ES2375610T3 - Fotoproteina mtciclina aislada y su uso. - Google Patents
Fotoproteina mtciclina aislada y su uso. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2375610T3 ES2375610T3 ES04764797T ES04764797T ES2375610T3 ES 2375610 T3 ES2375610 T3 ES 2375610T3 ES 04764797 T ES04764797 T ES 04764797T ES 04764797 T ES04764797 T ES 04764797T ES 2375610 T3 ES2375610 T3 ES 2375610T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- photoprotein
- nucleic acid
- mtclitin
- sequence
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 14
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 13
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 13
- 241001126328 Clytia gregaria Species 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 4
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 241001102657 Obelia geniculata Species 0.000 description 3
- 241000512291 Pholas dactylus Species 0.000 description 3
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001326175 Aequorea macrodactyla Species 0.000 description 1
- 241001343373 Aequorea parva Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241001126333 Campanulariidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 241000286904 Leptothecata Species 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001429712 Mitrocoma cellularia Species 0.000 description 1
- 101710128071 Mitrocomin Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101000982592 Obelia geniculata Obelin Proteins 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241001481152 Sthenoteuthis oualaniensis Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000005669 field effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000989 food dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 1
- 230000003760 hair shine Effects 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N morin Natural products OC1=CC(O)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 229940034610 toothpaste Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos divulgada por la SEC ID Nº 2; y b) moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la SEC ID N 1 :
Description
Fotoproteína mtCiclina aislada y su uso
La invención se refiere a la fotoproteína mtClitina, a sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, y a la actividad y uso de la fotoproteína mtClitina.
5 Fotoproteínas
La bioluminiscencia se refiere al fenómeno de generación de luz por los organismos vivos. Es el resultado de reacciones bioquímicas en células, reacciones en las que la energía química se emite en forma de cuantos de luz (que también se denomina emisión fría por quimioluminiscencia). La luz generada de este modo es monocromática, ya que se emite durante una transferencia de electrones discretos, pero se puede desplazar a regiones del espectro
10 de mayor longitud de onda mediante pigmentos luminiscentes secundarios (por ejemplo, proteínas fluorescentes en medusas luminiscentes del género Aequora).
La función biológica es múltiple: a una profundidad marina de entre 200 y 1000 m (región mesopelágica), aproximadamente el 90 % de todos los organismos vivos brilla. Aquí, las señales luminiscentes se emplean para atraer a la pareja, como engaño y como cebo. Los gusanos brillantes y las luciérnagas también explotan las señales 15 de luz para atraer a la pareja. Por el contrario, el significado de la luminiscencia de las bacterias, hongos y algas monocelulares no está claro. Se supone que se usa para coordinar muchos individuos únicos de una gran población
o constituye una clase de reloj biológico.
Un gran número de celentéreos son bioluminiscentes (Morin y col., 1974). Estos organismos emiten luz azul o verde. La aecuorina, que deriva de Aequoria victoria y que, en 1962, fue la primera proteína productora de luz que se 20 identificó (Shimomura et al., 1969), emitió, como proteína aislada, una luz azul y no una luz verde como se observó fenotípicamente en el caso de Aequoria victoria. Más tarde, se aisló la proteína verde fluorescente (GFP) de Aequoria victoria, proteína que hace que la medusa aparezca fenotípicamente verde como resultado de la excitación mediante acuorina (Johnson y col., 1962; Hastings y col., 1969; Inouye y col., 1994). Otras fotoproteínas que también se han identificado y descrito son clitina (Inouye y col., 1993), mitrocomina (Fagan y col., 1993) y obelina
25 (Illarionov y col., 1995).
Tabla 1: Resumen de algunas fotoproteínas. En la tabla se proporcionan el nombre, el organismo del que se ha aislado la proteína y el número de identificación (Nº Reg.) de la entrada en la base de datos.
- Nombre
- Organismo Nº de identificación
- Obelina
- Obelia geniculata AAL86372
- Clitina
- Clytia gregaria CAA49754
- Acuorina
- Aequorea macrodactyla AAK02061
- Acuorina
- Aequorea parva AAK02060
- Mitrocomina
- Mitrocoma cellularia AAA29298
- Folasina
- Pholas dactylus AAM18085
- ?
- Symplectoteuthis oualaniensis AX305029
Tabla 2: Resumen de algunas fotoproteínas. En la tabla se proporcionan el organismo del que se ha aislado la proteína, el nombre de la fotoproteína y una selección de patentes o solicitudes.
- Organismo
- Proteína fluorescente Patente/Solicitud
- Obelia geniculata
- Obelina WO03006497
- Clytia gregaria
- Clitina WO03006497
- Aequoria victoria
- Acuorina WO200168824 US-0908909 US 6,152,358 JP-0176125
- Pholas dactylus
- Folasina WO0028025 GB-0024357
Actualmente, la bioluminiscencia se usa en la tecnología de muchos modos, por ejemplo en forma de bioindicadores de contaminación o en bioquímica para la detección sensible de proteínas, para la determinación cuantitativa de compuestos específicos o como lo que se conoce como “indicador” en el estudio de la regulación génica en células.
Las fotoproteínas no solo difieren en sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, sino también en sus propiedades bioquímicas y físicas.
Se ha demostrado que las propiedades físicas y bioquímicas de las fotoproteínas se pueden modificar a través de la alteración de la secuencia de aminoácidos. En la literatura se describen ejemplos de fotoproteínas mutageneizadas (documentos se 6.495.355; US 5.541.309; US 5.093.240; Shimomura y col., 1986).
Las fotoproteínas mencionadas anteriormente generan luz oxidando la coelentarazina (Haddock y col., 2001; Jones y col., 1999).
Markeva SV y col., Biochemistry, Volumen 41, Nº 7, 19 de febrero de 2002, páginas 2227-2236, divulgan la clonación, el análisis de la secuencia y la expresión de la proteína obelina del hidroide pelagial bioluminiscente Obelia geniculata. El documento WO 91/01305 describe proteínas bioluminiscentes y su uso como marcadores/indicadores, entre otras, las fotoproteínas acuorina y obelina (página 7, líneas 17-21). El documento también describe la posibilidad de unión de las proteínas mencionadas anteriormente a un péptido señal para el transporte al interior de los orgánulos celulares, tales como, por ejemplo, la mitocondria o el retículo endoplásmico (página 8, líneas 9-26).
Dunstan SL y col., Journal of Biological Chemistry, Volumen 275, Nº 13, 31/3/2000, páginas 9403-9409, divulga la fotoproteína folasina de Pholas dactylus, que contiene un péptido señal natural con 20 aminoácidos para la secreción de la proteína (resumen, página 9407, columna de la derecha, líneas 14-16).
El término gen indicador se refiere, en general, a genes cuyos productos génicos pueden detectarse fácilmente usando sencillos procedimientos bioquímicos o histoquímicos. Se puede distinguir entre al menos 2 tipos de genes indicadores.
- 1.
- Genes de resistencia. La expresión genes de resistencia se refiere a genes cuya expresión confiere, sobre una célula, resistencia a antibióticos u otras sustancias cuya presencia en el medio de crecimiento produce la muerte de la célula si el gen de resistencia no está.
- 2.
- Genes indicadores. En la manipulación genética, los productos de los genes indicadores se usan en forma de indicadores condensados o no condensados. Entre los genes indicadores más usados se incluyen los de la beta-galactosidasa (Alam y col., 1990), fosfatasa alcalina (Yang y col., 1997; Cullen y col., 1992), luciferasas y otras fotoproteínas (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne y col., 1984).
La luminiscencia se refiere a la emisión de fotones en el intervalo del espectro visible, efectuándose mediante moléculas emisoras excitadas. En contraste con la fluorescencia, aquí, la energía no se suministra desde el exterior en forma de radiación de una longitud de onda más corta.
Se establece una distinción entre quimioluminiscencia y bioluminiscencia. Una reacción química que tiene como resultado una molécula excitada que brilla cuando los electrones excitados vuelven al estado basal se denomina quimioluminiscencia. Si esta reacción es catalizada por una enzima, el fenómeno se denomina bioluminiscencia. Las enzimas implicadas en la reacción se denominan, en general, luciferasas.
Clasificación de la especie Clytia gregaria
Cnidaria • Leptomedusae • Campanulariidae • Clytia gregaria
La especie Clytia gregaria pertenece a los cnidarios, específicamente a las medusas. El fenotipo bioluminiscente o fluorescente ya se describió en 1998 (Ward y col., 1998).
Para Investigar la actividad bioluminiscente de la especie Clytia gregaria, se obtuvieron especimenes en el Mar Blanco (Estación Biológica de Kartesh, Rusia) y se almacenaron en nitrógeno líquido. Para establecer las bibliotecas de ADNc de Clytia gregaria, se aisló el poli(a)+ARN con la ayuda del procedimiento de aislamiento “Straight A” de Novagen (EE.UU.).
Para preparar en ADNc se llevó a cabo una PCR-RT. Con este fin, se incubó 1 µg de ARN con la transcriptasa inversa (Superscribt Gold II) de acuerdo con el esquema siguiente:
PCR 1. 30 segundos 95 °C
- 2.
- 6 minutos 68 °C
- 3.
- 10 segundos 95 °C
- 4.
- 6 minutos 68 °C
17 ciclos de la etapa 4 después de la etapa 3
Para inactivar la polimerasa, los productos de reacción se incubaron durante 30 minutos con proteinasa K a 37 ºC y el ADNc se precipitó con etanol. La expresión de la biblioteca de ADNc se llevó a cabo con la ayuda del “kit de construcción de bibliotecas de ADNc SMART” de Clontech (EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc se clonó en el vector de expresión pTriplEx2 (Clontech; EE.UU.). Los vectores de expresión se transformaron mediante electroporación en bacterias de la cepa E. coli XL1-Blue.
Las bacterias se sembraron en placas con medio nutritivo LB sólido y se incubaron durante 24 horas a 37 ºC. Después, se repitió la siembra en placas transfiriendo las bacterias a otra placa con medio nutritivo sólido usando un filtro de nitrocelulosa. La placa duplicada, a su vez, se incubó durante 24 horas a 37 ºC y las colonias bacterianas que habían crecido se transfirieron a medio líquido LB. Después de la adición de IPTG (concentración final 0,1 mM), las bacterias se incubaron durante 4 horas a 37 ºC en un agitador. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación y la biomasa bacteriana se resuspendió a 0 ºC en 0,5 ml de tampón de alteración (EDTA 5 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 9,0) a 0 ºC. Las bacterias se rompieron después mediante sonicación.
Tras la adición de coelenterazina (concentración final 10E-07 M), los lisados se incubaron durante 3 horas a 4 ºC. Después, se midió la bioluminiscencia usando un luminómetro, tras la adición de cloruro cálcico (concentración final 20 mM).
Se identificó una fotoproteína. La fotoproteína se denominó mtClitina. La fotoproteína mtClitina se describe con detalle más adelante en el presente documento.
Con una identidad del 87 %, la fotoproteína mtClitina muestra el grado más elevado de homología a nivel de aminoácidos con la clitina de Clytia gregaria, y una identidad del 77 % con obelina de Obelia geniculata (mostrado en el ejemplo 8, Figura 8). La homología del 87 %, en relación con la clitina, se revela en el extremo C de la proteína, identificándose múltiples sustituciones de aminoácidos, distribuida por toda la proteína. A nivel de ácido nucleico, la identidad es inferior al 30 % (mostrado en el Ejemplo 7; Figura 7). Para comparar la secuencia se usó el procedimiento BLAST (Altschul y col., 1997).
La fotoproteína mtClitina tiene un péptido señal que puede conducir a la translocación de la fotoproteína al interior de las mitocondrias. El péptido señal se identificó mediante el programa informático MITOPROT (Claros y col., 1996) (mostrado en el Ejemplo 10). El péptido señal identificado mediante MITOPROT se muestra en la SEC ID Nº 3. La fotoproteína mtClitina es la primera fotoproteína en la que se identificó un péptido señal natural para la translocación a las mitocondrias.
También se describen equivalentes funcionales de la mtClitina. Equivalentes funcionales son las proteínas que tienen propiedades fisicoquímicas comparables y que tienen una homología de al menos un 70 % con la SEC ID Nº
2. Se prefiere una homología de al menos un 80 % o un 90 %. Especialmente preferida es una homología de al menos un 95 %.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como gen indicador para los sistemas celulares, específicamente para receptores, canales iónicos, transportadores, factores de transcripción o para sistemas inducibles.
Como fusión con genes indicadores, el péptido señal de la mtClitina es también adecuado como gen indicador condensado para los sistemas celulares, específicamente para receptores, canales iónicos, transportadores, factores de transcripción o para sistemas inducibles.
La fotoproteína mtClitina también es adecuada como gen indicador mediante marcaje, identificación y caracterización de orgánulos celulares, especialmente para mitocondrias.
La fotoproteína mtClitina también es adecuada como gen indicador para determinar parámetros dentro y fuera de orgánulos celulares, específicamente mitocondrias, específicamente las concentraciones de calcio.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como gen indicador en sistemas bacterianos y eucariotas, específicamente en células de mamífero, en bacterias, en levaduras, en baculovirus, en plantas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como gen indicador para sistemas celulares en combinación con sistemas bioluminiscentes o quimioluminiscentes, específicamente sistemas con luciferasas, con oxigenasas, con fosfatasas.
Como proteína de fusión, la fotoproteína mtClitina es adecuada específicamente para receptores, canales iónicos, transportadores, factores de transcripción, proteinasas, quinasas, fosfodiesterasas, hidrolasas, peptidasas, transferasas, proteínas de membrana y glicoproteínas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para su inmovilización, específicamente mediante anticuerpos, mediante biotina o mediante soportes magnéticos o magnetizables.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como proteína para sistemas de transferencia de energía, especialmente sistemas FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia), BRET (transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia), FET (transistores de efecto de campo), FP (polarización de fluorescencia), HTRF (fluorescencia resuelto por tiempo homogéneo).
La fotoproteína mtClitina es adecuada para marcar sustratos o ligandos, específicamente para proteasas, para quinasas, para transferasas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para expresar en sistemas bacterianos, específicamente para la determinación de títulos, como sustrato para sistemas bioquímicos, específicamente para proteinasas y quinasas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador, específicamente acoplado a anticuerpos, acoplado a enzimas, acoplado a receptores, acoplado a canales iónicos y a otras proteínas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como gen indicador en la búsqueda de compuestos farmacológicos activos, específicamente en HTS (detección selectiva de alto rendimiento).
La fotoproteína mtClitina es adecuada como componente de sistemas de detección, específicamente para ensayos ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzimas), para inmunohistoquímica, para transferencias de tipo Western, para microscopia confocal.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador para analizar las interacciones, específicamente para interacciones proteína-proteína, para interacciones ADN-proteína, para interacciones ADN-ARN, para interaccionesARN-ARN, para interacciones ARN-proteínas (ADN: �?cido desoxirribonucleico; ARN: ácido ribonucleico).
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador o proteína de fusión para su expresión en organismos transgénicos, específicamente en ratones, en ratas, en hámsteres, en otros mamíferos, en primates, en peces, en gusanos, en plantas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador o proteína de fusión para analizar el desarrollo embrionario.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador a modo de un mediador de acoplamiento, específicamente mediante biotina, mediante NHS (N-hidroxisulfosuccimida), mediante CN-Br.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como indicador que está acoplado a ácidos nucleicos, específicamente a ADN
o ARN.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como indicador que está acoplado a proteínas o péptidos.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como indicador para medir las concentraciones de calcio intracelulares o extracelulares.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para caracterizar cascadas de señales en sistemas celulares.
La fotoproteína mtClitina, acoplada a ácidos nucleicos o péptidos, es adecuada como sonda, específicamente para transferencias de tipo Northern, para transferencias de tipo Southern, para transferencias de tipo Western, para ELISA, para secuenciación de ácido nucleico, para análisis de proteínas o para análisis en circuitos.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para marcar formulaciones farmacológicas, específicamente agentes infecciosos, anticuerpos, “moléculas pequeñas”.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para investigaciones geológicas, especialmente para aguas pelágicas, aguas subterráneas y corrientes fluviales.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para su expresión en sistemas de expresión, específicamente en sistemas de traducción in vitro, en sistemas bacterianos, en sistemas de levaduras, en sistemas de baculovirus, en sistemas víricos, en sistemas eucarióticos.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para visualizar tejidos o células en relación con intervenciones quirúrgicas, específicamente en el caso de intervenciones invasivas, no invasivas, mínimamente invasivas.
La fotoproteína mtClitina es también adecuada para marcar tejidos tumorales y otros tejidos alterados fenotípicamente, específicamente en investigación hidrológica y en relación con intervenciones quirúrgicas
También se describe la purificación de la fotoproteína mtClitina, específicamente como la proteína silvestre, como una proteína de fusión, como proteína mutageneizada.
También se describe la purificación del péptido señal de mtClitina, específicamente como la proteína silvestre, como una proteína de fusión, como proteína mutageneizada.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina en el campo de la cosmética, específicamente aditivos para el baño, lociones, jabones, pinturas corporales, pasta de dientes, polvos corporales.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina para pigmentar específicamente colorantes alimentarios, aditivos para baño, tinta, materiales textiles y plásticos.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina para pigmentar papel, específicamente tarjetas de felicitación, productos de papel, papel de empapelar y artículos artesanía.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina para pigmentar líquidos, específicamente para pistolas de agua, fuentes, bebidas, hielo.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina para la producción de juguetes, específicamente pintura para dedos y maquillaje.
La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido divulgado por la SEC ID Nº 2.
La invención se refiere al polipéptido con la secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC ID Nº 2.
También se describen moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos divulgada por la SEC ID Nº 2; b) las moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la SEC ID N 1; c) las moléculas de ácido nucleico cuya hebra complementaria hibrida con una molécula de ácido nucleico de a) o b) en condiciones rigurosas y que codifican un polipéptido que exhibe la función biológica de una fotoproteína; Se puede efectuar una hibridación rigurosa de moléculas de ácido nucleico en, por ejemplo, una solución acuosa que comprende 0,2 x SSC (1 x solución salina estándar-citrato= NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM) a 68 ºC (Sambrook y col., 1989). d) moléculas de ácido nucleico que difieren de las moléculas de ácido nucleico mencionadas en c) como resultado de la degeneración del código genético; e) las moléculas de ácido nucleico que exhiben una homología de secuencia de al menos 95 % con la SEC ID N 1 y cuyo producto proteico tiene la función biológica de una fotoproteína; y f) las moléculas de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de al menos 65 % con la SEC ID N 1 y cuyo producto proteico tiene la función biológica de una fotoproteína.
También se describen moléculas de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de al menos 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 % o 60 % con la SEC ID N 1 y que codifican un polipéptido que tiene las propiedades de una fotoproteína.
La invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención en las que la secuencia contiene un promotor funcional en 5’ de la secuencia codificadora de la fotoproteína o de la secuencia de codificación de la secuencia líder, o secuencia señal.
La invención también se refiere a las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que son un componente de vectores de ADN o ARN recombinantes.
La invención se refiere a organismos no humanos que contienen dicho vector.
La invención se refiere a fotoproteínas que están codificadas por las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención.
La invención se refiere a procedimientos de expresión de los polipéptidos de fotoproteína de acuerdo con la invención en bacterias, en células eucariotas o en sistemas de expresión in vitro.
Se describen péptidos que tienen más de 5 aminoácidos consecutivos que son reconocidos inmunológicamente por anticuerpos contra las fotoproteínas de acuerdo con la invención.
La invención se refiere al uso de los ácidos nucleicos que codifican fotoproteínas de acuerdo con la invención como genes marcadores o genes indicadores, en particular para buscar compuestos farmacológicos activos y para diagnóstico.
La invención se refiere al uso de las fotoproteínas de acuerdo con la invención o a un ácido nucleico que codifica la fotoproteína de acuerdo con la invención como marcador o indicador o como gen marcador o gen indicador.
La invención se refiere al uso de la fotoproteína mtClitina (SEC ID Nº 2) o al uso de un ácido nucleico que codifica la fotoproteína mtClitina como marcador o indicador, o como gen marcador o gen indicador, en particular para buscar compuestos farmacológicos activos y para diagnóstico.
La invención se refiere al uso del ácido nucleico mostrado en la SEC ID Nº 1 como gen marcador o indicador, en particular para buscar compuestos farmacológicos activos y diagnósticos.
También se describen anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen un polipéptido de acuerdo con la invención.
También se describen anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen un la fotoproteína mtClitina (SEC ID Nº 2).
Expresión de las fotoproteínas de acuerdo con la invención
Expresión se refiere a la generación de una molécula que, después de que se ha introducido el gen en una célula huésped adecuada, permite que el gen heterólogo que se clona en un vector de expresión se transcriba y se traduzca. Los vectores de expresión contienen las señales control requeridas para expresar genes en células procariotas o eucariotas.
En principio, los vectores de expresión se pueden interpretar de dos modos diferentes. En el caso de lo que se denomina fusiones de transcripción, la proteína codificada por el gen heterólogo clonado se sintetiza como una proteína auténtica biológicamente activa. Con este fin, el vector de expresión porta todas las señales de control en 5’ y 3’ para expresión.
En el caso de lo que se denomina fusiones de traducción, la proteína codificada por el gen heterólogo clonado se expresa como proteína híbrida junto con otra proteína que se puede detectar fácilmente. Las señales control en 5’ y 3’, que son necesarias para la expresión, incluido el codón de iniciación y, posiblemente, algunas de las secuencias que codifican las regiones en N-terminal de la proteína híbrida que se va a formar, se originan del vector. El resto proteico insertado adicional, en muchos casos, no solo estabilizará la proteína codificada por el gen heterólogo clonado contra la degradación por acción de las proteasas celulares, sino también se puede usar para detectar y aislar la proteína híbrida formada. La expresión puede tener lugar de forma temporal o estable. Los organismos huésped adecuados no solo son bacterias, levaduras y virus, sino también sistemas eucarióticas.
Purificación de las fotoproteínas de acuerdo con la invención
El aislamiento de las proteínas (incluido después de su sobreexpresión) con frecuencia se denomina purificación de proteínas. Se dispone de un gran número de técnicas y procedimientos establecidos para purificar proteínas.
La separación de sólidos/líquidos es una operación básica en relación con el aislamiento de las proteínas. Esta etapa del procedimiento es necesaria para separar las células del medio de cultivo, para aclarar el extracto bruto después de la rotura de las células y eliminación de los residuos celulares y para separar los sedimentos después de las precipitaciones, y similares. Se realiza mediante centrifugación y filtración.
Para obtener proteínas intracelulares, la pared celular se debe destruir o hacer permeable. Con este fin se usan homogeneizadores de presión alta o molinos de bolas con agitación o molinos de esferas de cristal, en función de la escala y del organismo. Los tratamientos de integración celular mecánica y de sonicación se usan, entre otras, a escala de laboratorio.
Tanto en el caso de proteínas extracelulares como en el caso de proteínas intracelulares (tras la rotura de la célula), varios procedimientos de precipitación que usan sales (en particular sulfato amónico) o disolventes orgánicos (alcoholes o acetonas) representan procedimientos rápidos y eficientes para concentrar proteínas. Cuando se purifican proteínas intracelulares, es deseable eliminar los ácidos nucleicos solubles (precipitación con, por ejemplo, sulfato de estreptomicina o sulfato de protamina). Cuando se aíslan proteínas extracelulares, con frecuencia se añaden transportadores (por ejemplo almidón, kieselguhr) antes de añadir los agentes de precipitación con el fin de obtener precipitados que sean más fáciles de manipular.
Se dispone de numerosos procedimientos cromatográficos y procedimientos de reparto (Cromatografía de absorción, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía de afinidad, electroforesis) para purificación de alto grado. La cromatografía en columna también se usa a escala industrial. La cromatografía de afinidad, que hace posible factores de purificación de hasta varias centenas por etapa, es especialmente importante para las operaciones a escala de laboratorio.
Las proteínas extracelulares se generan en soluciones relativamente diluidas. Como las proteínas extracelulares, deben concentrarse antes de usar. Además de los procedimientos que ya se han mencionado, se ha demostrado que la ultrafiltración era valiosa, incluida a escala industrial.
Sales inorgánicas que acompañan a las proteínas son, con frecuencia, indeseables para aplicaciones específicas. Se pueden eliminar mediante, entre otros, filtración en gel, diálisis y diafiltración.
Un gran número de proteínas se usan como preparaciones secas. Procedimientos de secado importantes son secado al vacío, liofilizado y secado por pulverización.
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos
La fotoproteína de mtClitina está codificada por la siguiente secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 1):
Esto conduce a una secuencia de aminoácidos de (SEC ID Nº 2):
10 El supuesto péptido señal de la fotoproteína mtClitina tiene la siguiente secuencia (SEC ID Nº 3):
y la siguiente secuencia de ácidos nucleicos:
Estas secuencias también se encuentran en el listado de secuencias.
Figura 1: La Figura 1 muestra el mapa plasmídico del vector pTrip1EX2-mtClitina.
Figura 2: La Figura 2 muestra el mapa plasmídico del vector pcDNA3-mtClitina.
Figura 3: La Figura 3 muestra el resultado de la expresión bacteriana de metclitina y la actividad de
bioluminiscencia de la mtClitina tras la expresión bacteriana. (Y = ULR: unidades lumínicas 20 relativas; X) dilución; barras negras= mtClitina; barras grises= lisado control).
Figura 4: La Figura 4 muestra el resultado de la expresión eucariótica de mtClitina y la actividad de bioluminiscencia de la mtClitina tras la expresión en células CHO. (Y = ULR: unidades lumínicas relativas; X= ATP (representación logarítmica en mol/l)).
Figura 5: La Figura 5 muestra el análisis cinético de la bioluminiscencia de la mtClitina (Y= ULR: unidades 25 lumínicas relativas; X= tiempo [segundos]).
Figura 6: La Figura 6 muestra el análisis cinético de la bioluminiscencia de la obelina (Y= ULR: unidades
lumínicas relativas; X= tiempo [segundos]). Figura 7: La Figura 7 muestra la alineación de clitina y mtClitina a nivel de aminoácidos. Figura 8: La Figura 8 muestra la alineación de clitina y mtClitina a nivel de ácido nucleico. Figura 9: La Figura 9 muestra la alineación de clitina, mtClitina y clitina-2 a nivel de aminoácidos.
Ejemplos
Ejemplo 1
El vector usado para la preparación de la construcción mostrada más adelante en el presente documento fue el plásmido pTrip1Ex2 de Clontech. El derivado del vector se designó pTrip1Ex2-mtClitina. El vector pTrip1Ex2mtClitina se usó para expresar mtClitina en sistemas bacterianos.
La Figura 1 muestra el mapa plasmídico del vector pTrip1EX2-mtClytin.
Ejemplo 2
El vector usado para la preparación de la construcción mostrada más adelante en el presente documento fue el plásmido pcDNA3.1(+) de Clontech. El derivado del vector se designó pcDNA3-mtClitina. El vector pcDNA3-mtClitina se usó para expresar mtClitina en sistemas eucarióticas.
La Figura 2 muestra el mapa plasmídico del vector pcDNA3-mtClytin.
Ejemplo 3
Expresión bacteriana
La expresión bacteriana se realizó en la cepa de E. coli BL21(DE3) transformando las bacterias con los plásmidos de expresión pTrip1EX2-mtClitina y pTrip1EX2. Las bacterias transformadas se incubaron durante 3 horas en medio LB a 37 ºC y se indujo la expresión durante 4 horas añadiendo IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Las bacterias inducidas se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en Tris/HCl 50 mM (pH 9,0) + EDTA 5 mM y se rompieron mediante sonicación. El lisado se centrifugó después durante 15 minutos a 13.000 revoluciones por minuto (16.000 rcf) y se eliminó el sobrenadante. El sobrenadante (diluciones 1:5; 1:10; 1:20 y 1:50 con Tris/HCl pH 9,0)) se incubó con celenterazina (celentereazina 10E-07 M en Tris/HCl pH 9,0) durante 3 horas en oscuridad. Directamente después de la adición de cloruro cálcico 5 mM, se midió la bioluminiscencia en un luminómetro. El tiempo de integración de la medición fue de 40 segundos.
La Figura 3 muestra los resultados de medir la bioluminiscencia de la mtClitina en bacterias.
Ejemplo 4
Expresión eucariótica
La expresión eucariótica constitutiva se llevó a cabo en células CHO transfeccionando las células con los plásmidos de expresión pcDNA3-mtClytin y pcDNA3.1(+) en experimentos transitorios. Con este fin, 10.000 células se sembraron en placas por pocillo en medio DMEM-F12, en placas de microtitulación de 96 pocillos y las placas se incubaron durante la noche a 37 ºC. La transfección se realizó usando el kit Fugene 6 (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células transfeccionadas se incubaron durante la noche en medio DMEM-F12 a 37 ºC. Después, el medio se retiró y sustituyó con 50 µl de celenterazina (celenterazina 10E-07M en PBS). Las células se incubaron durante 3 horas a 37 ºC y, después, se añadió ATP (adenosina trifosfato) hasta una concentración final de 1 µM. La medición en el luminómetro se inició directamente después de la adición. El tiempo de integración fue de 1 segundo, con un tiempo de medición total de 60 segundos.
La Figura 4 muestra los resultados de medir la bioluminiscencia de la mtClitina en células CHO.
Ejemplo 5
BLAST
Resultado de un análisis BLAST de mtClitina a nivel de aminoácidos.
Ejemplo 6
BLAST
Resultado de un análisis BLAST de mtClitina a nivel de ácido nucleico:
Ejemplo 7
La Figura 7 muestra la alineación de mtClitina y clitina (Clytia gregaria) a nivel de ácido nucleico.
Ejemplo 8
10 La Figura 8 muestra la alineación de mtClitina y clitina (Clytia gregaria) a nivel de aminoácidos.
Ejemplo 9
Análisis cinético de mtClitina
Para llevar a cabo el análisis cinético de la bioluminiscencia de mtClitina, las células CHO se transfeccionaron de forma transitoria con pcDNA3-mtClitina o pcDNA-obelina o pcDNA3 (sin ADNc integrado). La transfección y la 5 medición se llevaron a cabo como se ha descrito para el Ejemplo 4, Las lecturas se tomaron en un periodo de 60 segundos, con un tiempo de integración de 1 segundo.
Las Figuras 5 y 6 muestran los resultados del análisis cinético de mtClitina y obelina.
Ejemplo 10
Análisis MITOPROT
10 Se usó el programa informático MITOPROT para analizar el péptido señal de mtClitina (Claros y col., 1996). Se analizaron las siguientes fotoproteínas: obelina (Q27709), aecuorina (P07164), clitina (Q08121) y mtClitina (SEC ID Nº 2).
Resultados de los análisis: Obelina: 15 Nombre de la secuencia: OBELINA Longitud de la secuencia inicial: 196 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS Carga neta de la secuencia de búsqueda: -11 Región analizada: Número de residuos básicos en la secuencia destino:
3 Número de residuos ácidos en la secuencia destino: 0 Sitio de escisión: no predecible Secuencia escindida: -
ESCALA HIDROFÓBICA USADA GES KD GVH1 ECS H17: -0.624 0.259 -0.30S 0.295
- GES
- KD GVH1 ECS
- MesoH :
- -1,573 -0,241 -0,642 0,060
- MuHd_075:
- 14,019 3,641 4,408 1,523
- MuHd_095:
- 7,994 7,898 3,285 1,838
- MuHd_100:
- 13,734 9,836 5,597 2,742
- MuHd_105:
- 21,195 11,755 7,339 4,117
- Hrnax_075 :
- -9,450 -2,800 4,008 1 132
- Hrnax_095 :
- -0,963 1,837 -1,971 1,103
- Hrnax_100 :
- 0,400 1,300 -1,942 2,240
- Hmax_105 :
- 10,617 6,067 0,733 3,127
PROBABILIDAD
de exportación a la mitocondria: 0,1479
Aecuorina:
Nombre de la secuencia: AECUORINA Longitud de la secuencia inicial: 196 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS Carga neta de la secuencia de búsqueda: -13 Región analizada: 3 Número de residuos básicos en la secuencia destino:
0 Número de residuos ácidos en la secuencia destino: 0 Sitio de escisión: no predecible Secuencia escindida: -
ESCALA HIDROFÓBICA USADA
GES KD GVH1 ECS H17: 0,006 0,794 -0,263 0,368 MesoH : -1,673 -0,382 -0,703 0,048 MuHd_075: 24,326 4,153 5,947 2,450 MuHd_095: 12,638 7 213 4,218 1,796 MuHd_100 : 13,748 8,827 4,477 2,427 MuHd_105: 16,581 11,426 5,056 3,463 Hmax_075 : 0,438 0,233 -2,490 1,692 Hmax_095 : 0,525 -1,400 -2,394 0,674 Hmax_100 : -0,100 -1,200 -2,292 1,550 H max_105: 0,500 -0,000 -2,164 1,540
PROBABILIDAD de exportación a la mitocondria: 0,0148
Clitina:
- Nombre de la secuencia: CLITINA
- Longitud de la secuencia inicial: 198 aa
- VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS
- Carga neta de la secuencia de búsqueda:
- -11
- Región analizada:
- 11
- Número de residuos básicos en la secuencia destino:
- 3
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS
Número de residuos ácidos en la secuencia destino: Sitio de escisión: no predecible
- Secuencia escindida:
- ESCALA HIDROFÓBICA USADA
- GES
- KD GVH1 ECS
- H17:
- -0,624 0,259 -0,308 0,295
- MesoH :
- -1,573 -0,241 -0,642 0,060
- MuHd_075
- 14,019 3,641 4,408 1,523
- MuHd_095
- 7,994 7,698 3,285 1,638
- MuHd_100
- 13,734 9,836 5,597 2,742
- MuHd_105
- 21,195 11,755 7,339 4,117
- Hmax_075
- -9,450 -2,800 -4,008 1,132
- Hmax_095
- -0,963 1,837 -1,971 1,103
- Hmax_100
- 0,400 1,300 -1,942 2,240
- Hmax_105
- 10,617 6,067 0,733 3,127
- PROBABILIDAD
- de exportación a la mitocondria: 0,1479
Aecuorina: Hmax_105 0,500 -0,000 -2,164 1,540
- Nombre de la secuencia: AECUORINA
- Longitud de la secuencia inicial: 196 aa
- VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS
- Carga neta de la secuencia de búsqueda:
- -13
- Región analizada:
- 3
- Número de residuos básicos en la secuencia destino:
- 0
- Número de residuos ácidos en la secuencia destino:
- 0
- Sitio de la escisión:
- no predecible
- Secuencia escindida:
- ESCALA HIDROFÓBICA USADA
- GES
- KD GVH1 ECS
- H17:
- 0,006 0,794 -0,263 0,368
- MesoH :
- -1,673 -0,382 -0,703 0,048
- MuHd_075
- 24,326 4,153 5,947 2,450
- MuHd_095
- 12,638 7,213 4,218 1,796
- MuHd_100
- 13,748 8,827 4,477 2,427
- MuHd_105
- 16,581 11,426 5,056 3,453
- Hmax_075
- 0,438 0,233 -2,490 1,692
- Hmax_095
- -0,525 -1,400 -2,394 0,674
- Hmax_100
- -0,100 -1,200 -2,292 1,560
PROBABILIDAD
de exportación a la mitocondria: 0,0148
Clitina:
Nombre de la secuencia: CLITINA Longitud de la secuencia inicial: 198 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS Carga neta de la secuencia de búsqueda: -9 Región analizada: 32 Número de residuos básicos en la secuencia destino: 6 Número de residuos ácidos en la secuencia destino: 2 Sitio de la escisión: no predecible Secuencia escindida: ESCALA HIDROFÓBICA USADA
GES KD GVH1 ECS H17: -0,429 0,341 -0,313 0,313 MesoH : -1,778 -0,307 -0,718 0,053 MuHd_075 32,928 17,509 7,351 5,708 MuHd_095 30,874 20,344 9,074 5,834 MuHd_100 36,596 22,666 10,051 6,762 MuHd_105 39,174 19,336 10,379 7,609 Hmax_075 4,900 7,087 -1,223 3,684 Hmax_095 13,600 10,100 1,261 4,390 H max_100 14,000 12,600 1,601 5,060 Hmax_105 6,650 13,067 -0,468 3,920
PROBABILIDAD de exportación a la mitocondria: 0,2047 Clitina-2: Nombre de la secuencia: CLITINA-2 Longitud de la secuencia inicial: 198 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS Carga neta de la secuencia de búsqueda: -7 Región analizada: 16 Número de residuos básicos en la secuencia destino: 3 Número de residuos ácidos en la secuencia destino: 1 Sitio de la escisión: no predecible
- Secuencia escindida:
- ESCALA HIDROFÓBICA USADA
- GES
- KD GVH1 ECS
- H17:
- -0,288 0,341 -0,213 0,313
- MesoH :
- -1,519 -0,206 -0,681 0,081
- MuHd_075
- 32,594 15,092 8,192 4,075
- MuHd_095
- 36,090 19,707 8,836 6,716
- MuHd_100
- 38,617 20,269 9,682 6,851
- MuHd_105
- 30,267 16,082 8,229 5,470
- Hmax_075
- 6,533 6,417 -0,793 2,508
- Hmax_095
- 13,600 10,100 1,251 4,390
- Hmax_100
- 13,600 10,100 1,251 4,390
- Hmax_105
- 13,417 10,150 1,612 3,862
- PROBABILIDAD
- de exportación a la mitocondria: 0,3974
- mtClitina:
- Nombre de la secuencia: mtClitina
- Longitud de la secuencia inicial: 228 aa
- VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS
- Carga neta de la secuencia de búsqueda:
- -8
- Región analizada:
- 34
- Número de residuos básicos en la secuencia destino:
- : 6
- Número de residuos ácidos en la secuencia destino:
- 0
- Sitio de la escisión:
- 17
- Secuencia escindida:
- MQRFTNRLLSMSALRA
- ESCALA HIDROFÓBICA USADA
- GES
- KD Gvm ECS
- H17:
- -0,135 0,453 -0,343 0,309
- MesoH :
- -1,623 -0,215 -0,701 0,073
- MuHd_075:
- 33,394 19,322 8,634 7,593
- MuHd_095:
- 34,726 19,634 8,110 8,861
- MuHd_100:
- 32,825 16,596 7,376 7,520
- MuHd_105 :
- 28,005 19,893 7,410 7,865
- Hmax_075 :
- 16,683 17,733 2,861 5,763
- Hmax_095 :
- 13,125 13,388 2,299 4,314
- Hmax_100 :
- 8,30O 11,500 1,845 3,830
Hmax_105 : 1,700 9,500 -1,171 2,390
PROBABILIDAD
de exportación a la mitocondria: 0,9974
La probabilidad de que el péptido analizado se transloque a la mitocondria aumenta a medida que el factor calculado se aproxima a 1.
El análisis de las secuencias proteicas de obelina, aecuorina, clitina, clitina-2 y mtClitina ha revelado que sólo la mtClitina tiene las características de una proteína que puede ser transportada al interior de la mitocondria.
Ejemplo 11
La Figura 9 muestra la alineación de mtClitina, clitina (Clytia gregaria) y clitina de tipo 2 a nivel de aminoácidos.
LISTADO DE SECUENCIAS
Claims (10)
- REIVINDICACIONES1. Una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos divulgada por la SEC ID Nº 2; y 5 b) moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la SEC ID N 1 :
-
- 2.
- �?cido nucleico según la reivindicación 1, que contiene un promotor funcional en 5’ de la secuencia de codificación.
-
- 3.
- Vectores de ADN o de ARN recombinantes que contienen ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 2.
-
- 4.
- Organismos no humanos que contienen un vector de acuerdo con la reivindicación 3.
- 5. Un péptido o polipéptido, que está codificado por una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la 10 reivindicación 1.
-
- 6.
- Un procedimiento para expresar los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 5 en bacterias, sistemas víricos, levaduras o células eucarióticas o en sistemas de expresión in vitro.
-
- 7.
- Un procedimiento para purificar/aislar un polipéptido de fotoproteína de acuerdo con la reivindicación 6.
-
- 8.
- El uso de un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 como gen marcador o gen indicador.
15 9. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5 como indicador o marcador. -
- 10.
- El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5 como proteína indicadora para buscar principios activos farmacológicos.
-
- 11.
- El uso de un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 como gen indicador para buscar principios activos farmacológicos.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10342670A DE10342670A1 (de) | 2003-09-16 | 2003-09-16 | Isoliertes Photoprotein mtClytin, sowie dessen Verwendung |
DE10342670 | 2003-09-16 | ||
PCT/EP2004/009843 WO2005035559A1 (de) | 2003-09-16 | 2004-09-03 | Isoliertes photoprotein mtclytin, sowie dessen verwendung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2375610T3 true ES2375610T3 (es) | 2012-03-02 |
Family
ID=34352845
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04764797T Expired - Lifetime ES2375610T3 (es) | 2003-09-16 | 2004-09-03 | Fotoproteina mtciclina aislada y su uso. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7833749B2 (es) |
EP (1) | EP1664102B1 (es) |
JP (1) | JP4728240B2 (es) |
KR (1) | KR20070029630A (es) |
CN (2) | CN1882608B (es) |
AT (1) | ATE533779T1 (es) |
CA (1) | CA2538903A1 (es) |
DE (1) | DE10342670A1 (es) |
DK (1) | DK1664102T3 (es) |
ES (1) | ES2375610T3 (es) |
SG (1) | SG146640A1 (es) |
WO (1) | WO2005035559A1 (es) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101490548A (zh) * | 2006-06-02 | 2009-07-22 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 蛋白质表面重建 |
EP3045532A1 (en) | 2006-06-02 | 2016-07-20 | President and Fellows of Harvard College | Protein surface remodeling |
JP5374840B2 (ja) * | 2006-07-20 | 2013-12-25 | Jnc株式会社 | カルシウム結合発光蛋白質、それをコードする遺伝子およびその用途 |
DE102007011241A1 (de) * | 2007-03-08 | 2008-09-11 | Bayer Healthcare Ag | Isoliertes Photoprotein mtClytinDecay, sowie dessen Verwendung |
JP5304275B2 (ja) * | 2009-01-29 | 2013-10-02 | Jnc株式会社 | アポクライティン−iiをコードするコドン最適化核酸およびその使用方法 |
WO2010129023A2 (en) | 2009-04-28 | 2010-11-11 | President And Fellows Of Harvard College | Supercharged proteins for cell penetration |
JP5549113B2 (ja) | 2009-05-14 | 2014-07-16 | Jnc株式会社 | カルシウム結合発光蛋白質、それをコードする遺伝子およびその用途 |
JP2012533298A (ja) * | 2009-07-14 | 2012-12-27 | イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン | カルシウム親和性の増加と生物発光の増強を示す改変型発光蛋白質及びその使用 |
GB201501603D0 (en) * | 2015-01-30 | 2015-03-18 | Norwegian University Of Life Sciences And Hedmark University College | Method and product |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8916806D0 (en) | 1989-07-22 | 1989-09-06 | Univ Wales Medicine | Modified proteins |
US5648218A (en) * | 1993-02-12 | 1997-07-15 | Sealite Sciences, Inc. | Preparation of photoprotein conjugates and methods of use thereof |
FR2827292B1 (fr) | 2001-07-12 | 2004-06-18 | Centre Nat Rech Scient | Photoproteines mutees et leurs applications |
ES2237643T3 (es) * | 2002-10-21 | 2005-08-01 | Axxam S.R.L. | Fotoproteina con bioluminiscencia mejorada. |
DE10257354A1 (de) * | 2002-12-09 | 2004-07-08 | Bayer Healthcare Ag | Isoliertes fluoreszierendes Protein CGFP, sowie dessen Verwendung |
-
2003
- 2003-09-16 DE DE10342670A patent/DE10342670A1/de not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-09-03 CA CA002538903A patent/CA2538903A1/en not_active Abandoned
- 2004-09-03 EP EP04764797A patent/EP1664102B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-09-03 JP JP2006526546A patent/JP4728240B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-09-03 AT AT04764797T patent/ATE533779T1/de active
- 2004-09-03 ES ES04764797T patent/ES2375610T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-09-03 US US10/572,175 patent/US7833749B2/en active Active
- 2004-09-03 KR KR1020067007173A patent/KR20070029630A/ko active IP Right Grant
- 2004-09-03 WO PCT/EP2004/009843 patent/WO2005035559A1/de active Application Filing
- 2004-09-03 CN CN2004800337823A patent/CN1882608B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-09-03 DK DK04764797.9T patent/DK1664102T3/da active
- 2004-09-03 SG SG200806861-1A patent/SG146640A1/en unknown
- 2004-09-03 CN CN2009100023089A patent/CN101514341B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1882608B (zh) | 2011-09-14 |
EP1664102B1 (de) | 2011-11-16 |
CN1882608A (zh) | 2006-12-20 |
KR20070029630A (ko) | 2007-03-14 |
CN101514341B (zh) | 2011-12-14 |
ATE533779T1 (de) | 2011-12-15 |
WO2005035559A1 (de) | 2005-04-21 |
CA2538903A1 (en) | 2005-04-21 |
JP2007527708A (ja) | 2007-10-04 |
JP4728240B2 (ja) | 2011-07-20 |
SG146640A1 (en) | 2008-10-30 |
DE10342670A1 (de) | 2005-04-21 |
CN101514341A (zh) | 2009-08-26 |
US20070275377A1 (en) | 2007-11-29 |
DK1664102T3 (da) | 2012-02-27 |
US7833749B2 (en) | 2010-11-16 |
EP1664102A1 (de) | 2006-06-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20130344591A1 (en) | Modified Fluorescent Proteins and Methods for Using Same | |
ES2375610T3 (es) | Fotoproteina mtciclina aislada y su uso. | |
JP2010517543A (ja) | 分泌型MLuc7ルシフェラーゼおよびその使用 | |
ES2254044T3 (es) | Proteinas fluorescentes procedentes de especies de copepodos y procedimientos para usarlas. | |
AU2003292121B2 (en) | Isolated fluorescent protein from clytia gregaria CGFP and use thereof | |
US20070042375A1 (en) | Isolated berovin photoprotein and use thereof | |
CN110305199A (zh) | 结合藻红胆素的荧光生物标记物及标记方法 | |
KR20080021018A (ko) | 단리된 광단백질 aq디케이 및 그의 용도 | |
RU2535981C1 (ru) | Нуклеиновая кислота, кодирующая основанный на fret дальне-красный биосенсор для измерения активности каспазы 3 внутри клеток | |
RU2338785C2 (ru) | Флуоресцирующие белки и хромопротеины из видов hydrozoa, не относящихся к aequorea, и способы их получения | |
EP1124957A1 (en) | Pholasin | |
TW200900418A (en) | Isolated mtclytindecay photoprotein and use thereof | |
EP1638998A1 (de) | Isoliertes photoprotein bolinopsin, sowie dessen verwendung |