CN1882608B

CN1882608B - 分离的发光蛋白mtClytin及其用途

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Publication number: CN1882608B
Application number: CN2004800337823A
Authority: CN
Inventors: S·戈尔茨; S·马科瓦; L·布拉科瓦; L·弗兰克; E·维索特斯基
Original assignee: AXXAM Srl
Current assignee: Bayer Pharma AG; AXXAM Srl
Priority date: 2003-09-16
Filing date: 2004-09-03
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2024-09-03
Also published as: DE10342670A1; CN101514341A; CN1882608A; ATE533779T1; JP2007527708A; US7833749B2; WO2005035559A1; KR20070029630A; ES2375610T3; EP1664102A1; CA2538903A1; EP1664102B1; CN101514341B; DK1664102T3; US20070275377A1; SG146640A1; JP4728240B2

Abstract

本发明涉及发光蛋白mtClytin，其核苷酸和氨基酸序列，以及发光蛋白mtClytin的活性和用途。

Description

分离的发光蛋白mtClytin及其用途

技术领域

本发明涉及发光蛋白mtClytin，其核苷酸和氨基酸序列以及发光蛋白mtClytin的活性和用途。

背景技术

发光蛋白

活生物体产生光的现象被称作生物发光。它是细胞中生化反应的结果，所述反应以光量子的形式发出化学能(化学发光的方法被称作冷发射)。以该方式产生的光是单色的，因为它的发出与离散电子传递相关，其可通过次级发光染料(例如Aequora属的发光水母中的荧光蛋白)易位进入较长波长的光谱区。

生物发光具有生物学功能的多样性：在200至1000m(Mesopelagial)之间的海洋中层带，大约90％的活生物体发冷光。此时，发光信号被用于吸引配偶，欺骗和作为诱饵。萤火虫(Glowworms)以及萤火虫(fireflies)也使用光信号寻找配偶。另一方面，细菌、真菌和单细胞藻类发光的意义不明。其被假定用于协调大种群中的众多单独个体或表示生物钟的类型。

许多腔肠动物具有生物发光性(Morin等，1974)。这些生物发出蓝色或绿色光。水母发光蛋白(源自Aequoria victoria(Shimomura等，1969)且于1962年被鉴别出的首个产生光的蛋白)作为分离的蛋白发出蓝光，而并非如经Aequoria victoria表象观察到的绿光。随后从该Aequoria victoria中分离出绿色荧光蛋白(GFP)，其(作为被水母发光蛋白活化的结果)使水母在表型上呈现绿色(Johnson等，1962；Hastings等，1969；Inouye等，1994)。同样已被鉴定和描述的其它发光蛋白可以为clytin(Inouye等，1993)、mitrocomin(Fagan等，1993)和obelin(Illarionov等，1995)。

表1：某些发光蛋白概述。表中给出了名称，已从中分离出该蛋白的生物体，和数据库登录的识别号(Acc.No.)。

名称	生物体	识别号
			Obelin	曲膝薮枝螅(Obelia geniculata)	AAL86372
Clytin	Clytia gregaria	CAA49754
			水母发光蛋白	大型多管水母(Aequorea macrodactyla)	AAK02061
水母发光蛋白	细小多管水母(Aequorea parva)	AAK02060
			Mitrocomin	Mitrocoma cellularia	AAA29298

Pholasin	Pholas dactylus	AAM18085
			7	南鱿(Symplectoteuthis oualaniensis)	AX305029

表2：某些发光蛋白概述。表中给出了已从中分离出该蛋白的生物体，发光蛋白的名称和专利或申请文选。

生物体	荧光蛋白	专利/申请
			曲膝薮枝螅	Obelin	WO03006497
Clytia gregaria	Clytin	WO03006497
			Aequoria victoria	水母发光蛋白	WO200168824US-0908909US6,152,358JP-0176125
Pholas dactylus	Pholasin	WO0028025GB-0024357

生物发光现被应用于各种各样的技术方法中，例如作为环境保护的生物指示剂、在生物化学中用于敏感性检测蛋白或定量特定化合物，或被称作“报道分子”而用于研究细胞中的基因调节.

发光蛋白不仅在其核苷酸序列和氨基酸序列还在其生物化学性质和物理性质上存在差异.

已经证明，发光蛋白的物理性质和生物化学性质可通过改变这些蛋白的氨基酸序列而进行改变。诱变的发光蛋白的实例在文献中已有描述(US 6,495,355；US 5,541,309；US 5,093,240；Shimomura等，1986)。

上述发光蛋白通过氧化性腔肠素(coelenterazine)产生光(Haddock等，2001；Jones等，1999)。

报道系统

一般而言，采用简单的生物化学方法或组织化学方法即可轻易检测基因产物的基因被称作报道基因或指示基因。报道基因至少可分为2个类型。

1.抗性基因。该术语用于这样的基因，其在细胞上的表达提供了对抗生素或在如果缺乏抗性基因时存在于生长培养基中即导致细胞死亡的其他物质的抗性。

2.报道基因.报道基因的产物作为融合指示物或非融合指示物而被用于基因操作中。最常见的报道基因包括β-半乳糖苷酶(Alam等，1990)、碱性磷酸酶(Yang等，1997；Cullen等，1992)，和荧光素酶以及其它发光蛋白(Shinomura，1985；Phillips GN，1997；Snowdowne等，1984)。

在可见的光谱范围内发射光子(该发射通过激发的发射体分子的方式产生)被称作发光。这种情况与荧光相反，其能量并非由外在较短波长的辐射形式所提供。

化学发光和生物发光之间存在差异。当激发电子返回基态时，导致激发分子自身发冷光的化学反应被称作化学发光。如果该反应由酶催化，则该现象被称作生物发光.反应中涉及的酶通常被称作荧光素酶。

物种Clytia gregaria的分类

刺胞动物门→薄水母目→钟螅水母科→Clytia gregaria

物种Clytia grenaria属于刺胞动物门，具体地说是水母(Medusae)。生物发光表型和荧光表型已于1998年被分别报道(Ward等，1998)。

分离cDNA

为了研究物种Clytia gregaria的生物发光活性，从白海(BiologicalStation Kartesh，Russia)中获取样品并贮存于液氮中。为了构建Clytiagregaria的cDNA文库，使用来自Novagen(USA)的“Straight A”分离法分离poly(a)+RNA。

实施RT-PCR来制备cDNA。为此，根据以下程序，将1μg RNA与逆转录酶(Superscript Gold II)一起孵育：

PCR 1. 30 秒 95℃

2. 6 分钟 68℃

3. 10 秒 95℃

4. 6 分钟 68℃

步骤3然后步骤4进行17个循环

将反应产物与蛋白酶k孵育，37℃下培养30分钟，以便使聚合酶失活，然后用乙醇沉淀cDNA。使用Clontech(USA)“SMART cDNA文库构建试剂盒”依照厂商说明书构建cDNA表达文库。将cDNA克隆至表达载体pTriplEx2(Clontech；USA)。通过电穿孔法将表达载体转化至细菌E.coli XL1-blue。

将细菌铺于固体LB营养培养基上，37℃培养24小时。然后进行影印培养，使用硝化纤维滤纸将细菌转移至另一固体营养培养基平板.影印培养板依次于37℃培养24小时，然后将生长的菌落移至LB液体培养基.加入IPTG(终浓度，0.1mM)后，细菌于振荡器上37℃培养4小时。经离心获得细菌，然后于0℃，0.5ml的破裂缓冲液(5mM EDTA，20mM Tris-HCL，pH 9.0)中重悬细菌团块。然后通过超声波处理破裂细菌。

在加入发光基团(终浓度，10E-07M)后，溶解产物于4℃培养3小时。然后在加入氯化钙(终浓度，20mM)后用光度计测量生物发光。

鉴定发光蛋白。发光蛋白被命名为mtClytin。以下详细描述发光蛋白mtClytin。

MtClytin

发光蛋白mtClytin在氨基酸水平上表现出与源自Clytia gregaria的Clytin最高的同源性，其同一性为87％，而其与源自Obeliageniculata的Obelin的同一性为77％(参见实施例8；图8)。对于Clytin，87％的同源性出现于蛋白的C末端，其中整个蛋白上分布有多个可识别的氨基酸置换。在核苷酸水平上，同一性小于30％(参见实施例7；图7)。使用BLAST法进行序列比较(Altschul等，1997)。

发光蛋白Clytin-2在氨基酸水平上表现出与源自Clytia gregaria的Clytin最高的同源性。然而，该序列在氨基酸序列上存在多处差异，实施例11(图9)中描述了这些差异。这些差别可导致物理化学，生物化学和生物发光特性的改变。发光蛋白Clytin-2不具有信号肽(如实施例10中所示)。

发光蛋白mtClytin具有可导致发光蛋白转移至线粒体中的信号肽。采用计算机程序MITOPROT(Claros等，1996)鉴别该信号肽(如实施例10所示)。SEQ ID NO：3中给出经MITOPROT确定的信号肽。发光蛋白mtClytin是首个已鉴别出用于易位至粒体中的天然信号肽的发光蛋白。

本发明还涉及mtClytin的功能等同物。功能等同物是那些具有可比拟理化性质并与SEQ ID NO：2有至少70％同源性的蛋白。优选至少80％或90％同源性。特别优选至少95％的同源性。

本发明还涉及mtClytin信号肽的功能等同物。功能等同物是那些具有可比拟理化性质并与SEQ ID NO：3有至少70％同源性的蛋白或肽。优选至少80％或90％同源性。特别优选至少95％的同源性。

发光蛋白mtClytin适于用作细胞系统(尤其是受体、离子通道、转运载体、转录因子)或诱导系统的报道基因。

MtCiytin信号肽还适于与报道基因融合，以便用作细胞系统(尤其是受体、离子通道、转运载体、转录因子)或诱导系统的融合报道基因。

发光蛋白mtClytin还适于用作通过标记，鉴别和特征化细胞器(尤其是线粒体)的报道基因。

mtClytin信号肽还适于与肽或蛋白融合以易位至细胞器(尤其是线粒体)中。

发光蛋白mtClytin还适于用作测定细胞器(尤其是线粒体)内部和外部参数，尤其是钙浓度的报道基因。

mtClytin信号肽还适于作为融合肽用作测定细胞器(尤其是线粒体)内部和外部参数，尤其是钙浓度的报道基因。

发光蛋白mtClytin还适于用作细菌性和真核生物性系统，尤其是哺乳动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒和植物中的报道基因。

发光蛋白mtClytin适于用作联合生物发光或化学发光系统，尤其是使用荧光素酶、氧合酶或磷酸酶系统的细胞系统的报道基因。

mtClytin信号肽还适于作为融合肽用作联合生物发光或化学发光系统，尤其是使用荧光素醇、氧合酶或磷酸酶系统的细胞系统的报道基因。

发光蛋白mtClytin适于作为融合蛋白特别用于受体、离子通道、转运载体、转录因子、蛋白水解酶、激酶、磷酸二酯酶、水解酶、肽酶、转移酶、膜蛋白和糖蛋白。

mtClytin信号肽还适于作为融合肽作为融合蛋白尤其是用于受体、离子通道、转运载体、转录因子、蛋白水解酶、激酶、磷酸二酯酶、水解酶、肽酶、转移酶、膜蛋白和糖蛋白。

发光蛋白mtClytin适于被，尤其是抗体、生物素、或磁性或可磁化的载体固定。

发光蛋白mtClytin适于作为蛋白用于能量传递系统，尤其是FRET(荧光共振能量转移)、BRET(生物发光共振能量转移)、FET (场效应晶体管)、FP(荧光偏振)和HTRF(均相时间分辨荧光分析)系统。

发光蛋白mtClytin适于标记底物或配体，尤其是蛋白酶、激酶或转移酶。

发光蛋白mtClytin适于在细菌系统中(尤其是对于滴度测定)作为生物化学系统，特别对于蛋白水解酶和激酶的底物进行表达。

发光蛋白mtClytin适于用作，尤其是偶联至抗体、偶联至酶、偶联至受体或偶联至离子通道和其他蛋白的标记物。

mtClytin信号肽还适于作为融合肽用作尤其是偶联至抗体、偶联至酶、偶联至受体或偶联至离子通道和其他蛋白的标记物。

发光蛋白mtClytin适于用作寻求药理学活性化合物，尤其在HTS(高通量筛选)中的报道基因。

mtClytin信号肽还适于用作寻求药理学活性化合物，尤其在HTS(高通量筛选)中的报道基因。

发光蛋白mtClytin适于用作检测系统，尤其是ELISA(酶联免疫吸附测定法)、免疫组织化学、Western印迹法或共聚焦显微镜法的组件。

发光蛋白mtClytin适于用作分析相互作用，尤其是蛋白-蛋白相互作用、DNA-蛋白相互作用、DNA-RNA相互作用、RNA-RNA相互作用或RNA-蛋白相互作用(DNA：脱氧核糖核酸；RNA：核糖核酸)的标记物。

发光蛋白mtClytin适于用作在转基因生物，尤其是小鼠、大鼠、仓鼠和其它哺乳动物，灵长类动物、鱼、虫或植物中表达的标记物或融合蛋白。

mtClytin信号肽还适于作为融合肽而用作在转基因生物，尤其在小鼠、大鼠、仓鼠和其他哺乳动物，灵长类动物、鱼、虫或植物中表达的标记物或融合蛋白。

发光蛋白mtClytin适于用作分析胚胎发育的标记物或融合蛋白。

发光蛋白mtClytin适于通过偶联介质，尤其通过生物素、通过NHS(N-羟基磺基丁二酰亚胺)或通过CN-Br的方式用作标记物。

发光蛋白mtClytin适于用作与核酸，尤其是DNA或RNA偶联的报道分子。

发光蛋白 mtClytin适于用作与蛋白或肽偶联的报道分子。

mtClytin信号肽还适于作为融合肽而用作与蛋白或肽偶联的报道分子。

发光蛋白mtClytin适于用作测量细胞内或细胞外钙浓度的报道分子。

发光蛋白mtClytin适用于特征化细胞系统中信号级联反应。

与核酸或肽偶联的发光蛋白mtClytin适于用作探针，尤其是对于Northern印迹、Southern印迹、Western印迹、ELISA、核酸序列测定、蛋白分析或芯片分析。

发光蛋白mtClytin适用于标记药理学制剂，尤其是传染因子、抗体或“小分子”。

发光蛋白mtClytin适用于地质学研究，尤其是对于海洋，地下水和河流。

发光蛋白mtClytin适于在表达系统中，尤其是在体外翻译系统、细菌系统、酵母系统、杆状病毒系统、病毒系统和真核生物系统中表达。

mtClytin信号肽还适于作为融合肽而在表达系统中，尤其是在体外翻译系统、细菌系统，酵母系统，杆状病毒系统，病毒系统和真核生物系统中表达。

发光蛋白mtClytin适于在外科手术方面，尤其是在侵入性、非侵入性和最低限度侵入性介入方面中使组织或细胞可视化。

发光蛋白mtClytin还适于标记肿瘤组织和其它表型改变的组织，尤其是在组织学研究和外科介入方面。

本发明还涉及发光蛋白mtClytin，尤其是以野生型蛋白、融合蛋白和诱变化蛋白的纯化。

本发明还涉及mtClytin信号肽，尤其是以野生型蛋白、融合蛋白和诱变化蛋白的纯化。

本发明还涉及发光蛋白mtClytin在化妆品领域，尤其是沭浴添加剂、洗剂、肥皂、身体染色剂、牙膏和粉底中的用途。

本发明还涉及发光蛋白mtClytin在染色，尤其是食品染色、沐浴添加剂、墨水、纺织品和塑料制品中的用途。

本发明还涉及发光蛋白mtClytin在纸染色，尤其是贺卡、纸制品、壁纸和手工艺制品中的用途。

本发明还涉及发光蛋白mtClytin在液体染色，尤其是水枪、喷泉、饮料和冰中的用途。

本发明还涉及发光蛋白mtClytin在生产玩具，尤其是手指染料和化妆品中的用途。

本发明涉及编码SEQ ID NO：2所示多肽的核酸分子。

本发明涉及编码SEQ ID NO：3所示多肽的核酸分子。

本发明涉及编码SEQ ID NO：6所示多肽的核酸分子。

本发明涉及具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

本发明涉及具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。

本发明涉及具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽。

本发明还涉及核酸分子，其选自组成如下的一组：

a)编码包含SEQ ID NO：2所公开的氨基酸序列的多肽的核酸分子；

b)包含SEQ ID NO：1所示序列的核酸分子；

c)其互补链在严格条件下与a)或b)中的核酸分子杂交且编码表现发光蛋白生物学功能的多肽的核酸分子；

核酸分子的严格条件下杂交可在，例如，包含0.2×SSC(1×标准盐水-枸橼酸盐＝150mM NaCl，15mM枸橼酸钠)的水溶液中于68℃进行(Sambrook等，1989)。

d)由于遗传密码的简并性而与c)中所述核酸分子不同的核酸分子；

e)表现出与SEQ ID NO：1至少95％的序列同源性且其蛋白产物表现出发光蛋白生物学功能的核酸分子；和

f)表现出与SEQ ID NO：1至少65％的序列同源性且其蛋白产物表现出发光蛋白生物学功能的核酸分子。

本发明还涉及表现出与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5至少95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％的序列同源性且编码具有发光蛋白性质的多肽的核酸分子。

本发明还涉及表现出与SEQ ID NO：4至少95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％的序列同源性且编码具有信号肽或前导肽性质的多肽的核酸分子。

本发明涉及上述的核酸分子，其中序列包含发光蛋白编码序列5’端的或前导或信号序列编码序列5’端的功能启动子。

本发明还涉及如上述的核酸分子，其构成重组体DNA或RNA载体。

本发明涉及包含上述载体的生物体。

本发明涉及具有大于10个连续核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸与mtClytin分子或根据本发明的其它分子的DNA或RNA序列相同或互补。

本发明涉及由上述核苷酸序列编码的发光蛋白。

本发明涉及在细菌、真核细胞或体外表达系统中表达根据本发明的发光蛋白多肽的方法。

本发明还涉及纯化/分离根据本发明的发光蛋白多肽的方法。

本发明涉及具有大于5个连续氨基酸且其被针对根据本发明的发光蛋白的抗体免疫识别的肽。

本发明涉及根据本发明的发光蛋白编码核酸作为标记基因或报道基因，尤其是针对寻找药理学活性化合物和诊断剂的用途。

本发明涉及根据本发明的发光蛋白或根据本发明的发光蛋白编码核酸作为标记物或报道分子或作为标记基因或报道基因的用途。

本发明涉及发光蛋白mtClytin(SEQ ID NO：2)，或编码发光蛋白mtClytin的核酸作为标记物或报道分子，或作为标记基因或报道基因，尤其是针对寻找药理学活性化合物和诊断剂的用途。

本发明涉及SEQ ID NO：1所示核酸作为标记基因或报道基因，尤其是针对寻找药理学活性化合物和诊断剂的用途。

本发明涉及SEQ ID NO：6所示肽和其相应核酸序列SEQ ID NO：5作为标记基因或报道基因，尤其是针对寻找药理学活性化合物和诊断剂的用途。

本发明还涉及识别根据本发明的多肽的多克隆抗体或单克隆抗体。

本发明还涉及识别发光蛋白mtClytin(SEQ ID NO：2)或发光蛋白Clytin-2(SEQ ID NO：6)的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还涉及识别发光蛋白mtClytin的信号肽(SEQ ID NO：3)的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还涉及核酸分子，其选自组成如下的一组：

a)编码包含SEQ ID NO：3所公开的氨基酸序列的多肽的核酸分子；

b)包含SEQ ID NO：4所示序列的核酸分子；

c)其互补链在严格条件下与a)或b)中的核酸分子杂交且编码表现信号肽或前导肽的生物学功能的肽的核酸分子；

e)表现出与SEQ ID NO：4至少95％的序列同源性且编码具有信号肽或前导肽的生物学功能的肽的核酸分子；和

f)表现出与SEQ ID NO：4至少65％的序列同源性且编码具有信号肽或前导肽的生物学功能的肽的核酸分子。

本发明还涉及核酸分子，其选自组成如下的一组：

a)编码包含SEQ ID NO：6所公开的氨基酸序列的多肽的核酸分子；

b)包含SEQ ID NO：5所公开的序列的核酸分子；

c)其互补链在严格条件下与a)或b)中的核酸分子杂交且编码表现出发光蛋白的生物学功能的多肽的核酸分子；

e)表现出与SEQ ID NO：5至少95％的序列同源性且编码具有发光蛋白的生物学功能的多肽的核酸分子；和

f)表现出与SEQ ID NO：5至少80％的序列同源性且编码具有发光蛋白的生物学功能的多肽的核酸分子。

本发明还涉及如前面段落所述的核酸，其包含编码序列5’端的功能启动子。

本发明包括包含如上述的核酸的重组体DNA或RNA载体。

本发明还涉及包含如上述的载体的生物体。

本发明还涉及具有大于10个连续核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸与上述核酸分子的组成序列相同或互补。

本发明还涉及由如上所述的核酸序列编码的多肽。

本发明还涉及在细菌、病毒细胞、酵母或真核生物细胞中或在体外表达系统中表达上述多肽的方法。

本发明还涉及纯化/分离根据本发明的多肽的方法。

本发明还涉及具有大于5个连续氨基酸的肽，所述肽被针对发光蛋白mtClytin的抗体免疫识别。

本发明还涉及具有大于5个连续氨基酸的肽，所述肽被针对发光蛋白Clytin-2的抗体免疫识别。

本发明还涉及具有大于5个连续氨基酸的肽，所述肽被针对SEQID NO：3所公开的信号肽或前导肽的抗体免疫识别。

本发明还涉及具有大于5个连续氨基酸的肽，所述肽被针对SEQID NO：6(Clytin-2)所示发光蛋白的抗体免疫识别。

本发明涉及根据本发明的核酸作为标记基因或报道基因的用途。

本发明还涉及根据本发明的发光蛋白作为标记物或报道分子的用途。

本发明还涉及包含SEQ ID NO：4所示序列或与SEQ ID NO：4具有60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％，优选95％序列同一性的序列的核酸作为信号序列或前导序列的用途。

本发明还涉及包含SEQ ID NO：3所示序列或与SEQ ID NO：3具有 60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％，优选95％序列同一性的序列的肽作为信号肽或前导肽的用途。

本发明还涉及如以上两个段落中所述的用途，用于将与信号肽或前导肽融合的蛋白转运至细胞器中。

本发明还涉及如以上段落中所述的用途，其中细胞器是线粒体。

本发明还涉及如以上段落中所述的用途，其中细胞器是内质网(ER)。

本发明还涉及SEQ ID NO：4所示核酸序列作为信号序列或前导序列的用途。

本发明还涉及SEQ ID NO：3所示的肽，其包含所述序列；作为信号肽或前导肽的用途。

本发明还涉及根据本发明的多肽作为报道蛋白在寻找药物学活性化合物中的用途。

最后，本发明还涉及根据本发明的核酸作为报道基因在寻找药物学活性化合物中的用途。

本发明发光蛋白的表达

在将基因导入适宜的宿主细胞后，能使被克隆至表达载体的外源基因转录和翻译的分子生成被称为表达。表达载体包括在原核生物细胞或真核生物细胞中表达基因所需的控制信号。

一般而言，表达载体可以通过两种不同的方式构建。在被称为转录融合的方式中，由克隆的外源基因所编码的蛋白被合成为真正的生物学活性蛋白。为此目的，表达载体携带所有表达所需的5’和3’控制信号。

在被称为翻译融合的方式中，由克隆的外源基因所编码的蛋白与易于检测的另一蛋白一起作为杂合蛋白而被表达。表达所需的5’和3’控制信号(包括起始密码子和，或者，编码所要形成的杂合蛋白的N端区域的序列的一部分)是载体的起始点。其它插入的蛋白部分不仅在许多情况下稳定由克隆的外源基因所编码的蛋白使其免于被细胞蛋白酶切断，其还可被用于检测和分离产生的杂合蛋白。表达可以瞬时或稳定地发生。适宜的宿主生物体是细菌、酵母、病毒或真核生物系统。

本发明的发光蛋白的纯化

蛋白(在其同样已被过表达后)的分离通常被称作蛋白纯化。很多已建立的方法和工艺可用于纯化蛋白。

固体/液体分离是与蛋白分离相关的基本操作。在下列时候需要该工艺步骤，当从培养基分离细胞时，在破裂细胞和除去细胞碎片后澄清粗提物时，和沉淀后分离沉淀物的时，等等。其通过离心和过滤方式进行实施。

为获得细胞内的蛋白，必须破坏细胞壁或使其具有可透过性。为此目的，根据规模和生物体，使用高压匀浆器或搅拌球磨机或玻璃珠砂磨机。在实验室规模上，尤其要使用机械性细胞整合和超声波处理。

在细胞外蛋白的情况和细胞内蛋白的情况下(细胞破碎之后)，使用盐(尤其是硫酸铵)或有机溶剂(醇、丙酮)的各种沉淀法均为浓缩蛋白的快速且有效的方法。纯化细胞内蛋白时，需要除去可溶解性核酸(例如，用硫酸链霉素或硫酸鱼精蛋白沉淀)。分离细胞外蛋白时，通常在加入沉淀剂前加入载体(例如淀粉、硅藻土)以获得较易处理的沉淀物。

很多层析法和分配法(吸收层析法和离子交换层析法，凝胶过滤法，亲和层析法和电泳)可用于高度纯化。柱层析也被用于工业规模。亲和层析(使高达数百每步骤的纯化因子成为可能)对实验室规模尤其重要。

细胞外蛋白在相对稀的溶液中获得。如同细胞外蛋白一样，它们在进一步使用前必须浓缩。除已提到的方法外，超滤法同样已被证明在工业规模上有价值。

蛋白所伴随的无机盐在具体应用时通常是不需要的。可以通过，特别是通过凝胶过滤，渗析和渗滤将其除去。

很多蛋白以干制剂进行使用。真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥是重要的干燥法。

核苷酸序列和氨基酸序列

发光蛋白mtClytin由以下核苷酸序列(SEQ ID NO：1)编码：

5`-

gacagataaaaaattcactccttagattatttagtgaataagagaaaaaaaggataagaaatcaag

atgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatgtcggctttacgtgcaagatcaagattgcaacgc

acggcaaattttcacaccagcatactcttggctacagattcaaaatacgcggtcaaactcgatcct

gattttgcaaatccaaaatggatcaacagacacaaatttatgttcaactttttggacataaacggt

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ttcgacaaagacgcaagtggctcaatcagtttagacgaatggaaggcttacggacgaatctctgga

atctgtccatcagacgaagacgctgagaagacgttcaaacattgtgatttggacaacagtggcaaa

cttgatgttgatgagatgaccaggcaacatttaggcttctggtacacattggatccaacttctgat

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aaaattatattcattttcatttcgtaaaattagtatttataaatttgtatcataaattgtatccat

gttgtagactaaataagactcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3`.

其产生以下氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

MQRFTNRLLSMSALRARSRLQRTANFHTSILLATDSKYAVKLDPDKANPKWINRHKFMFN

FLDINGKGKITLDEIVSKASDDICAKLDATPEQTKRHQDAYEAFFKKMGMDYGKBVAPPE

FIKGWEELAEHDLELWSQNKSTLIREWGDAVFDIFDKDASGSISLDEWKAYGRISGICPSDE

DABKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPTSDGLYGNFVP

推定的发光蛋白mtClytin信号肽具有以下序列(SEQ ID NO：3)：

MQRFTNRLLSMSALRA

并具有以下核酸序列：

5`-atgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatgtcggctttacgtgca-3`(SEQ ID NO 4)

发光蛋白Clytin-2由以下核酸序列(SEQ ID NO：5)编码：

5`-

GATCTCAGCTCAACTTGCAATAAGTATCAGATCAAATTTTGCAACTCAAAGCAAATCA

TCAACTTCATCATAATGACTGACACTGCTTCAAAATACGCTGTCAAACTCAAGACCAA

CTTTGAAGATCCAAAATGGGTCAACAGACACAAATTTATGTTCAACTTTTTGGACATT

AACGGCAACGGAAAAATCACTTTGGATGAAATTGTCTCCAAAGCTTCGGATGACATTT

GCGCCAAACTTGGAGCTACACCAGCTCAAACCCAACGTCATCAGGAAGCTGTTGAAGC

TTTCTTCAAGAAGATTGGTTTGGATTATGGCAAAGAAGTCGAATTCCAGCTTTCGTTA

ACGGATGGAAAGAACTGGCCAAACATGACTTGAAACTTTGGGTCCCAAAACAAGAAAT

CTTTGATCCGCAATTGGGGGAGAAGCTGTATTCGACATTTTCGACAAGGACGGAAGTGG

CTCAATCAGTTTGGACGAATGGAAACATACGGAGGAATCTCTGGAATCTGTCCATCA

GACGAAGACGCTGAAAAGACCTTCAAACATTGCGATTTGGACAACAGTGGCAAACTT

GATGTTGACGAGATGACCAGACAACATTTGGGATTCTGGTACACCTTGGACCCTAACG

CTGATGGTCTTTATGGCAACTTTGTCCCTTAAAAACTTTTTTTGCTGTAAATTCTTTACG

GGTTATTTTTTCATAATTGTCATTTGATTTTAACTTTGTTTCGGAAAATGAAAAATATT

CTTTATTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3`

其产生以下氨基酸序列(SEQ ID NO：6)：

MTDTASKYAVKLKTNFEDPKWVNRHKFMFNFLDINGNGKILDEIVSKASDDICKKLGAT

PAQTQRHQEAVEAFFKKIGLDYGKEVEFPAFVNGWKELAKHDLKLWSQNKKSLIRNWGE

AVFDIFDKDGSGSISLDEWKTYGGISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLG

FWYTLDPNADGLYGNPVP

这些序列再现于序列表中。

附图简述

图1：图1表示载体pTriplEX2-mtClytin的质粒图谱。

图2：图2表示载体pcDNA3-mtClytin的质粒图谱。

图3：图3表示mtClytin的细菌表达的结果和细菌表达后mtClytin的生物发光活性。(Y＝RLU：相对光单位；X＝释度；黑色柱＝mtClytin；灰色柱＝对照裂解物)。

图4：图4表示mtClytin真核生物表达的结果和在CHO细胞中表达后mtClytin的生物发光活性。(Y＝RLU：相对光单位；X＝ATP(以mol/l的对数表示)。

图5：图5表示mtClytin生物发光的动力学分析。(Y＝RLU：相对光单位；X＝时间[秒])。

图6：图6表示Obelin生物发光的动力学分析。(Y＝RLU：相对光单位；X＝时间[秒])。

图7：图7表示Clytin和mtClytin在氨基酸水平上的比对。

图8：图8表示Clytin和mtClytin在核酸水平上的比对。

图9：图9表示Clytin，mtCyltin和Clytin-2在氨基酸水平上的比对。

具体实施方式

实施例

实施例1

采用Clontech公司的质粒pTriplEx2作为载体用于制备下述的构建体。载体的衍生物被称为pTriplEx2-mtClytin。载体pTriplEx2-mtClytin被用于在细菌系统中表达mtClytin。

图1表示载体pTripiEx2-mtClytin的质粒图谱。

实施例2

采用Clontech公司的质粒pcDNA3.1(+)作为载体用于制备下述的构建体。载体的衍生物被称作pcDNA3-mtClytin。载体pcDNA3-mtClytin被用于在真核生物系统中表达mtClytin。

图2表示载体pcDNA3-mtClytin的质粒图谱。

实施例3

细菌性表达

通过用表达质粒pTriplEx2-mtClytin和pTriplEx2转化细菌在E.coli菌株BL21(DE3)中进行细菌性表达。转化的细菌在LB培养基中于37℃培养3小时，然后通过加入IPTG至终浓度1mM，诱导表达4小时。通过离心分离采集诱导的细菌，在50mM Tris/HCl(pH 9.0)+5mM EDTA中重悬并经超声裂解.随后，裂解产物以13000rpm(16000ref)离心15分钟，然后除去上清液。上清液(用Tris/HCl pH 9.0稀释1∶5，1∶10，1∶20和1∶50)与发光基团(于Tris/HCl pH 9.0中的10E-07M发光基团)在黑暗中孵育3小时。在加入5mM氯化钙后立即用光度计测量生物发光。测量积分时间(integration time)是40秒。

图3表示细菌中mtClytin生物发光的检测结果。

实施例4

真核生物性表达

通过在瞬时实验中用表达质粒pcDNA3-mtClytin和pcDNA3.1(+)转染细胞，在CHO细胞中进行构成性真核生物性表达。为此，将10000个细胞/孔(DMEM-F12培养基中)铺于96孔微量平板上，然后将平板于37℃培养过夜。使用Fugene 6试剂盒(Roche)按照厂商说明书实施转染。转染的细胞在DMEM-F12培养基中于37℃培养过夜。然后除去培养基，并用50μl的发光基团(PBS中10E-07M发光基团)代替。细胞于37℃培养3小时，然后加入ATP(三磷酸腺苷)至终浓度1μM。在加入后立即开始用光度计测量。总测量时间是60秒，积分时间是1秒。

图4表示CHO细胞中mtClytin生物发光的检测结果。

实施例5

BLAST

mtClytin在氨基酸水平上的BLAST分析结果：

＞emb|CAD87655.1|无名蛋白产品[Clytia gregaria]，长度＝198，评分＝368bite(945)，Expect＝e-101，同一性＝171/195(87％)，Positives＝182/195(92％)

＞sp|Q08121|CLYT_CLYGR Clytin 前体(Phialidin)，pit||S28860clytin-hydromedusa(Clytia gregarium)，emb|CAA49754.1|clytin[Clytia gregaxia]，gb|AAA28293.1|apoclytin，长度＝198，评分＝368bits(945)，Expect＝e-101，同一性＝171/195(87％)，Positives＝182/195(92％)

＞emb|CAD87658.1|无名蛋白产品[合成构建体]，长度＝198，评分＝367bits(943)，Expect＝e-101，同一性＝170/195(87％)，Positives＝182/195(93％)

＞sp|Q27709|OBL_OBELO Obelin 前体(OBL)，pdb|1EL4|A链A，钙调节的发光蛋白Obelin的结构，由SulfurSas测定，gb|AAA67708.1|无名蛋白产品，长度＝195，评分＝327bits(837)，Expect＝1e-88，同一性＝150/193(77％)，Positives＝170/193(87％)

＞emb|CAD87674.1|无名蛋白产品[合成构建体]，长度＝195，评分＝326bits(835)Expect＝2e-88，同一性＝149/193(77％)，Positives＝170/193(87％)

＞emb|CAD87672.1|无名蛋白产品[合成构建体]，长度＝195，评分＝325bits(834)，Expect＝3e-88，同一性＝149/193(77％)，positives＝170/193(87％)

＞emb|CAD87673.1|无名蛋白产品[合成构建体]，长度＝195，评分＝325bits(833)，Expect＝4e-88，同一性＝149/193(77％)，Positives＝170/193(87％)

＞pdb|1JF0|A链A，来自Geniculata的Obelin的晶体结构，在1.82A分辨率，gb|AAL86372.1|AF394688_1apoobelin[Obelia geniculata]，长度＝195，评分＝325bits(833)，Expect＝4e-88，同一性＝149/193(77％)，Positives＝168/193(86％)

实施例6

BLAST

mtClytin在核酸水平上的BLAST分析结果：

＞emb|AX702125.1|序列23，来自专利WO03006497，长度＝597，评分＝669bits(348)，Expect＝0.0，同一性＝504/582(86％)

＞emb|AX702119.1|序列17，来自专利WO03006497，长度＝597；评分＝669bits(348)，Expect＝0.0，同一性＝504/582(86％)

＞emb|X70221.1|CGCLYTIN C.gregaria mRNA for clytin，长度＝747，评分＝669bits(348)，Expect＝0.0，同一性＝504/582(86％)

＞gb|L13247.1|CY1APOCLYT Clytia gregarium apoclytin mRNA，completecds，长度＝747，评分＝669bits(348)，Expect＝0.0，同一性＝504/582(86％)

＞emb|AX702187.1|序列85，来自专利WO03006497，长度＝597，评分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)

＞emb|AX702185.1|序列83，来自专利WO03006497，长度＝597，评分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)

＞emb|AX702183.1|序列81，来自专利WO03006497，长度＝597，评分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)

＞emb|AX702181.1|序列79，来自专利WO03006497，长度＝597，评分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)

＞emb|AX702179.1|序列77，来自专利WO03006497，长度＝597，评分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)

＞emb|AX702131.1|序列29，来自专利WO03006497，长度＝597，评分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)

＞emb|AX702129.1|序列27，来自专利WO03006497，长度＝597，评分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)

实施例7

图7表示mtClytin与Clytin(Clytia gregaria)在核酸水平上的比对。

实施例8

图8表示mtClytin与Clytin(Clytia gregaria)在氨基酸水平上的比对。

实施例9

mtClytin的动力学分析

对于mtClytin生物发光的动力学分析，采用pcDNA3-mtClytin或pcDNA-Obelin或pcDNA3(无任何整合的cDNA)瞬时转染CHO细胞。转染和检测如实施例4中所述。以1秒的积分时间，读数时间为60秒。

图5和图6表示mtClytin和Obelin的动力学分析结果。

实施例10

MITOPROT分析

使用计算机程序MITOPROT分析mtClytin信号肽(Claros等，1996)。分析以下发光蛋白：Obelin(Q27709)、水母发光蛋白(P07164)、Clytin(Q08121)和mtClytin(SEQ ID NO：2)。

分析结果：

Obelin：

序列名称：OBELIN

输入序列长度：195aa

---------------------------------------------------------

计算参数的值

query序列的净电荷：-11

分析区：11

引导肽中碱性残基的数目：3

引导肽中酸性残基的数目：0

裂解位点：未测到

裂解序列：-

---------------------------------------------------------

所用的疏水尺度

GES KD GVH1 ECS

H17 ： -0.624 0.259 -0.308 0.295

MesoH ： -1.573 -0.241 -0.642 0.060

MuHd_075 ： 14.019 3.641 4.408 1.523

MuHd_095 ： 7.994 7.898 3.285 1.838

MuHd_100 ： 13.734 9.836 5.597 2.742

NuHd_105 ： 21.195 11.755 7.339 4.117

Hmax_075 ： -9.450 -2.800 -4.008 1.132

Hmax_095 ： -0.963 1.837 -1.971 1.103

Hmax_100 ： 0.400 1.300 -1.942 2.240

Hmax_105 ： 10.617 6.067 0.733 3.127

--------------------------------------------------------

概率

输出到线粒体的：0.1479

水母发光蛋白：

序列名称：AEQUORIN

输入序列长度：196aa

---------------------------------------------------------

计算参数的值

query序列的净电荷：-13

分析区：3

引导肽中碱性残基的数目：0

引导肽中酸性残基的数目：0

裂解位点：未测到

裂解序列：-

---------------------------------------------------------

所用的疏水尺度

GES KD GVH1 ECS

H17 ： 0.006 0.794 -0.263 0.368

MesoH ： -1.673 -0.382 -0.703 0.048

MuHd_075 ： 24.326 4.153 5.947 2.450

MuHd_095 ： 12.638 7.213 4.218 1.796

MuHd_100 ： 13.748 8.827 4.477 2.427

MuHd_105 ： 16.581 11.426 5.056 3.453

Hmax_075 ： 0.438 0.233 -2.490 1.692

Hmax_095 ： 0.525 -1.400 -2.394 0.674

Hmax_100 ： -0.100 -1.200 -2.292 1.550

Hmax_105 ： 0.500 -0.000 -2.164 1.540

---------------------------------------------------------

概率

输出到线粒体：0.0148

Clytin：

序列名称：CLYTIN

输入序列长度：198.aa

---------------------------------------------------------

计算参数的值

query序列的净电荷：-9

分析区：32

引导肽中碱性残基的数目：6

引导肽中酸性残基的数目：2

裂解位点：未测到

裂解序列：-

---------------------------------------------------------

所用的疏水尺度

GES KD GVH1 ECS

H17 ： -0.429 0.341 -0.313 0.313

MesoH ： -1.778 -0.307 -0.718 0.053

MuHd_075 ： 32.928 17.509 7.351 5.708

MuHd_095 ： 30.874 20.344 9.074 5.834

MuHd_100 ： 36.596 22.666 10.051 6.762

MuHd_105 ： 39.174 19.336 10.379 7.609

Hmax_075 ： 4.900 7.087 -1.223 3.684

Hmax_095 ： 13.600 10.100 1.251 4.390

Hmax 100 ： 14.000 12.600 1.601 5.060

Hmax_105 ： 6.650 13.067 -0.468 3.920

---------------------------------------------------------

概率

输出到线粒体：0.2047

Clytin-2：

序列名称：CLYTIN-2

输入序列长度：198aa

---------------------------------------------------------

计算参数的值

query序列的净电荷：-7

分析区：16

引导肽中碱性残基的数目：3

引导肽中酸性残基的数目：1

裂解位点：未测到

裂解序列：-

---------------------------------------------------------

所用疏水尺度

GES KD GVH1 ECS

H17 ： -0.288 0.341 -0.213 0.313

MesoH ： -1.519 -0.206 -0.681 0.081

MuHd_075 ： 32.594 15.092 8.192 4.075

MuHd_095 ： 36.090 19.707 8.836 6.716

MuHd_100 ： 38.617 20.269 9.682 6.851

MuHd_105 ： 30.267 16.082 8.229 5.470

Hmax 075 ： 6.533 6.417 -0.793 2.508

Hmax_095 ： 13.600 10.100 1.251 4.390

Hmax_100 ： 13.600 10.100 1.251 4.390

Hmax_105 ： 13.417 10.150 1.612 3.862

---------------------------------------------------------

概率

输出到线粒体：0.3974

mtClytin：

序列名称：mtClytin

输入序列长度：228aa

---------------------------------------------------------

计算参数的值

query序列的净电荷：-8

分析区：34

引导肽中碱性残基的数目： 6

引导肽中酸性残基的数目： 0

裂解位点：17

裂解序列：MQRFTNRLLSMSALRA

---------------------------------------------------------

所用疏水尺度

GES KD GVH1 ECS

H17 ： -0.135 0.453 -0.343 0.309

MesoH ： -1.623 -0.215 -0.701 0.073

MuHd_075 ： 33.394 19.322 8.634 7.593

MuHd_095 ： 34.726 19.634 8.110 8.861

MuHd_100 ： 32.825 16.596 7.376 7.520

MuHd_105 ： 28.005 19.893 7.410 7.865

Hmax_075 ： 16.683 17.733 2.851 5.763

Hmax_095 ： 13.125 13.388 2.299 4.314

Hmax_100 ： 8.300 11.500 1.845 3.830

Hmax_105 ： 1.700 9.500 -1.171 2.390

---------------------------------------------------------

概率

输出到线粒体：0.9974

被分析的肽易位至线粒体的概率以接近1的计算因数增加。

Obelin、水母发光蛋白、Clytin、Clytin-2和mtClytin的蛋白序列的分析表明仅mtClytin具有可以转运至线粒体的蛋白特征。

实施例11

图9显示mtClytin，Clytin(Clytia gregaria)和Clytin-type2在氨基酸水平上比对。

文献/专利

US 6,495,355

US 5,541,309

US 5,093,240

US-0908909

US 6,152,358

JP-0176125

GB-0024357

WO03006497

WO200168824

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