JP2002535978A - サンゴ組織から得た色素タンパク質 - Google Patents

サンゴ組織から得た色素タンパク質

Info

Publication number
JP2002535978A
JP2002535978A JP2000597303A JP2000597303A JP2002535978A JP 2002535978 A JP2002535978 A JP 2002535978A JP 2000597303 A JP2000597303 A JP 2000597303A JP 2000597303 A JP2000597303 A JP 2000597303A JP 2002535978 A JP2002535978 A JP 2002535978A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
ppct
seq
nucleotide sequence
molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000597303A
Other languages
English (en)
Inventor
オーヴ・ヘーグ−ガルドバーグ
ソフィー・ドーヴ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Sydney
Original Assignee
University of Sydney
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Sydney filed Critical University of Sydney
Publication of JP2002535978A publication Critical patent/JP2002535978A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

(57)【要約】 サンゴ由来色素タンパク質（ＰＰＣＴ）、及び上記色素タンパク質をコードするヌクレオチド分子が開示される。上記色素タンパク質は、入射光による照射の際に蛍光を放射可能であり、その場合入射光の最大吸収は３２０−６００ｎｍの範囲に存し、最大蛍光放射は３００−７００ｎｍの範囲である。特に組織マーカー、蛍光マーカー、若しくは一般的染料としての、上記顔料タンパク質の使用もまた開示される。それ故本発明は特に、入射光による照射の際に蛍光を放射可能な、サンゴ組織由来色素タンパク質（ＰＰＣＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子であって、上記入射光の最大吸収が３２０−６００ｎｍの範囲であり、最大蛍光放射が３００−７００ｎｍの範囲である分子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サンゴ由来色素タンパク質、及び特に上記色素タンパク質をコード
するポリヌクレオチド分子、並びにそれらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
天然のソースから単離され特徴緒付けされている数多くの色素及び／または蛍
光分子が存在する。例としては、蛍光性クラゲAequorea victoriaから単離され
た一本鎖ポリペプチドであるアポエクオリン(apoaequorin)、グリーン蛍光タン
パク質（ＧＦＰ）、及びアントゾアン(anthozoans)としても周知の腔腸動物に属
するRenilla（シーパンジー(sea pansies)とも称される）から単離されたレニラ
ルシフェラーゼが含まれる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本出願人は、各種のサンゴ組織から色素タンパク質（ＰＰＣＴ）を精製し、独
特で有用な特性を有するＰＰＣＴをコードする遺伝子をクローン化した。
【０００４】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
第一の特徴点として、本発明は、入射光による照射の際に蛍光を放射すること
が可能なサンゴ組織由来色素タンパク質（ＰＰＣＴ）をコードするヌクレオチド
配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供し、上記入射光の最大波長は
３２０−６００ｎｍ（好ましくは５５０−５８０ｎｍ）の範囲であり、最大蛍光
放射は３５０−７００ｎｍ（好ましくは４００−６５０ｎｍ）の範囲である。
【０００５】 好ましくは単離されたポリヌクレオチド分子は、Ｎ末端アミノ酸配列： ＳＶＩＡＫ（配列番号１） を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０００６】 とりわけ単離されたポリヌクレオチド分子は、Ｎ末端アミノ酸配列： ＳＶＩＡＫＱＭＴＹＫＶＹＭＳＧＴＶ（配列番号２） を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０００７】 またより好ましくは単離されたポリヌクレオチド分子は、以下で配列番号３若
しくは４として示される配列に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列を含む。
【０００８】 またより好ましくは単離されたポリヌクレオチド分子は、以下で配列番号５若
しくは６として示される配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも
９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を
含む。
【０００９】 最も好ましくは単離されたポリヌクレオチド分子は、以下で配列番号５若しく
は６として示される配列に実質的に対応するヌクレオチド配列を含む。
【００１０】 本発明の好ましい実施態様として、単離されたポリヌクレオチド分子は、高い
緊縮条件の下で配列番号５若しくは６として示される配列にハイブリダイズ可能
であり、５０００ヌクレオチド未満の長さを有するヌクレオチド配列を含むが、
１０００未満若しくは５００未満の長さのヌクレオチドであってもよい。しかし
ながら好ましくは、本発明に従ったハイブリダイズするポリヌクレオチド分子は
、少なくとも１８ヌクレオチドの長さを有する。
【００１１】 高い緊縮条件の下で配列番号５若しくは６として示される配列にハイブリダイ
ズする本発明に従ったポリヌクレオチド分子は、２２１アミノ酸の長さを有する
本出願人に周知であるＰＰＣＴアイソフォームをコードするポリヌクレオチド分
子を含む。上記ポリヌクレオチド分子は、配列番号５若しくは６中で示されるＣ
ｙｓ221をコードするコドンに代わって停止コドンを含む。
【００１２】 第二の特徴点として、本発明は、Ｎ末端アミノ酸配列 ＳＶＩＡＫ（配列番号１） を含むタンパク質を提供し、上記タンパク質は実質的に生成された形態である。
【００１３】 好ましくは上記実質的に生成されたタンパク質は、Ｎ末端アミノ酸配列： ＳＶＩＡＫＱＭＴＹＫＶＹＭＳＧＴＶ（配列番号２） を含む。
【００１４】 より好ましくは上記タンパク質は、以下で配列番号３若しくは４として示され
る配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。
【００１５】 本発明に従ったタンパク質（ＰＰＣＴ）は、以下の特徴を有する： i) 水溶性タンパク質（２３１−２３５アミノ酸の長さ）； ii) ３４０−６００ｎｍの範囲のλmaxを有する吸光スペクトル； iii) 光誘導性： iv) ほとんどがダイマー形態で、場合によりトリマー形態； v) グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と約２２％のアミノ酸同一性と約５
６％のアミノ酸相同性； vi) ＧＦＰ色素体タンパク質中の「ＳＹＧ」の代わりに、ＰＰＣＴ中ではア
ミノ酸配列「ＱＹＧ」； vii) 見積もり値でＰＩ＝９．５；及び viii) 高温（例えば３５℃）で合成され、より高温（例えば４０℃）で安定。
【００１６】 最大で５６０−６００ｎｍで吸収するＰＰＣＴは、全ての条件下で弱く蛍光性
である（５６０−６００ｎｍでの励起で、６００−６５０ｎｍでの放射）。大雑
把に４種のクラスが存在する：３００−３６０ｎｍ、４２０−４６５ｎｍ、４８
０−４９０ｎｍ及び５５０−６００ｎｍの波長で励起された際に、蛍光挙動は、
ＰＰＣＴを蛍光を発するものに変換する。これらの分子はそれぞれ、４００−４
５０ｎｍ、４８０−４９０ｎｍ、５００−５０５ｎｍ及び６１０−６３０ｎｍで
最大の放射を有する（表４参照）。
【００１７】 ＰＰＣＴは、以下のサンゴ科の組織から精製できる：Pocilloporidae, Acropo
ridae, Poritidae, Faviidae, Merulinidae, Fungiidae。
【００１８】 好ましくはＰＰＣＴは、以下のサンゴの組織から精製される：Acropora asper
a、Acropora digitifera、Acropora horrida、Acropora formosa、Montipora mo
nasteriata、Montipora caliculata、Pocillopora damicornis、Porites murray
ensis、Porites lobata、Plesiastrea versipora若しくはSeriatopora hystrix
。
【００１９】 より好ましくはＰＰＣＴは、以下のサンゴの組織から精製される：Acropora a
spera、Acropora horrida、Montipora monasteriata、Montipora caliculata、P
orites murrayensis、Porites lobata若しくはPlesiastrea versipora。
【００２０】 別法としてＰＰＣＴは、導入されたＰＰＣＴコードポリヌクレオチド分子から
ＰＰＣＴを発現する組換え宿主細胞のカルチャーから精製できる。
【００２１】 第三の特徴点として、本発明は、本発明の第一の特徴点に従ったポリヌクレオ
チド分子の複製及び／または発現のための適切なベクターを提供する。
【００２２】 該ベクターは例えば、複製のためのオリジン、及び好ましくは上記ポリヌクレ
オチドの発現のためのプロモーター、及び任意に上記プロモーターのレギュレー
ターを備えたプラスミド、ウイルス、若しくはファージベクターでもよい。上記
ベクターは、例えば細菌プラスミドの場合アンピシリン耐性遺伝子、若しくは哺
乳動物発現ベクターのためのネオマイシン耐性遺伝子といった、一つ以上の選択
マーカーを含んでもよい。上記ベクターは例えば、ＲＮＡの生産のため、または
別法として宿主細胞のトランスフェクション若しくはトランスフォーメーション
のため、in vitroで使用してもよい。
【００２３】 本発明の第四の特徴点は、本発明の第三の特徴点のベクターでトランスフェク
ト若しくはトランスフォームされた宿主細胞を提供する。
【００２４】 ＰＰＣＴをクローニング若しくは発現するための適切な宿主細胞は、原核生物
、酵母、若しくは高等真核生物である。
【００２５】 適切な原核生物には、例えばE. coli, B. subtilis若しくはB. thuringiensis
のようなBacilli、P. aeruginosaのようなPseudomonas種、Salmonella typhimur
ium若しくはSerratia marcescensといった、グラム陰性若しくはグラム陽性生物
のような真正細菌が含まれる。
【００２６】 繊維状真菌若しくは酵母のような真核微生物もまた、ＰＰＣＴを発現するホス
トに適した宿主である。Saccharomyces cerevisiae若しくは一般的なパン酵母は
、低級真核宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、Schizosa
ccharomyces pombe; K. lactisのようなKluyveromyces宿主；Neurospora若しく
はPenicilliumのような繊維状真菌；及びA. nidulans及びA. nigerのようなAspe
rgillus宿主といった、多数の他の属、種及び株が一般的に入手可能であり、こ
こで有用である。
【００２７】 適切な高等真核生物宿主細胞は、培養した脊椎動物、無脊椎動物、若しくは宿
物細胞でもよい。Spodoptera frugiperda, Aedes aegypti, Aedes albopictus,
Drosophila melanogaster及びBombyx moriのような種から得た昆虫宿主細胞が使
用できる。綿花、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、及びタバコの宿
物細胞カルチャーは、宿主として利用できる。典型的に、宿物細胞は、細菌Abro
bacterium tumefaciensの特定の株とインキュベートすることによってトランス
フェクトできる。
【００２８】 カルチャー中の脊椎動物細胞（組織カルチャー）の増殖は、細菌の一般的な方
法で達成できる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例として、ＳＶ４０によりトラン
スフェクトされたサル腎ＣＶ１系(COS-7, ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎系(１９３
細胞、若しくは懸濁カルチャー中で培養のためサブクローン化された１９３細胞
）；ベビーハムスター腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣
細胞／−ＤＨＦＲ(CHO)；マウスセルトリ細胞、マウス腎細胞(CV1, ATCC CCL 70
)；ヒト大脳カルシノーマ細胞(HELA, ATCC CCL 2)；イヌ腎細胞(MDCK, ATCC CCL
34)；及びヒト肝細胞系(Hep G2)が含まれる。好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎２
９３及びチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【００２９】 宿主細胞は、本発明の発現若しくはクローニングベクターでトランスフェクト
、若しくはより好ましくはトランソフォームされ、プロモーターの誘導、トラン
スフォーマントの選択、若しくは所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために
適切に修飾された一般的な栄養培地で培養される。トランスフォーメーションは
、ＤＮＡが染色体外エレメントとして、若しくは染色体への挿入のいずれかで複
製可能なように、生物内にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細
胞に依存して、トランスフォーメーションは上記細胞に適切な標準法を使用して
実施される。
【００３０】 第五の特徴点として、本発明は、本発明の第二の特徴点に従ったタンパク質を
生産する方法を提供し、上記方法は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオ
チド分子の発現に適した条件下で、本発明の第三の特徴点の（発現）ベクターで
トランスフェクト若しくはトランソフォームされた宿主細胞を培養する工程、及
び任意に発現したタンパク質を回収する工程を含む。
【００３１】 上記細胞は、コードされたタンパク質の商業的に有用な量の生産のため使用で
きる。
【００３２】 ＰＰＣＴは、高温（例えば３５−４０℃）で安定性を示すようであるため、第
五の特徴点の方法は、最適な培養温度で（例えば３０−３７℃）若しくはその近
傍で実施されてもよい。
【００３３】 第六の特徴点として、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブ若しくはプライ
マーを提供し、上記プローブ若しくはプライマーは、本発明の第一の特徴点に従
ったポリヌクレオチド分子に選択的にハイブリダイズする配列を有する。
【００３４】 第六の特徴点の好ましい実施態様として、上記オリゴヌクレオチドプローブ若
しくはプライマーは、少なくとも８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１
８ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも２５ヌクレオチドを含む。
【００３５】 されに好ましい実施態様として、上記オリゴヌクレオチドプローブ若しくはプ
ライマーは、放射性同位元素、酵素、ビオチン、蛍光分子若しくは化学発光分子
のようなラベルと接合されており、検出可能なプローブとして使用される。
【００３６】 第七の特徴点として、本発明は、組織マーカー、蛍光マーカー、若しくは一般
的な染料としての第二の特徴点に従ったタンパク質の使用を提供する。
【００３７】 本発明のタンパク質は、トランスフォーム化組織中での後の遺伝子発現のため
の無害なタンパク質ベースのマーカーとして使用できると予測される。本発明の
タンパク質はまた、容易に製造可能な無害な色素としての有用性も有する。
【００３８】 第八の特徴点として、本発明は、適切な製薬学的に許容可能な担体若しくは賦
形剤と混合して、第二の特徴点に従ったタンパク質の有効量を含むサンスクリー
ン製剤を提供する。
【００３９】 第九の特徴点として、本発明は、第二の特徴点に従ったタンパク質の有効量を
含む、入射光のＵＶ若しくは他の波長を遮断するためのフィルターを提供する。
【００４０】 本明細書を通じて他に断り書きがなければ、用語「含む」、若しくは「含む」
若しくは「含んでいる」のような変異型は、記載されたエレメント、数字、若し
くは工程、またはエレメント、数字、若しくは工程の群を包含するように意味す
ると解され、いずれかの他のエレメント、数字、若しくは工程、またはエレメン
ト、数字、若しくは工程の群を排除するものと解されるべきではない。
【００４１】 本明細書を通じて、ヌクレオチド配列同一性のパーセンテージレベルが参照さ
れている場合、そのレベルは、Altschul, S.F.等、"Gapped BLAST and PSI-BLAS
T: a new generation of protein databese serach programs", Nucleic Acids
Research, Vol. 25., No. 17, pp 3389-3402 (1997)に記載されたＢＬＡＳＴプ
ログラムｂｌａｓｔｎによって計算されたものである。
【００４２】 ここで使用される用語、「高い緊縮条件」は、（１）例えば５０℃で１５ｍＭ
ＮａＣｌ／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ4といった
、洗浄のために低いイオン強度で高い温度を使用し；（２）例えば４２℃で０．
１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリド
ン、及び７５０ｍＭＮａＣｌと７５ｍＭクエン酸ナトリウムを有する５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５を含む５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミ
ドといったホルムアミドのような変性剤をハイブリダイゼーションの間で使用し
；または０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸ナトリウム）及び
０．１％ＳＤＳ中の４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭＮ
ａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．
８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、ソニケーションさ
れたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ及び１０％デキストラ
ン硫酸を使用する条件を指す。
【００４３】 ヌクレオチド配列に関してここで使用される用語、「実質的に対応する」は、
ＤＮＡコドン中の縮重のためコード化タンパク質中の変化を引き起こさないヌク
レオチド配列中のマイナーな変異を包含するように企図される。さらにこの用語
は、特定の系における発現を促進するのに必要とされる配列中のマイナーな変異
であるが、コード化タンパク質の機能的特徴の変化を引き起こさない変異を包含
するように企図される。
【００４４】 アミノ酸配列に関してここで使用される用語、「実質的に対応する」は、ＰＰ
ＣＴの機能的な特徴の変化を引き起こさないアミノ酸配列中のマイナーな変異を
包含するように企図される。これらの変異は、保存的なアミノ酸置換を含んでも
よい。考慮される置換は以下のものである： Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ；Ｆ、Ｙ、Ｗ、
Ｈ；並びにＰ、Ｎα−アルキルアミノ酸。
【００４５】 本発明をより明確に理解するために、好ましい形態が以下の実施例及び図面を
参考にして記載されるであろう。
【００４６】
【実施例】
実施例１： 一般的分子生物学 他に断り書きがなければ、本発明において使用される組換えＤＮＡ法は、当業
者に周知の標準法である。上記方法は、J. Perbal, A Practical Guide to Mole
cular Cloning, John Wiley及びSons (1984), J. Sambrook等, Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A
. Brown（編者）, Essential Molecular Biology: A Parctical Approach, Volu
mes 1及び2, IRL Press (1991), D.M. Glover及びB.D. Hames（編者）, DNA Clo
ning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995及び1996)、並び
にF.M. Ausubel等（編者）, Current Protocols in Molecular Biology, Greene
Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 今日までの全ての最新版を
含む）のようなソースにおける文献を通じて記載され且つ説明され、これら文献
は参考としてここに取り込まれる。
【００４７】 遺伝子／ＤＮＡ単離 タンパク質をコードするＤＮＡは、該遺伝子のｍＲＮＡを発現し、それを検出
可能なレベルで発現すると思われる組織から調製されたいずれかのｃＤＮＡライ
ブラリーから得られてもよい。ＤＮＡはまた、ゲノムライブラリーから得られて
もよい。
【００４８】 ライブラリーは、興味ある遺伝子、若しくはそれによってコードされるタンパ
ク質を同定するためにデザインされたプローブ若しくは分析ツールでスクリーニ
ングされる。ｃＤＮＡ発現ライブラリーについては、適切なプローブは、タンパ
ク質を認識し且つ特異的に結合するものモノクローナル若しくはポリクローナル
抗体；同種若しくは異種から得たｃＤＮＡの周知の部分若しくは存在する疑いの
ある部分をコードする、約２０−８０ベースの長さのオリゴヌクレオチド；及び
／または同じ若しくはハイブリダイズする遺伝子をコードする相補的な若しくは
ホモローガズなｃＤＮＡまたはその断片を含む。ゲノムＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするための適切なプローブは、オリゴヌクレオチド；発現配列タグ
等を含む同じ若しくはハイブリダイズＤＮＡをコードするｃＤＮＡ若しくはその
断片；ホモローガスなゲノムＤＮＡ若しくはその断片を制限することなく含む。
選択されたプローブでのｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーのスクリーニング
は、Sambrook等の１０−１２章に記載されたような標準法を使用して実施されて
もよい。
【００４９】 コードする遺伝子を単離するための代替的手段は、Sambrook等の１４セクショ
ンに記載されたようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用することである
。この方法は、遺伝子にハイブリダイズするであろうオリゴヌクレオチドプロー
ブの使用を必要とする。
【００５０】 プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、偽のポジティブを最小
化するために、十分な長さを有し十分に明白であるべきである。実際のヌクレオ
チド配列は通常、上記遺伝子の保存された若しくは高度にホモローガスなヌクレ
オチド配列若しくは領域に基づく。上記オリゴヌクレオチドは、一つ以上の部位
で縮重していてもよい。縮重したオリゴヌクレオチドの使用は、当該種において
嗜好性のコドンの使用が周知である種から得たライブラリーがスクリーニングさ
れる場合、特に重要であろう。上記オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされ
るライブラリー中のＤＮＡにハイブリダイズする際に検出できるようにラベルさ
れなければならない。ラベリングの好ましい方法は、オリゴヌクレオチドを放射
線ラベルするための、本分野で周知であるポリヌクレオチドキナーゼでの32Ｐラ
ベル化ＡＴＰを使用することである。しかしながら、ビオチン化若しくは酵素ラ
ベリングを制限することなく含む他の方法を、オリゴヌクレオチドをラベルする
ために使用してもよい。
【００５１】 全タンパク質コード配列を有する核酸は、もし必要であれば、Sambrook等の７
．７９セクションに記載されたような従来のプライマー伸張法を使用して、ｃＤ
ＮＡへ逆転写されなくてもよいｍＲＮＡの前駆体及びプロセッシング中間体を検
出するために、選択されたｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーをスクリーニン
グすることによって得られる。
【００５２】 興味ある遺伝子を得るための別の代替的な方法は、Fingels等(Agnew Chem. In
t. Ed. Engl. 28: 716-734, 1989)に記載された方法の一つを使用して、上記遺
伝子を化学的に合成することである。これらの方法は、トリエステル法、ホスフ
ァイト法、ホスホルアミダイト法、及びＨ−ホスホナート法、ＰＣＲ及び他のオ
ートプライマー法、並びに固相の支持体でのオリゴヌクレオチド合成を含む。も
し遺伝子の全核酸配列が周知であれば、若しくはコード鎖に相補的な核酸の配列
が入手可能であれば、これらの方法を使用してもよく、または別法として、もし
標的アミノ酸配列が周知であれば、各アミノ酸残基に対して周知の好ましいコー
ド残基を使用して、可能性のある核酸配列を推測してもよい。
【００５３】 精製スキーム (i) ０．６Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．６５中に４℃で一晩サンゴを浸
液することによる、サンゴ組織からの着色色素の抽出； (ii) ２８０ｎｍ及びリン酸緩衝液で放射されるλmax（ピーク集積）でモニタ
ーされるゲル濾過(Pharmacia, Superose HR 10/30)； (iii) 脱塩及び凍結乾燥； (iv) １５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離； (v)ＣＡＰＳ緩衝液を使用するＰＶＤＦへの電気ブロット； (vi) Ｎ末端配列分析(Australian National University Sequencing Facility)
。
【００５４】 ｃＤＮＡライブラリー 種：青色先端Acropora aspera (i) ｍＲＮＡの単離：Qiagen mRNAキット（ポリＡ＋）またはより好ましくはC
homczynski及びSacchi (Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987))によって記載さ
れた方法による； (ii) CLONTECHから得られるSMART PCR cDNA Synthesis KitでのｃＤＮＡの作成
； (iii) Stratagene LambdaZapII EcoR1 cut/CIAP内へのｃＤＮＡのライゲーショ
ン、及びStratagene Gigapack IIによるパッケージング。
【００５５】 ライブラリーからのＰＣＲ (i) ５’プライマーとしてゲル精製オリゴマーの使用、３’プライマーとして
SMART PCRアダプターの使用−遺伝子のＰＣＲ増幅； (ii) pGemTイージーベクター(Promega)内へのゲル生成産物のライゲーション、
Ｔ７及びＳＰ６プライマーからのＬＩＣＯＲシークエンシング、及び配列を翻訳
して、上記アミノ酸配列の取得。
【００５６】 ミュータントの生産 弱く蛍光性のＰＰＣＴの蛍光特性は、ミュータジェナイズにより改良できるも
のと予測される。上記ミュータント（及びそれらをコードするポリヌクレオチド
分子）は、本発明の一部として考慮される。
【００５７】 ミューテーションの部位は、例えば以下の方法によって、個々的に若しくは連
続して修飾できる： (i) 最初に保存的なアミノ酸選択で、次いで達成される結果に依存してよりラ
ジカルな選択での、標的残基の置換； (ii) 標的残基の欠失；及び／または (iii) 標的残基に隣接して、残基若しくは他のリガンドの挿入。
【００５８】 ミュータジェネシスのための残基若しくは領域の同定のための一つの有用な方
法は、Cunningham及びWells (Science (1989) 244: 1081-1085)に記載されたよ
うな「アラニンスキャニングミュータジェネシス」と称される。ここで、標的残
基若しくは標的残基の群が同定され（例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及
びＧｌｕのような荷電残基）、中性若しくは負に荷電したアミノ酸によって置換
され（最も好ましくはＡｌａ若しくはポリＡｌａ）、細胞の内外の周囲の水性環
境とアミノ酸の相互作用に影響するようにする。次いで置換に機能的な感受性を
示すドメインを、さらなる若しくは他のミューテーションを導入することによっ
て決める。かくして、アミノ酸配列ミューテーションを導入するための部位が事
前に決定され、ミューテーションの性質は本質的に事前に決定される必要はない
。例えば、所定部位でのミューテーションの実効性を最適化するために、アラニ
ンスキャニング若しくはランダムミューテーションを、標的コドン若しくは領域
で実施してもよく、発現したミュータントを、所望の機能の最適な組み合わせの
ためにスクリーニングする。
【００５９】 実施例２： 方法 色素タンパク質の単離及び精製 色素タンパク質を精製し、Dove等, Biol Bull, 189; 288-297, 1995に記載さ
れた方法を使用して、変性条件下で電気泳動した。精製したＳＤＳ−ＰＡＧＥサ
ブユニットを、ＣＡＰＳ緩衝液の存在下でＰＶＤＦペーパー上にトランスファー
した。次いで５種の雌雄同体サンゴから単離された２８ｋＤサブユニットを、Au
stralian National UniversityのBiomolecular Resource Facilityによってシー
クエンスした。
【００６０】 ＲＮＡ単離−ｃＤＮＡライブラリー構築−熱サイクル条件 Acropora asperaの分枝先端（青色）を、ヘロン島礁原から1997年11月24日の
正午に集め、研究室に迅速に持っていった。１０の先端（約１ｃｍ長）から得た
全ＲＮＡを迅速に単離し、Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA)から得
たSMART PCR cDNA Synthesis Kitを使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。
ＰＰＣＴの全長ｍＲＮＡ配列を、最も一般的な配列（表１）の５’末端若しくは
Ｎ末端の最初の１０アミノ酸で作成されたゲル精製縮重プライマー、及びSMART
PCR CDS ３’往来マーを使用して、ライブラリーから増幅した。これにより、約
７６０ｂｐの長さの単一産物を得た。ゲル精製産物を、ｐＧｅｍＴイージーベク
ター(Promega, Madison, WI, USA)内にライゲートし、Ｔ７及びＳＰ６プライマ
ー（２個のクローン、正及び負の配向、LICOR, USA)を使用してシークエンスし
た。生成した由来するタンパク質は、数個の機能的に同様なアミノ酸置換のみを
有する２３１アミノ酸（ＰＯＣ３）及び２３５アミノ酸（ＰＯＣ４）を有した。
【００６１】 モデル構築 複数構造整列から由来するデフォルトスコアーイングマトリックスを有するMA
LIGN (Johnson等, 1993)を使用して配列整列を実施し、視覚的に編集して、保存
され且つ化学的に同じ残基の整列を最適化した。グリーン蛍光タンパク質のテン
プレート構造（ＰＤＢ １ＧＦＬ）に基づいて、ＰＯＣ４モデルを生産するため
にプログラムMODELLERを使用した。最初のモデルを、シュミレーションしたアニ
リングプロトコールで構築分子力学によって反復して構築し、PROCHECKによって
コンピューター処理して構造体系を改良した。タンパク質モデルの分子表面を構
築するために、GRASPを使用した。
【００６２】 放射及び励起スペクトルの測定 以下のゲル濾過分画を、励起及び放射スペクトルのために分析した：(i)１分
間の間隔でのゲル濾過分画を、２５ｋＤと２９ｋＤの間の範囲のサブユニットの
モノマータンパク質からトリマーにほぼ対応する、２５分と２９分の間で回収し
、(ii)タンパク質精製のために最大の吸収の波長の周囲で、狭いゲル濾過分画を
回収し、これらはサンゴ種に依存して約２６分から約２８分の範囲であった（表
１）。
【００６３】 ゾウキサンテラからのペリジニン−クロロフィル−タンパク質（ＰＣＰ）複合体
の単離。水溶性ペリジニン−クロロフィル−タンパク質（ＰＣＰ）複合体を、エ
アブラシを使用することによってサンゴから回収された組織をホモジェネートす
ることにより、いくつかのサンゴ(Montipora digitata, Acropora aspera)から
単離したゾウキサンテラから単離した。共生渦鞭毛藻類リッチ分画を、３０００
ｒｐｍで２分間ホモジェネートをスピンすることによって作成した。ペレットえ
お、氷冷リン酸緩衝液でインキュベートした。ＰＣＲ複合体をさらに精製し、分
画を３０−３１分の間で回収することを除いて、Dove等, 1995, 上記参照に記載
された方法を使用する変性条件の下で電気泳動した。
【００６４】 結果と議論 珊瑚礁形成サンゴの１０種からＰＰＣＴを単離した。単離されたタンパク質は
、４２から６９ｋＤの範囲の天然の分子量（およそ）を有し（表１）、約２８ｋ
Ｄのサイズのサブユニットより成る（図２）。Acroporid及びPoritidサンゴの６
種から得たサブユニットのＮ末端をシークエンスした。２８ｋＤのバンドで数多
くのバックグランド配列が存在するが、アミノ酸ＳＶＩＡＫで開始する配列が、
全ての科で共通していた（表１）。Mono-Qカラム(Pharmacia, Sweden)、及び各
種のｐＨ勾配と塩濃度を使用するイオン交換クロマトグラフィーは、ゲル濾過分
画のさらなる分析を与えなかった。このことは、これらのポリペプチドの表面電
荷が非常に類似することを示唆する。共通するＮ末端配列を有するポリペプチド
の完全な配列を得るために、青色有色サンゴ、Acropora asperaからｃＤＮＡラ
イブラリーを構築した。これにより、このタンパク質をコードする全長ｍＲＮＡ
の成功した増幅を生じた。増幅の結果、２３１（ＰＯＣ３）（図５参照）及び２
３５（ＰＯＣ４）（図６参照）の長さのタンパク質を生ずる、いくつかの核酸の
差異を有する二つのクローンが生じ、両者はアミノ酸２２１で停止コドンを有す
るアイソマーを有した。データーベースサーチにより、クラゲAequorea victori
a (Cl. Scyphozoa)由来のグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とこれらの配列を
マッチが検出された。重要なことに、ＧＦＰもまた、２８ｋＤサブユニットを有
するダイマーである(Tsien, Ann. Rev. Biochem., 67, 509-544, 1998)。ＧＦＰ
及びDiscosoma種から単離されたＧＦＰ様タンパク質(Order Corallomorpharia,
Cl. Anthozoa, Malt等, Nature Biotech., 17, 969-973, 1999)の整列により、
ＧＦＰと１９．６％の同一性、ｄｒＦＰ５８３と６５．３％の同一性を示した（
表２）。濃縮した場合、狭いゲル濾過分画は、それらが由来するサンドとほぼ同
じ発色を有する（即ち青色、紫色若しくはピンク色）。それ故可視光の下でサン
ゴから観察される色素は、ＧＦＰタンパク質のこのファミリーのためである。２
８ｋＤサブユニットを有するダイマーは、ＧＦＰのプロフィールとマッチする。
【００６５】 三次元モデルの構築により、ＰＰＣＴ配列が、タンパク質内に１１のβストラ
ンドと色素体（修飾残基Ｇｌｎ−６１、Ｔｙｒ−６２及びＧｌｙ−６３より成る
）を有するグリーン蛍光タンパク質（ＰＤＢ１ＧＦＬ）(Yang等, Nature Biotec
h, 14, 1246-1251, 1996)の「β−ｃａｎ」構造を取ることができることが明ら
かとなった。このモデルは、色素体が、「ＱＹＧ」アミノ酸モチーフによって形
成されることを示す。ＰＰＣＴ中のＮ末端キャップ（表２中の整列を参照、図８
Ａ、Ｂ）の一部の欠失は、この領域が、Ｎ末端切りつめ実験においてＧＦＰに必
須であることが見出されているように、このモデルは蛍光の減少した能力を有す
ることを示唆する。この配列は、以下に議論される色素の高吸収性−低放射形態
を表す可能性がある（５７０ｎｍでの励起最大、図９）。ＰＰＣＴモデルのＧＲ
ＡＳＰ分子表面（示さず）により、チャンネルが存在しないことが明らかにされ
、蛍光体が溶媒から十分に保護されていることを示唆する。蛍光体の非常に近傍
は、ＧＦＰ中の１９残基と比較して、５Å以内の２６残基で（表４に掲げられ図
８Ａ、Ｂに示される）、多量の溶媒から完全に隠されているようである。この増
大は、Ｇｌｎ−６１の側鎖によって形成される水素結合に一部寄与している。二
つの共鳴形態が蛍光体について提案されており、一方はＴｙｒ−６２のベンジル
酸素（ＯＨ）上で部分的に負の電荷を有し、他方はＴｙｒ−６２のカルボキシ酸
素上で負の電荷を有する（イミダゾリドン環の一部）。両者の共鳴形態は、それ
ぞれＡｒｇ−１９２及びＡｒｇ−９０によって等しく安定化されているようであ
り（表４，太字）、かくしてこのモデルからどちらの形態が優勢であるかを考察
することは不可能である。Yang等, (1996), 上記参照は、ＧＦＰのＴｈｒ−２０
３、Ｇｌｕ−２２２若しくはＩｌｅ−１６７のミューテーションが、立体障害と
静電的な考察から、蛍光体に直接影響するであろうと示唆している。ＰＰＣＴ中
の対応する残基、Ａｒｇ−１９２、Ｇｌｕ−２１０及びＭｅｔ−１５８は、全て
蛍光体の近傍に位置し、これらは上記タンパク質の機能に重要な残基であること
を示唆する。「β−ｃａｎ」構造中のトリプトファン残基の存在は、特に重要性
を有する：蛍光体のファンデルワールス接触内のＴｒｐ−８８（ＧＦＰのＡｓｎ
−９４に対応する）、並びに蛍光体から由来するＴｒｐ−５３及びＴｒｙ−１３
８（それぞれ１０．８Å及び６．７Å）。後者は、ＧＦＰのＴｒｐ−５７（ＷＴ
中の１３Å；Yang等, (1996)上記参照）及びＴｙｒ−１４５と並べられ、電荷脱
配置に起用しているであろう。これらのトリプトファンは、紫外線からＰＰＣＴ
を安定化し保護する点で重要であり、紫外線は高レベルの太陽光の下でその潜在
的な機能に加える（以下参照）。モデル構造はまた、ＰＰＣＴの顕著な安定性を
説明し、それは最大２５℃で安定であるＧＦＰとは対照的に、３５℃を越えるで
あろうÅ水環境の浅瀬で発現される。
【００６６】 珊瑚礁形成サンゴの１０種由来の天然ＰＰＣＴの蛍光の調査により、天然及び
ミュータントＧＦＰの両者で見られるものと同じ広範囲の蛍光挙動が明らかとな
った(Tsien等, Biochem., 67, 509-544, 1988)。蛍光挙動は大雑把に、３００−
３６０ｎｍ、４２０−４６５ｎｍ、４８０−４９０ｎｍ及び５５０−６００ｎｍ
の波長で励起された際に、分子に蛍光を与える（表４）。これらの分子は、それ
ぞれ４００−４５０ｎｍ、４８０−４９０ｎｍ、５００−５０５ｎｍ及び６１０
−６３０ｎｍで最大の放射を有する。５５０−６００ｎｍの範囲で吸収し、６１
０−６３０ｎｍの範囲で放射する分子の群は、狭いゲル濾過分画（及び高タンパ
ク質含有量）のこの範囲で読み取られる高い吸収から示されるように非常に低い
明るさの蛍光を有し、比較的低い蛍光を有する（図９）。また、各サンゴ中に存
在するＰＰＣＴのタイプに対する種間の非常に顕著な差異が存在した。Acropori
dサンゴ、Acropora asperaの青色分枝先端から由来するＰＰＣＴは例えば、ＵＶ
Ａ及び可視光の両者の下で蛍光を発し、３４０ｎｍ、４２０ｎｍ及び５７６ｎｍ
の三種の別個の励起最大を示した（図９Ａ、Ｂ）。三種の波長での励起は、それ
ぞれ４４５ｎｍ（青色）、４９０ｎｍ（青緑色）及び６３０ｎｍ（オレンジ赤色
、弱）で蛍光放射を導いた。もし稼働中の２５−２６分でＨＰＬＣサンプルを取
得するのであれば、３４０ｎｍの励起最大を有するＰＰＣＴが優勢であり、２６
−２７分で取得されたサンプルでは、４２０ｎｍ及び５７６ｎｍの励起最大を有
するＰＰＣＴが優勢であった。ＰＰＣＴのいくつかのタイプが、Acropora asper
aの組織内で見出され、いくつかの形態は他者よりホモ、もしかしたらヘテロ、
ダイマー若しくはトリマーを形成する高い可能性を有する。異なる溶出時間はま
た、全ての他の種由来のＰＰＣＴで観察された。ＧＦＰ及びミュータントは、単
一（主要な、肩を除いて）励起及び放射最大を有し、さらに励起及び放射スペク
トルの各ペアが代表的な個々のＰＰＣＴで見出される場合を確固たるものとする
。
【００６７】 珊瑚礁形成産後の明色は、重要なことに一つ以上のＧＦＰ様ポシロポリンの吸
収特性と蛍光特性の組み合わせによる。例えば、Acropora asperaの青色先端の
青色は、可視スペクトルの緑からオレンジの強い吸収（ピーク吸収＝５８０ｎｍ
、６５０ｎｍより長い波長では吸収なし）と、実質的な青色蛍光放射による（図
９Ｃ）。紫色の種においては、吸収最大は、スペクトルの赤色端から遠くへシフ
トするが、約３４０ｎｍ及び／または４２０−４６５ｎｍの励起での強い青色蛍
光は維持される。一方、Pocillopora damicornisのようなピンク色のサンゴ種（
図９Ｆ）は、５６０ｎｍでピークの吸収を有し、６００ｎｍを越えると吸収を有
さないＰＰＣＴを有す。この場合、ほとんどの黄色及び赤色光が透過し、下部に
存在する白色のサンゴ骨格によって反射され、３５０ｎｍ若しくは４８４ｎｍで
の励起から生ずる青色の蛍光が比較的弱い、または全く存在しない。多くのサン
ゴは、３４０ｎｍで高い蛍光を有するが、可視光の下でいずれかの可視的な原色
を有さないかまたは発光緑色を有する。これらのサンゴは好ましくは、３４０ｎ
ｍ、及びＧＦＰ様タンパク質（緑色放射因子）の４２０−４６５ｎｍの励起範囲
を有し、ここで記載される高吸収性−低放射青色若しくはピンク色範囲を有さな
い。
【００６８】 グリーン蛍光タンパク質は、生体発光性クラゲ(Cl. Scyphozoa) Aequorea vic
toriaにおいて発見され、それは４００ｎｍ（４７５ｎｍで肩）で励起最大を有
し、５０９ｎｍで放射ピークを有する。この種において、ＧＦＰはＣａ2+活性化
フォトタンパク質、エクオリン(Morin等, J. Cell Physiol., 77, 313-318)から
由来する青緑光を吸収した後、緑色を放射するように機能する。珊瑚礁形成サン
ゴは、生体発光性ではない。そのため、何故、珊瑚礁形成サンゴは、ＰＰＣＴの
ような蛍光性ＧＦＰ様タンパク質を有しているのであろうか？ＰＰＣＴの分子特
性は、いくつかの著者によって示唆されているように、これらのタンパク質が光
保護及び光回収において機能することを示唆する。異なるＰＰＣＴは、異なる役
割を有しているようである。高吸収性−低放射範囲は、ＰＣＰ複合体による吸収
に対してあまりに長い波長（４１０−５５０ｎｍ、図１３）で５５０−６００ｎ
ｍの光を特異的に吸収し、クロロフィルａ及びｃのＱyバンドに対してあまりに
短い波長で放射する。これらの低放射性ＰＰＣＴの吸収範囲は、クロロフィルａ 及びｃのＱxバンドと一致する。Ｑxバンドは、これらのクロロフィルの各種の双
極子配向のため散乱光を吸収するように機能する。全照射に対する散乱光の割合
が光強度と共に増大するにつれて、この特定のＰＰＣＴは、光依存性遮断色素と
して機能するようであり、高い光環境中の共生渦鞭毛藻類の光阻害を減少する。
光吸収性−低放射ＰＰＣＴの濃度は、ＰＡＲと相関し、ＵＶとは無関係であると
いう事実は、この役割のさらなる証拠である。
【００６９】 他のＰＰＣＴは、ＵＶ光（少なくとも３００ｎｍ以下、図９ａ）と青色光を、
より低い波長に変換する。これは、それぞれ高い及び低い光条件の両者のそれぞ
れの下でのＰＰＣＴの二つのさらなる役割を示唆する。太陽光のＵＶ部分は、サ
ンゴ及びその共生渦鞭毛藻類に対して主要な且つ負の効果を有することが示され
ている。ＵＶ光を青色光（４４０−４４５ｎｍ）に変換し、次いで（多くの場合
）青緑光（４８０−４９０ｎｍ及び５００−５０５ｎｍ）に変換することによっ
て、ＵＶ光は、共生渦鞭毛藻類のＰＣＰ複合体によって吸収可能なより無害の可
視光に変換できる（図１０）。ＰＣＰ複合体は、二つの光合成系に対して捕捉し
たエネルギーを直接向けることができ、または会合するカロテノイドへの輸送を
経て過剰な光エネルギーを熱として排除することができる高度に調節された光回
収複合体である。これらのタンパク質のあるものが、約４３０ｎｍでのSoretバ
ンドからエネルギーを逃がし、ＰＣＰ複合体の吸収波長に溝中で向ける方法は、
注意すべきものである（図１０）。これを実施することによって、それらは明ら
かに、ＰＣＰ複合体の他の構成成分によって吸収可能な光にある光を変換するこ
とによって、クロロフィルａ内に光の直接的なエネルギーを制限する役割を有す
る。ＵＶ光をより長い波長に変換するいくつかのＰＰＣＴの挙動はまた、低い光
環境中で役割を果たすように機能するようである。光合成できないＵＶ光を青色
光及び緑色光に変換することによって、ＰＰＣＴは共生渦鞭毛藻類が存在できる
波長範囲を拡大する。従って低い光環境において、ＰＰＣＴの３００−３６０ｎ
ｍ及び４２０−４６５ｎｍ形態は、そこで生育する珊瑚礁形成サンゴの光利用可
能性を増大する宿主ベースのアクセサリー色素として機能できる。蛍光色素粒子
が、深海のサンゴの光合成速度を促進するという観察は、ＰＰＣＴのこのさらな
る役割を支持する。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】 実施例３： ＰＯＣ３及びＰＯＣ４を、以下の正及び負のプライマーを使用して、ｐＧＥＭ
−ＥＡＳＹクローニングベクターから増幅した： ＰＯＣ （正）：5'-TCC GTT ATC GCT AAA CAG AT-3'（配列番号１１） ＰＯＣ3(231)（負）：5'-TTT GTG CCT TGA TTT GAC TC-3'（配列番号１２） ＰＯＣ4(235)（負）：5'-CGC CAC TGC GTA TTT GTG CC-3'（配列番号１３） ＰＯＣ4(220)（負）：5'-GGC GAC CAC AGG TTT GCG TG-3'（配列番号１４）
【００７５】 増幅配列をゲル精製し、pBAD TOPO TAクローニングキット(Invitrogen, Carls
bad, CA, USA)を使用して細菌pBAD TOPO発現ベクター中に挿入し、その後One Sh
ot Competent Cells(invitrogen, Carlsbad, CA, USA)内にトランスフォームし
た。より長い配列（２３１アミノ酸及び２３５アミノ酸）中のリーディングフレ
ーム及びＡＡ２２１での停止コドンの出現を、pBAD TOPO発現ベクター中のｐＢ
ＡＤ正及び負プライミング部位からのＡＢＩヌクレオチドシークエンシングによ
りチェックした。
【００７６】 pBAD TOPOからのタンパク質発現は、アラビノース濃度を最適化することによ
って調節された。発現されたタンパク質を、(i)pBAD TOPO転写終結コドンを使用
するように操作されたタンパク質のＣ末端で合成される６×Ｈｉｓタグを結合す
ることにより、並びに(ii)６×Ｈｉｓタグを各発現されたタンパク質に対するゲ
ル濾過クロマトグラフィーにより精製する。
【００７７】 実施例４： ＵＶＡ及びＵＶＢ光をカバーする３２０−７００ｎｍの範囲の光を吸収するＰ
ＰＣＴの能力は、それらをサンスクリーン製剤の有用なスクリーニング化合物と
する。上記製剤は、例えば任意に製薬学的に許容可能な担体若しくは賦形剤と混
合して、ＰＰＣＴのスクリーニングに有効な量を含むであろう。ＰＰＣＴを含む
サンスクリーン製剤は、ＰＰＣＴを非水溶性にする薬剤若しくは組成物とＰＰＣ
Ｔを混合することによって、エマルションを形成することで提供されてもよい。
別法として、ＰＰＣＴは、ＰＰＣＴを非水溶性にし、それによって水性担体若し
くは賦形剤中でエマルションを形成できるようにするために、「タグ」ペプチド
若しくは長鎖脂肪酸のような化合物を合成されてもよい（例えばＰＰＣＴのＣ末
端に、若しくはＣ末端近傍に「タグ」を結合することによって）。タンパク質の
カルボキシ基若しくはアミノ基（例えばε−アミノ基）でタンパク質をアシル化
する方法は、当該技術分野で周知である。サンスクリーン製剤中に存在するＰＰ
ＣＴの量は一般的に、製剤の少なくとも１重量％であろう。（１０より多いの炭
素原子を有する脂肪酸でアシル化された）ＰＰＣＴを含む好ましいサンスクリー
ン製剤は、以下のものを含む： (i) 約３％のセトステアリルアルコール、ＰＥＧ−４０ヒマシ油及び／または
セテアリル硫酸ナトリウム； (ii) 約１０％のデシルオレアート； (iii) 約１．５％の水酸化ナトリウム（４５％溶液）； (iv) 約０．１から０．５％の二ナトリウムエデタート； (v) 約０．５％のカーボマー； (vi) 約１から１０％のアシル化ＰＰＣＴ；及び (vii) バランスである水。
【００７８】 上記サンスクリーン製剤はまた、例えばプロピルヒドロキシベンゾアート、ジ
メチルアミノベンゾアート（ＰＡＢＡ）、フェニルサルチラート、及び／または
オクチルメトキシシンナマートといった、当該技術分野で周知の他のスクリーニ
ング剤を含んでもよい。
【００７９】 実施例５： ３２０−７００ｎｍの範囲の光を吸収するＰＰＣＴの能力はまた、それらを例え
ばサングラスレンズ、カメラ、水槽およびグリーンハウスのような応用のための
フィルターとして使用するための、ガラス及びパースペックス（登録商標）のよ
うなポリマー性物質のような各種の材料中に取り込ませるために有用なものとす
る。
【００８０】 ３２０−７００ｎｍのＰＰＣＴの吸収範囲は、クロロフィルａのソーレーバン
ド（４３０ｎｍ）をカバーするが、とりわけクロロフィルａ及びｃのＱxバンド
をカバーする（５５０−６００ｎｍ）。Ｑxバンドは特に、高光強度と関連する
散乱光を吸収する。それ故フィルター内に取り込まれたＰＰＣＴは、高い光環境
中の植物の光阻害を減少緒するように機能してもよい。さらにその励起若しくは
最大吸収波長より高い波長で光を放射するＰＰＣＴの能力は、さもなければ透過
しないであろう光波長と関連するエネルギーを、例えばガラスを通過させる可能
性を提供する。そのエネルギーが４００−５５０ｎｍである光合成で活性な光（
ＰＡ）の範囲の波長で輸送される場合、フィルターにおけるＰＰＣＴの使用は、
植物、藻類、サンゴ等のための改良された増殖条件を生産する可能性を提供する
。例えば、３２０−３６０ｎｍの光によって励起されるA. horrida由来のＰＰＣ
Ｔの使用は、ＵＶＡ光の吸収（それはガラスによってほぼ伝達されない）を、４
３０−４５０ｎｍのＰＡＲ波長で伝達させるようにするであろう。
【００８１】 ＰＰＣＴの高温耐性（＞４０℃）は、ＰＰＣＴをガラス及び他のポリマー性物
質（特に比較的低融点温度を有するポリマー性物質）内に容易に含ませる、また
はその上に皮膜させることを可能にする。ガラス及び他のポリマー性物質に含ま
れるＰＰＣＴの量、若しくはコーティング材料中に含まれるＰＰＣＲの量は一般
的に、１重量％より多いであろう。
【００８２】 数多くの変形及び／または修正が、広く記載された本発明の精神若しくは範囲
から離れることなく特異的な実施態様に示された本発明になされるであろうこと
は、当業者に予測できるであろう。それ故、本実施態様は、全て説明の観点で考
慮され、制限的なものではない。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＰＰＣＴをコードする遺伝子にハイブリダイズするた
めに有用な縮重プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【図２】 図２は、シークエンシングのために集められたゲル濾過ＨＰＬ
Ｃ分画のＳＤＳ ＰＡＧＥの電気ブロットを提供する。各レーンは以下の通りで
ある：１．A. Horrida, ２．M. Caliculata, ３．M. Monasteriata,４．P. Laba
ta, ５．P. murrayensis, ６．A. Formosa, ７．S. hystrix, ８．P. damicormi
s, ９．S. Pistillata。分子量マーカーは、数字のないレーンに示される。
【図３】 図３は、図３のT7SP6BASPOC3クローンによってコードされるア
ミノ酸配列を示す。
【図４】 図４は、図４のT7SP6BASPOC4クローンによってコードされるア
ミノ酸配列を示す。
【図５】 図５は、A. asperaから得られたＰＰＣＴをコードするT7SP6BA
SPOC3クローンのｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す。
【図６】 図６は、A. asperaから得られたＰＰＣＴをコードするT7SP6BA
SPOC4クローンのｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す。
【図７】 図７は、ＰＰＣＴをコードするｃＤＮＡの導入及び後の細菌発
現のために適したベクターを示す。
【図８】 図８は、珊瑚礁形成サンゴから得られた主要な色素ポリペプチ
ドの分子モデルの模式図を提供する。Ａ．Ｎ末端からＣ末端までのMOLSCRIPYカ
ートン。矢印はβストランドを表し、螺旋はヘリックス部分を示す。フルオロホ
アの重原子（Ｑ６１，Ｙ６２及びＧ６３）が、ボールと棒の記号で示されている
。Ｂ．直近の荷電側鎖、極性側鎖及び疎水性側鎖が、ボールと棒の記号で示され
ている。
【図９】 図９は、Ａ−Ｃ．Acropora aspera及びＤ−Ｆ．Pocillopora d
amicormisから得たＧＦＰ様色素（ポシロポリン）の吸収スペクトル、励起スペ
クトル及び放射スペクトルを示す。ゲル濾過中の２７−２８分（Ａ及びＤ）及び
２５−２６分（Ｂ及びＥ）で採取されたサンプルは、優勢な蛍光励起（１−３，
５−６）および放射（１−３，５−６）スペクトルを示して描く。合成吸収（４
，７，５８０及び５６０ｎｍでのピーク）及び放射スペクトル（点線）が、パネ
ルＣ及びＦに示されている。
【図１０】 図１０は、ＰＰＣＴと、共生渦鞭毛藻類のペリジニン−クロ
ロフィル−タンパク質（ＰＣＰ）複合体の間の相互作用を示す。レーン１は、６
７４ｎｍで単離されたＰＣＰ複合体による蛍光放射を引き起こす、共生渦鞭毛藻
類(Acropora aspera)のＰＣＰ複合体の励起スペクトルを示す（レーン２，Ｑyク
ロロフィルａ遷移に対する同等なもの）。レーン３，４，５及び６は、珊瑚礁形
成サンゴAcropora aspera及びPocillopora damicormis中のＧＦＰ様ポシロポリ
ンの典型的な励起スペクトルを示す。対応する矢印は、最大の励起が生ずる箇所
を示す。連続する蛍光色素の放射（矢印）及び励起波長の組み合わせに注意すべ
きである。点線は、ＰＣＰ複合体についてのそれぞれの励起ピークと、クロロフ
ィルａのＱxバンドのおよその位置を示す。Ａ＝クロロフィルａ（４４１ｎｍ）
、Ｂ＝ペリジニン（４７２ｎｍ）及びＣ＝ペリジニンのさらなる振動バンド（５
２５ｎｍ）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８３ 1/19 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 21/78 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ソフィー・ドーヴ オーストラリア・クィーンズランド・ 4072・ブリスベン・ユニバーシティ・オ ブ・クィーンズランド・センター・フォ ア・マリーン・スタディーズ（番地なし) Ｆターム(参考） 2G054 CE02 EA03 4B024 AA03 BA80 CA04 CA09 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 GA11 HA01 HA03 HA12 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 CE07 CE11 DA16 DA20 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA50 CA52 4C083 AA071 AD411 CC19 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA50 EA15 FA72 FA74 GA22 GA23

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 入射光による照射の際に蛍光を放射可能な、サンゴ組織由来
    色素タンパク質（ＰＰＣＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポ
    リヌクレオチド分子であって、上記入射光の最大吸収が３２０−６００ｎｍの範
    囲であり、最大蛍光放射が３００−７００ｎｍの範囲である分子。
  2. 【請求項２】 コードされた色素タンパク質が、５５０−５８０ｎｍの範囲
    で上記入射光の最大吸収を有し、４００−６３０ｎｍの範囲で最大蛍光放射を有
    する、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  3. 【請求項３】 上記分子が、Ｎ末端アミノ酸配列： ＳＶＩＡＫ（配列番号１） を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、サンゴ組織由来色素
    タンパク質（ＰＰＣＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌ
    クレオチド分子。
  4. 【請求項４】 上記分子が、Ｎ末端アミノ酸配列： ＳＶＩＡＫＱＭＴＹＫＶＹＭＳＧＴＶ（配列番号２） を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、サンゴ組織由来色素
    タンパク質（ＰＰＣＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌ
    クレオチド分子。
  5. 【請求項５】 コードされたタンパク質が、アミノ酸配列ＱＹＧを含む色素
    体領域を含む、請求項１から４のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチ
    ド分子。
  6. 【請求項６】 上記分子が、配列番号３若しくは４として示された配列に対
    応するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、
    請求項１から５のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  7. 【請求項７】 上記分子が、配列番号５若しくは６として示された配列と少
    なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１から６のい
    ずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  8. 【請求項８】 上記分子が、配列番号５若しくは６として示された配列と少
    なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７記載の単離
    されたポリヌクレオチド分子。
  9. 【請求項９】 上記分子が、配列番号５若しくは６として示された配列と少
    なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７記載の単離
    されたポリヌクレオチド分子。
  10. 【請求項１０】 上記分子が、配列番号５若しくは６として示された配列と
    実質的に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１から９のいずれか一項記載
    の単離されたポリヌクレオチド分子。
  11. 【請求項１１】 実質的に精製形態で存在する、Ｎ末端アミノ酸配列ＳＶＩ
    ＡＫ（配列番号１）を含むタンパク質。
  12. 【請求項１２】 実質的に精製形態で存在する、Ｎ末端アミノ酸配列ＳＶＩ
    ＡＫＱＭＴＹＫＶＹＭＳＧＴＶ（配列番号２）を含むタンパク質。
  13. 【請求項１３】 上記タンパク質が、配列番号３若しくは４として示された
    配列に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２記載のタンパク質。
  14. 【請求項１４】 上記タンパク質が、Pocilloporidae、Acroporidae、Porit
    idae、Faviidae、Merulinidae及びFungiidaeより成る群から選択されるサンゴ科
    から得たサンゴ組織から精製できる、請求項１１から１３のいずれか一項記載の
    タンパク質。
  15. 【請求項１５】 上記タンパク質が、Acropora aspera、Acropora digitife
    ra、Acropora horrida、Acropora formosa、Montipora monasteriata、Montipor
    a caliculata、Pocillopora damicornis、Porites murrayensis、Porites lobat
    a、Plesiastrea versipora及びSeriatopora hystrixより成る群から選択される
    サンゴの組織から精製できる、請求項１４記載のタンパク質。
  16. 【請求項１６】 上記タンパク質が、Acropora aspera、Acropora horrida
    、Montipora monasteriata、Montipora caliculata、Porites murrayensis、Por
    ites lobata及びPlesiastrea versiporaより成る群から選択されるサンゴの組織
    から精製できる、請求項緒１４記載のタンパク質。
  17. 【請求項１７】 請求項１から１０のいずれか一項記載のポリヌクレオチド
    を含むベクター。
  18. 【請求項１８】 請求項１７記載のベクターでトランスフェクト若しくはト
    ランスフォームされた宿主細胞。
  19. 【請求項１９】 請求項１１から１６のいずれか一項記載のタンパク質を生
    産する方法であって、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の発現
    に適した条件下で、請求項１７記載のベクターでトランスフェクト若しくはトラ
    ンスフォームされた宿主細胞を培養する工程、及び任意に発現タンパク質を回収
    する工程を含む方法。
  20. 【請求項２０】 宿主細胞の培養工程が、３０−３７℃の範囲の温度で実施
    される、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 宿主細胞の培養工程が、約３５℃の温度で実施される、請
    求項１９記載の方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１から１０のいずれか一項記載のポリヌクレオチド
    分子に選択的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチ
    ドプローブ若しくはプライマー。
  23. 【請求項２３】 上記プローブ若しくはプライマーが、少なくとも８のヌク
    レオチドを含む、請求項２２記載のオリゴヌクレオチドプローブ若しくはプライ
    マー。
  24. 【請求項２４】 上記プローブ若しくはプライマーが、少なくとも１８のヌ
    クレオチドを含む、請求項２２記載のオリゴヌクレオチドプローブ若しくはプラ
    イマー。
  25. 【請求項２５】 上記プローブ若しくはプライマーが、少なくとも２５のヌ
    クレオチドを含む、請求項２２記載のオリゴヌクレオチドプローブ若しくはプラ
    イマー。
  26. 【請求項２６】 上記オリゴヌクレオチドが、検出可能なラベルに接合され
    る、請求項２２から２５のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドプローブ若し
    くはプライマー。
  27. 【請求項２７】 組織マーカー、蛍光マーカー、若しくは一般的染料として
    の、請求項１１から１６のいずれか一項記載のタンパク質の使用。
  28. 【請求項２８】 適切な製薬学的に許容可能な担体若しくは賦形剤と混合し
    て、請求項１１〜１６のいずれか一項記載のタンパク質の有効量を含むサンスク
    リーン製剤。
  29. 【請求項２９】 請求項１１から１６のいずれか一項記載のタンパク質の有
    効量を含む、入射光のＵＶ若しくは他の波長を遮断するためのフィルター。
  30. 【請求項３０】 入射光のＵＶ若しくは他の波長が、上記タンパク質によっ
    て上記光の有するエネルギーの吸収により遮断され、上記入射光より長い波長で
    放射される、請求項２９記載のフィルター。
  31. 【請求項３１】 上記入射光の吸収エネルギーが、４００から５５０ｎｍの
    範囲の波長で上記タンパク質から放射される、請求項３０記載のフィルター。
JP2000597303A 1999-02-02 2000-02-02 サンゴ組織から得た色素タンパク質 Pending JP2002535978A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU8463 1994-09-29
AUPP8463A AUPP846399A0 (en) 1999-02-02 1999-02-02 Pigment protein from coral tissue
PCT/AU2000/000056 WO2000046233A1 (en) 1999-02-02 2000-02-02 Pigment protein from coral tissue

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002535978A true JP2002535978A (ja) 2002-10-29

Family

ID=3812663

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000597303A Pending JP2002535978A (ja) 1999-02-02 2000-02-02 サンゴ組織から得た色素タンパク質

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7067278B1 (ja)
EP (1) EP1155028A4 (ja)
JP (1) JP2002535978A (ja)
CN (1) CN1345330A (ja)
AU (1) AUPP846399A0 (ja)
BR (1) BR0007837A (ja)
CA (1) CA2361038A1 (ja)
WO (1) WO2000046233A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008539239A (ja) * 2005-04-29 2008-11-13 ジョンソン・アンド・ジョンソン・コンシューマー・カンパニーズ・インコーポレイテッド 局所用組成物の蛍光検出
WO2015025959A1 (ja) * 2013-08-23 2015-02-26 独立行政法人理化学研究所 蛍光特性を示すポリペプチド、およびその利用

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9834584B2 (en) 1998-12-11 2017-12-05 Takara Bio Usa, Inc. Nucleic acids encoding chromophores/fluorophores and methods for using the same
US20030087492A1 (en) 2001-11-02 2003-05-08 Promos Technologies, Inc. Semiconductor device and method of manufacturing the same
US7338784B2 (en) 1998-12-11 2008-03-04 Clontech Laboratories, Inc Nucleic acids encoding chromophores/fluorophores and methods for using the same
EP1305412A2 (en) 1999-10-14 2003-05-02 Clontech Laboratories Inc. Anthozoa derived chromo/fluoroproteins and methods for using the same
DE60122562T2 (de) 2000-10-12 2007-08-23 Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto Nukleinsäuren, die für stichodactylidae chromoproteine kodieren
US6969597B2 (en) 2001-02-21 2005-11-29 Clontech Laboratories, Inc. Nucleic acids encoding non aggregating fluorescent proteins and methods for using the same
US20050214756A1 (en) * 2001-03-02 2005-09-29 Mirko Karan Cell visual characteristic-modifying sequences
CA2439986A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-12 Florigene Limited Cell visual characteristic-modifying sequences
CA2461824A1 (en) 2001-10-12 2003-04-17 Clontech Laboratories, Inc. Nucleic acids encoding linked chromo/fluorescent domains and methods for using the same
JP2005509420A (ja) 2001-11-13 2005-04-14 クローンテック ラボラトリーズ インク． 新規発色団／蛍光発色団およびそれらの使用法
JP4700281B2 (ja) 2001-12-19 2011-06-15 ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ 急速に成熟する蛍光タンパク質およびその使用法
US7271241B2 (en) 2002-04-24 2007-09-18 Los Alamos National Security, Llc Directed evolution methods for improving polypeptide folding and solubility and superfolder fluorescent proteins generated thereby
WO2005019252A2 (en) 2003-05-22 2005-03-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Novel fluorescent and colored proteins, and polynucleotides that encode these proteins
ATE527280T1 (de) 2003-06-16 2011-10-15 Riken Fluoreszentprotein und chromoprotein
CN1886420B (zh) 2003-10-24 2012-02-29 加利福尼亚大学 自我组装脱落荧光蛋白系统
EP1732944B1 (en) 2004-04-07 2012-09-05 The University of Chicago Monomeric red fluorescent proteins
US7230080B2 (en) 2005-02-16 2007-06-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Fluorescent and colored proteins, and polynucleotides that encode these proteins
US20060246019A1 (en) * 2005-04-29 2006-11-02 Cole Curtis A Topical composition detection
EP1785434A1 (en) 2005-11-11 2007-05-16 Ludwig-Maximilians-Universität München Targeting and tracing of antigens in living cells
US20120075577A1 (en) 2006-03-20 2012-03-29 Ishak Andrew W High performance selective light wavelength filtering providing improved contrast sensitivity
US8882267B2 (en) * 2006-03-20 2014-11-11 High Performance Optics, Inc. High energy visible light filter systems with yellowness index values
EP2054514A4 (en) 2006-08-04 2009-11-04 Univ Georgia State Res Found ENZYME SENSORS, METHODS OF PREPARATION AND USE OF SUCH SENSORS, AND METHODS OF DETECTING PROTEASE ACTIVITY
WO2009059305A2 (en) 2007-11-01 2009-05-07 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
ES2606706T3 (es) 2008-01-09 2017-03-27 Ludwig-Maximilians-Universitat München Un ensayo de doble híbrido fluorescente (F2H) para la visualización directa de interacciones de proteínas en células vivas
EP2275442A1 (en) 2009-07-06 2011-01-19 Ludwig-Maximilians-Universität München Detection and vizualization of the cell cycle in living cells
US10842728B2 (en) 2010-08-09 2020-11-24 Allele Biotechnology & Pharmaceuticals, Inc. Light-absorbing compositions and methods of use
US9737472B2 (en) * 2010-08-09 2017-08-22 Allele Biotechnology & Pharmaceuticals, Inc. Light-absorbing compositions and methods of use
US9205284B2 (en) * 2010-08-09 2015-12-08 Allele Biotechnology & Pharmaceuticals, Inc. Light-absorbing compositions and methods of use
EP2685260A1 (en) 2012-07-09 2014-01-15 Ludwig-Maximilians-Universität München Direct and quantitative detection of targets in living cells
KR20200042926A (ko) * 2017-08-21 2020-04-24 알렐 바이오테크놀로지 앤 파마슈티칼스, 인크. 광-흡수 조성물 및 사용 방법
CN111848767A (zh) * 2020-07-07 2020-10-30 浙江师范大学 一种湛蓝色荧光蛋白及其构建方法和在蛋白质防晒剂制备中的应用
CN113303247A (zh) * 2021-05-18 2021-08-27 中国科学院南海海洋研究所 一种珊瑚共生菌的回接和示踪方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2324648C (en) 1998-03-27 2013-02-26 Prolume, Ltd. Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
WO2000034326A1 (en) * 1998-12-11 2000-06-15 Clontech Laboratories, Inc. Fluorescent proteins from non-bioluminescent species of class anthozoa, genes encoding such proteins and uses thereof
WO2000034319A1 (en) * 1998-12-11 2000-06-15 Clontech Laboratories, Inc. Fluorescent proteins from non-bioluminescent species of class anthozoa, genes encoding such proteins and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6009044705, Ｂｉｏｌ Ｂｕｌｌ， （１９９５）， ｖｏｌ．１８９， ｐ．２８８−２９７ *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008539239A (ja) * 2005-04-29 2008-11-13 ジョンソン・アンド・ジョンソン・コンシューマー・カンパニーズ・インコーポレイテッド 局所用組成物の蛍光検出
WO2015025959A1 (ja) * 2013-08-23 2015-02-26 独立行政法人理化学研究所 蛍光特性を示すポリペプチド、およびその利用
US10030055B2 (en) 2013-08-23 2018-07-24 Riken Polypeptide exhibiting fluorescent properties, and utilization of the same

Also Published As

Publication number Publication date
EP1155028A1 (en) 2001-11-21
CA2361038A1 (en) 2000-08-10
WO2000046233A1 (en) 2000-08-10
AUPP846399A0 (en) 1999-02-25
CN1345330A (zh) 2002-04-17
US7067278B1 (en) 2006-06-27
EP1155028A4 (en) 2004-10-06
BR0007837A (pt) 2003-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002535978A (ja) サンゴ組織から得た色素タンパク質
US20060041108A1 (en) Renilla reniformis green fluorescent protein
CA2383642A1 (en) Anthozoa derived chromophores/fluorophores and methods for using the same
KR102594240B1 (ko) 신규한 루시퍼라제 및 이를 이용하는 방법
JP2011087581A (ja) Ａｅｑｕｏｒｅａｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ由来の新規な蛍光タンパク質およびその使用方法
JP2017051208A (ja) 花虫類に由来する発色団／蛍光体、およびそれらの使用法
EP1334122B1 (en) Nucleic acids encoding stichodactylidae chromoproteins
JP4480674B2 (ja) コペポーダ種由来の蛍光たんぱく質および該たんぱく質の使用方法
AU2002211722A1 (en) Nucleic acids encoding stichodactylidae chromoproteins
CA2434737C (en) Non aggregating fluorescent proteins and methods for using the same
WO2010138727A1 (en) Cyanochrome fluorophores
US8206978B2 (en) Green fluorescent protein optimized for expression with self-cleaving polypeptides
Tu et al. A naturally enhanced green fluorescent protein from magnificent sea anemone (Heteractis magnifica) and its functional analysis
RU2434943C2 (ru) БИОСЕНСОР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ИЗМЕНЕНИЯМ pH
AU779629B2 (en) Pigment protein from coral tissue
WO2003025134A2 (en) mcFP ENCODING NUCLEIC ACIDS, POLYPEPTIDES, ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
KR102210877B1 (ko) 형광세기가 향상된 애기장대 유래 플라빈 모노뉴클레오타이드 결합 단백질 변이체들
US20040216180A1 (en) Nucleic acids encoding linked chromo/fluorescent domains and methods for using the same
RU2812474C2 (ru) Кофеилпируват-гидролазы и их применение
KR102520959B1 (ko) 형광세기가 향상된 슈도모나스 푸티다 유래 플라빈 모노뉴클레오타이드 결합 단백질 변이체들
US20040248180A1 (en) Mutant chromophores/fluorophores and methods for making and using the same
KR101670008B1 (ko) 신규한 적색형광단백질 및 이의 형질전환 마커로서의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20061207

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090901

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091201

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20091208

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100420