CN110386977B - 一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白 - Google Patents

一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白，所述近红外光荧光蛋白包括BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列，并且包括在第113位、125位和127位的氨基酸处的突变，所述BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列如SED ID NO:1所示。本发明公开的近红外光荧光蛋白的光谱性质多样，有效亮度高于现有已知的近红外光荧光蛋白，在低pH、高浓度盐酸胍溶液或高温的环境中，都具有优异的稳定性，而且也能耐受光漂白。

Description

一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白
技术领域
本发明属于荧光标记物技术领域，更具体地，涉及一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白。
背景技术
远红光(FR)或近红外光(NIR)在动物组织中光吸收和光散射较低，有较高的穿透性，是穿透皮肤等大部分组织的能力最大的光谱区域。具有这类发光色素基团的荧光蛋白更适宜于动物活体组织的深层成像，是活体成像更为理想的荧光标记物。
目前该类荧光标记物主要有两种，分子量大小均在35kD左右。一种源自绿色荧光蛋白(GFP),能自催化形成发色团，但是光谱范围有一定局限性，最大荧光发射波长一般在670nm 左右，例如标记物TagRFP675。另一种源自存在千细菌中的受体蛋白，细菌光敏色素蛋白 (BphP)。BphP主要利用线性四吡咯结构的胆绿素(BV)作为发色团；同时胆绿素BV广泛存在千真核生物体内，这意味着BphP类荧光标记物可应用于活的动物细胞和组织，且无需任何酌或外源辅助因子。BphP类标记物的代表iFP系列和iRFP系列，荧光发射波长范围为670nm-720nm，比如IFP2.0最大荧光发射波长714nm。
藻胆蛋白(phycobi1iprotein)存在远红光范围的荧光发射，机制与细菌光敏色素蛋白 (BphP)类似，主要源自于非共价结合的藻蓝胆素(PCB)。典型的藻胆蛋白类荧光标记物，例如ApcA、smURFP、ApcF2，它们的最大荧光发射波长为698nm。
Ding W L等人基于藻胆蛋白体的核心亚基ApcF2的序列，进行基因改造后得到了几种新的荧光藻胆蛋白并将其命名BDFP，这些BDFP蛋白可共价结合胆绿素BV，性能比ApcF2稳定，另外，这些BDFP蛋白的分子最较小，约15kD，最大荧光发射波长为710nm左右。
虽然Ding W L等人得到的BDFP蛋白很好地弥补了现有的远红光或近红外光的荧光蛋白的上述缺点，但是这些蛋白荧光发射波长比较单一(均在710nm左右)，因此不能有效地组合使用。因此通过基因工程改造，得到亮度更高、光谱性质更为多样和优异的荧光蛋白，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中近红外光荧光蛋白种类不多、发射波长较为单一且亮度不够高的技术不足，提供一种近红外光荧光蛋白。
本发明要解决的另一技术问题是提供一种融合荧光蛋白。
本发明还一要解决的技术问题是提供编码上述近红外光荧光蛋白或融合荧光蛋白的核酸。
本发明还一要解决的技术问题是提供一种包括上述核酸的载体。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种近红外光荧光蛋白，所述近红外光荧光蛋白包括BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列，并且包括在第113位、125位和127位的氨基酸处的突变，所述BDFP远红光荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述近红外光荧光蛋白还包括在第30、50、54、57、76、77、80、81、94、101、108、143和/或151位的氨基酸处的突变。
优选地，其特征在于，第113位苯丙氨酸突变为亮氨酸；第125位半胱氨酸突变为甘氨酸；第127位丙氨酸突变为苏氨酸或颉氨酸。
优选地，第30位亮氨酸突变为苯丙氨酸；第50位谷氨酸突变为颉氨酸；第54位苏氨酸突变为丝氨酸；第57位丝氨酸突变为甘氨酸；第76位苏氨酸突变为丙氨酸；第77位精氨酸突变为组氨酸；第80位天冬酰胺突变为懒氨酸；第81位甲硫氨酸突变为赖氨酸；第94位丝胺酸突变为天冬氨酸；第101甘氨酸突变为天冬氨酸；第108位精氨酸突变为谷氨酰胺；第 143位丙氨酸突变为颉氨酸；第151位丙氨酸突变为苏氨酸。
更进一步地，所述近红外光荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2～14任一所示。
提供一种二倍串联融合荧光蛋白，采用连接子串联上述近红外光荧光蛋白的氨基酸序列。
进一步地，所述连接子序列为GHGTGSTGSGS(SEQ ID NO:15)。
优选地，所述二倍串联融合荧光蛋白为BDFP1.7:1.7或BDFP1.8:1.8，即两个BDFP1.7 蛋白用过连接子连接成为二倍串联融合荧光蛋白BDFP1.7:1.7，或两个BDFP1.8蛋白用过连接子连接成为二倍串联融合荧光蛋白BDFP1.8:1.8.
提供一种融合荧光蛋白，所述融合荧光蛋白包括上所述近红外光荧光蛋白或上述二倍串联融合荧光蛋白。
进一步地，采用连接子连接上述近红外荧光蛋白与其他蛋白或多肽。
优选地，所述连接子的序列为GGGSGGGSGGGSSG(SEQ ID NO:16)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSSG(SEQ ID NO:17)或 MSRRRHSYENDGGQPHKRRKTSPPVAT(SEQ IDNO:18)。
提供编码上述近红外光荧光蛋白、上述二倍串联融合荧光蛋白或上述融合荧光蛋白的核酸。
提供一种包括上述核酸的载体。
本发明的有益效果是：
本发明提供了多种近红外光荧光蛋白，发射波长在694nm到705nm左右，且保留了现有 BDFP1.6高亮度的特性，提供了一系列光谱性质更为多样的近红外光荧光蛋白。其中，BDFP1.7 序列的荧光范围红移至近红外光范围，保留了高亮度的特性，对比BDFP1.1，有效亮度提升至其6.25倍，但是仍不如iRFP720；V6序列的突变体，可明显提升有效亮度，约为BDFP1.7 的2.3倍；在V6序列的基础上，得到的BDFP1.8(V10序列)，其有效亮度约为V6序列蛋白的1.4倍，iRFP720的2.4倍。
此外，本发明进一步提供了通过串联单体结构的BDFP，得到的二倍串联融合荧光蛋白 BDFP1.7:1.7、BDFP1.8:1.8，其中BDFP1.8:1.8为单体结构，有效亮度4.4倍于iRFP720。在应用方面，单体结构的荧光蛋白，由于不会影响目标蛋白的化学计量，因而更适合作为蛋白融合标签序列。
本发明提供的多种近红外光荧光蛋白在低pH、高浓度盐酸胍溶液或高温的环境中，都具有优异的稳定性，而且也能耐受光漂白。
近红外荧光蛋白(FPs)是实现深度成像的有力工具，本发明为深度成像的荧光蛋白提供的了更多的选择，且本发明提供的近红外荧光蛋白可与其他荧光蛋白联合使用。
附图说明
图1 BDFPs荧光蛋白的光谱和亮度比较：(a)BDFPs的吸光度和荧光光谱，蛋白样品经 Ni2+亲和层析纯化；(c)相同条件下HEK 293t细胞中BDFPs与iRFP720和IFP2.0的有效亮度比较。平均近红外荧光强度归一化为平均eGFP荧光强度。误差条，SEM(n＝3，图像数量)。(d)相同条件下hek293t的有效亮度与近红外FPs分子亮度的比较。将BDFP1.7的有效亮度和分子亮度设为100％。
图2 BDFP1.8的模拟结构和聚集作用分析。(a)BDFP1.8的模拟结构图，红色表示与光谱红移的氨基酸，蓝色与粉色表示与有效亮度相关的氨基酸；(b)和(c)分别为BDFP1.8在M81K和A127V处的局部结构。
图3 BDFPs荧光蛋白与BV的体外聚合作用。溶液中BDFPs BV的荧光增强。将18μMBDFPs与0.1(a),(b)1，(c)10μM BV在KPB缓冲液(包含150mM/L氯化钠，pH值7.2) 中孵化，利用F＝A1-A2exp-kt方程拟合荧光指数增长。(d)HEK 293t细胞中BDFPs的有效亮度与平均k值(t50％＝ln2/k)的关系，BDFP1.7的有效亮度设为1。
图4 BDFPs荧光蛋白分子大小及细胞内荧光强度。(a)BDFPs荧光蛋白经排阻色谱的结果；(b)使用的蛋白marker经排阻色谱的结果；(c)BDFPs荧光蛋白SDS-PAGE结果；(d)eGFP、mCherry、BDFPs融合荧光蛋白的质粒在HeLa细胞中表达后的荧光显微成像；(e) 几种融合荧光蛋白在HeLa细胞的光滑内质网的荧光强度比。
图5 BDFPs与IFP2.0、iRFP720在HEK 293T细胞中的光漂白处理中荧光的保持时间：在HEK 293T细胞中表达BDFPs、IFP2.0和iRFP720，转染24小时后检测对其进行光漂白处理，在640nm二极管激光器(最大输出功率为100mW的77％)的连续照射下，检测荧光的保持时间。
图6 HeLa细胞中BDFP与人类蛋白融合蛋白的荧光显微成像。(a)BDFPs与组蛋白H2B、细胞核定位序列(NLS)、钙连接蛋白、Tomm20；β-actin和角蛋白的融合蛋白的荧光显微成像；(b)HeLa细胞中双重荧光显微成像，分别在线粒体和细胞核中共表达BDFP1.6与BDFP1.8，BDFP1.6成像使用λex＝630/20nm和λem＝667/30nm过滤器(left column),BDFP1.8成像使用λex＝685/20和λem＝740/40nm过滤器(middle column)，比例尺：10μm。
图7 BDFPs与IFP2.0、iRFP720的体外稳定性比较。(a)pH2-9酸碱环境下，BDFPs与IFP2.0、iRFP720的稳定性；(b)BDFPs与IFP2.0、iRFP720与在不同浓度盐酸胍(GdnHCl) 溶液(pH 7.2)中的稳定性；(c)BDFPs与IFP2.0、iRFP720在80℃高温下的稳定性；(d)BDFPs 与IFP2.0、iRFP720光漂白处理中荧光的保持时间：FPs在KPB缓冲液(pH 7.2)中，100W HBO103W/2灯照射下的光漂白，BDFPs和IFP2.0采用近红外滤光片组(λex＝650/45nm和λem＝710/50nm)，iRFP720采用近红外滤光片组(λex＝650/45nm和λem＝720/40nm)，将光通过 C-Apochromat油浸透镜(100×，数值孔径＝1.2)聚焦在Zeiss Axioscope A1显微镜上，该显微镜配有cool-snap HQ2CCD相机，荧光强度曲线拟合采用单指数衰减。
具体实施方式
以下结合具体的实施例与附图对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 BDFPs突变体的载体构建、表达及性质测定
突变起始模板BDFP1.6(SEQ ID NO.1，即 ApcF2(20-169)-F30L/S46T/I51V/N72C/Y82C/Y92M/D101G/E107G/L109M/L113F/G125C/T127 A/S130G/N136K/V143A/T151A/V160I/V161A/E163V)来源于藻种Chroococcidiopsisthermalis sp.PCC7203的藻胆体核亚基蛋白ApcF2。BDFP1.6，由BDFP1.1 (ApcF2(20-169)-S46T/I51V/N72C/Y82C/Y92M/N136K/V160I/V161A)进化而来。BDFP1.6的荧光范围由近红外光蓝移至远红光；特别是其有效亮度甚至优于常用的iRFP670，而分子量只有其一半大小。
通过长时间创造性地研究发现，第113位，125位和127位氨基酸残基对BDFPs蛋白的光谱性质有着重要影响。BDFP1.1中的这些残基分别是亮氨酸(L)、甘氨酸(G)和苏氨酸(T)，而BDFP1.6中的苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)和丙氨酸。首先对BDFP1.6的序列的113位，125 位，127位氨基酸残基进行回复突变(F113L/C125G/A127T)得到BDFP1.7序列(SEQ IDNO.3)，后续基于BDFP1.7序列，对127位氨基酸残基再次突变(T127V)，得到的V6序列(SEQID NO.4)。进一步研究哪些氨基酸残基可能增强色素基团与脱辅基蛋白亲和力，后续在V6序列突变体的基础上，再进一步针对相关氨基酸进行突变，得到V7～V18的序列。具体序列名称、突变位点、对应序列序号见下表1。
表1蛋白/突变体名称、突变位点及编号
Figure BDA0002114798230000051
Figure BDA0002114798230000061
1.克隆及融合体构建
pET28和pACYCDuet(Novagen)是T7启动子表达载体。pACYCDuet经设计，能够用于双目的基因序列在大肠杆菌(E.coli)内共同转化表达。
荧光蛋白序列的编码基因可通过酶切位点NcoI和XhoI，克隆进入pET28a载体。血红素氧化酶基因ho1可克隆进入pACYCDuet载体质粒，用于产生胆绿素BV。
表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)是带有CMV启动子的哺乳动物类表达载体。
在HEK 293T细胞内进行筛选时，使用表达载体pcDNA3.1，设计融合表达序列为FP:IRES:eGFP。作亮度对比时，可基于eGFP的荧光亮度，对FP蛋白的荧光亮度进行修正。
二倍串联融合蛋白设计(BDFP1.7:1.7，BDFP1.8:1.8等)，采用的连接序列(linker)为 11个氨基酸残基的连接子：GHGTGSTGSGS(SEQ ID NO.15)。采用一步克隆的方法构建了 BDFP 1.7:1.7和BDFP 1.8:1.8的DNA。
2.大肠杆菌表达
将带有编码荧光蛋白的pET表达载体转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)后，再将载体pACYC-ho1转化到同一菌株中。将经转化的BL21细胞在18℃，培养在补充有卡那霉素(20μg/ml)和氯霉素(17μg/ml)LB培养基中。当O.D值达到0.4～0.6时，使用1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达5～16小时，然后在4℃，12,000×g离心3min，收集细胞，经水冲洗2次，短期保存在4℃或者置于-20℃长期保存。
3.哺乳动物细胞表达
将HEK 293T或HeLa细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)中。使用
Figure BDA0002114798230000062
3000(Invitrogen)进行转染。转染时，
Figure BDA0002114798230000063
2000与DNA以 2:1(μl:μg)的比率在无血清培养基
Figure BDA0002114798230000064
中混合10分钟后，立即加入到要转染的细胞中。6～8h后，更换新鲜的DMEM培养基。
荧光蛋白表达24h后开始进行活体细胞成像(镜检)。成像前先用1mL PBS冲洗两次，然后用DEME培养基(无酚红)冲洗一次。成像设备为倒置显微镜Nikon Ti，配有cool-snap HQ2CCD相机和Nikon Plan Fluor ELWD 20×0.45-DIC L-WD物镜。激发和发射设置如下： eGFP为绿色通道，λex＝470/40，λem＝510/40nm；近红外光BDFPs蛋白和IFP2.0为近红外光通道1，λex＝650/40，λem＝710/50nm；iRFP720为近红外光通道2，λex＝650/40，λem＝720/40nm。图片使用ImageJ软件(National Institutes of Health)进行分析和处理。
4.蛋白纯化与定量
将湿菌体悬浮在冰预冷的起始缓冲液[磷酸钾缓冲液(KPB,20mM,pH 7.2)，氯化钠(NaCl, 0.5M)]中。经50W功率超声(JY92-II,宁波新芝生物科技股份有限公司，中国)破碎，5分钟。悬浮液在4℃，12000×g离心60分钟。得到的上清液经Ni2+亲和层析柱(AmershamBiosciences)纯化，其中使用起始缓冲液[磷酸钾(KPB,20mM,pH 7.2)上样，使用额外含有0.5M咪唑的缓冲液进行洗脱。收集到的样品，用起始缓冲液(pH 7.2)透析至少两次。通过Bradford法测定蛋白浓度，使用牛血清白蛋白作为标准品进行校正。纯化后的蛋白经排阻色谱以及SDS-PAGE验证蛋白分子大小。用Zn2+诱导的荧光法对其染色，然后用考马斯亮蓝染色，结果如附图4(c)所示。
5.同源建模分析
BDFP荧光蛋白结构比对，在SWISS-MODEL远程服务器上完成。采用的模板序列为层理鞭枝藻(Mastigocladuslaminosus)的藻胆蛋白ApcB(pdb code:1B33)，对比软件为Swiss-PDB Viewer，版本4.1。采用PyMOL(http://www.pymol.org/)创建蛋白结构图。采用Clustal (http://www.clustal.org/)创建完成蛋白序列比对图。
6.蛋白寡聚状态分析
采用分子筛纯化法，通过与一组蛋白质Marker(12-66kDa；Sigma-Aldrich)进行对比，可测定蛋白样品的分子量大小，进而推算其寡聚状态。蛋白样品上样量为1mL，样品经过Ni2+亲和层析纯化，并透析至KPB缓冲液(20mM,pH7.2,含150mM NaCl)条件下。分子筛柱型为Superdex 75(30×1.0cm)，洗脱缓冲液条件同样品。
7.光谱分析
将Ni2+亲和层析纯化的荧光蛋白进行吸收光谱检测，是通过UV-9000S分光光度计(Shanghai Metash Instruments Co.,Ltd)来完成。
荧光蛋白的消光系数是依据胆色素BV在390nm处的吸收系数ε＝39,900M-1cm-1，进行参比换算的。
荧光光谱是通过荧光分光光度计(F320，天津港东科技发展股份有限公司)来检测完成。参考BDFP1.1荧光蛋白(ΦF＝0.059)检测荧光量子产率ΦF，样品检测环境为磷酸钾盐溶液 (20mM,pH 7.2，KPB)。
8.广域与超分辨率显微镜成像
在室温，通过独立模式，使用配有100×1.49NA油浸物镜的ECLIPSE Ti-E倒置尼康显微镜上的尼康结构化照明系统，获取广域和结构化照明显微镜(SIM)照片。使用640nm的半导体激光器(100mW,CUBE 640-100C,COHERENT)激发NIR荧光。使用受NIS-Elements AR软件(尼康)控制的电子倍增CCD相机(Andor iXon3 DU897)进行数据采集。使用NIS-Elements AR对图像进行处理。
9.定量与统计分析
所有的荧光照片都统一使用工具软件ImageJ(National Institutes of Health)进行调校分析。数据图和统计使用工具软件Origin 8.0(OriginLab)。
表2不同近红外光荧光蛋白(NIR FRs)的性质对比
Figure BDA0002114798230000081
从结果中可以看出，BDFP1.7蛋白，在680nm处吸收最多，在705nm处发出荧光。虽然BDFP1.7的分子亮度仅比BDFP1.1高1.09倍，但在HEK 293T细胞中，BDFP1.7的有效亮度比BDFP1.1高6.25倍。基于BDFP1.7序列，对127位氨基酸残基再次突变(T127V)得到的V6突变体，显著提高了BDFP1.7的有效亮度2.3倍。模型结构表明，V6突变体中，两个甲基可能作为“钳”作用，通过范德瓦尔斯相互作用锁住BV染色质环，增强荧光，如附图2 (c)所示。另一个突变(M81K)可能会在染色质和脱辅基蛋白之间产生氢键，如附图2(b) 所示，所以加入了这个突变，使得有效亮度比V6突变体提高了1.4倍。
游离状态的BV是非荧光的，在体外，BDFPs与BV的结合需要三个动力学步骤，第一步，BDFP1.1、1.7、V6、1.8和脱辅基蛋白蛋白非共价结合BV，产生长波长发射(～712nm)。随后，光谱发生蓝移，荧光增强。BDFP1.2和1.6的蓝移为～40nm，而BDFP1.1、1.7、V6 突变体和1.8的蓝移仅为5-10nm。在第二步中，这种变化可能是由于在BV 3-乙烯基上添加了C82巯基导致共价附着，从而使荧光发生蓝移，如附图2(a)所示。此外，荧光的增加可以通过第三步共价染色质结合后的进一步重组来解释。有趣的是，BDFP1.8和V6突变体与 BV组装的速度要快于其他两个，如附图3所示；因此推测范德瓦尔斯相互作用和氢键可以显著加快BV组装的速度。此外，有效亮度与BV组装率的线性关系表明，BDFPs与BV组装越快，哺乳动物细胞的有效亮度越高，如附图3所示。有效亮度与分子亮度明显无关，如附图1(d)所示。
经过上述分子进化，得到的BDFP1.8(Fmax＝702nm)的近红外光荧光蛋白，其在HEK293T细胞中的有效亮度分别是BDFP1.1和BDFP1.7的20.25和3.24倍。此外，BDFP1.8有效亮度高于iRFP720的2.4倍，这是报告为最亮的与BV组装的近红外光荧光蛋白组装(见f 附图1(c)和表2)。且BDFP1.8只有iRFP720分子质量的一半，相比于iRFP720，BDFP1.8 应该是更优的荧光生物标记。
串联融合也是提高荧光蛋白在哺乳动物细胞中有效亮度的一种可行策略，我们使用11个氨基酸的连接子构建了BDFP1.7:1.7和1.8:1.8，发现它们的光谱分别与BDFP1.7和1.8相似，但溶液中的分子亮度较低，如附图1(a)、1(b)和表2所示。然而，在HEK 293t细胞中， BDFP1.7:1.7和1.8:1.8的有效亮度为BDFP1.7的1.8-2倍，如附图1(c)和表2所示。此外， BDFP1.8:1.8的有效亮度高于iRFP720的4.4倍，如附图1(c)和表2所示。根据现有的已知数据，BDFP1.8:1.8(Fmax＝702nm)是近红外区域中最亮的荧光蛋白。
用HeLa细胞检测BDFPs的低聚状态。转染和活细胞成像如上所述。选择二聚体荧光蛋白(eGFP)作为阳性对照，测定有组织的光滑内质网(OSER)结构；mCherry被报道为一种真正的单体荧光蛋白，作为阴性对照。利用ImageJ(美国国立卫生研究院)计算了OSER结构的平均强度与三个核膜(NE)区域的平均强度之比。在没有可见OSER结构的情况下，采用点状非 OSER结构，结果见下表3及附图4。从结果中可以看出，由于eGFP为二聚体结构，在细胞中组织定位时会有明显聚集作用，即为附图4中膜结构中的亮点，因信号过强反而可能存在显示不清细胞结构的情况，而单体结构的mCherry荧光蛋白则不会有聚集的亮点，也进一步佐证了BDFPs蛋白与mCherry荧光蛋白呈单体结构。
表3突变体序列(相比BDFP1.6)及其有效亮度(相比BDFP1.7)对比
Figure BDA0002114798230000101
HeLa细胞中表达eGFP、mCherry、BDFPs荧光蛋白，荧光显微成像见附图4(d)，对应的荧光强度比见附图4(e)。
实施例2 BDFPs突变体荧光蛋白的稳定性
本实施例检测了荧光蛋白对体外条件，例如酸碱、变性条件、高温、光漂白的耐受性。结果示于图7中。
图7(a)中展示了pH2-9酸碱环境下，BDFPs以及IFP2.0和iRFP720的稳定性，BDFPs的荧光强度在pH从9到2的范围内仅变化40％，而IFP2.0在pH3.5时、iRFP720在pH2时荧光已经完全猝灭了。这说明BDFPs在低pH下是相对稳定的。在酸性条件下，具有比IFP2.0 和iRFP720更高的稳定性。
图7(b)中展示了BDFPs以及IFP2.0和iRFP720在不同浓度的盐酸胍溶液中的荧光强度。从图中可以看出，IFP2.0、iRFP720和BDFP1.1在4M的盐酸胍溶液中荧光已经完全猝灭了，而BDFP1.7、1.8仍保留30％以上的荧光，说明BDFP1.7、1.8在高浓度变性剂条件下，相比IFP2.0和iRFP720具有更好的稳定性。
图7(c)中展示了BDFPs以及IFP2.0和iRFP720在80℃条件下荧光保持的时间。从图中可以看出，相比IFP2.0和iRFP720，BDFPs在80℃温浴2h后，仍保留有40％以上的荧光。而IFP2.0在80℃的高温下，10分钟就已经猝灭，iRFP720在80℃温浴2h后，荧光强度也降低到10％以下。
图7(d)中展示了BDFPs以及IFP2.0和iRFP720在光漂白处理中荧光的保持时间。从图中可以看出，BDFPs在光漂白处理中荧光的保持时间也远比IFP2.0和iRFP720长。
基于上述结果，可以得出经检测的这一系列BDFPs在低pH、高浓度盐酸胍溶液或高温的环境中，都具有优异的稳定性，而且也能耐受光漂白，相比IFP2.0和iRFP720具有跟高的稳定性。
实施例3 BDFPs突变体荧光蛋白的融合表达
在HeLa细胞中表达BDFPs与角蛋白H2B、细胞核定位序列(NLS)、钙连接蛋白、Tomm20；β-actin和角蛋白的融合蛋白，对应的荧光显微成像见附图6(a)。
HeLa细胞中，分别在线粒体和细胞核中同时表达BDFP1.6和BDFP1.8，双重荧光显微成像结果见附图6(b)。其中，BDFP1.6成像使用λex＝630/20nm和λem＝667/30nm过滤器(left column),BDFP1.8成像使用λex＝685/20和λem＝740/40nm过滤器(middle column).覆盖层显示在右栏。比例尺:10μm。
当BDFPs与其他蛋白融合时，它是一种合适的生物标志物。由于其高的光稳定性，融合蛋白在SIM条件下定位正确，表现良好(图6(a) )。此外，FR BDFP1.6和NIR BDFP1.8可以有效地用双色标记细胞，见附图6(b)。其中，BDFP1.6成像使用λex＝630/20nm和λem＝667/30 nm过滤器(left column),BDFP1.8成像使用λex＝685/20和λem＝740/40nm过滤器(middle column)。从结果中可以看出，细胞核区域呈红色荧光，细胞质区域呈紫红色弥散状，说明 BDFP1.6和BDFP1.8可以有效地用于双色标记细胞。
从上述结果中可以看出，BDFP1.7序列的荧光范围红移至近红外光范围，保留了高亮度的特性。对比BDFP1.1，有效亮度提升至其6.25倍，但是仍不如iRFP720。V6序列的突变体，可明显提升有效亮度，约为BDFP1.7的2.3倍。在V6序列的基础上，得到的BDFP1.8(V10序列)，其有效亮度约为V6序列蛋白的1.4倍，iRFP720的2.4倍。此外，通过串联单体结构的BDFP，得到的BDFP1.7:1.7、BDFP1.8:1.8，其中BDFP1.8:1.8，单体结构，有效亮度4.4 倍于iRFP720。
此外，BDFPs可以与其他蛋白融合，是一种合适的生物标志物。由于其高的光稳定性，融合蛋白在SIM条件下定位正确，表现良好。此外，BDFP1.6和BDFP1.8可以有效地用于双色标记细胞。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州天宝颂原生物科技开发有限公司
<120> 一种近红外光荧光蛋白及其融合蛋白
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
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20 25
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 18
Met Ser Arg Arg Arg His Ser Tyr Glu Asn Asp Gly Gly Gln Pro His
1 5 10 15
Lys Arg Arg Lys Thr Ser Pro Pro Val Ala Thr
20 25

Claims (6)

1.一种近红外光荧光蛋白，其特征在于，所述近红外光荧光蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2或SEQ ID NO:7所示。
2.一种二倍串联融合荧光蛋白，其特征在于，采用连接子串联近红外光荧光蛋白的氨基酸序列，所述近红外光荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7所示。
3.根据权利要求2所述的二倍串联融合荧光蛋白，其特征在于，所述连接子序列为GHGTGSTGSGS(SEQ ID NO:15)。
4.一种融合荧光蛋白，其特征在于，所述融合荧光蛋白包括权利要求1所述近红外光荧光蛋白或权利要求2～3任一项所述二倍串联融合荧光蛋白。
5.编码权利要求1所述近红外光荧光蛋白、权利要求2～3任一项所述二倍串联融合荧光蛋白或权利要求4所述融合荧光蛋白的核酸。
6.一种包括权利要求5所述核酸的载体。
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