열 번호 6으로 기재된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

   b) 서열 번호 5로 서술된 서열을 함유하는 핵산 분자;

   c) 상보적 가닥이 엄격한 조건 하에서 a) 또는 b)로부터의 핵산 분자와 혼성화되며, 광단백질의 생물학적 기능을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;

   d) 유전 암호의 축퇴성으로 인해 c)에서 언급된 핵산 분자와 상이한 핵산 분자;

   e) 서열 번호 5와 95％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 광단백질의 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및

   f) 서열 번호 5와 80％ 이상의 서열 상동성을 나타내며, 광단백질의 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자

   로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열의 5'에 기능적 프로모터를 함유하는 핵산.
5. 제4항에 기재된 핵산을 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 벡터.
6. 제5항에 기재된 벡터를 보유하는 유기체.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자의 구성 서열과 동일하거나 상보적인 10개 초과의 연속적인 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드.
9. 박테리아, 바이러스계, 효모 또는 진핵생물 세포에서 또는 시험관내 발현계에서 제8항에 기재된 폴리펩티드를 발현시키는 방법.
10. 제8항에 기재된 광단백질 폴리펩티드를 정제/단리하는 방법.
11. 광단백질 엠티클리틴에 대항하여 지시된 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 갖는 펩티드.
12. 광단백질 클리틴-2에 대항하여 지시된 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 갖는 펩티드.
13. 서열 번호 3으로 기재된 신호 또는 리더 펩티드에 대항하여 지시된 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 갖는 펩티드.
14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 핵산의, 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 용도.
15. 제8항에 기재된 광단백질의, 표지 또는 리포터로서의 용도.
16. 서열 번호 4로서 서술된 서열을 함유하는 핵산의, 신호 또는 리더 서열로서의 용도.
17. 서열 번호 3으로서 서술된 서열을 함유하는 펩티드의, 신호 또는 리더 펩티 드로서의 용도.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 신호 또는 리더 펩티드에 융합된 단백질을 세포 기관으로 수송하기 위한 용도.
19. 제18항에 있어서, 세포 기관이 미토콘드리아 또는 소포체 (ER)인 용도.
20. 제8항에 기재된 폴리펩티드의, 약리학적 활성 화합물을 찾기 위한 리포터 단백질로서의 용도.
21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 핵산의, 약리학적 활성 화합물을 찾기 위한 리포터 유전자로서의 용도.

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