KR101670008B1 - 신규한 적색형광단백질 및 이의 형질전환 마커로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종래의 적색형광단백질인 DsRed2 보다도 빠르게 발현되어 상대적으로 높은 수준의 적색형광을 발색시킬 수 있는 신규한 적색형광단백질, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 신규한 적색형광단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 mRFP 단백질은 종래의 DsRed2 보다도 더욱 빠르게 발색되어 상대적으로 높은 수준의 적색형광을 발색시킬 수 있으므로, 이를 마커로 사용하는 다양한 분야의 생물학적 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 적색형광단백질 및 이의 형질전환 마커로서의 용도{Novel red fluorescent protein and uses as transforming marker thereof}

본 발명은 신규한 적색형광단백질 및 이의 형질전환 마커로서의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 종래의 적색형광단백질인 DsRed2 보다도 빠르게 발현되어 상대적으로 높은 수준의 적색형광을 발색시킬 수 있는 신규한 적색형광단백질, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 신규한 적색형광단백질을 제조하는 방법 및 상기 적색형광단백질을 포함하는 생물학적 마커에 관한 것이다.

현재 생물학적 연구에 있어서, 살아있는 세포내에서의 활성을 검증하기 위한 수단으로 형광단백질이 널리 사용되고 있다. 상기 형광단백질은 형광을 발색시키는 단백질을 의미하며, 가장 널리 사용되고 있는 형광단백질로는 녹색형광단백질(green fluorescence protein)을 들 수 있다. 그러나, 녹색형광단백질이 여기되면 자외선 영역의 파장을 가지는 빛이 방출되고, 이러한 자외선 영역의 빛으로 인하여 생체시료가 영향을 받을 가능성이 있다는 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있는데, 예를 들어, 한국특허공개 제2003-0073037호에는 형광강도가 증강된 삽입형 녹색 형광 단백질이 개시되어 있고, 상기 녹색 형광 단백질을 이용하여 적은량의 녹색형광단백질을 발현시켜도 동일한 강도의 형광을 측정함으로써, 검출에 이용하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 개발된 녹색 형광 단백질은 일회용으로 사용할 수는 있으나, 세포내에서 장기적으로 세포활성의 변화를 모니터링하는데는 적합하지 못하다는 단점이 그대로 남아 있었다.

이러한 녹색형광단백질의 단점을 극복하는 방안으로서, 적색형광단백질(red fluorescent protein)이 대두되고 있다. 상기 적색형광단백질은 여기시에도 자외선 영역의 파장을 가지는 빛이 아닌 가시광선 영역내에서 적외선에 가까운 파장의 빛이 방출될 뿐만 아니라, 별도의 수단없이도 형광을 육안으로 관찰할 수 있으므로, 사용의 편리성 및 안전성의 측면에서 녹색형광단백질보다 우수한 특성을 나타낸다고 알려져 있다. 특히, 적색형광단백질 중 디스코소마 속(Discosoma sp.) 미생물에서 발견된 DsRed는 558nm에서 여기가 되고 583nm에서 방출이 되므로 육안으로 쉽게 형광을 관찰할 수가 있고, 높은 양자수득률(quantum yield)과 빛안정성을 니타낸다는 장점이 있다. 그러나, 상기 DsRed는 4개의 단량체 펩타이드가 합쳐진 4차 구조를 갖고 있어, 발현후에도 발색되기 위하여는 상당한 시간이 필요하므로, 상기 DsRed를 마커로 사용할 경우 상기 DsRed가 도입되었음에도 불구하고, 검출되지 않아, 도입되지 않은 것으로 오해할 소지가 있다는 단점이 있었다.

이러한 단점을 극복하기 위하여, 다양한 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 미국공개특허 제2004/0110225호에는 악티노디스쿠스 또는 디스코소마로부터 분리된 적색 형광 단백질 및 몬타스트래아 카베르노사로부터 단리된 녹색 형광 단백질 뿐만 아니라, 상기 형광 단백질을 변이시켜서 더 높은 수준의 형광을 나타내는 변이체 형광 단백질이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 변이체 형광 단백질은 형광의 발색수준이 일정하게 유지되지 않는다는 단점이 있었다. 또한, 상기 DsRed를 무작위적으로 돌연변이시켜서, 발현후 발색에 필요한 시간을 단축시킨 변이 단백질인 DsRed2를 개발하였다. 그러나, 최근들어 짧은시간동안 세포활성을 측정하려는 연구가 활발히 진행됨에 따라 상기 DsRed2 보다도 더욱 빠르게 발색될 수 있는 적색형광단백질에 대한 요구가 증가하고 있는 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 DsRed2 보다도 더욱 빠르게 발색될 수 있는 적색형광단백질을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, directed mutagenesis를 통하여 상기 DsRed2의 N-말단에 3개의 아미노산이 추가된 형태의 변이된 DsRed2를 제작하고, 이를 mRFP라 명명하였는데, 상기 mRFP는 야생형 DsRed2 보다도 더욱 빠르게 발색되므로, 효모 염색체에 삽입되는 플라스미드의 형질전환의 여부 및 정도를 파악할 수 있는 형질전환 마커로서 활용하고자 하였는데, RFP의 특성상 자외선 영역의 빛을 방출하지 않아서 시료에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라, 장파장의 적색형광을 나타내므로, 육안으로도 확인히 가능하다는 장점이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 적색형광단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 적색형광단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 적색형광단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 적색형광단백질을 포함하는 생물학적 마커를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 DsRed2 보다도 더욱 빠르게 발색될 수 있는 적색형광단백질을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, DsRed2 보다도 더욱 빠르게 발색될 수 있는 적색형광단백질은 DsRed2 보다도 빠르게 발현되는 단백질이 될 것으로 가정하고, 이처럼 빠르게 발현되는 단백질은 적색형광을 더욱 높은 수준으로 발색시킬 수 있을 것이라는 점에 착안하였다. 이에, DsRed2의 무작위적 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이 라이브러리를 제작하고, 이들 라이브러리가 도입된 각각의 형질전환체 중에서 DsRed2 보다도 더욱 높은 수준의 적색형광을 발색시키는 형질전환체를 선발하였다. 상기 선발된 형질전환체로부터 라이브러리를 통해 도입된 폴리뉴클레오티드를 수득하고, 이의 염기서열을 분석한 결과, 야생형 DsRed2 단백질의 N-말단에 3개의 아미노산인 KIK(라이신-이소루이신-라이신)으로 구성된 펩타이드가 부가된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드임을 확인하고, 상기 확인된 폴리뉴클레오티드를 "mRFP(mutated red fluorescent protein) 유전자"라 명명하였다.

상기 mRFP 유전자로부터 발현된 mRFP 단백질은 종래의 DsRed2 보다도 더욱 빠르게 발색되어 보다 높은 수준의 적색형광을 발색시킬 수 있으므로, 이를 마커로 사용하는 다양한 분야의 생물학적 연구에 널리 활용될 수 있을 것으로 분석되었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 적색형광을 발색시키는 신규한 적색형광단백질 mRFP(mutated red fluorescent protein)를 제공한다.

본 발명의 용어 "신규한 적색형광단백질 mRFP(mutated red fluorescent protein)"이란, 종래의 적색형광단백질인 DsRed2의 아미노산 서열을 기준으로, N-말단에 3개의 아미노산인 KIK(라이신-이소루이신-라이신)으로 구성된 펩타이드가 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 의미하는데, 종래의 적색형광단백질인 DsRed2 보다도 빠르게 발현되어 상대적으로 높은 수준의 적색형광을 발색시킬 수 있다는 특징을 나타낸다.

본 발명에 있어서, 상기 mRFP는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 종래의 적색형광단백질인 DsRed2 보다도 빠르게 발현되어 상대적으로 높은 수준의 적색형광을 발색시킬 수 있는 한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

아울러, 종래의 적색형광단백질인 DsRed2 보다도 빠르게 발현되어 상대적으로 높은 수준의 적색형광을 발색시킬 수 있다면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체 단백질도 본 발명에서 제공하는 mRFP의 범주에 포함될 수 있다.

특히, 본 발명에서 제공하는 mRFP는 서열번호 1의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

끝으로, 본 발명에서 제공하는 mRFP는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 mRFP를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 mRFP를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열번호 2의 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 2의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다.

또한, 종래의 적색형광단백질인 DsRed2 보다도 빠르게 발현되어 상대적으로 높은 수준의 적색형광을 발색시킬 수 있는 단백질을 코딩할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 mRFP의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 mRFP의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 본 발명에서 제공하는 mRFP를 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는데, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50), λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 배큘로바이러스(baculovirus) 등이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 mRFP를 생산하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입될 수 있는 숙주세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

또한, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 mRFP를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 본 발명의 mRFP를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 mRFP를 제조하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 mRFP를 회수하는 단계를 포함한다.

또 다른 방법으로서, 본 발명의 mRFP를 제조하는 방법은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계; (c) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및, (d) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 mRFP를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 mRFP를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 mRFP의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 배양물로부터 상기 mRFP를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 mRFP를 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 mRFP를 포함하는 생물학적 마커를 제공한다.

본 발명의 용어 "생물학적 마커(bioological marker)"란, 생물학, 의학, 약학 등의 생명과학 분야에서 사용되는 연구적, 병리학적 또는 임상적 처리에 의한 반응결과가 나타나는지의 여부를 표시하는 표지자를 의미한다. 상기 생물학적 마커의 종류는 특별히 제한되지 않고, 단백질, 지질, 당질, 핵산 등의 모든 생물학적 물질(biological substance)이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생물학적 마커는 세포수준에서 다양한 처리에 의한 반응결과를 나타내는 표지자로 해석될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 숙주세포에 외래유전자가 도입되어 발현되는지의 여부를 확인하기 위한 형질전환마커; 표적세포에 목적하는 물질이 도입되었는지의 여부를 확인하기 위한 외래물질 도입마커; 표적세포내에서 의도하는 생물학적 반응이 수행되었는지의 여부를 확인하기 위한 세포내반응 확인마커 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 박테리아 세포, 효모 세포, 균류 세포, 곤충 세포, 동물 세포 또는 식물 세포 등의 다양한 숙주세포에 대한 형질전환마커가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포에 외래유전자가 도입되어 발현되는지의 여부를 확인하기 위한 형질전환마커가 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 mRFP 단백질은 종래의 DsRed2 보다도 더욱 빠르게 발색되어 상대적으로 높은 수준의 적색형광을 발색시킬 수 있으므로, 이를 마커로 사용하는 다양한 분야의 생물학적 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 변이체 라이브러리를 만들기 위한 재조합 플라스미드의 벡터맵으로서, A는 대조군 벡터인 pET-DsRed2를 나타내고, B는 돌연변이 라이브러리 벡터인 pET-mRFP를 나타낸다.
도 2의 A는 고체 LB 배지에서 배양된 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발생되는 형광을 비교한 사진이다.
도 2의 B 및 C는 액체 LB 배지에서 배양된 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발생되는 형광을 측정한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 3의 A는 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발현되는 RFP 단백질의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 3의 B는 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발현되는 RFP 단백질의 mRNA 수준을 정량분석하여 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발현되는 RFP 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, M레인은 크기마커, 1번 레인은 Mock, 2번 레인은 12시간 동안 배양된 DsRed2, 3번 레인은 12시간 동안 배양된 mRFP, 4번 레인은 24시간 동안 배양된 DsRed2, 5번 레인은 24시간 동안 배양된 mRFP, 6번 레인은 36시간 동안 배양된 DsRed2, 7번 레인은 36시간 동안 배양된 mRFP, 8번 레인은 48시간 동안 배양된 DsRed2 및 9번 레인은 48시간 동안 배양된 mRFP를 각각 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 mRFP 유전자를 포함하는 효모 발현용 형질전환 벡터 2δ-mRFP-GAI의 벡터맵이다.
도 6은 mRFP 유전자가 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI 또는 2δ-mRFP(4)-GAI)을 평판배지에서 배양한 결과를 나타내는 사진으로서, 2δ-mRFP(3)-GAI는 본 발명의 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입되어 진한 적색을 나타내는 형질전환체를 나타내고, 2δ-mRFP(4)-GAI는 본 발명의 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입되어 연한 적색을 나타내는 형질전환체를 나타낸다.
도 7의 A는 mRFP 유전자가 도입되지 않은 형질전환 효모균(Mock), mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI) 및 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)에서 유래된 gDNA를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7의 B는 mRFP 유전자가 도입되지 않은 형질전환 효모균(Mock), mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI) 및 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)에서 유래된 gDNA에 도입된 mRFP 유전자의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8의 A는 mRFP 유전자가 도입되거나 도입되지 않은 효모균에서 발현되는 mRFP의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 8의 B는 mRFP 유전자가 도입되거나 도입되지 않은 효모균에서 발현되는 mRFP의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 mRFP 유전자가 도입되거나 도입되지 않은 효모균에서 발현되는 mRFP의 단백질 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석사진이다.
도 10은 mRFP 유전자가 도입되거나 도입되지 않은 효모균의 일반 사진, 형광사진 및 이들의 합성 이미지를 나타내는 사진으로서, Merged 는 일반 사진과 형광사진의 합성 이미지를 나타낸다.
도 11은 mRFP 유전자와 연관된 GAI 유전자가 서로 다른 수준으로 도입된 형질전환 효모균에 의해 형성된 수용성 전분질 분해환의 크기를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: DsRed2 에 대한 돌연변이 라이브러리 제조

공지된 돌연변이(directed mutagenesis) PCR 방법을 이용하여, DsRed2에 대한 돌연변이 라이브러리를 다음과 같이 제작하였다.

먼저, pDsRed2-N1(Clontech)를 주형으로 하고, 하기 DsRed2-F 및 DsRed2-R 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, 야생형 DsRed2 유전자를 수득하였다. 이때, PCR은 94℃ 40초, 58℃ 40초 및 72℃ 40초의 조건하에 30 cycle을 수행하였다.

DsRed2-F: 5'-AGTCATATGGCCTCCTCCGAGAACGTCA-3'(서열번호 3)

DsRed2-R: 5'-TGACTCGAGCTACAGGAACAGGTGGTGGC-3'(서열번호 4)

또한, 돌연변이를 유발하기 위하여, pDsRed2-N1(Clontech)를 주형으로 하고, 하기 F1 내지 F6 중 어느 하나의 프라이머와 DsRed2-R 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, 변이된 DsRed2 유전자를 수득하였다.

F1: 5'-AGTCATATGNNNATTAAGGCCTCCTCCGAGAACGTCA-3'(서열번호 5)

F2: 5'-AGTCATATGATTAAGNNNGCCTCCTCCGAGAACGTCA-3'(서열번호 6)

F3: 5'-AGTCATATGNNNATTGCCTCCTCCGAGAACGTCA-3'(서열번호 7)

F4: 5'-AGTCATATGATTNNNGCCTCCTCCGAGAACGTCA-3'(서열번호 8)

F5: 5'-AGTCATATGNNNAAGGCCTCCTCCGAGAACGTCA-3'(서열번호 9)

F6: 5'-AGTCATATGAAGNNNGCCTCCTCCGAGAACGTCA-3'(서열번호 10)

상기 수득한 야생형 또는 변이된 DsRed2 유전자를 pET-21a(+) 벡터(Novagen)에 클로닝하여, 돌연변이 라이브러리를 제작하였다. 이때, 야생형 DsRed2 유전자를 pET-21a(+) 벡터에 클로닝하여 제조된 pET-DsRed2 벡터는 대조군으로 사용하였고, 변이된 DsRed2 유전자를 pET-21a(+) 벡터에 클로닝하여 제조된 pET-mRFP 벡터를 이용하여 돌연변이 라이브러리를 제작하였으며, 상기 수득한 유전자는 pET-21a(+) 벡터의 NdeI/XhoI 부위에 삽입되었다(도 1a 및 1b).

도 1은 변이체 라이브러리를 만들기 위한 재조합 플라스미드의 벡터맵으로서, A는 대조군 벡터인 pET-DsRed2를 나타내고, B는 돌연변이 라이브러리 벡터인 pET-mRFP를 나타낸다.

상기 제작된 대조군 벡터인 pET-DsRed2와 돌연변이 라이브러리에 포함된 pET-mRFP 벡터를 각각 E.coli BL21(DE3)에 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 상기 수득한 각 형질전환체를 LB 고체배지에 도말하여, 대조군 보다도 더 빨리 적색형광을 나타내는 형질전환체를 선발하였다. 이때, 형질전환 방법은 경쟁자 세포(competent cell)와 각 벡터를 얼음조건하에서 30분동안 방치하고, 42℃로 90초동안 가열한 다음, 얼음에서 다시 60초 동안 방치하고, 이를 액체 LB 배지에 접종하여 60분 동안 배양하였다. 이어, 배양된 세포를 앰피실린이 함유된 LB 고체 배지에 도말하고 하루 뒤 콜로니 생성 여부를 확인하였다.

상기 형질전환체를 배양하여, 이에 삽입된 변이된 DsRed2 유전자를 수득하고, 이의 염기서열을 확인한 결과, 야생형 DsRed2 단백질의 N-말단에 3개의 아미노산인 KIK(라이신-이소루이신-라이신)으로 구성된 펩타이드가 부가된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드임을 확인하고, 상기 확인된 폴리뉴클레오티드를 "mRFP(mutated red fluorescent protein) 유전자"라 명명하였다.

상기 mRFP 유전자를 포함하는 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)를 LB 고체배지에 도말하여 배양하였다(도 2의 A).

도 2의 A는 고체 LB 배지에서 배양된 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발생되는 형광을 비교한 사진이다. 도 2의 A에서 보듯이, pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP)가 가장 진한 적색형광을 나타냄을 확인하였다.

아울러, 상기 각 형질전환체를 LB 액체배지에 접종하고 48시간 동안 배양하면서, 배양시작 후 12시간이 경과된 시점부터 2시간 간격으로 형광값을 측정하였다(도 2의 B 및 C). 이때, 적색형광 값의 측정은 다음과 같이 수행하였다: 배양된 각 형질전환체를 원심분리하여 동일중량의 각 균체를 수득하고, 이를 용해완충액(20 mM Tris-HCl, 1 Mm EDTA, 200mM NaCl, 1% Triton X-100 및 1 mM PMSF, pH 7.4)에 현탁시킨 다음, 초음파 분쇄방법으로 균체를 파쇄하여, 각각의 세포파쇄물을 수득하였다. 이어, 동일한 양의 각 세포파쇄물을 96웰 플레이트에 분주하고, fluoremeter(Tecan, Sweden)를 이용하여 각 세포파쇄물에서 발생되는 형광값을 측정하였다.

도 2의 B 및 C는 액체 LB 배지에서 배양된 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발생되는 형광을 측정한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 2의 B 및 C에서 보듯이, pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP)가 가장 진한 적색형광을 나타내었는데, 이는 도 2의 A의 결과와 동일함을 확인하였다.

상기 도 2의 결과는, 야생형 DsRed2를 발현하는 형질전환체(DsRed2)에 비하여 mRFP를 발현하는 형질전환체(mRFP)에서 mRFP 단량체가 빨리 발현되거나 또는 상기 단량체로부터 mRFP가 빨리 형성되어, 결과적으로는 mRFP의 세포내 수준이 증가하였기 때문인 것으로 예측되었다.

실시예 2: mRFP 의 발현수준 평가

상기 실시예 1의 결과로부터, 야생형 DsRed2를 발현하는 형질전환체(DsRed2)에 비하여 mRFP를 발현하는 형질전환체(mRFP)에서 mRFP 단량체가 빨리 발현되거나 또는 상기 단량체로부터 mRFP가 빨리 형성될 것으로 예측하였으므로, 이러한 예측을 확인하고자 mRFP 단량체의 발현수준을 평가하고자 하였다.

실시예 2-1: mRNA 수준에서 mRFP 의 발현수준 평가

상기 실시예 1에서 제작된 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)를 RNeasy mini kit (Qiagen, Germany)에 적용하여 각각의 총 RNA를 추출하였다.

이어, 상기 추출된 각각의 총 RNA 3㎍을 Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen, USA)에 적용하여 역전사시켜서, 각각의 cDNA를 합성하였다.

한편, 상기 합성된 각 cDNA를 주형으로 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 증폭된 산물을 수득하였다. 이때, PCR은 95℃ 10초, 58℃ 10초 및 72℃ 15초의 조건하에 30 cycle을 수행하였고, 장치로는 Corbett RG-6000 apparatus (Corbett Life Science, Australia)를 이용하였으며, 내부 대조군으로는 gapA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene)를 사용하였다(도 3의 A).

도 3의 A는 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발현되는 RFP 단백질의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 도 3의 A에서 보듯이, pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP)가 pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 보다도 상대적으로 우수한 mRNA 수준을 나타냄을 확인하였다.

또한, 상기 측정된 mRNA 수준을 내부대조군인 gapA의 mRNA 수준으로 정상화하여, 정량분석하였다(도 3의 B).

도 3의 B는 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발현되는 RFP 단백질의 mRNA 수준을 정량분석하여 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3의 B에서 보듯이, pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP)가 pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 보다도 상대적으로 우수한 mRNA 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 2-2: 단백질 수준에서 mRFP 의 발현수준 평가

상기 실시예 1에서 제작된 12, 24, 36 및 48시간 동안 배양된 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)를 실시예 1의 방법에 적용하여 각각의 세포파쇄물을 수득하고, 이를 12% SDS-PAGE에 적용하여 mRFP 단량체 단백질의 발현수준을 비교하였다(도 4).

도 4는 pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP), pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 및 Mock(빈 pET-21a(+) 벡터)가 도입된 형질전환체(Mock)에서 발현되는 RFP 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, M레인은 크기마커, 1번 레인은 Mock, 2번 레인은 12시간 동안 배양된 DsRed2, 3번 레인은 12시간 동안 배양된 mRFP, 4번 레인은 24시간 동안 배양된 DsRed2, 5번 레인은 24시간 동안 배양된 mRFP, 6번 레인은 36시간 동안 배양된 DsRed2, 7번 레인은 36시간 동안 배양된 mRFP, 8번 레인은 48시간 동안 배양된 DsRed2 및 9번 레인은 48시간 동안 배양된 mRFP를 각각 나타낸다. 도 4에서 보듯이, pET-mRFP가 도입된 형질전환체(mRFP)가 pET-DsRed2가 도입된 형질전환체(DsRed2) 보다도 상대적으로 우수한 단백질 수준을 나타냄을 확인하였다.

상기 실시예 2의 결과를 종합하면, mRFP의 단량체의 발현수준이 DsRed2의 것보다 현저하게 높은 수준을 나타내며, 이같은 차이로 인하여, mRFP의 단량체를 발현하는 형질전환체(mRFP)가 DsRed2의 단량체를 발혀하는 형질전환체보다 가장 진한 적색형광을 나타내는 바, 본 발명에서 제공하는 mRFP는 DsRed2를 대체하여 형질전환 마커 등의 용도로 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.

실시예 3: 효모에서 mRFP 의 형질전환 마커로서의 용도 평가

상기 실시예 1 및 2의 결과로부터, 본 발명에서 제공하는 mRFP가 DsRed2를 대체하여 형질전환 마커 등의 용도로 사용될 수 있을 것으로 예상되었으므로, 이를 효모에서 확인하고자 하였다.

실시예 3-1: 효모에서 발현하는 형질전환 벡터의 제작

먼저, pET-mRFP를 주형으로 하고, 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, mRFP 유전자를 수득하였다.

2δ-F1 primer: 5'-actggtaccatgaaaattaaggcctcctccg-3'(서열번호 11)

2δ-R primer: 5'-tgatctagactacaggaacaggtggtggc-3'(서열번호 12)

상기 수득한 mRFP 유전자를 효모용 발현벡터인 YIpδAURSAδ의 다클론 부위에 도입하여, mRFP 유전자를 포함하는 형질전환 벡터 2δ-mRFP를 제작하였다.

상기 2δ-mRFP를 주형으로 하고, 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, 증폭된 유전자 단편을 수득하였다.

2δ-F2 primer: 5'-cagtctagagcatgcaacttcttttcttttttt-3'(서열번호 13)

2δ-F1 primer (서열번호 11)

상기 증폭된 유전자 단편을 효모용 발현벡터인 YIpδAGSAδ의 다클론 부위에 도입하여, mRFP 유전자를 포함하는 효모 발현용 형질전환 벡터 2δ-mRFP-GAI를 제작하였다(도 5).

도 5는 본 발명에서 제공하는 mRFP 유전자를 포함하는 효모 발현용 형질전환 벡터 2δ-mRFP-GAI의 벡터맵이다.

실시예 3-2: 형질전환 효모의 제작

먼저, 효모균(S. cerevisiae, ATCC 9763)을 YPD 액체 배지에 접종하고 배양하여, 약 4 x 10⁷ 세포수에 도달하면, 배양을 종료하고, 배양물을 4,000rpm으로 2분 동안 원심분리하여, 균체를 수득하였다. 상기 수득한 균체는 LiOAc 용액(0.1 M Lithium acetate, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)으로 세척하였다. 세척된 균체를 100㎕의 LiOAc 용액에 현탁시키고, 이에 10㎕의 2δ-mRFP-GAI 및 10㎎/㎖의 herring sperm DNA(Invitrogen, USA)를 가하여 혼합물을 수득하였다. 상기 혼합물에 300㎕의 PEG4000 용액(50% PEG4000을 포함하는 LiOAc 용액)을 가하여 혼합한 다음, 30℃에서 45분간 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 배양물에 43㎕의 DMSO를 가하고 42℃로 5분간 가열하였다. 그런 다음, 상기 배양물을 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 균체를 수득하고, 상기 균체에 멸균수를 가하여 세척한 다음, 상기 균체를 YPDS2 평판 배지에 도말하고, 30℃에서 3일 동안 배양하였다(도 6).

도 6은 mRFP 유전자가 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI 또는 2δ-mRFP(4)-GAI)을 평판배지에서 배양한 결과를 나타내는 사진으로서, 2δ-mRFP(3)-GAI는 본 발명의 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입되어 진한 적색을 나타내는 형질전환체를 나타내고, 2δ-mRFP(4)-GAI는 본 발명의 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입되어 연한 적색을 나타내는 형질전환체를 나타낸다. 도 6에서 보듯이, mRFP 유전자가 효모에 도입된 수준에 따라, 상대적으로 진한 적색형광(2δ-mRFP(3)-GAI)을 나타낼 수도 있고, 상대적으로 연한 적색형광(2δ-mRFP(4)-GAI)을 나타낼 수도 있음을 확인하였다.

실시예 3-3: 효모 염색체 DNA 추출 및 실시간 PCR

상기 실시예 3-2에서 제작한 mRFP 유전자가 도입되지 않은 형질전환 효모균(Mock), mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI) 및 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)을 GeneAll Exgene™ Cell SV kit (GeneAll, Korea)에 적용하여 각각의 효모 염색체 DNA(gDNA)를 수득하고, 동량을 전기영동하였다(도 7의 A). 도 7의 A는 mRFP 유전자가 도입되지 않은 형질전환 효모균(Mock), mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI) 및 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)에서 유래된 gDNA를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

상기 수득한 각각의 효모 염색체 DNA 3㎍을 주형으로 하며, 하기의 프라이머를 사용한 실시간 PCR을 수행하여, 각 효모 염색체 DNA에 도입된 mRFP 유전자의 수준을 전기영동으로 비교하였다(도 7의 B). 이때, PCR은 95℃ 10초, 58℃ 10초 및 72℃ 15초의 조건하에 30 cycle을 수행하였고, 내부 대조군으로는 액틴을 사용하였다.

forward primer: 5'-gccttctacgtttccatcca-3'(서열번호 14)

reverse primer: 5'-gccaaatcgattctcaaaatg-3'(서열번호 15)

도 7의 B는 mRFP 유전자가 도입되지 않은 형질전환 효모균(Mock), mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI) 및 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)에서 유래된 gDNA에 도입된 mRFP 유전자의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7의 B에서 보듯이, mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)의 염색체 DNA에는 mRFP 유전자가 다량으로 도입되어 있음을 알 수 있었다.

실시예 3-4: 효모 RNA 추출 및 실시간 PCR

상기 실시예 3-2에서 제작한 mRFP 유전자가 도입되지 않은 형질전환 효모균(Mock), mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI) 및 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)을 RNeasy mini kit (Qiagen, Germany)에 적용하여 각각의 효모 총 RNA를 수득하고, 이를 Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)에 적용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 각각의 cDNA를 주형으로 하고, 하기 프라이머 및 SYBR® premix Ex Taq™ (TaKaRa, Japan)을 사용한 PCR을 수행하여, 증폭된 DNA 단편을 수득하고, 이를 전기영동으로 비교하였다(도 8의 A 및 B). 이때, PCR은 95℃ 10초, 58℃ 10초 및 72℃ 15초의 조건하에 30 cycle을 수행하였고, 내부 대조군으로는 액틴을 사용하였다.

forward primer: 5'-gccttctacgtttccatcca-3'(서열번호 16)

reverse primer: 5'-gccaaatcgattctcaaaatg-3'(서열번호 17)

도 8의 A는 제작한 mRFP 유전자가 도입되거나 도입되지 않은 효모균에서 발현되는 mRFP의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진이고, 도 8의 B는 증폭된 mRFP의 mRNA 수준을 나타내는 그래프이다. 도 8의 A 및 B에서 보듯이, mRFP의 mRNA는 mRFP 유전자가 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)에서는 다량으로 발현되는 반면, mRFP 유전자가 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI)에서는 극히 미미한 수준으로 발현되어 거의 검출되지 않음을 확인하였다.

실시예 3-5: 효모에서 발현되는 mRFP 의 단백질 수준 평가

상기 실시예 3-2에서 제작한 mRFP 유전자가 도입되지 않은 형질전환 효모균(Mock), mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI) 및 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)을 각각 YPD 배지에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 세포파쇄완충액(8 M Urea, 5% SDS, 0.1 mM EDTA, 40 mg/㎖ bromophenol blue, 40 mM Tris-HCl, pH 6.8)을 가하여 세포용해물을 수득하고, 이를 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 상등액을 10% SDS-PAGE에 적용한 후, 1차 항체로는 토끼의 항-DsRed 항체(clontech, Germany)를 사용하고, 2차 항체로는 염소의 항-토끼 IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여, mRFP의 단백질 수준을 평가하였다(도 9).

도 9는 mRFP 유전자가 도입되거나 도입되지 않은 효모균에서 발현되는 mRFP의 단백질 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석사진이다. 도 9에서 보듯이, mRFP 유전자가 도입된 형질전환 효모균에서만, mRFP 단백질이 발현됨을 확인하였다.

실시예 3-6: 효모에서 발현되는 mRFP 의 형광이미지 분석

상기 실시예 3-2에서 제작한 mRFP 유전자가 도입되지 않은 형질전환 효모균(Mock), mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI) 및 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)을 각각 YPD 배지에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 광학현미경 또는 형광현미경(BX43 fluorescence microscope equipped with 100x/1.30 Oil DIC)과 DP71 digital camera(Olympus, Japan)을 이용하여 일반 사진 및 형광사진을 촬영하고 이를 합성한 후, 비교하였다(도 10).

도 10은 mRFP 유전자가 도입되거나 도입되지 않은 효모균의 일반 사진, 형광사진 및 이들의 합성 이미지를 나타내는 사진으로서, Merged 는 일반 사진과 형광사진의 합성 이미지를 나타낸다. 도 10에서 보듯이, mRFP 유전자가 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)에서만, 적색형광이 발색됨을 확인하였다.

실시예 3-7: 효모에서 발현되는 GAI 의 효소활성 분석

상기 실시예 3-2에서 제작한 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 낮은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI) 및 mRFP 유전자가 효모균에 상대적으로 높은 수준으로 도입된 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)에 mRFP와 함께 도입된 GAI(glucoamylase I) 유전자에서 발현된 GAI는 수용성 전분질을 분해하므로, 상기 형질전환 효모균을 수용성 전분질이 포함된 YPD 배지에 배양하면, 균주 주위의 배지에 포함된 수용성 전분질을 분해하여 환을 형성한다. 상기 mRFP 유전자와 GAI 유전자의 도입수준이 동일하기 때문에, 상기 mRFP 유전자에 의해 적색형광이 높은 수준으로 나타날 경우, GAI 유전자에 의해 YPD 배지에서 형성되는 환의 크기도 증가할 것으로 예상하고, 이를 확인하였다. 즉, 상기 각 형질전환된 효모균을 YPD 배지에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 형성되는 환의 크기를 비교하였다(도 11).

도 11은 mRFP 유전자와 연관된 GAI 유전자가 서로 다른 수준으로 도입된 형질전환 효모균에 의해 형성된 수용성 전분질 분해환의 크기를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 11에서 보듯이, 적색형광이 높은 수준으로 발생되는 형질전환 효모균(2δ-mRFP(3)-GAI)은 전분질 분해환을 상대적으로 큰 범위로 형성하였으나, 적색형광이 낮은 수준으로 발생되는 형질전환 효모균(2δ-mRFP(4)-GAI)은 전분질 분해환을 거의 형성하지 않음을 확인하였다.

따라서, mRFP에 의하여 발생되는 적색형광은 형질전환 효모균에 도입된 목적유전자의 수준을 반영하는 형질전환 마커로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel red fluorescent protein and uses as transforming marker thereof <130> KPA140421-KR <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mRFP <400> 1 Met Lys Ile Lys Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg 1 5 10 15 Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys 35 40 45 Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu 50 55 60 Ser Pro Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala 65 70 75 80 Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp 85 90 95 Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln 100 105 110 Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile 115 120 125 Gly Val Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met 130 135 140 Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu 145 150 155 160 Lys Gly Glu Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr 165 170 175 Leu Val Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu 180 185 190 Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn 195 200 205 Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His 210 215 220 His Leu Phe Leu 225 <210> 2 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRFP <400> 2 atgaaaatta aggcctcctc cgagaacgtc atcaccgagt tcatgcgctt caaggtgcgc 60 atggagggca ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 120 tacgagggcc acaacaccgt gaagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc 180 tgggacatcc tgtcccccca gttccagtac ggctccaagg tgtacgtgaa gcaccccgcc 240 gacatccccg actacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 300 aacttcgagg acggcggcgt ggcgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggctgc 360 ttcatctaca aggtgaagtt catcggcgtg aacttcccct ccgacggccc cgtgatgcag 420 aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 480 aagggcgaga cccacaaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 540 aagtccatct acatggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gctactacta cgtggacgcc 600 aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggagcagta cgagcgcacc 660 gagggccgcc accacctgtt cctgtag 687 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agtcatatgg cctcctccga gaacgtca 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgactcgagc tacaggaaca ggtggtggc 29 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agtcatatgn nnattaaggc ctcctccgag aacgtca 37 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agtcatatga ttaagnnngc ctcctccgag aacgtca 37 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agtcatatgn nnattgcctc ctccgagaac gtca 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agtcatatga ttnnngcctc ctccgagaac gtca 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agtcatatgn nnaaggcctc ctccgagaac gtca 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agtcatatga agnnngcctc ctccgagaac gtca 34 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 actggtacca tgaaaattaa ggcctcctcc g 31 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgatctagac tacaggaaca ggtggtggc 29 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cagtctagag catgcaactt cttttctttt ttt 33 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gccttctacg tttccatcca 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gccaaatcga ttctcaaaat g 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gccttctacg tttccatcca 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gccaaatcga ttctcaaaat g 21

Claims (10)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 적색형광을 발색시키는 신규한 적색형광단백질 mRFP(mutated red fluorescent protein).
   
2. 제1항의 mRFP를 코딩하는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 염기서열은 서열번호 2의 서열로 구성되는 것인 폴리뉴클레오티드.
   
4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
   
5. 제4항의 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
   
6. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;
   (b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계;
   (c) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,
   (d) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 mRFP를 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 mRFP의 제조방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것인 방법.
   
8. 제1항의 mRFP를 포함하는 생물학적 마커 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 생물학적 마커 조성물은 형질전환마커 조성물, 외래물질 도입마커 조성물 또는 세포내반응 확인마커 조성물인 것인 마커 조성물.
   
10. 제8항에 있어서,
    상기 생물학적 마커 조성물은 박테리아 세포, 효모 세포, 균류 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 숙주세포에 외래유전자가 도입되어 발현되는지의 여부를 확인하기 위한 형질전환마커 조성물인 것인 마커 조성물.
    
    

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