ES2375610T3 - Fotoproteina mtciclina aislada y su uso. - Google Patents

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ES2375610T3 ES04764797T ES04764797T ES2375610T3 ES 2375610 T3 ES2375610 T3 ES 2375610T3 ES 04764797 T ES04764797 T ES 04764797T ES 04764797 T ES04764797 T ES 04764797T ES 2375610 T3 ES2375610 T3 ES 2375610T3
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Ludmila Burakova
Ludmila Frank
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos divulgada por la SEC ID Nº 2; y b) moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la SEC ID N 1 :

Description

Fotoproteína mtCiclina aislada y su uso
La invención se refiere a la fotoproteína mtClitina, a sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, y a la actividad y uso de la fotoproteína mtClitina.
5 Fotoproteínas
La bioluminiscencia se refiere al fenómeno de generación de luz por los organismos vivos. Es el resultado de reacciones bioquímicas en células, reacciones en las que la energía química se emite en forma de cuantos de luz (que también se denomina emisión fría por quimioluminiscencia). La luz generada de este modo es monocromática, ya que se emite durante una transferencia de electrones discretos, pero se puede desplazar a regiones del espectro
10 de mayor longitud de onda mediante pigmentos luminiscentes secundarios (por ejemplo, proteínas fluorescentes en medusas luminiscentes del género Aequora).
La función biológica es múltiple: a una profundidad marina de entre 200 y 1000 m (región mesopelágica), aproximadamente el 90 % de todos los organismos vivos brilla. Aquí, las señales luminiscentes se emplean para atraer a la pareja, como engaño y como cebo. Los gusanos brillantes y las luciérnagas también explotan las señales 15 de luz para atraer a la pareja. Por el contrario, el significado de la luminiscencia de las bacterias, hongos y algas monocelulares no está claro. Se supone que se usa para coordinar muchos individuos únicos de una gran población
o constituye una clase de reloj biológico.
Un gran número de celentéreos son bioluminiscentes (Morin y col., 1974). Estos organismos emiten luz azul o verde. La aecuorina, que deriva de Aequoria victoria y que, en 1962, fue la primera proteína productora de luz que se 20 identificó (Shimomura et al., 1969), emitió, como proteína aislada, una luz azul y no una luz verde como se observó fenotípicamente en el caso de Aequoria victoria. Más tarde, se aisló la proteína verde fluorescente (GFP) de Aequoria victoria, proteína que hace que la medusa aparezca fenotípicamente verde como resultado de la excitación mediante acuorina (Johnson y col., 1962; Hastings y col., 1969; Inouye y col., 1994). Otras fotoproteínas que también se han identificado y descrito son clitina (Inouye y col., 1993), mitrocomina (Fagan y col., 1993) y obelina
25 (Illarionov y col., 1995).
Tabla 1: Resumen de algunas fotoproteínas. En la tabla se proporcionan el nombre, el organismo del que se ha aislado la proteína y el número de identificación (Nº Reg.) de la entrada en la base de datos.
Nombre
Organismo Nº de identificación
Obelina
Obelia geniculata AAL86372
Clitina
Clytia gregaria CAA49754
Acuorina
Aequorea macrodactyla AAK02061
Acuorina
Aequorea parva AAK02060
Mitrocomina
Mitrocoma cellularia AAA29298
Folasina
Pholas dactylus AAM18085
?
Symplectoteuthis oualaniensis AX305029
Tabla 2: Resumen de algunas fotoproteínas. En la tabla se proporcionan el organismo del que se ha aislado la proteína, el nombre de la fotoproteína y una selección de patentes o solicitudes.
Organismo
Proteína fluorescente Patente/Solicitud
Obelia geniculata
Obelina WO03006497
Clytia gregaria
Clitina WO03006497
Aequoria victoria
Acuorina WO200168824 US-0908909 US 6,152,358 JP-0176125
Pholas dactylus
Folasina WO0028025 GB-0024357
Actualmente, la bioluminiscencia se usa en la tecnología de muchos modos, por ejemplo en forma de bioindicadores de contaminación o en bioquímica para la detección sensible de proteínas, para la determinación cuantitativa de compuestos específicos o como lo que se conoce como “indicador” en el estudio de la regulación génica en células.
Las fotoproteínas no solo difieren en sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, sino también en sus propiedades bioquímicas y físicas.
Se ha demostrado que las propiedades físicas y bioquímicas de las fotoproteínas se pueden modificar a través de la alteración de la secuencia de aminoácidos. En la literatura se describen ejemplos de fotoproteínas mutageneizadas (documentos se 6.495.355; US 5.541.309; US 5.093.240; Shimomura y col., 1986).
Las fotoproteínas mencionadas anteriormente generan luz oxidando la coelentarazina (Haddock y col., 2001; Jones y col., 1999).
Markeva SV y col., Biochemistry, Volumen 41, Nº 7, 19 de febrero de 2002, páginas 2227-2236, divulgan la clonación, el análisis de la secuencia y la expresión de la proteína obelina del hidroide pelagial bioluminiscente Obelia geniculata. El documento WO 91/01305 describe proteínas bioluminiscentes y su uso como marcadores/indicadores, entre otras, las fotoproteínas acuorina y obelina (página 7, líneas 17-21). El documento también describe la posibilidad de unión de las proteínas mencionadas anteriormente a un péptido señal para el transporte al interior de los orgánulos celulares, tales como, por ejemplo, la mitocondria o el retículo endoplásmico (página 8, líneas 9-26).
Dunstan SL y col., Journal of Biological Chemistry, Volumen 275, Nº 13, 31/3/2000, páginas 9403-9409, divulga la fotoproteína folasina de Pholas dactylus, que contiene un péptido señal natural con 20 aminoácidos para la secreción de la proteína (resumen, página 9407, columna de la derecha, líneas 14-16).
Sistemas indicadores
El término gen indicador se refiere, en general, a genes cuyos productos génicos pueden detectarse fácilmente usando sencillos procedimientos bioquímicos o histoquímicos. Se puede distinguir entre al menos 2 tipos de genes indicadores.
1.
Genes de resistencia. La expresión genes de resistencia se refiere a genes cuya expresión confiere, sobre una célula, resistencia a antibióticos u otras sustancias cuya presencia en el medio de crecimiento produce la muerte de la célula si el gen de resistencia no está.
2.
Genes indicadores. En la manipulación genética, los productos de los genes indicadores se usan en forma de indicadores condensados o no condensados. Entre los genes indicadores más usados se incluyen los de la beta-galactosidasa (Alam y col., 1990), fosfatasa alcalina (Yang y col., 1997; Cullen y col., 1992), luciferasas y otras fotoproteínas (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne y col., 1984).
La luminiscencia se refiere a la emisión de fotones en el intervalo del espectro visible, efectuándose mediante moléculas emisoras excitadas. En contraste con la fluorescencia, aquí, la energía no se suministra desde el exterior en forma de radiación de una longitud de onda más corta.
Se establece una distinción entre quimioluminiscencia y bioluminiscencia. Una reacción química que tiene como resultado una molécula excitada que brilla cuando los electrones excitados vuelven al estado basal se denomina quimioluminiscencia. Si esta reacción es catalizada por una enzima, el fenómeno se denomina bioluminiscencia. Las enzimas implicadas en la reacción se denominan, en general, luciferasas.
Clasificación de la especie Clytia gregaria
Cnidaria • Leptomedusae • Campanulariidae • Clytia gregaria
La especie Clytia gregaria pertenece a los cnidarios, específicamente a las medusas. El fenotipo bioluminiscente o fluorescente ya se describió en 1998 (Ward y col., 1998).
Aislamiento del ADNc
Para Investigar la actividad bioluminiscente de la especie Clytia gregaria, se obtuvieron especimenes en el Mar Blanco (Estación Biológica de Kartesh, Rusia) y se almacenaron en nitrógeno líquido. Para establecer las bibliotecas de ADNc de Clytia gregaria, se aisló el poli(a)+ARN con la ayuda del procedimiento de aislamiento “Straight A” de Novagen (EE.UU.).
Para preparar en ADNc se llevó a cabo una PCR-RT. Con este fin, se incubó 1 µg de ARN con la transcriptasa inversa (Superscribt Gold II) de acuerdo con el esquema siguiente:
PCR 1. 30 segundos 95 °C
2.
6 minutos 68 °C
3.
10 segundos 95 °C
4.
6 minutos 68 °C
17 ciclos de la etapa 4 después de la etapa 3
Para inactivar la polimerasa, los productos de reacción se incubaron durante 30 minutos con proteinasa K a 37 ºC y el ADNc se precipitó con etanol. La expresión de la biblioteca de ADNc se llevó a cabo con la ayuda del “kit de construcción de bibliotecas de ADNc SMART” de Clontech (EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc se clonó en el vector de expresión pTriplEx2 (Clontech; EE.UU.). Los vectores de expresión se transformaron mediante electroporación en bacterias de la cepa E. coli XL1-Blue.
Las bacterias se sembraron en placas con medio nutritivo LB sólido y se incubaron durante 24 horas a 37 ºC. Después, se repitió la siembra en placas transfiriendo las bacterias a otra placa con medio nutritivo sólido usando un filtro de nitrocelulosa. La placa duplicada, a su vez, se incubó durante 24 horas a 37 ºC y las colonias bacterianas que habían crecido se transfirieron a medio líquido LB. Después de la adición de IPTG (concentración final 0,1 mM), las bacterias se incubaron durante 4 horas a 37 ºC en un agitador. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación y la biomasa bacteriana se resuspendió a 0 ºC en 0,5 ml de tampón de alteración (EDTA 5 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 9,0) a 0 ºC. Las bacterias se rompieron después mediante sonicación.
Tras la adición de coelenterazina (concentración final 10E-07 M), los lisados se incubaron durante 3 horas a 4 ºC. Después, se midió la bioluminiscencia usando un luminómetro, tras la adición de cloruro cálcico (concentración final 20 mM).
Se identificó una fotoproteína. La fotoproteína se denominó mtClitina. La fotoproteína mtClitina se describe con detalle más adelante en el presente documento.
Con una identidad del 87 %, la fotoproteína mtClitina muestra el grado más elevado de homología a nivel de aminoácidos con la clitina de Clytia gregaria, y una identidad del 77 % con obelina de Obelia geniculata (mostrado en el ejemplo 8, Figura 8). La homología del 87 %, en relación con la clitina, se revela en el extremo C de la proteína, identificándose múltiples sustituciones de aminoácidos, distribuida por toda la proteína. A nivel de ácido nucleico, la identidad es inferior al 30 % (mostrado en el Ejemplo 7; Figura 7). Para comparar la secuencia se usó el procedimiento BLAST (Altschul y col., 1997).
La fotoproteína mtClitina tiene un péptido señal que puede conducir a la translocación de la fotoproteína al interior de las mitocondrias. El péptido señal se identificó mediante el programa informático MITOPROT (Claros y col., 1996) (mostrado en el Ejemplo 10). El péptido señal identificado mediante MITOPROT se muestra en la SEC ID Nº 3. La fotoproteína mtClitina es la primera fotoproteína en la que se identificó un péptido señal natural para la translocación a las mitocondrias.
También se describen equivalentes funcionales de la mtClitina. Equivalentes funcionales son las proteínas que tienen propiedades fisicoquímicas comparables y que tienen una homología de al menos un 70 % con la SEC ID Nº
2. Se prefiere una homología de al menos un 80 % o un 90 %. Especialmente preferida es una homología de al menos un 95 %.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como gen indicador para los sistemas celulares, específicamente para receptores, canales iónicos, transportadores, factores de transcripción o para sistemas inducibles.
Como fusión con genes indicadores, el péptido señal de la mtClitina es también adecuado como gen indicador condensado para los sistemas celulares, específicamente para receptores, canales iónicos, transportadores, factores de transcripción o para sistemas inducibles.
La fotoproteína mtClitina también es adecuada como gen indicador mediante marcaje, identificación y caracterización de orgánulos celulares, especialmente para mitocondrias.
La fotoproteína mtClitina también es adecuada como gen indicador para determinar parámetros dentro y fuera de orgánulos celulares, específicamente mitocondrias, específicamente las concentraciones de calcio.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como gen indicador en sistemas bacterianos y eucariotas, específicamente en células de mamífero, en bacterias, en levaduras, en baculovirus, en plantas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como gen indicador para sistemas celulares en combinación con sistemas bioluminiscentes o quimioluminiscentes, específicamente sistemas con luciferasas, con oxigenasas, con fosfatasas.
Como proteína de fusión, la fotoproteína mtClitina es adecuada específicamente para receptores, canales iónicos, transportadores, factores de transcripción, proteinasas, quinasas, fosfodiesterasas, hidrolasas, peptidasas, transferasas, proteínas de membrana y glicoproteínas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para su inmovilización, específicamente mediante anticuerpos, mediante biotina o mediante soportes magnéticos o magnetizables.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como proteína para sistemas de transferencia de energía, especialmente sistemas FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia), BRET (transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia), FET (transistores de efecto de campo), FP (polarización de fluorescencia), HTRF (fluorescencia resuelto por tiempo homogéneo).
La fotoproteína mtClitina es adecuada para marcar sustratos o ligandos, específicamente para proteasas, para quinasas, para transferasas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para expresar en sistemas bacterianos, específicamente para la determinación de títulos, como sustrato para sistemas bioquímicos, específicamente para proteinasas y quinasas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador, específicamente acoplado a anticuerpos, acoplado a enzimas, acoplado a receptores, acoplado a canales iónicos y a otras proteínas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como gen indicador en la búsqueda de compuestos farmacológicos activos, específicamente en HTS (detección selectiva de alto rendimiento).
La fotoproteína mtClitina es adecuada como componente de sistemas de detección, específicamente para ensayos ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzimas), para inmunohistoquímica, para transferencias de tipo Western, para microscopia confocal.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador para analizar las interacciones, específicamente para interacciones proteína-proteína, para interacciones ADN-proteína, para interacciones ADN-ARN, para interaccionesARN-ARN, para interacciones ARN-proteínas (ADN: �?cido desoxirribonucleico; ARN: ácido ribonucleico).
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador o proteína de fusión para su expresión en organismos transgénicos, específicamente en ratones, en ratas, en hámsteres, en otros mamíferos, en primates, en peces, en gusanos, en plantas.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador o proteína de fusión para analizar el desarrollo embrionario.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como marcador a modo de un mediador de acoplamiento, específicamente mediante biotina, mediante NHS (N-hidroxisulfosuccimida), mediante CN-Br.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como indicador que está acoplado a ácidos nucleicos, específicamente a ADN
o ARN.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como indicador que está acoplado a proteínas o péptidos.
La fotoproteína mtClitina es adecuada como indicador para medir las concentraciones de calcio intracelulares o extracelulares.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para caracterizar cascadas de señales en sistemas celulares.
La fotoproteína mtClitina, acoplada a ácidos nucleicos o péptidos, es adecuada como sonda, específicamente para transferencias de tipo Northern, para transferencias de tipo Southern, para transferencias de tipo Western, para ELISA, para secuenciación de ácido nucleico, para análisis de proteínas o para análisis en circuitos.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para marcar formulaciones farmacológicas, específicamente agentes infecciosos, anticuerpos, “moléculas pequeñas”.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para investigaciones geológicas, especialmente para aguas pelágicas, aguas subterráneas y corrientes fluviales.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para su expresión en sistemas de expresión, específicamente en sistemas de traducción in vitro, en sistemas bacterianos, en sistemas de levaduras, en sistemas de baculovirus, en sistemas víricos, en sistemas eucarióticos.
La fotoproteína mtClitina es adecuada para visualizar tejidos o células en relación con intervenciones quirúrgicas, específicamente en el caso de intervenciones invasivas, no invasivas, mínimamente invasivas.
La fotoproteína mtClitina es también adecuada para marcar tejidos tumorales y otros tejidos alterados fenotípicamente, específicamente en investigación hidrológica y en relación con intervenciones quirúrgicas
También se describe la purificación de la fotoproteína mtClitina, específicamente como la proteína silvestre, como una proteína de fusión, como proteína mutageneizada.
También se describe la purificación del péptido señal de mtClitina, específicamente como la proteína silvestre, como una proteína de fusión, como proteína mutageneizada.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina en el campo de la cosmética, específicamente aditivos para el baño, lociones, jabones, pinturas corporales, pasta de dientes, polvos corporales.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina para pigmentar específicamente colorantes alimentarios, aditivos para baño, tinta, materiales textiles y plásticos.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina para pigmentar papel, específicamente tarjetas de felicitación, productos de papel, papel de empapelar y artículos artesanía.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina para pigmentar líquidos, específicamente para pistolas de agua, fuentes, bebidas, hielo.
También se describe el uso de la fotoproteína mtClitina para la producción de juguetes, específicamente pintura para dedos y maquillaje.
La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido divulgado por la SEC ID Nº 2.
La invención se refiere al polipéptido con la secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC ID Nº 2.
También se describen moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos divulgada por la SEC ID Nº 2; b) las moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la SEC ID N 1; c) las moléculas de ácido nucleico cuya hebra complementaria hibrida con una molécula de ácido nucleico de a) o b) en condiciones rigurosas y que codifican un polipéptido que exhibe la función biológica de una fotoproteína; Se puede efectuar una hibridación rigurosa de moléculas de ácido nucleico en, por ejemplo, una solución acuosa que comprende 0,2 x SSC (1 x solución salina estándar-citrato= NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM) a 68 ºC (Sambrook y col., 1989). d) moléculas de ácido nucleico que difieren de las moléculas de ácido nucleico mencionadas en c) como resultado de la degeneración del código genético; e) las moléculas de ácido nucleico que exhiben una homología de secuencia de al menos 95 % con la SEC ID N 1 y cuyo producto proteico tiene la función biológica de una fotoproteína; y f) las moléculas de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de al menos 65 % con la SEC ID N 1 y cuyo producto proteico tiene la función biológica de una fotoproteína.
También se describen moléculas de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de al menos 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 % o 60 % con la SEC ID N 1 y que codifican un polipéptido que tiene las propiedades de una fotoproteína.
La invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención en las que la secuencia contiene un promotor funcional en 5’ de la secuencia codificadora de la fotoproteína o de la secuencia de codificación de la secuencia líder, o secuencia señal.
La invención también se refiere a las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que son un componente de vectores de ADN o ARN recombinantes.
La invención se refiere a organismos no humanos que contienen dicho vector.
La invención se refiere a fotoproteínas que están codificadas por las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención.
La invención se refiere a procedimientos de expresión de los polipéptidos de fotoproteína de acuerdo con la invención en bacterias, en células eucariotas o en sistemas de expresión in vitro.
Se describen péptidos que tienen más de 5 aminoácidos consecutivos que son reconocidos inmunológicamente por anticuerpos contra las fotoproteínas de acuerdo con la invención.
La invención se refiere al uso de los ácidos nucleicos que codifican fotoproteínas de acuerdo con la invención como genes marcadores o genes indicadores, en particular para buscar compuestos farmacológicos activos y para diagnóstico.
La invención se refiere al uso de las fotoproteínas de acuerdo con la invención o a un ácido nucleico que codifica la fotoproteína de acuerdo con la invención como marcador o indicador o como gen marcador o gen indicador.
La invención se refiere al uso de la fotoproteína mtClitina (SEC ID Nº 2) o al uso de un ácido nucleico que codifica la fotoproteína mtClitina como marcador o indicador, o como gen marcador o gen indicador, en particular para buscar compuestos farmacológicos activos y para diagnóstico.
La invención se refiere al uso del ácido nucleico mostrado en la SEC ID Nº 1 como gen marcador o indicador, en particular para buscar compuestos farmacológicos activos y diagnósticos.
También se describen anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen un polipéptido de acuerdo con la invención.
También se describen anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen un la fotoproteína mtClitina (SEC ID Nº 2).
Expresión de las fotoproteínas de acuerdo con la invención
Expresión se refiere a la generación de una molécula que, después de que se ha introducido el gen en una célula huésped adecuada, permite que el gen heterólogo que se clona en un vector de expresión se transcriba y se traduzca. Los vectores de expresión contienen las señales control requeridas para expresar genes en células procariotas o eucariotas.
En principio, los vectores de expresión se pueden interpretar de dos modos diferentes. En el caso de lo que se denomina fusiones de transcripción, la proteína codificada por el gen heterólogo clonado se sintetiza como una proteína auténtica biológicamente activa. Con este fin, el vector de expresión porta todas las señales de control en 5’ y 3’ para expresión.
En el caso de lo que se denomina fusiones de traducción, la proteína codificada por el gen heterólogo clonado se expresa como proteína híbrida junto con otra proteína que se puede detectar fácilmente. Las señales control en 5’ y 3’, que son necesarias para la expresión, incluido el codón de iniciación y, posiblemente, algunas de las secuencias que codifican las regiones en N-terminal de la proteína híbrida que se va a formar, se originan del vector. El resto proteico insertado adicional, en muchos casos, no solo estabilizará la proteína codificada por el gen heterólogo clonado contra la degradación por acción de las proteasas celulares, sino también se puede usar para detectar y aislar la proteína híbrida formada. La expresión puede tener lugar de forma temporal o estable. Los organismos huésped adecuados no solo son bacterias, levaduras y virus, sino también sistemas eucarióticas.
Purificación de las fotoproteínas de acuerdo con la invención
El aislamiento de las proteínas (incluido después de su sobreexpresión) con frecuencia se denomina purificación de proteínas. Se dispone de un gran número de técnicas y procedimientos establecidos para purificar proteínas.
La separación de sólidos/líquidos es una operación básica en relación con el aislamiento de las proteínas. Esta etapa del procedimiento es necesaria para separar las células del medio de cultivo, para aclarar el extracto bruto después de la rotura de las células y eliminación de los residuos celulares y para separar los sedimentos después de las precipitaciones, y similares. Se realiza mediante centrifugación y filtración.
Para obtener proteínas intracelulares, la pared celular se debe destruir o hacer permeable. Con este fin se usan homogeneizadores de presión alta o molinos de bolas con agitación o molinos de esferas de cristal, en función de la escala y del organismo. Los tratamientos de integración celular mecánica y de sonicación se usan, entre otras, a escala de laboratorio.
Tanto en el caso de proteínas extracelulares como en el caso de proteínas intracelulares (tras la rotura de la célula), varios procedimientos de precipitación que usan sales (en particular sulfato amónico) o disolventes orgánicos (alcoholes o acetonas) representan procedimientos rápidos y eficientes para concentrar proteínas. Cuando se purifican proteínas intracelulares, es deseable eliminar los ácidos nucleicos solubles (precipitación con, por ejemplo, sulfato de estreptomicina o sulfato de protamina). Cuando se aíslan proteínas extracelulares, con frecuencia se añaden transportadores (por ejemplo almidón, kieselguhr) antes de añadir los agentes de precipitación con el fin de obtener precipitados que sean más fáciles de manipular.
Se dispone de numerosos procedimientos cromatográficos y procedimientos de reparto (Cromatografía de absorción, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía de afinidad, electroforesis) para purificación de alto grado. La cromatografía en columna también se usa a escala industrial. La cromatografía de afinidad, que hace posible factores de purificación de hasta varias centenas por etapa, es especialmente importante para las operaciones a escala de laboratorio.
Las proteínas extracelulares se generan en soluciones relativamente diluidas. Como las proteínas extracelulares, deben concentrarse antes de usar. Además de los procedimientos que ya se han mencionado, se ha demostrado que la ultrafiltración era valiosa, incluida a escala industrial.
Sales inorgánicas que acompañan a las proteínas son, con frecuencia, indeseables para aplicaciones específicas. Se pueden eliminar mediante, entre otros, filtración en gel, diálisis y diafiltración.
Un gran número de proteínas se usan como preparaciones secas. Procedimientos de secado importantes son secado al vacío, liofilizado y secado por pulverización.
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos
La fotoproteína de mtClitina está codificada por la siguiente secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 1):
Esto conduce a una secuencia de aminoácidos de (SEC ID Nº 2):
10 El supuesto péptido señal de la fotoproteína mtClitina tiene la siguiente secuencia (SEC ID Nº 3):
y la siguiente secuencia de ácidos nucleicos:
Estas secuencias también se encuentran en el listado de secuencias.
15 Breve descripción de las figuras
Figura 1: La Figura 1 muestra el mapa plasmídico del vector pTrip1EX2-mtClitina. Figura 2: La Figura 2 muestra el mapa plasmídico del vector pcDNA3-mtClitina. Figura 3: La Figura 3 muestra el resultado de la expresión bacteriana de metclitina y la actividad de
bioluminiscencia de la mtClitina tras la expresión bacteriana. (Y = ULR: unidades lumínicas 20 relativas; X) dilución; barras negras= mtClitina; barras grises= lisado control).
Figura 4: La Figura 4 muestra el resultado de la expresión eucariótica de mtClitina y la actividad de bioluminiscencia de la mtClitina tras la expresión en células CHO. (Y = ULR: unidades lumínicas relativas; X= ATP (representación logarítmica en mol/l)).
Figura 5: La Figura 5 muestra el análisis cinético de la bioluminiscencia de la mtClitina (Y= ULR: unidades 25 lumínicas relativas; X= tiempo [segundos]).
Figura 6: La Figura 6 muestra el análisis cinético de la bioluminiscencia de la obelina (Y= ULR: unidades
lumínicas relativas; X= tiempo [segundos]). Figura 7: La Figura 7 muestra la alineación de clitina y mtClitina a nivel de aminoácidos. Figura 8: La Figura 8 muestra la alineación de clitina y mtClitina a nivel de ácido nucleico. Figura 9: La Figura 9 muestra la alineación de clitina, mtClitina y clitina-2 a nivel de aminoácidos.
Ejemplos
Ejemplo 1
El vector usado para la preparación de la construcción mostrada más adelante en el presente documento fue el plásmido pTrip1Ex2 de Clontech. El derivado del vector se designó pTrip1Ex2-mtClitina. El vector pTrip1Ex2mtClitina se usó para expresar mtClitina en sistemas bacterianos.
La Figura 1 muestra el mapa plasmídico del vector pTrip1EX2-mtClytin.
Ejemplo 2
El vector usado para la preparación de la construcción mostrada más adelante en el presente documento fue el plásmido pcDNA3.1(+) de Clontech. El derivado del vector se designó pcDNA3-mtClitina. El vector pcDNA3-mtClitina se usó para expresar mtClitina en sistemas eucarióticas.
La Figura 2 muestra el mapa plasmídico del vector pcDNA3-mtClytin.
Ejemplo 3
Expresión bacteriana
La expresión bacteriana se realizó en la cepa de E. coli BL21(DE3) transformando las bacterias con los plásmidos de expresión pTrip1EX2-mtClitina y pTrip1EX2. Las bacterias transformadas se incubaron durante 3 horas en medio LB a 37 ºC y se indujo la expresión durante 4 horas añadiendo IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Las bacterias inducidas se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en Tris/HCl 50 mM (pH 9,0) + EDTA 5 mM y se rompieron mediante sonicación. El lisado se centrifugó después durante 15 minutos a 13.000 revoluciones por minuto (16.000 rcf) y se eliminó el sobrenadante. El sobrenadante (diluciones 1:5; 1:10; 1:20 y 1:50 con Tris/HCl pH 9,0)) se incubó con celenterazina (celentereazina 10E-07 M en Tris/HCl pH 9,0) durante 3 horas en oscuridad. Directamente después de la adición de cloruro cálcico 5 mM, se midió la bioluminiscencia en un luminómetro. El tiempo de integración de la medición fue de 40 segundos.
La Figura 3 muestra los resultados de medir la bioluminiscencia de la mtClitina en bacterias.
Ejemplo 4
Expresión eucariótica
La expresión eucariótica constitutiva se llevó a cabo en células CHO transfeccionando las células con los plásmidos de expresión pcDNA3-mtClytin y pcDNA3.1(+) en experimentos transitorios. Con este fin, 10.000 células se sembraron en placas por pocillo en medio DMEM-F12, en placas de microtitulación de 96 pocillos y las placas se incubaron durante la noche a 37 ºC. La transfección se realizó usando el kit Fugene 6 (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células transfeccionadas se incubaron durante la noche en medio DMEM-F12 a 37 ºC. Después, el medio se retiró y sustituyó con 50 µl de celenterazina (celenterazina 10E-07M en PBS). Las células se incubaron durante 3 horas a 37 ºC y, después, se añadió ATP (adenosina trifosfato) hasta una concentración final de 1 µM. La medición en el luminómetro se inició directamente después de la adición. El tiempo de integración fue de 1 segundo, con un tiempo de medición total de 60 segundos.
La Figura 4 muestra los resultados de medir la bioluminiscencia de la mtClitina en células CHO.
Ejemplo 5
BLAST
Resultado de un análisis BLAST de mtClitina a nivel de aminoácidos.
Ejemplo 6
BLAST Resultado de un análisis BLAST de mtClitina a nivel de ácido nucleico:
Ejemplo 7
La Figura 7 muestra la alineación de mtClitina y clitina (Clytia gregaria) a nivel de ácido nucleico.
Ejemplo 8
10 La Figura 8 muestra la alineación de mtClitina y clitina (Clytia gregaria) a nivel de aminoácidos.
Ejemplo 9 Análisis cinético de mtClitina
Para llevar a cabo el análisis cinético de la bioluminiscencia de mtClitina, las células CHO se transfeccionaron de forma transitoria con pcDNA3-mtClitina o pcDNA-obelina o pcDNA3 (sin ADNc integrado). La transfección y la 5 medición se llevaron a cabo como se ha descrito para el Ejemplo 4, Las lecturas se tomaron en un periodo de 60 segundos, con un tiempo de integración de 1 segundo.
Las Figuras 5 y 6 muestran los resultados del análisis cinético de mtClitina y obelina.
Ejemplo 10 Análisis MITOPROT
10 Se usó el programa informático MITOPROT para analizar el péptido señal de mtClitina (Claros y col., 1996). Se analizaron las siguientes fotoproteínas: obelina (Q27709), aecuorina (P07164), clitina (Q08121) y mtClitina (SEC ID Nº 2).
Resultados de los análisis: Obelina: 15 Nombre de la secuencia: OBELINA Longitud de la secuencia inicial: 196 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS Carga neta de la secuencia de búsqueda: -11 Región analizada: Número de residuos básicos en la secuencia destino:
3 Número de residuos ácidos en la secuencia destino: 0 Sitio de escisión: no predecible Secuencia escindida: -
ESCALA HIDROFÓBICA USADA GES KD GVH1 ECS H17: -0.624 0.259 -0.30S 0.295
GES
KD GVH1 ECS
MesoH :
-1,573 -0,241 -0,642 0,060
MuHd_075:
14,019 3,641 4,408 1,523
MuHd_095:
7,994 7,898 3,285 1,838
MuHd_100:
13,734 9,836 5,597 2,742
MuHd_105:
21,195 11,755 7,339 4,117
Hrnax_075 :
-9,450 -2,800 4,008 1 132
Hrnax_095 :
-0,963 1,837 -1,971 1,103
Hrnax_100 :
0,400 1,300 -1,942 2,240
Hmax_105 :
10,617 6,067 0,733 3,127
PROBABILIDAD
de exportación a la mitocondria: 0,1479
Aecuorina:
Nombre de la secuencia: AECUORINA Longitud de la secuencia inicial: 196 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS Carga neta de la secuencia de búsqueda: -13 Región analizada: 3 Número de residuos básicos en la secuencia destino:
0 Número de residuos ácidos en la secuencia destino: 0 Sitio de escisión: no predecible Secuencia escindida: -
ESCALA HIDROFÓBICA USADA
GES KD GVH1 ECS H17: 0,006 0,794 -0,263 0,368 MesoH : -1,673 -0,382 -0,703 0,048 MuHd_075: 24,326 4,153 5,947 2,450 MuHd_095: 12,638 7 213 4,218 1,796 MuHd_100 : 13,748 8,827 4,477 2,427 MuHd_105: 16,581 11,426 5,056 3,463 Hmax_075 : 0,438 0,233 -2,490 1,692 Hmax_095 : 0,525 -1,400 -2,394 0,674 Hmax_100 : -0,100 -1,200 -2,292 1,550 H max_105: 0,500 -0,000 -2,164 1,540
PROBABILIDAD de exportación a la mitocondria: 0,0148
Clitina:
Nombre de la secuencia: CLITINA
Longitud de la secuencia inicial: 198 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS
Carga neta de la secuencia de búsqueda:
-11
Región analizada:
11
Número de residuos básicos en la secuencia destino:
3
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS
Número de residuos ácidos en la secuencia destino: Sitio de escisión: no predecible
Secuencia escindida:
ESCALA HIDROFÓBICA USADA
GES
KD GVH1 ECS
H17:
-0,624 0,259 -0,308 0,295
MesoH :
-1,573 -0,241 -0,642 0,060
MuHd_075
14,019 3,641 4,408 1,523
MuHd_095
7,994 7,698 3,285 1,638
MuHd_100
13,734 9,836 5,597 2,742
MuHd_105
21,195 11,755 7,339 4,117
Hmax_075
-9,450 -2,800 -4,008 1,132
Hmax_095
-0,963 1,837 -1,971 1,103
Hmax_100
0,400 1,300 -1,942 2,240
Hmax_105
10,617 6,067 0,733 3,127
PROBABILIDAD
de exportación a la mitocondria: 0,1479
Aecuorina: Hmax_105 0,500 -0,000 -2,164 1,540
Nombre de la secuencia: AECUORINA
Longitud de la secuencia inicial: 196 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS
Carga neta de la secuencia de búsqueda:
-13
Región analizada:
3
Número de residuos básicos en la secuencia destino:
0
Número de residuos ácidos en la secuencia destino:
0
Sitio de la escisión:
no predecible
Secuencia escindida:
ESCALA HIDROFÓBICA USADA
GES
KD GVH1 ECS
H17:
0,006 0,794 -0,263 0,368
MesoH :
-1,673 -0,382 -0,703 0,048
MuHd_075
24,326 4,153 5,947 2,450
MuHd_095
12,638 7,213 4,218 1,796
MuHd_100
13,748 8,827 4,477 2,427
MuHd_105
16,581 11,426 5,056 3,453
Hmax_075
0,438 0,233 -2,490 1,692
Hmax_095
-0,525 -1,400 -2,394 0,674
Hmax_100
-0,100 -1,200 -2,292 1,560
PROBABILIDAD
de exportación a la mitocondria: 0,0148
Clitina:
Nombre de la secuencia: CLITINA Longitud de la secuencia inicial: 198 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS Carga neta de la secuencia de búsqueda: -9 Región analizada: 32 Número de residuos básicos en la secuencia destino: 6 Número de residuos ácidos en la secuencia destino: 2 Sitio de la escisión: no predecible Secuencia escindida: ESCALA HIDROFÓBICA USADA
GES KD GVH1 ECS H17: -0,429 0,341 -0,313 0,313 MesoH : -1,778 -0,307 -0,718 0,053 MuHd_075 32,928 17,509 7,351 5,708 MuHd_095 30,874 20,344 9,074 5,834 MuHd_100 36,596 22,666 10,051 6,762 MuHd_105 39,174 19,336 10,379 7,609 Hmax_075 4,900 7,087 -1,223 3,684 Hmax_095 13,600 10,100 1,261 4,390 H max_100 14,000 12,600 1,601 5,060 Hmax_105 6,650 13,067 -0,468 3,920
PROBABILIDAD de exportación a la mitocondria: 0,2047 Clitina-2: Nombre de la secuencia: CLITINA-2 Longitud de la secuencia inicial: 198 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS Carga neta de la secuencia de búsqueda: -7 Región analizada: 16 Número de residuos básicos en la secuencia destino: 3 Número de residuos ácidos en la secuencia destino: 1 Sitio de la escisión: no predecible
Secuencia escindida:
ESCALA HIDROFÓBICA USADA
GES
KD GVH1 ECS
H17:
-0,288 0,341 -0,213 0,313
MesoH :
-1,519 -0,206 -0,681 0,081
MuHd_075
32,594 15,092 8,192 4,075
MuHd_095
36,090 19,707 8,836 6,716
MuHd_100
38,617 20,269 9,682 6,851
MuHd_105
30,267 16,082 8,229 5,470
Hmax_075
6,533 6,417 -0,793 2,508
Hmax_095
13,600 10,100 1,251 4,390
Hmax_100
13,600 10,100 1,251 4,390
Hmax_105
13,417 10,150 1,612 3,862
PROBABILIDAD
de exportación a la mitocondria: 0,3974
mtClitina:
Nombre de la secuencia: mtClitina
Longitud de la secuencia inicial: 228 aa
VALORES DE LOS PAR�?METROS COMPUTADOS
Carga neta de la secuencia de búsqueda:
-8
Región analizada:
34
Número de residuos básicos en la secuencia destino:
: 6
Número de residuos ácidos en la secuencia destino:
0
Sitio de la escisión:
17
Secuencia escindida:
MQRFTNRLLSMSALRA
ESCALA HIDROFÓBICA USADA
GES
KD Gvm ECS
H17:
-0,135 0,453 -0,343 0,309
MesoH :
-1,623 -0,215 -0,701 0,073
MuHd_075:
33,394 19,322 8,634 7,593
MuHd_095:
34,726 19,634 8,110 8,861
MuHd_100:
32,825 16,596 7,376 7,520
MuHd_105 :
28,005 19,893 7,410 7,865
Hmax_075 :
16,683 17,733 2,861 5,763
Hmax_095 :
13,125 13,388 2,299 4,314
Hmax_100 :
8,30O 11,500 1,845 3,830
Hmax_105 : 1,700 9,500 -1,171 2,390 PROBABILIDAD
de exportación a la mitocondria: 0,9974
La probabilidad de que el péptido analizado se transloque a la mitocondria aumenta a medida que el factor calculado se aproxima a 1.
El análisis de las secuencias proteicas de obelina, aecuorina, clitina, clitina-2 y mtClitina ha revelado que sólo la mtClitina tiene las características de una proteína que puede ser transportada al interior de la mitocondria.
Ejemplo 11
La Figura 9 muestra la alineación de mtClitina, clitina (Clytia gregaria) y clitina de tipo 2 a nivel de aminoácidos.
Bibliografía/Patentes
LISTADO DE SECUENCIAS

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:
    a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos divulgada por la SEC ID Nº 2; y 5 b) moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia representada por la SEC ID N 1 :
  2. 2.
    �?cido nucleico según la reivindicación 1, que contiene un promotor funcional en 5’ de la secuencia de codificación.
  3. 3.
    Vectores de ADN o de ARN recombinantes que contienen ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 2.
  4. 4.
    Organismos no humanos que contienen un vector de acuerdo con la reivindicación 3.
  5. 5. Un péptido o polipéptido, que está codificado por una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la 10 reivindicación 1.
  6. 6.
    Un procedimiento para expresar los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 5 en bacterias, sistemas víricos, levaduras o células eucarióticas o en sistemas de expresión in vitro.
  7. 7.
    Un procedimiento para purificar/aislar un polipéptido de fotoproteína de acuerdo con la reivindicación 6.
  8. 8.
    El uso de un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 como gen marcador o gen indicador.
    15 9. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5 como indicador o marcador.
  9. 10.
    El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5 como proteína indicadora para buscar principios activos farmacológicos.
  10. 11.
    El uso de un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 como gen indicador para buscar principios activos farmacológicos.
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