JP5221308B2 - 非凝集性蛍光性タンパク質およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2001年12月4日出願の特許出願第10/006,922号の一部継続出願であり、また2001年2月21日出願の特許出願第60/270,983号に基づく優先権を主張し、これらの出願の開示は完全に本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明の分野は、色素タンパク質および蛍光性タンパク質である。
標識は、関心対象のタンパク質、細胞、または生物に印をつけるための道具であり、多くの生化学、分子生物学、および医学的診断適用において顕著な役割を果たしている。放射性標識、色素標識、蛍光標識、化学発光標識等を含む多様な異なる標識が開発されている。しかしながら、新規の標識の開発への関心は依然としてある。特に関心があるのは、色素タンパク質および/または蛍光性タンパク質標識を含む、新規のタンパク質標識の開発である。
関心対象の米国特許には、第6,066,476号(特許文献1);第6,020,192号(特許文献2);第5,985,577号(特許文献3);第5,976,796号(特許文献4);第5,968,750号(特許文献5);第5,968,738号(特許文献6);第5,958,713号(特許文献7);第5,919,445号(特許文献8);第5,874,304号(特許文献9);および第5,491,084号(特許文献10)が含まれる。関心対象の国際特許出願には、国際公開公報第00/46233号(特許文献11);国際公開公報第99/49019号(特許文献12);およびDE 197 18 640 A(特許文献13)が含まれる。Anderluhら、Biochemical and Biophysical Research Communications(1996)220:437-442(非特許文献2);Dove ら、Biological Bulletin(1995)189:288-297(非特許文献3);Fradkovら、FEBS Lett.(2000)479(3): 127-30(非特許文献4);Gurskayaら、FEBS Lett.,(2001)507(1):16-20(非特許文献5);Gurskayaら、BMC Biochem.(2001)2:6(非特許文献6);Lukyanov,K.ら、(2000)J Biol Chemistry 275(34):25879-25882(非特許文献7);Macekら、Eur.J.Biochem.(1995)234:329-335(非特許文献8);Martynovら、J Biol Chem.(2001)276: 21012-6(非特許文献9);Matz,M.V.ら(1999)Nature Biotechnol.,17:969-973(非特許文献1);Terskikhら、Science(2000)290:1585-8(非特許文献10);Tsien, Annual Rev. of Biochemistry(1998)67:509-544(非特許文献11);Tsien, Nat. Biotech. (1999)17:956-957(非特許文献12);Wardら、J.Biol.Chem.(1979)254:781-788(非特許文献13);Wiedermannら、Jarhrestagung der Deutschen Gesellschact fur Tropenokologie-gto.Ulm.17-19.02.1999.Poster P-4.20(非特許文献14);Yanushevichら、FEBS Lett(2002年1月30日)511(1-3):11-4(非特許文献15);およびYarbroughら、Proc Natl Acad Sci U S A(2001)98:462-7(非特許文献16)も関心対象である。
非凝集性色素/蛍光タンパク質およびそれらの変異体をコードする核酸組成物、ならびにそれらによってコードされるタンパク質が提供される。関心対象のタンパク質は、非凝集性有色および/または蛍光性タンパク質(非凝集性特質は、タンパク質のN末端の残基の調整により発生し、色素性および/または蛍光性特質は、タンパク質の2個またはそれ以上の残基の相互作用により発生する)であるポリペプチドである。本発明の核酸の断片、およびそれによってコードされるペプチドも提供され、さらに、本発明のタンパク質に対する抗体、ならびにトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物も提供される。本発明のタンパク質組成物および核酸組成物は、多様な異なる適用において有益である。最後に、そのような適用において使用するためのキット、例えば本発明の核酸組成物を含むキットが提供される。
本発明に従い、当技術分野の技術の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組み換えDNA技術が利用され得る。そのような技術は、文献中に充分に説明されている。例えば、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(1982);「DNA Cloning:A Practical Approach」、第IおよびII巻(D.N.Glover編 1985);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編 1984);「Nucleic Acid Hybridization」(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1985));「Transcription and Translation」(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1984));「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編(1986));「Immobilized Cells and Enzymes」(IRL Press,(1986));B. Perbal、「A Practical Guide To Molecular Cloning」(1984)を参照のこと。
非凝集性色素/蛍光タンパク質およびそれらの変異体をコードする核酸組成物、ならびにそれらがコードするタンパク質が提供される。関心対象のタンパク質は、有色および/または蛍光性である非凝集性タンパク質(非凝集性特質は、タンパク質のN末端の残基の調整より発生し、色素性および/または蛍光性特質は、タンパク質の2個またはそれ以上の残基の相互作用により発生する)である。前記の特定のタンパク質と実質的に類似しているタンパク質、または前記の特定のタンパク質の変異体も、関心対象である。核酸の断片およびそれらによってコードされるペプチドも提供され、さらに、本発明のタンパク質に対する抗体、ならびに本発明の核酸/タンパク質組成物を含むトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物も提供される。本発明のタンパク質組成物および核酸組成物は、多様な異なる適用において有益である。最後に、そのような適用において使用するためのキット、例えば本発明の核酸組成物を含むキットが提供される。
上に要約されたように、本発明は、非凝集性色素タンパク質および蛍光タンパク質ならびにそれらの変異体、ならびにこれらのタンパク質の断片および相同体をコードする核酸組成物を提供する。
細菌における発現系には、Changら、Nature(1978)275:615;Goeddelら、Nature(1979)281:544;Goeddelら、Nucleic Acids Res.(1980)8:4057;欧州特許第0 036,776号;米国特許第4,551,433号;DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1983)80:21-25;およびSiebenlistら、Cell(1980)20:269に記載されたものが含まれる。
酵母における発現系には、Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1978)75:1929;Itoら、J.Bacteriol.(1983)153:163;Kurtzら、Mol.Cell.Biol.(1986)6:142;Kunzeら、J.Basic Microbiol.(1985)25:141;Gleesonら、J.Gen.Microbiol.(1986)132:3459;Roggenkampら、Mol.Gen.Genet.(1986)202:302;Dasら、J.Bacteriol.(1984)158:1165;De Louvencourtら、J.Bacteriol.(1983)154:737;Van den Bergら、Bio/Technology(1990)8:135;Kunzeら、J.Basic Microbiol.(1985)25:141;Creggら、Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376;米国特許第4,837,148号および第4,929,555号;BeachおよびNurse、Nature(1981)300:706;Davidowら、Curr.Genet.(1985)10:380;Gaillardinら、Curr.Genet.(1985)10:49;Ballanceら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112:284-289;Tilburnら、Gene(1983)26:205-221;Yeltonら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1984)81:1470-1474;KellyおよびHynes、EMBO J.(1985)4:475479;欧州特許第0 244,234号;および国際公開公報第91/00357号に記載されたものが含まれる。
昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第4,745,051号;The Molecular Biology Of Baculoviruses(1986)(W.Doerfler編)における、Friesenら、The Regulation of Baculovirus Gene Expression;欧州特許第0 127,839号;欧州特許第0 155,476号;およびVlakら、J.Gen.Virol.(1988)69:765-776;Millerら、Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177;Carbonellら、Gene(1988)73:409;Maedaら、Nature(1985)315:592-594;Lebacq-Verheydenら、Mol.Cell.Biol.(1988)8:3129;Smithら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1985)82:8844;Miyajimaら、Gene(1987)58:273;およびMartinら、DNA(1988)7:99に記載されたようにして達成される。多数のバキュロウイルス株および異型、ならびに対応する許容性昆虫宿主細胞が、Luckowら、Bio/Technology(1988)6:47-55、Millerら、Generic Engineering(1986)8:277-279、およびMaedaら、Nature(1985)315:592-594に記載されている。
哺乳動物発現は、Dijkemaら、EMBO J.(1985)4:761、Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79:6777、Boshartら、Cell(1985)41:521、および米国特許第4,399,216号に記載されたようにして達成される。哺乳動物発現のその他の特質は、HamおよびWallace,Meth.Enz.(1979)58:44、BarnesおよびSato、Anal.Biochem.(1980)102:255、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、国際公開公報第90/103430号、国際公開公報第87/00195号、米国再発行特許第30,985号に記載されたようにして促進される。
本発明の核酸によりコードされる非凝集性の色素タンパク質および/または蛍光性タンパク質ならびにそれらの変異体、そしてそれらに関連するポリペプチド組成物も、本発明によって提供される。本明細書に使用されるように、ポリペプチド組成物という用語は、完全長タンパク質、およびそれらの一部または断片の両方をさす。この用語には、後に一層詳細に記載される、天然に存在するタンパク質と相同であるかまたは実質的に類似している、天然に存在するタンパク質の変形物、および天然に存在するタンパク質の変異体も含まれる。
本発明の非凝集性蛍光性タンパク質に特異的に結合する抗体も提供される。適当な抗体は、本発明のタンパク質の全部または一部を含むペプチドで宿主動物を免疫化することにより得られる。適当な宿主動物には、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギ等が含まれる。免疫原には、完全なタンパク質、またはその断片および誘導体が含まれ得る。
本発明の核酸は、トランスジェニック非ヒト植物もしくは動物、または細胞株における部位特異的遺伝子改変を生じるために使用され得る。本発明のトランスジェニック細胞は、導入遺伝子として存在する本発明による核酸を1個または複数含んでいる(この定義には、導入遺伝子を含むよう形質転換された親細胞およびそれらの子孫が含まれる)。多くの態様において、トランスジェニック細胞は、本発明に係る核酸を通常は保有または含有していない細胞である。トランスジェニック細胞が本発明の核酸を天然に含有している態様においては、その核酸は、細胞内の天然の位置ではない位置に存在すると考えられ、即ち細胞のゲノム物質内に非天然の位置で組み込まれているであろう。内因性遺伝子座を改変したトランスジェニック動物は、相同的組み換えを介して作製され得る。または、核酸構築物は、ゲノム内へ無作為に組み込まれる。安定的な組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルスおよびその他の動物ウイルス、YAC等が含まれる。
本発明の非凝集性色素タンパク質およびその蛍光性変異体は、多様な異なる適用において有益であるが、適用は、タンパク質が色素タンパク質であるかまたは蛍光性タンパク質であるかに依って必然的に異なる。これらの各タンパク質型の代表的な用途を以下に記載するが、以下に記載された用途は、単なる代表的なものであり、本発明のタンパク質の使用を下記のものに制限するものでは決してない。
本発明の色素タンパク質は、多様な異なる適用において有益である。一つの関心対象の適用は、問題としている特定の組成物に色または色素を付与することができる着色料としての本発明のタンパク質の使用である。ある種の態様において特に関心対象であるのは、無毒の色素タンパク質である。本発明の色素タンパク質は、問題とする多様な異なる組成物に取り込まれ得る(問題とする組成物の代表には、食物組成物、医薬品、化粧品、生物、例えば動物および植物等が含まれる)。着色料または色素として使用される場合、所望の色または色素を付与するために十分な量の色素タンパク質が、問題とする組成物に取り込まれる。色素タンパク質は、任意の便利なプロトコルを使用して、問題とする組成物に取り込まれてもよく、利用される特定のプロトコルは、少なくとも部分的には、着色すべき問題とする組成物の性質に必然的に依存すると考えられる。利用され得るプロトコルには、混和、拡散、摩擦、噴霧、注入、および入れ墨等が含まれるが、これらに制限はされない。
本発明の蛍光性タンパク質(および前記の本発明のその他の構成要素)は、以下のものを含むがこれらに制限はされない、多様な異なる適用において有益である。第一の関心対象の適用は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の適用における本発明のタンパク質の使用である。これらの適用において、本発明のタンパク質は、第二の蛍光性タンパク質または染料、例えばMatzら、Nature Biotechnology(1999年10月)17:969-973に記載されたような蛍光性タンパク質、例えば米国特許第6,066,476号;第6,020,192号;第5,985,577号;第5,976,796号;第5,968,750号;第5,968,738号;第5,958,713号;第5,919,445号;第5,874,304号(これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる)に記載されたようなエクオリア・ビクトリア(Aequoria victoria)由来の緑色蛍光タンパク質またはその蛍光性変異体、その他の蛍光染料、例えばクマリンおよびその誘導体、例えば7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン、ボディピー(Bodipy)FLのようなボディピー(bodipy)染料、カスケードブルー(cascade blue)、フルオレセインおよびその誘導体、例えばフルオレセイン・イソチオシアネート、およびオレゴングリーン(Oregon green)、ローダミン染料、例えばテキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン、およびエリスロシン、シアニン染料、例えばCy3およびCy5、ランタニド・イオンの大環状キレート、例えば量子染料(quantum dye)等、化学発光染料、例えば米国特許第5,843,746号;第5,700,673号;第5,674,713号;第5,618,722号;第5,418,155号;第5,330,906号;第5,229,285号;第5,221,623号;第5,182,202号(これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる)に記載されたものを含むルシフェラーゼと組み合わされて、供与体および/または受容体として機能する。本発明の蛍光性タンパク質を利用したFRETアッセイ法が使用され得る特定の例には、多数の異なる事象のバイオセンサーとしての、タンパク質−タンパク質相互作用、例えば哺乳動物ツー・ハイブリッド系、転写因子の二量体化、膜タンパク質の多量体化、多重タンパク質の複合体形成等の検出(この場合、ペプチドまたはタンパク質が、本発明の蛍光性タンパク質を含むFRET蛍光組合せと共有結合的に連結され、連結されるペプチドまたはタンパク質は、例えばカスパーゼ媒介切断などのためのプロテアーゼ特異的基質であるか、FRETを増加または減少させるシグナル、例えばPKA制御ドメイン(cAMPセンサー)、リン酸化(例えば、リンカー内にリン酸化部位が存在するか、またはリンカーが別のタンパク質のリン酸化/脱リン酸化ドメインとの結合特異性を有するか、またはリンカーがCa2+結合ドメインを有する場合)の受容によりコンフォメーション変化を起こすリンカーである)が含まれるが、これらに制限はされない。本発明のタンパク質が有益である代表的な蛍光共鳴エネルギー転移またはFRETの適用には、米国特許第6,008,373号;第5,998,146号;第5,981,200号;第5,945,526号;第5,945,283号;第5,911,952号;第5,869,255号;第5,866,336号;第5,863,727号;第5,728,528号;第5,707,804号;第5,688,648号;第5,439,797号(これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる)に記載されたものが含まれるが、これらに制限はされない。
典型的には、本発明のタンパク質を作成するための要素、例えば本発明のタンパク質のコーディング領域を含むベクターを含む構築物を含む、前記の適用のうちの一つ以上の実施において使用するためのキットも、本発明によって提供される。本発明のキット成分は、典型的には、適当な容器内に、適当な保存媒体、例えば緩衝溶液の中に存在する。本発明のキットには、提供されたタンパク質に対する抗体も存在し得る。ある種の態様において、キットは、各々が本発明のタンパク質をコードする複数の異なるベクター(この場合、ベクターは、異なる環境における、かつ/または異なる条件下での発現、例えば構成性発現のために設計されており、かつ哺乳動物細胞における発現のための強力なプロモーターを含む)、プロモーターのカスタム(custom)挿入およびテーラード(tailored)発現のためのマルチプル・クローニング・サイトを有するプロモーターレス・ベクター等を含む。
I.親凝集性野生型花虫綱タンパク質およびその変異体の配列
以下の表は、本発明の9個の特定の野生型花虫綱タンパク質の特性を要約したものである。
適切な標的置換を含有しているプライマーを用いたPCRにより、部位特異的突然変異誘発を実行した。全ての変異体を、pQE30ベクター(Qiagen)のBamHI制限部位とHindIII制限部位と間にクローニングした。組換えタンパク質は、最初のMetの代わりに配列「MRHHHHHHGS」を含有するよう6×ヒスチジンタグ化した。大腸菌における一晩の発現の後、蛍光性タンパク質を、タロン・メタル・アフィニティ・レジン(TALON Metal Affinity Resin)(CLONTECH)を使用して精製した。SDS-PAGE分析により、タンパク質が少なくとも95%純粋であることが明らかとなった。
表2は、上記のプロトコルを使用して製造された代表的な非凝集性変異体に関する詳細を提供する。
A.材料および方法
理論pI
理論pIは、「expasy.pku.edu.cn/tools/protoparam」の前に「http://」、後に「.html」を付けることによって作製され、Appel R.D.、Bairoch A.、Hochstrasser D.F. A new generation of information retrieval tools for biologists:the example of the ExPASy WWW server. Trends Biochem.Sci.1994、19:258-260に記載されているウェブサイト上で利用可能な、ProtParamプログラムを使用して計算した。
1.「偽非変性」タンパク質電気泳動。変異タンパク質の凝集特性の迅速な評価のため、本発明者らは、「偽非変性」タンパク質電気泳動と名付けた単純な方法を使用した。この方法は、通常のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル(SDS-PAG)への非煮沸タンパク質試料の適用に基づく。これらの条件において、FPは蛍光性のままである。さらに、これらの条件は、適用されたタンパク質の超分子構造を維持する。高分子量の凝集したタンパク質は、ゲルの一番上に残り、四量体タンパク質は>100 kDのバンドとして移動する。
赤色蛍光drFP583が、突然変異誘発に供された最初のタンパク質であった。E57と名付けられた、DsRed(哺乳動物細胞における発現のために最適化された、改変されたコドン使用を有するdrFP583の市販されている型)の改良された変異体を、親遺伝子として使用した(表2)。置換R2A、K5E、K9T(異なる組み合わせ)を含有するE57の変異体を製造した。大腸菌における発現および精製の後、これらのタンパク質を、偽非変性PAGE(上記参照)により分析した。全ての変異体が、親E57と比較して低いレベルの凝集を示し、R2A置換は、この結果に最も強い影響を及ぼすようであった(示していない)。凝集を示さず(図15)、励起−放射極大、蛍光輝度、および成熟速度に関してはE57と極めて類似していた、これらの3個の置換(R2A、K5E、およびK9T)全てを含有しているE57-NAと呼ばれる変異体を、最適なタンパク質として選択した。
要約すると、花虫綱FPのN末端近傍の塩基性残基は、タンパク質凝集物の形成において顕著な役割を果たすと結論付けられる。タンパク質凝集に対する単一アミノ酸置換の有意な効果の例は、多数、立証されている。同様に、FP内の1〜3個の残基の置換は、タンパク質可溶性の相当の増加をもたらした。
aこの方法は、非煮沸タンパク質試料のSDS-PAGEへの適用に基づく。これらの条件では、FPは蛍光性であり、電気泳動の条件は超分子構造を保存する。
b比率:(吸光(400nm)−吸光(650nm)/(吸光(566nm)−吸光(650nm))
Claims (19)
- 刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質またはその凝集性の蛍光性変異体の非凝集性の蛍光性変異体をコードする核酸であって、
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質が花虫綱種に由来し、
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質のN末端から25残基以内における少なくとも1個の塩基性残基が中性残基で置換され、
該塩基性残基がlysまたはargであり、および
N末端から25残基以内における9個以下の塩基性残基が置換される、前記核酸。 - 刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質またはその凝集性の蛍光性変異体の非凝集性の蛍光性変異体をコードする核酸であって、
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質が花虫綱種に由来し、かつN末端から2番目の位置にアルギニン残基を含み、および
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質のN末端から2番目の位置にある該アルギニン残基がアラニン残基で置換される、前記核酸。 - 刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質またはその凝集性の蛍光性変異体の非凝集性の蛍光性変異体をコードする核酸であって、
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質が花虫綱種に由来し、かつN末端から5番目の位置にリシン残基を含み、および
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質のN末端から5番目の位置にある該リシン残基がグルタミン酸残基で置換される、前記核酸。 - 刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質またはその凝集性の蛍光性変異体の非凝集性の蛍光性変異体をコードする核酸であって、
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質が花虫綱種に由来し、かつN末端から9番目の位置にリシン残基を含み、および
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質のN末端から9番目の位置にある該リシン残基がスレオニン残基で置換される、前記核酸。 - 刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質またはその凝集性の蛍光性変異体の非凝集性の蛍光性変異体をコードする核酸であって、
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質が花虫綱種に由来し、かつN末端から2番目の位置にアルギニン残基を含み、N末端から5番目の位置にリシン残基を含み、およびN末端から9番目の位置にリシン残基を含み、
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質のN末端から2番目の位置にある該アルギニン残基がアラニン残基で置換され、
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質のN末端から5番目の位置にある該リシン残基がグルタミン酸残基で置換され、および
該刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質のN末端から9番目の位置にある該リシン残基がスレオニン残基で置換される、前記核酸。 - 配列番号:13、14、15、17、19、21、および23からなる群より選択される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列からなる、請求項1〜5のいずれかに記載の核酸。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
- (a)発現宿主において機能性の転写開始領域、
(b)請求項1〜6のいずれかに記載の核酸、および
(c)該発現宿主において機能性の転写終結領域
を含む発現カセット。 - 宿主細胞への請求項8記載の発現カセットの導入の結果として、染色体外要素の一部として該発現カセットを含むか、または宿主細胞のゲノムへ組み込まれている該発現カセットを含む、単離された細胞またはその子孫である細胞。
- 蛍光性タンパク質を作製する方法であって、
請求項9記載の細胞を増殖させ、それにより該タンパク質が発現する段階、および
その他のタンパク質を含まない該タンパク質を分離する段階
を含む方法。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の核酸によってコードされるタンパク質。
- 請求項11記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の核酸である導入遺伝子を含む、単離されたトランスジェニック細胞またはその子孫である細胞。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の核酸である導入遺伝子を含む、ヒトを除くトランスジェニック生物。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の核酸を含む、蛍光共鳴エネルギー転移、生物発光共鳴エネルギー転移、自動化スクリーニング、顕微鏡による画像化、電子分析、ハイ・スループット・スクリーニング、セカンドメッセンジャー検出、インビボ分画(demarcation)、定量的測定のための較正のためのマーカー、酸素バイオセンサー機器におけるレポーター、動物、ペット、玩具、食物のためのマーカーもしくは標識、プロテアーゼ切断アッセイ、リン脂質膜組成決定、蛍光タイマー、および/または細胞標識に使用するためのキット。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の核酸を作製する方法であって、刺胞動物の凝集性の蛍光性タンパク質をコードする配列のN末端から25残基以内の残基をコードする少なくとも1個以上9個以下のコドンを変異させて該核酸を作製する段階を含み、該変異によりアミノ酸が置換する、前記方法。
- 前記少なくとも1個のコドンが塩基性残基をコードする、請求項16記載の方法。
- アミノ酸置換が、塩基性残基の中性残基への置換である、請求項17記載の方法。
- 塩基性残基がlysまたはargである、請求項17記載の方法。
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