JP5304275B2 - アポクライティン−ｉｉをコードするコドン最適化核酸およびその使用方法 - Google Patents

アポクライティン−ｉｉをコードするコドン最適化核酸およびその使用方法 Download PDF

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Description

本発明は、アポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化核酸、アポクライチン-IIタンパク質、およびその製造方法などに関する。
腔腸動物における発光クラゲの中には、カルシウムイオンと特異的に結合し発光する発光タンパク質が６種類知られている。その中で、イクオリンとオベリンが詳細に研究されている。これらのカルシウム結合型発光蛋白質は、細胞における生物学的カルシウム指標あるいはカルシウム濃度の測定に用いられてきた。またその遺伝子を用いて、カルシウム依存による細胞環境内の重要な修飾因子および生物学的メカニズムに関する情報を導きだす手法として用いられてきた。
他の発光オワンクラゲClytia gregaria由来の発光蛋白質であるクライティンは、1982年に単離され（非特許文献１参照）、その遺伝子は、1993年に単離され,大腸菌内での発現が確認されている（非特許文献２参照）。その後、井上らにより、詳細に遺伝子解析がなされ、発光性質の異なるクライティン遺伝子が同定され、最初に単離されたクライティン（＝クライティン-I）と区別して、クライティン-II と命名された（非特許文献３参照）。クライティン-II遺伝子は、大腸菌内で発現され、組換えクライティン-IIとしても精製され、生物学的カルシウム指標あるいはカルシウム濃度の測定に使用の可能性が示された。
クライティン-IIは、イクオリンおよびクライティン-Iと比較すると、蛋白質量あたりの全発光量はほぼ同一であるが、発光初速強度は約５倍である。すなわち、クライティン-IIのS／N比はイクオリンおよびクライティン-Iの５倍である。このことは、検出系においてクライティン-IIを使用する場合に、イクオリンおよびクライティン-Iより優れている可能性を示唆している。
このような発光能をもつクライティン-II は、分子量約２２,０００のアポクライティン-IIタンパク質、分子状酸素が付加したセレンテラジンからなる複合体である。クライティン-IIタンパク質の分子内には、カルシウムイオンと結合可能な配列が３カ所存在する。クライティン-IIにカルシウムイオンが結合すると青い光（λｍａｘ＝４７０ｎｍ）を放ち、二酸化炭素およびセレンテラミドを生成する。この発光強度は、カルシウムイオン濃度に依存することから、クライティン-IIは、高感度でのカルシウム濃度測定を可能にする。
先行技術によると発光タンパク質クライティン-IIのアミノ酸配列は、Inouyeにより最初に公開され（非特許文献３参照）、受託番号：AB360785によりＥＭＢＬ配列データベースにおいて開示されている（本明細書においても配列番号１として開示される）。
アミノ酸配列相同性について、クライティン-IIと他の発光蛋白質クライティン-I、イクオリン、オベリン及びマイトロコミンと比較すると、それぞれ88.4％、61.9％、76.2％、60.8％であり、イクオリン、オベリン及びマイトロコミンとは、相同性が低い（非特許文献３参照）。
また、特表2005-506053において、発光タンパク質イクオリンのアミノ酸配列にもとづいたコドン最適化（ヒト化）遺伝子配列の報告があるが、クライティン-IIのアミノ酸配列との相同性61.9％、発光パターンの異なること、さらに塩基配列における相同性は 64.6％であることから、全くことなる機能分子として認定できる。
特表2005-506053
Comp. Biochem. Physiol. (1982) 72B, 77-85 FEBS Lett. (1993) 333,301-305 J. Biochem. 143 (2008) 711-717
しかしながら、クライティン- IIには、真核細胞生物由来の宿主細胞あるいは宿主アッセイ細胞内で組換えクライティン- IIを安定的に発現された実績も、細胞内カルシウム濃度変化のレポーターとして用いられた実績もない。また、クライティン-IIについて、Ｇタンパク質結合型受容体および／またはイオンチャネルの活性化状態を起こす小分子のスクリーニングにおける有用性についての検討も行われていない。さらに、最適化されたクライチィン−II配列に関する報告もない。
クライティン-IIを用いて、哺乳類細胞中の細胞内カルシウム濃度における変化をアッセイするには、アポクライティン-IIをコードする核酸を含有するプラスミドを細胞内に導入することが必須である。核酸の細胞内への導入は、イオン脂質試薬を用いたＤＮＡ複合体形成またはＣａＰＯ４による沈殿のような標準的な形質導入技術により成し遂げられる。
しかしながら、形質導入された哺乳類細胞において、細胞の少集団のみがアポクライティン-II発現プラスミドを宿す場合には、アポクライティン-IIタンパク質の低発現の結果、発現再生アポクライティン-IIを用いたカルシウムアッセイにおいて、低発光強度（低発光量）に起因して、クライティン-IIの使用が制限される。本発明者らは、この事実に着目し、アポクライティン-IIタンパク質の細胞内発現量の増加が、カルシウムアッセイにおけるより高い発光量、さらにはノイズに対する高いシグナル比率の実現に有効ではないかとの仮説を立てた。
また、本発明者らは、アポクライティン-II遺伝子転写の増幅は、標準的な形質導入技術では扱いにくい哺乳類細胞におけるカルシウムアッセイの実施を可能とすること、さらにこれは、レトロウイルス遺伝子送達法によるアポクライティン-II遺伝子の導入により、または、普通は一過性形質導入より少ない遺伝子の転写数という結果となる他の方法によっても達成され、しかも、より広範な哺乳類細胞への遺伝子送達が可能となることに独自に着目した。
さらに、本発明者らは、非常に強化された発光シグナルの大きさという付加利点を有する、哺乳類細胞におけるアポクライティン-IIタンパク質の増加した発現に対するアポクライティン-IIのコドン最適化バージョン、およびその使用を教示する刊行物を知らない。
そこで前述の従来技術の課題に鑑み鋭意研究を重ねた。その結果、本発明者らは、アポクライティン-IIタンパク質をコードする核酸のコドン最適化（以下「ヒト化」と言うことがある。）が、クライティン-IIの発光活性を著しく向上させること、さらには、従来の野生型クライティン-IIを用いた場合に比べ、細胞内カルシウム流動の検出を顕著に容易なものとすることを知見し、この知見に基づき本発明を完成させた。
本発明は以下の構成を有するものである。
（１）アポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化核酸。
（２）配列番号：１のアミノ酸配列を有するアポクライティン-IIタンパク質またはその変異体をコードする、前記第１項に記載のコドン最適化核酸。
（３）前記第１項または第２項に記載のコドン最適化核酸と、他のタンパク質をコードする核酸とが融合したコドン最適化核酸。
（４）ＣＧＣアルギニンコード化コドン、ＡＡＣアスパラギンコード化コドン、ＧＡＣアスパラギン酸コード化コドン、ＣＡＧグルタミンコード化コドン、ＧＡＧグルタミン酸コード化コドン、ＧＧＣグリシンコード化コドン、ＣＡＣヒスチジンコード化コドン、ＡＴＣイソロイシンコード化コドン、ＣＴＧロイシンコード化コドン、ＡＡＧリジンコード化コドン、ＣＣＣプロリンコード化コドン、ＴＴＣフェニルアラニンコード化コドン、ＴＣＣまたはＡＧＣセリンコード化コドン、ＴＡＣチロシンコード化コドン、およびＧＴＧバリンコード化コドンからなる群から選ばれた1種以上のコドンの数が、配列番号：２の野生型クラゲアポクライティン-IIタンパク質をコードする核酸よりも多い、前記第１項から第３項の何れか１項に記載のコドン最適化核酸。
（５）前記第１項から第４項の何れか１項に記載のコドン最適化核酸を用いて発現されたアポクライティン-IIタンパク質。
（６）前記第５項に記載のアポクライティン-IIを構成成分とするクライティン-II。
（７）アポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化核酸の位置が、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下である、発現ベクター。
（８）アポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化核酸、および哺乳類細胞においてアポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化核酸の発現を制御する制御調節配列を有する、前記第７項に記載の発現ベクター。
（９）アポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化核酸を有する組換え宿主細胞。
（１０）宿主細胞が哺乳類細胞である、前記第９項に記載の組換え宿主細胞。
（１１）宿主細胞がヒト細胞である、前記第９項に記載の組換え宿主細胞。
（１２）宿主細胞が非ヒト哺乳類細胞である、前記第９項に記載の組換え宿主細胞。
（１３）下記(i)〜(iii)の工程を有するアポクライティン-IIタンパク質の製造方法。
アポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化核酸を、宿主細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程
（ii）該組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する工程
（iii）当該宿主細胞を培養し、アポクライティン-IIタンパク質を発現させる工程
（１４）アポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化された核酸と、当該核酸を発現し得る制御調節核酸とが結合した核酸を、宿主細胞に導入することを特徴とする、クライティン-IIの発光強度増強方法。
（１５）宿主細胞におけるクライティン-IIの発光強度を増強させるための、アポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化核酸の使用。
（１６）アポクライティン-IIタンパク質を発現するように遺伝子操作された宿主細胞を、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体と接触させ、次いで、発生した光量を測定することを特徴とする、活性化時の細胞内カルシウム流動の変化を仲介する受容体を阻害する化合物の能力測定方法。
（１７）さらに、受容体阻害の能力を記録する、前記第１６項に記載の方法。
アポクライティン-II をコードするコドン最適化核酸は新規の物質であり、このコドン最適化核酸を宿主細胞に導入するなどして得られるヒト化アポクライティン-IIタンパク質（以下「コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質」と言うことがある。は、発光基質、および分子状酸素から構成される複合体（ヒト化クライティン-II）を形成した場合には、野生型アポクライティン-IIを用いた場合に比較して極めて顕著な発光活性を示す。さらに、本発明によりもたらされるクライティン-IIは、細胞内カルシウム流動の検出などの用途において極めて有効である。
図１は、本発明で用いられる真核細胞生物でのコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質発現ベクターpCMX-hCLIIを示す概略図である。 図２は、本発明で用いられる原核細胞生物でのコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質発現ベクターpiP-H-hCLIIを示す概略図である。
本発明の第１の態様は、アポクライティン-IIタンパク質をコードするコドン最適化核酸（以下「コドン最適化アポクライティン-II核酸」と言うことがある。）である。
好ましい実施態様において、コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質は、配列番号：１において表された配列、またはそれらの切断バージョンを包含する。
切断バージョンは、当該タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端の１以上のアミノ酸、またはその近くの１以上のアミノ酸が失われたものである。１つの実施態様において、切断バージョンは、５０未満のアミノ酸がＣ−末端から取り除かれている。但し、本発明において切断バージョンは、若干の発光特性を保持する必要がある。
さらなる実施態様は、Inouye（J. Biochem. 143 (2008) 711-717）開示の野生型アポタンパク質のようなアポクライティン-IIタンパク質の変異型を包含する。本発明において変異型は、強化されたまたは変化した発光特性を有し得る。そしてそれら変異型は配列番号：１において表された配列に基づくアミノ酸置換体や、野生型アミノ酸配列から１つまたは２、３のアミノ酸が変化したものであることが好ましい。アポクライティン-IIタンパク質の変異型の具体例として、配列番号：１の位置６２のバリンがイソロイシンにより置換された変異型、位置７８のアラニンがプロリンにより置換された変異型、および位置９１のグルタミン酸がリジンにより置換された変異型などを挙げることができる。
また、本発明の実施態様である変異配列の配列番号：１との配列同一性は、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、さらには９９％以上の配列同一性を有することが好ましい。２配列間の配列同一性は、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ、ＷａｓｈＵ Ｂｌａｓｔ２、Ｆａｓｔa、およびＰＩＬＥＵＰのような適当なソフトウェアを用いる最適なコンピューターアラインメント解析を用いて、またはＢｌｏｓｕｍ６２のようなスコアマトリックス（scoring matrix）を用いて評価することができる。本発明において２配列間の配列同一性は、Smith-Watermanの「最高標準」のアライメントアルゴリズムの近似値を求める方法により決定する。
本明細書において使用する用語「コドン最適化」および「ヒト化」は、ヒト遺伝子においてより頻繁に用いられるコドンを有するクラゲアポクライティン-IIコドンの１以上、好ましくは有意な数の置換により哺乳類細胞、特にヒト細胞における発現に適応することを意味する。
別の好ましい実施態様において、ヒト化コドンのパーセンテージは、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、さらには９９％以上であることが好ましい。
本発明のコドン最適化核酸は一般的にｃＤＮＡであるが、ゲノムコピーも包含される。
コドン最適化核酸は、当該技術分野における標準的な技術を用いて化学的に合成することができる。あるいは、野生型ゲノムまたは野生型ｃＤＮＡを変異させることにより得ることができる。ヌクレオチド変化またはヌクレオチド変異は、新規ポリヌクレオチド合成、ＰＣＲ、適当にデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた部位指定の突然変異誘発、または当業者に公知の他の方法により達成される。本発明のコドン最適化アポクライティン-II核酸の末端は、適当な制限酵素認識配列を有するように設計されていてもよく、あるいは、プラスミドベクターへのヒト化遺伝子のクローニング等を容易にするために塩基配列を付加した制限酵素配列を使用してもよい。
様々な発現ベクター／宿主システムを使用して、アミノ酸配列をコードするコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を発現させることができる。発現ベクター／宿主システムは特に限定されるものではないが、具体的には、組換えアデノウイルスシステム、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）システムまたはレトロウイルスシステムなどを用いた発現ベクター／宿主システムを挙げることができる。本発明に好ましく用いたれる発現ベクターとしては、ワクシニアウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、および欠陥Ｂ型肝炎ウイルスなどを挙げることができる。本発明においては、コドン最適化アポクライティンII核酸の発現のために哺乳類発現システムを用いることが好ましいが、他のベクターおよびバクテリア、酵母、植物、真菌、昆虫のような宿主細胞を用いても良い。
哺乳類発現システムでの発現ベクターは、普通は複製開始点、プロモーター、転写開始部位、さらには、任意でシグナルペプチド、ポリアデニル化部位、転写終結部位などを含む。これらのベクターは、普通はセレクションのための１以上の抗生物質耐性マーカーも含有する。本発明において適当な発現ベクターは、プラスミド、コスミド、またはファージまたはレトロウイルスのようなウイルスである。タンパク質をコード化する核酸（以下「コード配列」と言うことがある。）が、発現ベクター構造により形質転換された宿主細胞または形質導入された宿主細胞においてＲＮＡへ転写されるように、タンパク質のコード配列は、それに適したプロモーター（すなわち、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＴＫ、ＲＳＶ、ＳＶ４０など）、調節因子および転写終結の制御下に置かれる。
当該コード配列は、宿主細胞外への目的タンパク質分泌のためのシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでもよく、または含まなくてもよい。本発明において好ましく用いられるベクターは、少なくとも１つのマルチクローニング部位を含む。ある実施態様においては、プロモーターとコドン最適化アポクライティン-II核酸の間に位置するクローニング部位またはマルチクローニング部位が存在する。かかるクローニング部位は、それがコドン最適化アポクライティン-II核酸と近接しインフレームであることから、第２の核酸配列をクローニング部位にクローン化することにより、Ｎ−末端融合タンパク質を生成させるために使用することができる。他の実施態様において、上記のＮ−末端融合に類似の方法でＣ−末端融合の生成を促進するためにコドン最適化アポクライティンII核酸の下流にすぐ接して位置するクローニング部位またはマルチクローニング部位を存在させてもよい。
本発明のコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質の発現および精製は、当該分野において公知の方法（例えば、Sambrook et al. “Molecular Cloning-A Laboratory Manual, second edition 1989”に記載）を用いて容易に実施される。発現ベクターおよびプラスミドの使用は、当業者にとって公知である。殆どのケースにおいて、いずれの哺乳類細胞発現ベクターは、本発明のコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質の発現に利用可能である。
本発明のさらなる態様により、宿主細胞でのコドン最適化アポクライティン-II核酸の発現を制御可能とする制御調節配列を含む発現ベクターが提供される。
本発明の発現ベクターにおいて、コドン最適化アポクライティン-II核酸は、哺乳類細胞で作動するプロモーターの転写調節下に位置することが好ましい。
コドン最適化アポクライティン-II核酸を含有するベクターは、ＣＨＯのような哺乳類細胞、E.coliのようなバクテリア；Saccharomyces cerevisiaまたはPichia pastorisのような酵母、または突然変異誘発、クローニング、あるいは発現といった操作を容易にする他の適当な宿主へ導入、すなわち形質転換または形質導入され得る。本発明の実施は、如何なる特定の宿主細胞株またはベクターにも依存せず、かつ制限されない。本発明の使用のために適当な宿主細胞またはベクターは、当業者にとって明白であり、選択可能な事項である。
ベクターを細胞に導入する方法としては、一般的に用いられている方法が好適に利用可能である。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム試薬を用いる方法、カチオン性脂質を用いたリポフェクション法などが挙げられる。ここで、ベクターが環状である場合、公知の方法により線状化して細胞に導入されてもよい。
コドン最適化アポクライティン-II核酸を含有するベクターで形質転換または形質導入された宿主細胞は、目的物質の発現および細胞培養物からの回収に適当な条件下で培養され得る。こうして発現されたコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質は、使用された配列に依存して、すなわち適当な分泌シグナル配列が存在するか否かによって、培養液中に分泌され、または細胞内に蓄積され得る。この際、一過性形質転換細胞／細胞株、安定的形質転換細胞／細胞株の両方が検討の対象となる。
コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質の発現における使用に適当な宿主細胞としては、具体的には、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅLａ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２等を挙げることができる。
コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を発現可能なトランスジェニック動物の作製には、例えばUS 5,714,666に開示のような発現システムを用いればよい。
本発明はさらに、その細胞においてコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質発現の制御が可能な、コドン最適化アポクライティン-II核酸および制御調節配列を含むトランスジェニックである非ヒト動物を提供する。
トランスジェニック動物は特に限定されるものではないが、本発明においてはマウスであることが好ましい。
本発明のさらなる態様は、本発明のコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を発現するために適した宿主細胞を提供する。すなわち、コドン最適化アポクライティン-II核酸を含む組換え宿主細胞である。本発明において宿主細胞は限定されるものではないが、好ましくは哺乳類細胞である。哺乳類細胞には、ヒト細胞と非ヒト細胞とがあり、非ヒト哺乳類細胞としては、ＣＨＯ−Ｋ１、Phoenix細胞などを例示できる。哺乳類細胞の中でもヒト細胞は、本発明において最も好ましい宿主細胞である。
本発明の実施態様である組換え宿主細胞は、クライティン-IIを形成させた際に検出可能とするのに十分な量のコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を産生する。
野生型クラティン-II のコード配列から作成したコドン使用頻度を示す表１の検討から、野生型クラゲアポクライティン-IIコドンは３番目の位置でＡまたはＵのどちらかを好むことが判る。一般に、好ましい哺乳類コドンは、位置１および位置２の２残基の同一性に関わらず一般に３番目の位置ではＣまたはＧのどちらかを好み、最も好ましくはＣを好む。１００の高発現ヒト遺伝子の比較は、Haas et al., (Current Biology. 6(3):3135-324, 1996)により解析され、次のような傾向が示されている。例えば、高発現遺伝子中のアラニン（ＧＣＸ）残基の５３％がＧＣＣにより、１７％がＧＣＴにより、１３％がＧＣＡにより、および１７％がＧＣＧによりコードされる。同様に、セリン残基は、以下の統計値：ＴＣＣ（２８％）、ＴＣＴ（１３％）、ＴＣＡ（５％）、ＴＣＧ（９％）、ＡＧＣ（３４％）およびＡＧＴ（１０％）を有する。クラゲとヒトとの間のコドン使用の表から明らかな様に、２つのコドンの選択のみが存在するアミノ酸において、野生型クラゲアポクライティン-II核酸は、ヒト遺伝子によって好まれるコドンと比較して最も好まれないコドンを通常用いている。
表１ 野生型クライティンIIコドン使用頻度表
Figure 0005304275
コドン最適化アポクライティン-II核酸を構築する際、それぞれのコドンは、その３番目の位置をＣまたはＧのどちらかで置き換えることにより哺乳類の相当物に変換される。これが可能でない場合には、問題のある制限酵素部位の導入があるはずであり、高発現ヒト遺伝子において次に頻繁に用いられるヌクレオチドを用いればよい。
本発明のコドン最適化アポクライティン-II核酸は、配列番号：２に示される野生型クラゲ核酸と比較して、ＧＣＣアラニンコード化コドンの数が増加していることが好ましい。
本発明においてコドンの数が増加するとは、例えば、コドン最適化型より多くのアラニンアミノ酸が存在することを意味するのではなく、例えば、ＧＣＣアラニンコード化コドンの相対的な数がコドン最適化アポクライティン-II核酸においてより多いことを意味する。もちろん、このことは、野生型のタンパク質と比較して特定のコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質内に特定のアミノ酸が数的に多く存在するものを除外しない。例えば、コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質は、配列番号：２の野生型タンパク質配列に対して相対的に数の上でより多くのアミノ酸を有し得る。
上記定義に照らして、本発明のコドン最適化アポクライティン-II核酸は、ＣＧＣアルギニンコード化コドン、ＡＡＣアスパラギンコード化コドン、ＧＡＣアスパラギン酸コード化コドン、ＣＡＧグルタミンコード化コドン、ＧＡＧグルタミン酸コード化コドン、ＧＧＣグリシンコード化コドン、ＣＡＣヒスチジンコード化コドン、ＡＴＣイソロイシンコード化コドン、ＣＴＧロイシンコード化コドン、ＡＡＧリジンコード化コドン、ＣＣＣプロリンコード化コドン、ＴＴＣフェニルアラニンコード化コドン、ＴＣＣまたはＡＧＣセリンコード化コドン、ＴＡＣチロシンコード化コドン、およびＧＴＧバリンコード化コドンからなる群から選ばれた1種の数が、配列番号：２の野生型クラゲアポクライティン-II核酸よりも多いことが好ましい。
アミノ末端に７個のアミノ酸が付加したヒト最適化アポクライティン-IIは、本発明において好ましいコドン最適化アポクライティン-II核酸の１つである。本発明のコドン最適化核酸は、コドン最適化アポクライティン-II核酸と他のタンパク質をコードする核酸とが融合したものであっても良い。これによりタンパク質発現を可能とする制御配列および前述の融合された配列を有する宿主細胞において融合タンパク質が発現するという結果をもたらす。そしてこの結果は、Ｎ−末端融合タンパク質およびＣ−末端融合タンパク質の何れの場合も同様に起こり得るのである。
本発明のコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質に融合される他のタンパク質は特に限定されるものではないが、具体的には、分泌あるいは他の制御配列、標識配列（例えば、６−ｈｉｓ標識）、標的指向配列等である。それ以外のタンパク質としては、レポーターまたは他のマーカーとして働く緑色蛍光タンパク質を挙げることができる。さらには、ＨＡ１赤血球凝集素エピトープを挙げることができる。これは、認識配列として働くことから、アポクライティン-IIタンパク質の発現および濃度の確認を可能とする。
本発明のさらなる態様は、下記（ｉ）〜（iii）の工程を有するアポクライティン-IIタンパク質の製造方法である。
（i）コドン最適化アポクライティン-II核酸を、宿主細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程
（ii）該組換え発現ベクターを適当な宿主細胞に導入する工程
（iii）当該宿主細胞を、コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を発現させる工程
本発明の製造方法において、宿主細胞は特に限定されるものではないが、哺乳類細胞であることが好ましく、その際に使用するプロモーターは哺乳類宿主細胞において作動するプロモーターであることが好ましい。
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、特に限定されるものではなく、前述あるいは後述の方法により可能である。また、コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を発現させる方法も特に限定されるものではなく、コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質の発現を可能とするのに適する条件において宿主細胞を培養する方法などが挙げられる。
さらに、本発明の製造方法においては、下記（iv）の工程を追加してもよい。
（iv）発現したコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を有意な量の他の細胞内タンパク質から精製する工程
前述の（iv）の工程の後、コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質の純度は、７０％以上、８５％以上、さらには９５％以上であることが好ましい。
本発明のさらなる態様は、アポクライティン-IIタンパク質をコードし、アポクライティン-IIタンパク質を産生するコドン最適化核酸の効果的な発現を可能とする制御配列と作動可能なように結合したコドン最適化核酸を含む核酸を、宿主に導入することを特徴とする、クライティン-IIの発光強度の増強方法である。
その好ましい実施態様において、制御配列に作動可能なように結合したコドン最適化アポクライティン-II核酸を含む核酸は、形質導入、形質転換またはエレクトロポレーションなどにより宿主細胞に導入すればよい。そしてこの宿主細胞をコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質の発現に適当な条件下で培養すればよい。ここで、「クライティン-II 発光強度の増大」は、野生型（非ヒト化）クラゲアポエクオリン遺伝子が用いられている以外は同一の発現システムに比較して、発光の大きさが増加していることを意味している。
本発明のさらなる態様は、宿主細胞におけるクライティン-II発光強度を増大させるコドン最適化アポクライティン-II核酸の使用である。
本発明のさらなる態様は、活性化されると細胞内カルシウム流動の変化を仲介するＧタンパク質結合受容体（以下「GPCR」と言うことがある。）またはイオンチャネルのような受容体を遮断、阻害、または拮抗する化合物の能力を測定する方法である。例えば、ＧＰＣＲは、コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を発現できるように操作された、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞のような細胞株において発現させることができ、測定に先立って、それら細胞をセレンテラジンの存在下にインキュベーションすることにより、生産されたアポクライティン-IIをクライティン-IIに変換することができる。
具体的には、試験化合物を細胞に加え、次いでリガンドを加える。そして、受容体の活性化に起因して増加したカルシウム流動により生じた発光を標準的なルミノメーターにより測定する。次いで、試験化合物により生じた阻害の程度を算定は、化合物で処理された細胞の発光強度と、リガンドのみで処理した細胞の発光強度とを比較すればよい。また、クライティン-II細胞を試験化合物で処理し、そして発光産生量を直接的測定することによりレセプターアゴニストを直接見つけ出すことができる。
従って、本発明のこの態様をふまえて、細胞内カルシウムの調節に含まれる受容体およびヒト化遺伝子由来のクライティン-IIを発現するように操作した哺乳類細胞を、試験しようとする化合物とインキュベートする。次いで、セレンテラジン補助因子を加えて発光強度を測定する。ここで、発光強度は細胞内カルシウム放出レベルの指標である。そして試験結果、すなわち受容体を阻害または調節するための試験化合物の能力は、例えば、紙などに、または電子的手段により記録すればよい。
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］野生型アポクライティン-IIのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］野生型アポクライティン-IIの塩基酸配列を示す。
［配列番号：３］コドン最適化アポクライティン-IIの塩基配列を示す。
［配列番号：４］実施例１で作製した発現ベクターpCMX-hCLIIに挿入された、ヒト型クライティン遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：５］実施例１で作製した発現ベクターpCMX-hCLIIに挿入された、ヒト型クライティン遺伝子のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］実施例２で作製した発現ベクターpiP-H-hCLIIに挿入された、ヒト型クライティン遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：７］実施例２で作製した発現ベクターpiP-H-hCLIIに挿入された、ヒト型クライティン遺伝子のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：８］実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：９］実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１０］実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１１］実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１２］実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１３］実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実験例１ コドン最適化アポクライティン-II核酸の設計および化学合成
コドン最適化アポクライティン-II核酸の設計は、アポクライティン-IIのアミノ酸配列を変えることなく、ヒトにおける高頻度使用のアミノ酸コドンの選択のみならず、転写因子認識配列の不活性化配列へ変換、スプライシングの可能性のある部位除去、６塩基認識の制限酵素部位の削除、ループ構造を作るパリンドローム配列が形成しないように配列設計を行った（配列表３）。コドン
最適化アポクライティン-IIコドン使用頻度表を表２ に示した。野性型アポクライティン-IIコドン頻度表の表１にくらべ、明らかにコドン最適化アポクライティン-II核酸は、ヒト化コドンへ最適化設計されている。
最適化設計したコドン最適化アポクライティン-II核酸を、常法により化学合成法により合成した。pBlueScript SK(+)（Stratagene社）のEcoRI／SalI制限酵素サイトにクローン化し、pBlue-hCLIIプラスミドを構築した。コドン最適化アポクライティン-II核酸の確認は、塩基配列（ABI社製）をDNAシークエンサーにて確認した。
表２ コドン最適化クライティンIIコドン使用頻度表
Figure 0005304275
実験例2 動物培養細胞でのコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質発現ベクターの構築
コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質発現ベクターの構築は以下の通りである。先ず、動物培養細胞での新規発現ベクターpCMX-Linker、を構築した。具体的には、pCMX-GFP (Ogawa et al., (1995) PNAS. 92(25), 11899-11903記載)において、制限酵素部位であるAsp718／SalI部位に、化学合成したマルチクローニング配列をもつリンカーLinker F(5)A-Sal (5' GT ACC ACC ATG CTC GAG CTG CAG GAA TTC TCT AGA G 3')（配列番号７）、および Linker R(5)A-Sal (5' TC GAC TCT AGA GAA TTC CTG CAG CTC GAG CAT GGT G 3')（配列番号８）を挿入して新規発現ベクターpCMX-Linkerを構築した。すなわち、新規発現ベクターは、CMVのプロモーターに制御され、その下流にコザック配列、マルチクローニングサイト配列（Asp718I/ XhoI/ PstI/ EcoRI/ XbaI/ SalI/ EcoRV/ BamHI/ MscI/ NheI）を有する。
次に、新規発現ベクターpCMX-Linkerを用いたコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質発現ベクターの構築は以下の通りである。 pBlue-hCLIIを常法により制限酵素EcoRI／SalIにて消化した後、pCMX-LinkerのEcoRI-SalI 部位に連結することによって、図1に示す発現ベクターpCMX-hCLIIを構築した。なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサートＤＮＡの確認を行った。また、コドン最適化アポクライティン-II核酸の対照となる野生型アポクライティン核酸を含むコントロールベクターであるpCMX-CLIIは、同様の方法により構築した。
実施例３ 細胞へのベクターの導入
（１）発現プラスミドの切断および精製
実施例２にて得られたpCMX-hCLIIプラスミドを用いて以下の実験を行った。大腸菌ＪＭ８３内のpCMX-hCLIIプラスミドを、Endofree Plasmid Maxi kit (QIAGEN社製)を用いて精製した。1 μg/ μlの濃度になるよう滅菌水に溶解した。同様にして、pCMX-hCLII，および内部標準のためのホタルルシフェラーゼベクター（pGL-control:プロメガ社）を使用した。
（２）トランスフェクション
ヒト子宮頸部がん由来細胞株であるＨｅＬａ株を、10％牛胎児血清（インビトロジェン社）を含むＤＭＥＭ培地（高グルコース含：和光純薬）にて培養し、2 x 10５ 細胞/ウエルにて6ウエルプレートに播種し、インキュベーター中37 ℃、5 % CO2にて培養した。24時間後、精製pCMX-hCLIIプラスミドをFuGene HD（ロッシュ社）トランスフェクションキットを用いて、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクション 実験に用いた。具体的には、100μl のＤＭＥＭ培地に、アポクライティン-II発現ベクターと内部標準ホタルルシフェラーゼ発現ベクターそれぞれ1μl/μlと FuGene HD 6μlを加え、室温で１５分間放置した。50μlのDNA−FuGene 複合体溶液を、6ウエルの細胞に添加した。24時間培養後、2ｍｌの冷ＰＢＳで3回洗浄した。細胞に250μlの冷ＰＢＳを加え、細胞を回収した。回収した細胞は、超音波破砕装置で破砕し、測定用酵素溶液とした。
実験例４ 動物培養細胞での発光活性測定
（１）内部標準用ホタルルシフェラーゼの測定方法：
実験例３で得られた測定用酵素溶液10μlを、50μl の酵素アッセイ用試薬（プロメガ社）に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）で、10秒間での発光積算し、相対発光強度で表記した。
（２）発光活性測定：
実験例３で得られた測定用酵素溶液50μl を、１μl のメルカプトエタノール（和光純薬）、１μl のセレンテラジン（チッソ社製）、および10ｍＭＥＤＴＡ（和光純薬）を含む950μlの50ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.6）に加え、４oC で3時間静置し、クライティン-IIを再生させた。この再生溶液10μlに100μlの50mM CaCl2 を含む50ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.6）溶液を、インジェクションすることにより発光させ、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）で、10秒間での発光測定し、最大発光強度を相対発光値で示した。
その結果を表３にまとめた。内部標準で使用したホタルルシフェラーゼ活性より、活性化率を求めた結果、野生型アポクライティン-IIに比べ、本発明のコドン最適化クライティン-IIタンパク質は約１５倍以上の活性を示すことが明らかとなった。
表３ 野生型クライティン-II遺伝子とヒト型ククライティン-II遺伝子の培養細胞での発現の比較
Figure 0005304275
実験例５ コドン最適化クライティン-IIタンパク質発現ベクターの大腸菌における構築
大腸菌においてコドン最適化アポクライティン-II核酸を発現させるために、出発となる発現ベクターpiP-H-L(6)を構築した。具体的には、特開2008-22848記載のpiP-(His6)HEベクターのHindIII-BamHIサイトに、化学合成したマルチクローニング配列をもつリンカーH/P/S/Xb/Xh/B:Linker-F（5' AG CTT CTG CAG GTC GAC TCT AGA CTC GAG G 3'） （配列番号９）、及びH/P/S/Xb/Xh/B:Linker-R（5' GA TCC CTC GAG TCT AGA GTC GAC CTG CAG A 3'） （配列番号１０）を挿入し、piP-H-L(6)を構築した。基本ベクターpiP-H-L(6)は、大腸菌のリポプロテインのプロモーター、ラクトースのオペロンに制御され、分泌のためのOmpA配列、キレートゲルによる精製のための６個のヒスチジン配列、種々のマルチクローニング配列を有する。
基本ベクターpiP-H-L(6)を用いたコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質発現ベクターの構築は以下の通りである。pBlue-hCLIIを鋳型としてPCRプライマーペア：hCLII-1N/HindIII（5' ggc aag ctt GTG AAG CTG GAC CCC GAC TTC 3'）（配列番号１１）及びhCLII-2C/XhoI（5' ggc CTC GAG TTA GGG GAC GAA GTT GCC GTA 3'）（配列番号１２）を用いて、PCRキット（日本ジーン社製）にてPCR（サイクル条件：25サイクル；1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃）を行った。得られた断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、制限酵素HindIII／XhoIで消化した後、piP-H-L(6)の制限酵素HindIII／XhoI部位に挿入することによって、図2に示す発現ベクターpiP-H-hCLIIを構築した。なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサートＤＮＡの確認を行った。
実験例６ コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質の大腸菌での発現
コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質（以下「hCLII」と言うことがある。）を、大腸菌において発現させるため、実施例２で作製した組換えプラスミドpiP-H-hCLIIを用いた。常法により大腸菌WA802株に導入し、得られた形質転換株をアンピシリン（50μg／ml）を含有する10mlのLB液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストイクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、30℃で18時間培養を行った。次いで、その培養物を新たなLB液体培地400ml x 5本（総量2L）に添加して30℃で18時間培養を行った。培養後、菌体を遠心回収（5,000rpm、5分）し、集菌された培養菌体をタンパク質抽出の出発材料とした。
実験例７ 培養菌体からのコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質の抽出および精製
集菌した培養菌体を200mlの50mM Tris-HCl（pH7.6）で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、Sonifier model cycle 250）を3分間、3回行い、その菌体破砕液を10,000 rpm（12,000×g）で4 ℃、20分間遠心した。得られた可溶性画分を、50mM Tris-HCl（pH7.6）で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径2.5×6.5cm）に供しコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を吸着させた。500mlの50mM Tris-HCl（pH7.6）で洗浄後、0.1Mイミダゾール（和光純薬工業社製）によりコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を溶出した。精製蛋白質濃度を、ウシ血清アルブミン（ピアス社製）を標品としてBradford法にもとづく市販のキット（バイオラッド社製）を用いて決定したところ、2Lの培養菌体より45.7mgのコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を得た。SDS-PAGE分析の結果、純度は95％以上であった。
実験例８ 発光活性の測定
精製過程における、コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質を構成成分とするクライティン-IIの発光測定は、10 mM EDTA を含む30mM Tris−HCl（ｐＨ7.6）990 μlに2-メルカプトエタノール(1μl)、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（1μg／μl）を混合した後、ヒト型アポクライティン-II溶液10μlを添加し、氷上(4℃)で2時間放置した。再生ヒト型クライティン-II溶液10μlへ、50mMカルシウム溶液を100μl加えることにより発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）で、10秒間での発光測定し、最大発光強度を相対発光値で示した（表４）。
表４ コドン最適化アポクライティン-IIタンパク質の精製収率を示す表
Figure 0005304275
アポクライティン-II をコードするコドン最適化核酸を宿主細胞に導入するなどして得られるコドン最適化アポクライティン-IIタンパク質、発光基質、および分子状酸素から構成される複合体を形成した場合には、野生型アポクライティン-IIを用いた場合に比較して極めて顕著な発光活性を示す。さらに、本発明によりもたらされるクライティン-IIは、細胞内カルシウム流動の検出などの用途において極めて有効である。

Claims (15)

  1. 配列番号：３の塩基配列を有するコドン最適化核酸。
  2. 配列番号：１のアミノ酸配列を有するアポクライティン-IIタンパク質をコードする、請求項１に記載のコドン最適化核酸。
  3. 請求項１または２に記載のコドン最適化核酸と、他のタンパク質をコードする核酸とが融合したコドン最適化核酸。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のコドン最適化核酸を有し、該コドン最適化核酸の位置が、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下である、発現ベクター。
  5. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のコドン最適化核酸、および哺乳類細胞において前記コドン最適化核酸の発現を制御する制御調節配列を有する、請求項４に記載の発現ベクター。
  6. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のコドン最適化核酸を有する組換え宿主細胞。
  7. 宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
  8. 宿主細胞がヒト細胞である、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
  9. 宿主細胞が非ヒト哺乳類細胞である、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
  10. 下記(i)〜(iii)の工程を有するアポクライティン-IIタンパク質の製造方法。
    請求項１〜３のいずれか１項に記載のコドン最適化核酸を、宿主細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程
    （ii）該組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する工程
    （iii）当該宿主細胞を培養し、前記コドン最適化核酸がコードするアポクライティン-IIタンパク質を発現させる工程
  11. 下記(i)〜(iii)の工程を有するクライティン-IIタンパク質の製造方法。
    請求項１〜３のいずれか１項に記載のコドン最適化核酸を、宿主細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程
    （ii）該組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する工程
    （iii）当該宿主細胞をセレンテラジンの存在下に培養し、前記コドン最適化核酸がコードするアポクライティン-IIタンパク質を発現させるとともに、該アポクライティン-IIタンパク質をクライティン-IIに変換させる工程
  12. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のコドン最適化核酸と、当該核酸を発現し得る制御調節核酸とが結合した核酸を、宿主細胞に導入することを特徴とする、クライティン-IIの発光強度増強方法。
  13. 宿主細胞におけるクライティン-IIの発光強度を増強させるための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコドン最適化核酸の使用。
  14. 請求項６〜９のいずれか１項に記載の宿主細胞を、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体と接触させ、次いで、発生した光量を測定することを特徴とする、活性化時の細胞内カルシウム流動の変化を仲介する受容体を阻害する化合物の能力測定方法。
  15. さらに、受容体阻害の能力を記録する、請求項１４に記載の方法。
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