CN110305199A - 结合藻红胆素的荧光生物标记物及标记方法 - Google Patents

结合藻红胆素的荧光生物标记物及标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了结合藻红胆素的荧光生物标记物及标记方法，公开了BDFP3.3的制备方法，采用PEB替代PΦB进行外源添加，得到全新的荧光蛋白。而且在BDFP3.3的基础上，得到新的荧光蛋白BDFP1.2:3.3:1.2以及BDFP1.6:3.3:1.6。有效亮度提高了，而且可适用于生物荧光标记，维持了远红光区域的荧光光谱特征和单体低聚状态。本发明增加藻红色素的选择，提高了蛋白的显色度，提高了融合蛋白的质量。

Description

结合藻红胆素的荧光生物标记物及标记方法
技术领域
本发明属于生物标记领域，特别涉及结合藻红胆素的荧光生物标记物及标记方法。
背景技术
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是非常重要的生物荧光标记，在生命科学领域应用十分广泛。但是在波长大于650nm的区域，它的荧光就较弱。细菌光敏色素蛋白(Bacteriophytochromes)可以结合胆绿素(biliverdin，BV)，突破了可见光区域，其荧光光谱扩展至远红光区域(FR,650-700nm)和近红外光区域(NIR,700-770nm)。在这两个区域，大多数的深层组织体内成像，可以实现最大透光率。同时，胆绿素BV广泛存在于哺乳动物细胞中，因此基于细菌光敏色素蛋白的远红光和近红外光生物荧光标记，可以应用于真核细胞和所有的动物细胞。但是，进一步提高其有效亮度，可以更好地应用于深层组织体内成像和多通道光谱分析。
藻胆蛋白作为藻胆体的功能组件，可以天然发出明亮的荧光，光谱范围包括橙色，红色以及远红光，是荧光蛋白的一个潜在来源。其组成亚基也比细菌光敏色素的胆绿素结合域小，更适用于荧光探针。比如发现的别藻蓝蛋白ApcF2，可以自催化结合胆绿素BV，发出远红光荧光；并在此基础上改造得到的BDFP1.2/1.6，进一步提高了有效亮度。其中BDFP1.6有效亮度最好，约为常用的远红光荧光标记蛋白iRFP670的1.3倍
此外，还发现了源自别藻蓝蛋白ApcE2的BDFP3，可以非共价结合光敏色素(PΦB)，得到BDFP3.1，该荧光蛋白可以发出近红外光荧光。并且提出了一种三倍体荧光蛋白融合模式(BDFP1.1/1.2:3.1:1.1/1.2)，可以提高有效亮度(荧光区域为近红外光)。其中BDFP1.1:3.1:1.1的有效亮度为常用的近红外光荧光标记蛋白iRFP720的2.7倍。现有技术中的荧光蛋白，荧光量子产率低，有效亮度低，无法用于生物荧光标记。
现有技术中没有高亮度的具有藻红胆素色基的荧光蛋白，如何选择合适的藻红胆素合成合适的荧光蛋白，是有待解决的技术问题。
发明内容
本发明的首要目的在于一种高亮度藻红胆素色基的荧光生物标记物及标记方法。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一种荧光蛋白，包括脱辅基蛋白以及藻红色素，其脱辅基蛋白的3个氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。
进一步的，脱辅基蛋白以及藻红色素的比例为1：1。
上述所述的荧光蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)将荧光蛋白基因序列fp插入到质粒pcDNA3.1；
2)将2000与质粒DNA以3μl：1μg的比率混合，共转染到细胞HEK293T体内表达，同时添加PEB进行培养，发酵超声提纯得到荧光蛋白，后续镜检进行动物细胞组织成像。
进一步的，所述的PEB的浓度为5～20um；优选的PEB浓度为5um。
进一步的，所述的提纯为镍离子金属螯合亲和层析提纯。
上述制备的荧光蛋白在生物标记中的应用。
进一步的，荧光蛋白的标记方法为：
1)将荧光蛋白基因序列fp插入到质粒pcDNA3.1；
2)将2000与质粒DNA以3μl：1μg的比率混合，共转染到细胞HEK293T体内表达，同时添加PEB进行培养，发酵超声提纯得到荧光蛋白，后续镜检进行动物细胞组织成像。
一种融合蛋白，结构为BDFP1.6-GHGTGSTGS-BDFP3-GHGTGST-BDFP1.6；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
上述制备的融合蛋白在生物标记中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明制备了三个不同的荧光蛋白，名称分别是：BDFP3.3(荧光蛋白)，BDFP1.2:3.3:1.2(融合蛋白)以及BDFP1.6:3.3:1.6(融合蛋白)。其中BDFP3.3荧光量子产率高，有效亮度约为58％，而且能够维持远红光区域荧光光谱特征以及单体低聚状态，可用于生物荧光标记。BDFP1.2:3.3:1.2和BDFP1.6:3.3:1.6有效亮度也有相应提高。荧光蛋白通过筛选结合特定比例的藻红胆素，制备出有效亮度更高的荧光蛋白。
附图说明
图1为BDFP3.3及其融合蛋白在溶液中的聚合态分析。其中A)为三种蛋白的分子筛层析(黑线：BDFP1.2:3.3:1.2；红线：BDFP1.6:3.3:1.6；蓝线BDFP3.3；B)为蛋白质Marker的分子筛层析。
图2为荧光共振能量传递效应FRET。其中：A)为接收区吸收光谱(BDFP1.2:蓝线，BDFP1.6:红线)和供给区荧光光谱(BDFP3:黑线，λex＝560nm)；B)为有效亮度对比(红色：BDFP1.2/1.6:3:1.2/1.6:IRES:eGFP无PEB添加；绿色：BDFP1.2/1.6:3:1.2/1.6:IRES:eGFP有PEB添加；蓝色：BDFP1.2/1.6:IRES:eGFP有PEB添加；青色：BDFP3:IRES:eGFP有PEB添加；黄色：BDFP2.0:IRES:eGFP；亮度数值计算：首先与eGFP的平均荧光亮度进行参比，对表达水平进行修正，然后与iRFP670的亮度数据进行参比得到相对亮度数值；镜检参数：λex＝580/25,λem＝690/50nm。
图3为BDFP3.3的有效亮度镜检图，其中A)、B)分别为BDFP3.3，即有PEB添加，C)为无PEB添加，阴性对照；镜检参数：绿色(λex＝470/40；λem＝510/40nm)，适用eGFP；红色(λex＝580/25；λem＝620/20nm)，适用BDFP3.3；比例尺为1：50μm；；有效亮度参比对象为红色荧光标记mCherry，非iRFP670。
图4为广域(wf)和结构化照明显微镜细胞镜检，细胞内产生融合有目标哺乳动物蛋白的BDFP3.3and BDFP1.2/1.6:3.3:1.2/1.6。其中A)BDFP3.3融合-Tubulin，在HeLacells内表达；B)BDFP3.3融合-Actin，在U-2OS cells内表达；C)BDFP1.2:3.3:1.2融合histone H2B在HEK293T细胞内表达；D)BDFP1.2:3.3:1.2融合-Tubulin，在HeLa cells内表达；E)BDFP1.6:3.3:1.6融合MTS序列，在HeLa cells内表达；F)BDFP1.6:3.3:1.6融合histone H2B在HEK293T细胞内表达。-Actin,-tubulin和H2B融合在荧光标签C端，MTS融合在荧光标签N端。图中比例尺:10μm。
图5为BDFP3.3及其融合蛋白双色标记人蛋白，其中A)BDFP3.3融合histone H2B；B)BDFP1.2:3.3:1.2融合MTS序列；C)合并图；图中比例尺：10μm。
具体实施方式
实施例1
克隆
所有基因实验操作实施都参考《分子克隆》等标准实验操作手册。
将三种荧光蛋白基因编码序列(GenBank：BDFP1.2，KY465660；BDFP1.6，MG727536；BDFP3，MH686030)克隆至载体pET28或者pcDNA3.1(Novagen)，得到pET-fp或者pcDNA3.1-fp:ires:egfp。
基因fp序列(指的是上文提及的BDFP3，BDFP1.2/1.6：3：1.2/1.6的荧光蛋白序列编码的基因序列)通过酶切位点NcoI和XhoI接入pET28载体，得到质粒pET-fp。将质粒pET-fp转化到已经含有质粒pACYC-ho1-pebS的大肠杆菌BL21细胞。质粒pACYC-ho1-pebS用于表达生成藻红色素，ho1为血红素氧化酶基因，pebS为藻红色素(也就是本发明的藻红胆素)合成酶基因。
BDFP3.3序列(已公开在专利CN2018113993152)
NREVVETLKEFLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGDASVLDERLLAGLRDTFNSLGIPLGPTARSIQLMKKIVKEKLVTAGNITFVDEPFDYIAREISETEIGHGTGSTGSGSVINGAHQRDRYPNHSEMQTLSTFERTGNQRTEIAQTLAQHANEIVAAGGKRIFVGGNPMAYFEQPEELVGMPGSGYFVAEDYLSPKSRRQTGNGSVQNSSSSITNPVAYEKGDFFSGKPSVPSRFQANIADYGAVRMKKAMRDLGWFLRYITYAVVAGDTSIITVNTRGLRGIIPEDVTVATTVALQEMQWKSLSFFPVDSAAAALVRRYFDVLIADYQVHGTGSTNREVVETLKEFLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGDASVLDERLLAGLRDTFNSLGIPLGPTARSIQLMKKIVKELVTAGMNITFVDEPFDYIAREISETEI(SEQ ID NO.1)
大肠杆菌表达及蛋白亲和层析纯化
将经转化的BL21细胞在18℃，培养在补充有卡那霉素(20μg/ml)和氯霉素(17μg/ml)LB培养基中。当O.D值达到0.4～0.6时，使用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达5～16小时，然后在4℃，12,000×g离心3min，收集细胞，经水冲洗2次，短期保存在4℃或者置于-20℃长期保存。
在上述收集的细胞中，加入5mL预冷的上样缓冲液充分重悬，利用超声的方式进行破碎，细胞的重悬液必须放置在冰水混合物中。超声功率设置为300W，时长1s，间隔2s，共240次。超声结束后，放置4℃，12000r/min，离心40min后，即可取上清，进行镍离子金属螯合亲和层析提纯。
镍离子金属螯合亲和层析具体步骤如下：
首先向Ni柱中加入2倍柱体积的200mM氯化镍，待氯化镍流尽以后加单蒸水直至留下来的溶液不再含氯化镍(绿色)为止；
然后用5倍柱体积的上样缓冲液平衡Ni柱，之后就可以上样。上样后依次用5倍柱体积的上样缓冲液和10倍柱体积的去杂蛋白液清洗柱子；
最后用1mL的目的蛋白洗脱液将目的蛋白洗脱下来。Ni柱使用完毕后需要用ElutionBuffer洗脱掉Ni离子，最后用5倍柱体积单蒸水处理。层析柱料于4℃用20％乙醇封存。洗脱下来的目的蛋白需要在4℃，不含咪唑的上样缓冲液中过夜透析。
哺乳动物细胞表达
进行蛋白的体外表达的同时，本发明还进行蛋白体内的表达。将HEK 293T、HeLa或U-2OS细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)中，将CHO-K1细胞培养在含10％胎牛血清的F-12K培养基中。使用2000(Invitrogen)进行转染。
转染时，2000与质粒DNA以3:1(μl:μg)的比率在无血清培养基Opti-中混合10分钟后，立即加入到要转染的细胞中。5～6h后，更换新鲜的DMEM培养基。24h后，通过镜检，分析其有效荧光亮度。
BDFP3等荧光蛋白基因序列通过克隆，转染进入哺乳动物细胞HEK293T体内表达，同时加入外源PEB进行培养。24h后，通过镜检，进行动物组织成像。
藻红胆素PEB的使用
提纯的色素溶于DMSO，终浓度1mM；荧光蛋白FP溶于磷酸盐缓冲液(20mM KPB，0.5MNaCl，pH5.6)中，蛋白终浓度为5μM。每1mL纯化后的荧光蛋白FP加入5μL色素。在DMEM培养基中标记哺乳动物细胞时，色素要分3小时持续添加，使得色素能充分扩散进入细胞。筛选色素PEB的终浓度，测得有效亮度。
实施例2
取实施例1制备的藻红胆素，终浓度为10μM，操作方法同实施例1，测得有效亮度。
实施例3
取实施例1制备的藻红胆素，终浓度为20μM，操作方法同实施例1，测得有效亮度。
表1色素PEB的终浓度条件优化
如表1所示，发现添加后的藻红胆素PEB在溶液中的终浓度为5μM时，有效亮度最高为100％，远高于其他有效亮度。因此选择5μM的PEB制备荧光蛋白。
实施例4
本发明BDFP3等荧光蛋白基因序列通过克隆，转化进入含藻红色素合成基因的大肠杆菌体内表达，提取后进行亲和层析纯化，可得到荧光蛋白BDFP3.3(PEB-BDFP3)。通过三倍体荧光蛋白融合模式，得到高亮度的远红光荧光蛋白BDFP1.2:3.3:1.2，通过提高荧光量子产率和能量转换效率，从而提高了有效亮度。然后进行光谱分析，测得各项光谱数据。通过分子筛纯化分析，确定其聚合态。
同时将BDFP3等荧光蛋白基因序列通过克隆，感染进入哺乳动物细胞HEK293T体内表达，同时加入外源PEB进行培养。24h后，通过镜检，分析其有效荧光亮度。
BDFP1.2:3:1.2序列(已公开在专利CN2018113996220)。
NREVVETLKELLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDERLLAGFRDTFNSLGIPLCPTARSIQLMKKIVKEKLATAGTNIAFVDEPFDYIAREISETEIGHGTGSTGSGSVINGAHQRDRYPNHSEMQTLSTFERTGNQRTEIAQTLAQHANEIVAAGGKRIFVGGNPMAYFEQPEELVGMPGSGYFVAEDYLSPKSRRQTGNGSVQNSSSSITNPVAYEKGDFFSGKPSVPSRFQAINIADYGAVRMKKAMRDLGWFLRYITYAVVAGDTSIITVNTRGLRGIIPEDVTVATTVALQEMQWKSLSFFPVDSAAAALVRRYFDVLIADYQVGHTGSTNREVVETLKELLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDERLLAGFRDTFNSLGIPLCPTARSIQLMKKIVKELATAGMTNIAFVDEPFDYIAREISETEI(SEQ ID NO.2)
实施例5
在本发明已经制备好的BDFP3.3基础上，通过三倍体荧光蛋白融合模式，得到高亮度的远红光荧光蛋白BDFP1.6:3.3:1.6，通过提高荧光量子产率和能量转换效率，从而提高了有效亮度。
BDFP1.6:3:1.6的结构为BDFP1.6-L1-BDFP3-L2-BDFP1.6，其中L1有9个氨基酸残基(L1＝GHGTGSTGS)，L2有7个氨基酸残基(L2＝GHGTGST)。
其中制备的BDFP3.3和BDFP1.2/1.6:3.3:1.2/1.6可以组合使用，实现原核细胞和哺乳动物细胞中各种蛋白的双色标记。
BDFP1.6:3:1.6序列为：
NREVVETLKELLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDGRMLAGFRDTFNSLGIPLCPAARGIQLMKKIVKEKLATAGNIAFVDEPFDYIARVISETEIGHGTGSTGSVINGAHQRDRYPNHSEMQTLSTFERTGNQRTEIAQTLAQHANEIVAAGGKRIFVGGNPMAYFEQPEELVGMPGSGYFVAEDYLSPKSRRQTGNGHSQNSSSSITNPVAYEKGDFFSGKPSVPSRFQANIADYGAVRMKKAMRDLGWFLRYITYAVVAGDTSIITVNTRGLRGIIPEDVTVATTVALQEMQWKSLSFFPVDSAAAALVRRYFDVLIADYQVGHTGSTNREVVETLKELLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDGRMLAGFRDTFNSLGIPLCPAARGIQLMKKIVKEKLTAGMNIAFVDEPFDYIARVISETEI(SEQ ID NO.3)
对本发明制备好的荧光蛋白进行效果检测。
聚合态检测
蛋白首先通过镍柱亲和层析纯化，洗脱收集1mL样品，然后上样至分子筛柱进行纯化。柱型为Superdex 75(301.0cm)，洗脱速度0.5mL/min，洗脱缓冲液为KPB(20mM，pH5.6，含0.5M NaCl)。通过与一组蛋白质Marker(12-66kDa，Sigma–Aldrich)进行对比，可检测样品的分子量大小。
图2中显示BDFP3.3及其融合蛋白在溶液中的聚合态分析，其分子量与理论单体分子量大小一致。
广域与超分辨率显微镜成像
成像要求使用individual模式，和配有1001.49NA油浸物镜的ECLIPSE Ti-E倒置尼康显微镜上的尼康结构化照明系统，来获取广域和结构化照明显微镜(SIM)照片。使用560nm的半导体激光器(100mW,COHERENT)激发FR荧光。使用受NIS-Elements AR软件(尼康)控制的电子倍增CCD相机(Andor iXon3DU897)进行数据采集。使用NIS-Elements AR对图像进行处理。
共焦激光扫描显微镜成像要求使用可调节的光谱扫描系统，垂直的Olympus(fv-1000mp,Olympus)，同时配有100油浸物镜。远红光荧光采用559nm(20mW)激光激发。信号采集是使用高灵敏的光电倍增管(PMT)，由FV10-ASW 3.1Viewer software软件控制。
图3为BDFP3.3的有效亮度镜检图，其中A)、B)分别为BDFP3.3，即有PEB添加，C)为无PEB添加，阴性对照；镜检参数：绿色(λex＝470/40；λem＝510/40nm)，适用eGFP；红色(λex＝580/25；λem＝620/20nm)，适用BDFP3.3。
蛋白质定量
蛋白浓度检测使用Bradford法，参照物为牛血清白蛋白。
光谱分析
通过分光光度计(DU800，Beckman–Coulter)来检测色素蛋白的紫外-可见吸收光谱。共价结合的胆色素BV，在390nm处的吸收系数＝39,900M-1cm-1；非共价结合的藻红色素PEB(溶于尿素溶液，pH2)，在590nm处的吸收系数＝49000M-1cm-1。
通过荧光分光光度计(F320，天津港东科技发展股份有限公司)检测荧光光谱。
纯化后的样品，进行荧光发射光谱检测以及吸收光谱扫描，其特征吸收以及荧光光谱如表1所示。
表1：BDFP3.3及其融合蛋白的光谱数据
将本发明制备的蛋白在广域(wf)和结构化照明显微镜细胞镜检，图4显示本发明制备的蛋白可在哺乳动物中作为荧光标记，亮度明显。图5为本发明制备的蛋白双色标记人蛋白，亮度明显。
结果；
1)BDFP3.3，荧光量子产率高，有效亮度约为58％，可用于生物荧光标记(单体，但是荧光在红光区域，参比对象为mCherry)。
2)BDFP1.2:3.3:1.2，有效亮度提高(单体，FR区域，参比对象iRFP670)。
3)BDFP1.6:3.3:1.6，有效亮度提高(单体，FR区域，参比对象iRFP670)。
本发明公开了荧光藻胆蛋白BDFP3.3的制备方法，使得BDFP3.3的荧光量子产率高达66％，最大吸收位置为608nm，荧光为619nm。在荧光藻胆蛋白BDFP3.3的基础上，构建了两种三倍体荧光藻胆蛋白，分别命名为BDFP1.2:3.3:1.2和BDFP1.6:3.3:1.6，单体形态。
使用时，激发能量在红光区域被BDFP3.3结合的藻红胆素所吸收，然后传递到BDFP1.2或者BDFP1.6结合的胆绿素上，发出的荧光位置接近670nm(远红光区域)。
BDFP3.3和BDFP1.2/1.6:3.3:1.2/1.6在实际应用中可以组合使用，实现原核细胞和哺乳动物细胞中各种蛋白的双色标记。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学 广州天宝颂原生物科技开发有限公司
<120> 结合藻红胆素的荧光生物标记物及标记方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Asp Gly Glu
1 5 10 15
Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala Glu Val
20 25 30
Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu Leu Val
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met Cys Val
50 55 60
Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile Val Ala
65 70 75 80
Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu Arg Asp
85 90 95
Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg Ser Ile
100 105 110
Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala Gly Asn
115 120 125
Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala Arg Glu Ile Ser
130 135 140
Glu Thr Glu Ile Gly His Gly Thr Gly Ser Thr Gly Ser Gly Ser Val
145 150 155 160
Ile Asn Gly Ala His Gln Arg Asp Arg Tyr Pro Asn His Ser Glu Met
165 170 175
Gln Thr Leu Ser Thr Phe Glu Arg Thr Gly Asn Gln Arg Thr Glu Ile
180 185 190
Ala Gln Thr Leu Ala Gln His Ala Asn Glu Ile Val Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Lys Arg Ile Phe Val Gly Gly Asn Pro Met Ala Tyr Phe Glu Gln Pro
210 215 220
Glu Glu Leu Val Gly Met Pro Gly Ser Gly Tyr Phe Val Ala Glu Asp
225 230 235 240
Tyr Leu Ser Pro Lys Ser Arg Arg Gln Thr Gly Asn Gly Ser Val Gln
245 250 255
Asn Ser Ser Ser Ser Ile Thr Asn Pro Val Ala Tyr Glu Lys Gly Asp
260 265 270
Phe Phe Ser Gly Lys Pro Ser Val Pro Ser Arg Phe Gln Ala Asn Ile
275 280 285
Ala Asp Tyr Gly Ala Val Arg Met Lys Lys Ala Met Arg Asp Leu Gly
290 295 300
Trp Phe Leu Arg Tyr Ile Thr Tyr Ala Val Val Ala Gly Asp Thr Ser
305 310 315 320
Ile Ile Thr Val Asn Thr Arg Gly Leu Arg Gly Ile Ile Pro Glu Asp
325 330 335
Val Thr Val Ala Thr Thr Val Ala Leu Gln Glu Met Gln Trp Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Phe Phe Pro Val Asp Ser Ala Ala Ala Ala Leu Val Arg Arg
355 360 365
Tyr Phe Asp Val Leu Ile Ala Asp Tyr Gln Val His Gly Thr Gly Ser
370 375 380
Thr Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Asp Gly
385 390 395 400
Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala Glu
405 410 415
Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu Leu
420 425 430
Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met Cys
435 440 445
Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile Val
450 455 460
Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu Arg
465 470 475 480
Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg Ser
485 490 495
Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Leu Val Thr Ala Gly Met
500 505 510
Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala Arg Glu Ile
515 520 525
Ser Glu Thr Glu Ile
530
<210> 2
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Leu Leu Ala Asp Gly Glu
1 5 10 15
Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala Glu Val
20 25 30
Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu Leu Val
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met Cys Val
50 55 60
Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile Val Ala
65 70 75 80
Gly Gly Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Phe Arg Asp
85 90 95
Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Cys Pro Thr Ala Arg Ser Ile
100 105 110
Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala Gly Thr
115 120 125
Asn Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala Arg Glu Ile
130 135 140
Ser Glu Thr Glu Ile Gly His Gly Thr Gly Ser Thr Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ile Asn Gly Ala His Gln Arg Asp Arg Tyr Pro Asn His Ser Glu
165 170 175
Met Gln Thr Leu Ser Thr Phe Glu Arg Thr Gly Asn Gln Arg Thr Glu
180 185 190
Ile Ala Gln Thr Leu Ala Gln His Ala Asn Glu Ile Val Ala Ala Gly
195 200 205
Gly Lys Arg Ile Phe Val Gly Gly Asn Pro Met Ala Tyr Phe Glu Gln
210 215 220
Pro Glu Glu Leu Val Gly Met Pro Gly Ser Gly Tyr Phe Val Ala Glu
225 230 235 240
Asp Tyr Leu Ser Pro Lys Ser Arg Arg Gln Thr Gly Asn Gly Ser Val
245 250 255
Gln Asn Ser Ser Ser Ser Ile Thr Asn Pro Val Ala Tyr Glu Lys Gly
260 265 270
Asp Phe Phe Ser Gly Lys Pro Ser Val Pro Ser Arg Phe Gln Ala Ile
275 280 285
Asn Ile Ala Asp Tyr Gly Ala Val Arg Met Lys Lys Ala Met Arg Asp
290 295 300
Leu Gly Trp Phe Leu Arg Tyr Ile Thr Tyr Ala Val Val Ala Gly Asp
305 310 315 320
Thr Ser Ile Ile Thr Val Asn Thr Arg Gly Leu Arg Gly Ile Ile Pro
325 330 335
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340 345 350
Lys Ser Leu Ser Phe Phe Pro Val Asp Ser Ala Ala Ala Ala Leu Val
355 360 365
Arg Arg Tyr Phe Asp Val Leu Ile Ala Asp Tyr Gln Val Gly His Thr
370 375 380
Gly Ser Thr Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Leu Leu Ala
385 390 395 400
Asp Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala
405 410 415
Ala Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro
420 425 430
Glu Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn
435 440 445
Met Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala
450 455 460
Ile Val Ala Gly Gly Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly
465 470 475 480
Phe Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Cys Pro Thr Ala
485 490 495
Arg Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Leu Ala Thr Ala
500 505 510
Gly Met Thr Asn Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
515 520 525
Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
530 535
<210> 3
<211> 531
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Leu Leu Ala Asp Gly Glu
1 5 10 15
Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala Glu Val
20 25 30
Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu Leu Val
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met Cys Val
50 55 60
Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile Val Ala
65 70 75 80
Gly Gly Ala Ser Val Leu Asp Gly Arg Met Leu Ala Gly Phe Arg Asp
85 90 95
Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Cys Pro Ala Ala Arg Gly Ile
100 105 110
Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala Gly Asn
115 120 125
Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala Arg Val Ile Ser
130 135 140
Glu Thr Glu Ile Gly His Gly Thr Gly Ser Thr Gly Ser Val Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ala His Gln Arg Asp Arg Tyr Pro Asn His Ser Glu Met Gln Thr
165 170 175
Leu Ser Thr Phe Glu Arg Thr Gly Asn Gln Arg Thr Glu Ile Ala Gln
180 185 190
Thr Leu Ala Gln His Ala Asn Glu Ile Val Ala Ala Gly Gly Lys Arg
195 200 205
Ile Phe Val Gly Gly Asn Pro Met Ala Tyr Phe Glu Gln Pro Glu Glu
210 215 220
Leu Val Gly Met Pro Gly Ser Gly Tyr Phe Val Ala Glu Asp Tyr Leu
225 230 235 240
Ser Pro Lys Ser Arg Arg Gln Thr Gly Asn Gly His Ser Gln Asn Ser
245 250 255
Ser Ser Ser Ile Thr Asn Pro Val Ala Tyr Glu Lys Gly Asp Phe Phe
260 265 270
Ser Gly Lys Pro Ser Val Pro Ser Arg Phe Gln Ala Asn Ile Ala Asp
275 280 285
Tyr Gly Ala Val Arg Met Lys Lys Ala Met Arg Asp Leu Gly Trp Phe
290 295 300
Leu Arg Tyr Ile Thr Tyr Ala Val Val Ala Gly Asp Thr Ser Ile Ile
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Phe Phe Pro Val Asp Ser Ala Ala Ala Ala Leu Val Arg Arg Tyr Phe
355 360 365
Asp Val Leu Ile Ala Asp Tyr Gln Val Gly His Thr Gly Ser Thr Asn
370 375 380
Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Leu Leu Ala Asp Gly Glu Lys
385 390 395 400
Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala Glu Val Val
405 410 415
Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu Leu Val Ser
420 425 430
Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met Cys Val Arg
435 440 445
Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile Val Ala Gly
450 455 460
Gly Ala Ser Val Leu Asp Gly Arg Met Leu Ala Gly Phe Arg Asp Thr
465 470 475 480
Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Cys Pro Ala Ala Arg Gly Ile Gln
485 490 495
Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Thr Ala Gly Met Asn Ile
500 505 510
Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala Arg Val Ile Ser Glu
515 520 525
Thr Glu Ile
530

Claims (8)

1.一种荧光蛋白，其特征在于，包括脱辅基蛋白以及藻红色素，其脱辅基蛋白的3个氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。
2.权利要求1所述的荧光蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将荧光蛋白基因序列fp插入到质粒pcDNA3.1；
2)将2000与质粒DNA以3μl：1μg的比率混合，共转染到细胞HEK293T体内表达，同时添加PEB进行培养，得到荧光蛋白，后续镜检进行动物细胞组织成像。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的PEB的终浓度为5～20um；优选的PEB终浓度为5um。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的提纯为镍离子金属螯合亲和层析提纯。
5.权利要求1制备的荧光蛋白在生物标记中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，荧光蛋白的标记方法为：
1)将荧光蛋白基因序列fp插入到质粒pcDNA3.1；
2)将2000与质粒DNA以3μl：1μg的比率混合，共转染到细胞HEK293T体内表达，同时添加PEB进行培养得到荧光蛋白，后续镜检进行动物细胞组织成像。
7.一种融合蛋白，其特征在于，结构为BDFP1.6-GHGTGSTGS-BDFP3-GHGTGST-BDFP1.6；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.权利要求7制备的融合蛋白在生物标记中的应用。
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