KR101896610B1

KR101896610B1 - 신규한 원적색 형광 단백질

Info

Publication number: KR101896610B1
Application number: KR1020170024793A
Authority: KR
Inventors: 정민섭; 김예지
Original assignee: 홍익대학교 산학협력단
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2018-09-07
Also published as: KR20180097956A

Abstract

본 발명은 신규한 원적색 형광 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 197번째 아미노산인 이소루신(Ile)이 트레오닌(Thr), 세린(Ser), 밸린(Val) 및 타이로신(Tyr)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질에 관한 것이다.

Description

신규한 원적색 형광 단백질{Novel far-red fluorescent protein}

본 발명은 신규한 원적색 형광 단백질에 관한 것이다.

형광 단백질은 기본적으로 생물 연구에 있어서 표지자로서 사용된다. 형광 단백질 이외에도 표지자 기능을 할 수 있는 것들은 여러 가지가 있지만, 형광 단백질을 이용한 표지 방법들은 기존의 염색 방법들과 다르게 세포가 살아있는 상태에서 관찰할 수 있다는 장점이 있어 널리 사용되고 있다. 가장 많이 사용되고 있는 형광 단백질로는 녹색형광단백질(Green fluorescence protein, GFP)을 들 수 있다.

원적색형광단백질(Far-red fluorescence protein)은 특히 동물의 심층 조직 이미징(deep tissue imaging)에 매우 적합하다. 왜냐하면 포유동물의 조직은 헤모글로빈의 강한 흡수로 인해 600 nm 이하 가시광선 파장의 대부분을 흡수하기 때문이다. 또한 오렌지색 또는 적색형광단백질 라벨링과 결합하는 다중 색상 이미징(multi-color imaging)을 위해 신뢰할 만한 원적색형광단백질들이 필요하다. 따라서 안정된 원적색형광단백질을 제작하기 위한 연구가 진행되고 있다.

현재 mPlum, E2-Crimson 등과 같은 몇몇 원적색형광단백질이 개발된 상태이다. 이 중, mPlum은 DsRed 파생물로 가장 유명한 모노머 원적색형광단백질이며, 들뜸(excitation) 및 방출(emission) 피크가 각각 593 nm, 644 nm이다. 그러나, mPlum의 광학적 성질은 미성숙한 녹색 중간체(intermediate)의 존재 때문에 복잡하다는 단점이 있다.

E2-Crimson은 들뜸 및 방출 피크가 각각 611, 646 nm로, 가장 적색 이동(red-shift)된 것이나 4분자체 상태로 존재한다. 이러한 4분자체 상태의 형광 단백질은 일반적으로 관심 단백질의 상호작용, 위치, 확산을 연구하는 데에 있어 퓨전 태그로써 호환될 수 없다는 단점이 있다.

따라서, 최대 600 nm 이상에서 들뜸이 일어나 633~640 nm의 레이저와 호환될 수 있고, 퓨전된 작제물(fused construct)의 미스타겟팅(mistargeting) 또는 응집을 일으키지 않는 모노머 형태의 원적색형광단백질의 개발이 필요한 실정이다.

한국공개특허 2016-0118038호

본 발명은 신규한 원적색 형광 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 197번째 아미노산인 이소루신(Ile)이 트레오닌(Thr), 세린(Ser), 밸린(Val) 및 타이로신(Tyr)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질.

2. 위 1에 있어서, 상기 원적색 형광 단백질은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질.

3. 위 1의 원적색 형광 단백질을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.

4. 위 3에 있어서, 상기 염기 서열은 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.

5. 위 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.

6. 위 5의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.

7. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 197번째 아미노산인 이소루신(Ile)이 트레오닌(Thr), 세린(Ser), 밸린(Val) 및 타이로신(Tyr)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포로부터 원적색 형광 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 원적색 형광 단백질의 제조 방법.

8. 위 7에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 것인, 원적색 형광 단백질의 제조 방법.

9. 위 3의 폴리뉴클레오티드를 리포터 유전자로서 포함하는 융합 단백질.

10. 위 9에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 것인 융합 단백질.

11. 위 1의 원적색 형광 단백질을 포함하는 pH 측정용 조성물.

본 발명에 따르면, 종래의 mCherry 적색 형광 단백질의 하나의 아미노산만을 치환함으로써 적색 이동된 원적색 형광 단백질을 얻을 수 있다. 따라서, 종래의 적색 형광 단백질보다 포유동물의 심층 조직 이미징에 유용하고, 다색상 이미징을 가능하게 한다. 또한, 모노머 형태를 가져 목적 유전자와 융합하여 발현시킬 때는 입체 구조에 영향이 적으며, 단순 명료한 광학적 특성을 가진다는 장점이 있다.

도 1은 mCherry 발색단 주위의 수소 결합을 나타낸 것이다.
도 2는 pET15b 벡터와 mCherry 발현을 위한 수정된 pET15b 벡터의 서열 일부를 나타낸 것이다.
도 3은 mCherry와 I197T의 콜로니 색상을 비교한 것이다.
도 4는 mCherry와 I197T의 정규화된 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 mCherry, I197T, I197S, I197V 및 I197Y의 pH에 의한 응집 현상을 비교한 것이다.
도 6은 mCherry와 I197T의 pH 의존도를 나타낸 것이다.
도 7은 mCherry, I197T, I197S, I197V, I197Y 및 mPlum의 정규화된 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 mCherry, I197T, I197S, I197V, I197Y 및 mPlum의 정규화된 들뜸 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 mCherry, I197T, I197S, I197V, I197Y 및 mPlum의 정규화된 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 mCherry, I197T, mPlum 및 avGFP의 용리점을 정규화한 그래프를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구체적인 실시형태를 설명하기로 한다. 그러나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "신규한 원적색 형광 단백질"은 종래의 mCherry의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산만을 치환함으로써 적색 이동(red-shift)된 원적색 형광 단백질(Far-red fluorescence protein)을 말한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 197번째 아미노산인 이소루신(Ile, I)이 트레오닌(Thr, T), 세린(Ser, S), 밸린(Val, V) 및 타이로신(Tyr, Y)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질을 제공한다. 본 발명의 서열번호 1은 종래의 mCherry의 아미노산 서열이다. 본 발명의 원적색 형광 단백질은 종래의 mCherry의 아미노산 서열(서열번호 1) 중 하나의 아미노산을 치환한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 원적색 형광 단백질은 종래의 mCherry의 아미노산 서열(서열번호 1) 중 197번째 아미노산인 이소루신(Isoleucine, Ile)이 트레오닌(Threonine, Thr), 세린(Serine, Ser), 밸린(Valine, Val) 또는 타이로신(Tyrosine, Tyr)으로 치환된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 원적색 형광 단백질은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질이다. 본 발명에 있어서, 서열번호 2 내지 5는 종래의 mCherry의 아미노산 서열(서열번호 1) 중 197번째 이소루신을 각각 트레오닌(T), 세린(S), 밸린(V) 또는 타이로신(Y)으로 치환한 것이다 (표 1). 표 1에 서열번호 1 내지 5의 197번째 아미노산을 굵게, 밑줄로 표시하였다. 종래의 mCherry의 서열 중 197번째 이소루신(I)을 트레오닌(T), 세린(S), 밸린(V) 또는 타이로신(Y)으로 치환한 경우를 각각 I197T, I197S, I197V 또는 I197Y로 명명하였다.

서열번호	아미노산 서열
1 (mCherry)	MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVN I KLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK
2 (I197T)	MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVN T KLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK
3 (I197S)	MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVN S KLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK
4 (I197V)	MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVN V KLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK
5 (I197Y)	MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVN Y KLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK

본 발명의 원적색 형광 단백질은 mCherry의 발색단 주위에 존재하는 하나의 아미노산만을 치환하여 수소 결합 네트워크를 복구한 것이다. 도 1은 mCherry 발색단 주위의 수소 결합을 나타낸 것이다. 도 1을 참조하면, 종래의 mCherry는 페놀형 발색단을 가지고 있고, 상기 발색단은 글루탐산(Glutamic acid, Glu)과 수소결합을 하고 있다. 발색단 주위에 위치한 이소루신(Ile197)은 발색단과 수소 결합을 이룰 수 없는 구조를 가진다.

구체적으로, 본 발명의 원적색 형광 단백질은 mCherry의 발색단 주위에 존재하면서 수소 결합을 형성하지 않은 197번째 아미노산인 이소루신을 치환하여 수소결합 네트워크를 복구한 것이다. 상기 197번째 아미노산 이소루신을 양성자성 아미노산(protic amino acid)으로 치환하여 수소결합 네트워크를 복구할 수 있다. 양성자성 아미노산은 양성자를 제공하여 발색단과의 양성자 와이어를 복구할 수 있는 아미노산으로, 트레오닌(T), 세린(S) 또는 타이로신(Y)일 수 있다.

상기 197번째 아미노산 이소루신을 밸린(V)으로 치환할 수 있다. 밸린(V)은 양성자성 아미노산이 아니지만, 상기 양성자성 아미노산들과는 다른 기작으로 수소 결합을 일부 복원하는 것으로 판단된다. 수소 결합의 일부 복원은 도 5 및 도 9에서 확인할 수 있다.

본 발명의 원적색 형광 단백질은 mCherry의 197번째 아미노산인 이소루신을 트레오닌(T), 세린(S), 밸린(V) 또는 타이로신(Y)으로 치환하여, 수소 결합을 복원함에 따라 적색편이(red-shift)가 유도된 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 원적색 형광 단백질은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 종래의 mCherry 보다 적색 이동이 일어난 단백질인 한, 상기 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다.

또한, 종래의 적색형광단백질인 mCherry 보다 적색 이동된 원적색형광단백질이 있다면, 상기 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체 단백질도 본 발명에서 제공하는 원적색형광단백질의 범주에 포함될 수 있다.

본 발명의 원적색 형광 단백질은 예를 들어, 유전자 클로닝 방법 및 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)등과 같이 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 197번째 아미노산인 이소루신(Ile)이 트레오닌(Thr), 세린(Ser), 밸린(Val) 및 타이로신(Tyr)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 즉, 본 발명은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 종래의 mCherry(서열번호 1)의 197번째 아미노산인 이소루신(Isoleucine, Ile)을 코딩하는 염기 서열을 트레오닌(T), 세린(S), 밸린(V) 또는 타이로신(Y)을 코딩하는 염기 서열로 치환된 것이다.

본 발명의 서열번호 6은 종래의 mCherry(서열번호 1)를 코딩하는 염기서열의 일 예시를 나타낸 것으로, 표 2에 서열번호 1의 197번째 이소루신을 코딩하는 염기서열은 굵게, 밑줄로 표시하였다.

본 발명의 서열번호 7는 상기 서열번호 2를 코딩하는 염기서열의 일 예시를 나타낸 것으로, 종래의 mCherry(서열번호 1)의 197번째 아미노산인 이소루신(Isoleucine, Ile)을 코딩하는 염기 서열을 트레오닌(T)을 코딩하는 염기 서열로 치환된 것이다. 상기 트레오닌(T)을 코딩하는 염기 서열은 표 2에 기재된 ACC 이외에도 ACT, ACA 또는 ACG 일 수 있다.

본 발명의 서열번호 8은 상기 서열번호 3을 코딩하는 염기서열의 일 예시를 나타낸 것으로, 종래의 mCherry(서열번호 1)의 197번째 아미노산인 이소루신(Isoleucine, Ile)을 코딩하는 염기 서열을 세린(S)을 코딩하는 염기 서열로 치환된 것이다. 상기 세린(S)을 코딩하는 염기 서열은 표 2에 기재된 TCC 이외에도 AGT, AGC, TCT, TCA 또는 TCG 일 수 있다.

본 발명의 서열번호 9는 상기 서열번호 4를 코딩하는 염기서열의 일 예시를 나타낸 것으로, 종래의 mCherry(서열번호 1)의 197번째 아미노산인 이소루신(Isoleucine, Ile)을 코딩하는 염기 서열을 밸린(V)을 코딩하는 염기 서열로 치환된 것이다. 상기 밸린(V)을 코딩하는 염기 서열은 표 2에 기재된 GTG 이외에도 GTT, GTC, 또는 GTA 일 수 있다.

본 발명의 서열번호 10은 상기 서열번호 5를 코딩하는 염기서열의 일 예시를 나타낸 것으로, 종래의 mCherry(서열번호 1)의 197번째 아미노산인 이소루신(Isoleucine, Ile)을 코딩하는 염기 서열을 타이로신(Y)을 코딩하는 염기 서열로 치환된 것이다. 상기 타이로신(Y)을 코딩하는 염기 서열은 표 2에 기재된 TAT 이외에도 TAC 일 수 있다.

서열번호	염기 서열
6 (mCherry)	ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGACAATATGGCAATTATTAAAGAGTTTATGCGCTTTAAAGTGCACATGGAAGGCTCAGTGAATGGCCACGAATTTGAAATTGAAGGAGAGGGCGAAGGTCGCCCTTATGAAGGGACACAAACCGCTAAACTGAAAGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCATTTGCATGGGACATCTTATCGCCGCAGTTCATGTACGGAAGCAAGGCCTATGTGAAACATCCGGCCGACATCCCTGATTACTTAAAACTTTCTTTTCCTGAGGGCTTTAAGTGGGAACGCGTCATGAATTTCGAAGATGGCGGGGTTGTAACGGTCACACAGGATTCTTCCCTTCAGGATGGAGAGTTCATTTACAAAGTAAAACTGCGTGGGACTAATTTCCCGAGCGATGGCCCAGTTATGCAGAAAAAAACAATGGGCTGGGAAGCGAGTAGTGAACGGATGTATCCAGAAGATGGCGCTCTGAAAGGAGAGATTAAGCAAAGACTGAAACTGAAGGATGGCGGACATTATGATGCGGAAGTTAAGACTACGTATAAAGCCAAAAAACCGGTTCAACTGCCCGGCGCGTACAACGTCAAC ATC AAATTGGACATAACCTCACATAACGAGGACTATACTATAGTTGAGCAGTATGAACGCGCAGAGGGGCGTCATTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA
7 (I197T)	ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGACAATATGGCAATTATTAAAGAGTTTATGCGCTTTAAAGTGCACATGGAAGGCTCAGTGAATGGCCACGAATTTGAAATTGAAGGAGAGGGCGAAGGTCGCCCTTATGAAGGGACACAAACCGCTAAACTGAAAGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCATTTGCATGGGACATCTTATCGCCGCAGTTCATGTACGGAAGCAAGGCCTATGTGAAACATCCGGCCGACATCCCTGATTACTTAAAACTTTCTTTTCCTGAGGGCTTTAAGTGGGAACGCGTCATGAATTTCGAAGATGGCGGGGTTGTAACGGTCACACAGGATTCTTCCCTTCAGGATGGAGAGTTCATTTACAAAGTAAAACTGCGTGGGACTAATTTCCCGAGCGATGGCCCAGTTATGCAGAAAAAAACAATGGGCTGGGAAGCGAGTAGTGAACGGATGTATCCAGAAGATGGCGCTCTGAAAGGAGAGATTAAGCAAAGACTGAAACTGAAGGATGGCGGACATTATGATGCGGAAGTTAAGACTACGTATAAAGCCAAAAAACCGGTTCAACTGCCCGGCGCGTACAACGTCAAC ACC AAATTGGACATAACCTCACATAACGAGGACTATACTATAGTTGAGCAGTATGAACGCGCAGAGGGGCGTCATTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA
8 (I197S)	ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGACAATATGGCAATTATTAAAGAGTTTATGCGCTTTAAAGTGCACATGGAAGGCTCAGTGAATGGCCACGAATTTGAAATTGAAGGAGAGGGCGAAGGTCGCCCTTATGAAGGGACACAAACCGCTAAACTGAAAGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCATTTGCATGGGACATCTTATCGCCGCAGTTCATGTACGGAAGCAAGGCCTATGTGAAACATCCGGCCGACATCCCTGATTACTTAAAACTTTCTTTTCCTGAGGGCTTTAAGTGGGAACGCGTCATGAATTTCGAAGATGGCGGGGTTGTAACGGTCACACAGGATTCTTCCCTTCAGGATGGAGAGTTCATTTACAAAGTAAAACTGCGTGGGACTAATTTCCCGAGCGATGGCCCAGTTATGCAGAAAAAAACAATGGGCTGGGAAGCGAGTAGTGAACGGATGTATCCAGAAGATGGCGCTCTGAAAGGAGAGATTAAGCAAAGACTGAAACTGAAGGATGGCGGACATTATGATGCGGAAGTTAAGACTACGTATAAAGCCAAAAAACCGGTTCAACTGCCCGGCGCGTACAACGTCAAC TCC AAATTGGACATAACCTCACATAACGAGGACTATACTATAGTTGAGCAGTATGAACGCGCAGAGGGGCGTCATTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA
9 (I197V)	ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGACAATATGGCAATTATTAAAGAGTTTATGCGCTTTAAAGTGCACATGGAAGGCTCAGTGAATGGCCACGAATTTGAAATTGAAGGAGAGGGCGAAGGTCGCCCTTATGAAGGGACACAAACCGCTAAACTGAAAGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCATTTGCATGGGACATCTTATCGCCGCAGTTCATGTACGGAAGCAAGGCCTATGTGAAACATCCGGCCGACATCCCTGATTACTTAAAACTTTCTTTTCCTGAGGGCTTTAAGTGGGAACGCGTCATGAATTTCGAAGATGGCGGGGTTGTAACGGTCACACAGGATTCTTCCCTTCAGGATGGAGAGTTCATTTACAAAGTAAAACTGCGTGGGACTAATTTCCCGAGCGATGGCCCAGTTATGCAGAAAAAAACAATGGGCTGGGAAGCGAGTAGTGAACGGATGTATCCAGAAGATGGCGCTCTGAAAGGAGAGATTAAGCAAAGACTGAAACTGAAGGATGGCGGACATTATGATGCGGAAGTTAAGACTACGTATAAAGCCAAAAAACCGGTTCAACTGCCCGGCGCGTACAACGTCAAC GTG AAATTGGACATAACCTCACATAACGAGGACTATACTATAGTTGAGCAGTATGAACGCGCAGAGGGGCGTCATTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA
10 (I197Y)	ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGACAATATGGCAATTATTAAAGAGTTTATGCGCTTTAAAGTGCACATGGAAGGCTCAGTGAATGGCCACGAATTTGAAATTGAAGGAGAGGGCGAAGGTCGCCCTTATGAAGGGACACAAACCGCTAAACTGAAAGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCATTTGCATGGGACATCTTATCGCCGCAGTTCATGTACGGAAGCAAGGCCTATGTGAAACATCCGGCCGACATCCCTGATTACTTAAAACTTTCTTTTCCTGAGGGCTTTAAGTGGGAACGCGTCATGAATTTCGAAGATGGCGGGGTTGTAACGGTCACACAGGATTCTTCCCTTCAGGATGGAGAGTTCATTTACAAAGTAAAACTGCGTGGGACTAATTTCCCGAGCGATGGCCCAGTTATGCAGAAAAAAACAATGGGCTGGGAAGCGAGTAGTGAACGGATGTATCCAGAAGATGGCGCTCTGAAAGGAGAGATTAAGCAAAGACTGAAACTGAAGGATGGCGGACATTATGATGCGGAAGTTAAGACTACGTATAAAGCCAAAAAACCGGTTCAACTGCCCGGCGCGTACAACGTCAAC TAT AAATTGGACATAACCTCACATAACGAGGACTATACTATAGTTGAGCAGTATGAACGCGCAGAGGGGCGTCATTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA

본 발명의 용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오타이드(ribonucleotide)가 수개 이상 중합한 중합체를 의미하며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 폴리뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 원적색 형광 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 실질적으로 상보적이라는 것은 모든 뉴클레오티드가 또 다른 핵산 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지는 않지만 그럼에도 불구하고 두 핵산 가닥이 특정 조건 하에서 안정한 혼성체를 형성할 수 있는 서열을 갖는 것을 의미한다.

또한, 종래의 적색형광단백질인 mCherry 보다 적색 이동된 원적색형광단백질을 코딩할 수 있는 한, 상기 염기 서열과 상동성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있다. 바람직하게는 상기 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, PCR 방법, 고상 합성 기술 등과 같이 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 상기 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등과 같은 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등과 같은 파지 또는 SV40 등과 같은 바이러스를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터에서 상기 원적색 형광 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명의 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"이란, 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 즉, 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사(transcription) 및/또는 번역(translation)을 조절하게 된다.

상기 재조합 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 원적색 형광 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, p_L ^λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터에 포함되는 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환된 것" 또는 "코돈 최적화"란 숙주세포 내에서 DNA가 단백질로 전사 및 번역될 때 아미노산을 지령하는 코돈 사이에 숙주에 따라 선호도가 높은 코돈이 존재하는데, 이들 선호도가 높은 코돈으로 치환함으로써 그 핵산이 암호화하는 아미노산 또는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 것을 말한다.

본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 용어 "형질전환"은 하나 이상의 핵산 분자들을 세포 내로 전달하는 것을 의미한다.

상기 숙주 세포는 상기 원적색 형광 단백질을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 말한다. 즉, 상기 숙주 세포는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포의 게놈 상에 포함하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된 재조합 벡터를 포함하는 것이다.

상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 197번째 아미노산인 이소루신(Ile)이 트레오닌(Thr), 세린(Ser), 밸린(Val) 및 타이로신(Tyr)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포로부터 원적색 형광 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 원적색 형광 단백질의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 서열번호 2 내지 5는 종래의 mCherry의 아미노산 서열(서열번호 1) 중 하나의 아미노산이 치환된 것이다. 구체적으로, 본 발명의 서열번호 2 내지 5는 종래의 mCherry의 아미노산 서열 중 197번째 이소루신(Isoleucine, Ile)이 각각 트레오닌(T), 세린(S), 밸린(V) 또는 타이로신(Y)으로 치환된 것이다 (표 1).

서열번호 1의 아미노산 서열에서 197번째 아미노산인 이소루신(Ile)이 트레오닌(Thr, T), 세린(Ser, S), 밸린(Val, V) 및 타이로신(Tyr, Y)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, PCR 방법, 고상 합성 기술 등과 같이 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 벡터에서 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 상기 재조합 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 숙주 세포는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 말한다. 즉, 상기 숙주 세포는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포의 게놈 상에 포함하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된 재조합 벡터를 포함하는 것이다.

상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질전환된 숙주 세포로부터 원적색 형광 단백질을 수득하는 단계는, 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 발현된 원적색 형광 단백질을 수득하는 것을 말한다.

상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 형질전환된 숙주 세포를 적절한 항생제가 포함된 액상 배지에 배양하고, 세포 밀도가 일정 수준에 도달하면 단백질 발현이 유도되는 조건에서 배양함으로써, 배양물로부터 발현된 단백질을 얻을 수 있다. 상기 발현된 단백질은 세포 내 또는 배지로 분비될 수 있다.

상기 배양물로부터 발현된 단백질을 수득하는 것은 당업계에 공지된 다양한 정제 방법에 따라 정제된 형태로 얻을 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 크기 분별 여과, 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화(solubility fractionation), 다양한 크로마토그래피 (크기 배제, 이온 교환, 친화성 및 소수성) 등에 의한 정제 방법을 통하여 정제된 형태로 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 리포터 유전자로서 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 원적색 형광 단백질 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합하여 융합 단백질(fusion protein)을 얻을 수 있다. 상기 원적색 형광 단백질 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 공지된 방법에 따라 연결될 수 있다. 상기 원적색 형광 단백질을 목적 단백질과 융합함으로써 목적 단백질의 분산, 위치, 상호작용, 발현 모니터링을 용이하게 할 수 있다. 상기 원적색 형광 단백질을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질은 생물학적 표지자로 이용될 수 있다. 본 발명에서 용어 "생물학적 표지자"는 의학, 약학, 생물학, 식품공학 등의 생명과학 분야에서 사용되는 핵산, 단백질, 지질, 세포, 조직, 특정 개체 등의 모든 생물학적 물질(biological substance)의 정량, 위치, 발현, 이동 경로, 특정 자극에 대한 변화 등을 확인하기 위하여 표시하는 것을 말한다. 예를 들어, 상기 원적색 형광 단백질 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합하여 얻은 융합 단백질을 표지자로 이용할 수 있다. 상기 융합 단백질을 이용하여 개체 내 목적 단백질의 위치, 단백질의 이동 경로, 특정 자극에 대한 단백질의 발현 확인 등을 확인할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 197번째 아미노산인 이소루신(Ile)이 트레오닌(Thr), 세린(Ser), 밸린(Val) 및 타이로신(Tyr)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질을 포함하는 pH 측정용 조성물을 제공한다. 상기 원적색 형광 단백질은 종래의 mCherry보다 pH에 민감성을 나타낸다. 도 5는 mCherry, I197T, I197S, I197V 및 I197Y의 pH에 의한 응집 현상을 비교한 것이다. 도 5의 I197T, I197S, I197V 및 I197Y는 본 발명의 원적색 형광 단백질을 약어로 명명한 것으로, I197T, I197S, I197V 및 I197Y는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 197번째 이소루신(I)이 각각 트레오닌(T), 세린(S), 밸린(V) 및 타이로신(Y)으로 치환된 것이다.

도 5를 참조하면, I197T, I197S, 197V 및 197Y는 pH 5 아래에서 응집되는 반면에, mCherry는 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있다. I197V와 I197Y는 응집되는 정도가 덜한 것을 관찰할 수 있었는데, 상대적으로 소수성인 밸린(V)과 타이로신(Y)의 경우 수소결합 네트워크의 복원이 완전하지 않은 것으로 보인다.

상기 원적색 형광 단백질은 pH 5를 기준으로 하여 중성에서 약산성으로 변화했음을 감지하는 민감한 센서물질로 사용될 수 있다. 또는 응집이 일어나지 않는 pH 6~10 범위에서 pH를 판단하는 pH 측정용 물질로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

실시예 1. 돌연변이 유발(mutagenesis) 및 클로닝

E. coli에 코돈 최적화된(codon-optimized) mCherry 유전자(서열번호 11, 표 3에 기재)를 pET15b 벡터(Novagen) 내 NcoI과 BamHI 사이트 사이에 클로닝하였다. 이는 히스택(His tag) 및 트롬빈 절단 부위가 없는 본래의 mCherry 형태로 단백질을 발현하기 위함이다. 발현된 단백질의 색에 의해 콜로니 스크리닝이 가능하도록 락 오퍼레이터(lac operator)를 삭제하였다 (도 2). mCherry 클로닝 후, 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 유발하였다. 부위 특이적 돌연변이는 mCherry의 197번째 아미노산 이소루신을 트레오닌, 세린, 밸린 또는 타이로신으로 치환될 수 있도록 하는 프라이머를 제작하여 PCR 증폭(바이오니어 사의 Pfu DNA Polymerase 이용)을 통해 수행하였다. 그리고 PCR 산물은 DpnI 제한효소(Takara 사) 처리하였다. mCherry의 197번째 아미노산 이소루신을 트레오닌로 돌연변이를 유발할 수 있는 정방향/역방향 프라이머(각각 서열번호 12 및 13), 세린으로 돌연변이를 유발할 수 있는 정방향/역방향 프라이머(각각 서열번호 14및 15), 밸린으로 돌연변이를 유발할 수 있는 정방향/역방향 프라이머(각각 서열번호 16및 17), 및 타이로신으로 돌연변이를 유발할 수 있는 정방향/역방향 프라이머(각각 서열번호 18및 19)는 표 3에 나타냈다.

열충격(heat shock) 방법으로 E. coli strain BL21(DE3)을 mCherry 발현을 위한 플라스미드 또는 mCherry의 돌연변이체(mutant)들로 형질전환 시켰다. 형질전환 된 E. coli들을 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB(Luria-Bertani) 아가 플레이트에서 37℃, 하룻밤 동안(16 시간) 배양시켰다. 형질전환 된 E. coli 콜로니는 적색 계열의 색을 나타냈다.

서열번호	염기 서열 (5'-3')
11	ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGACAATATGGCAATTATTAAAGAGTTTATGCGCTTTAAAGTGCACATGGAAGGCTCAGTGAATGGCCACGAATTTGAAATTGAAGGAGAGGGCGAAGGTCGCCCTTATGAAGGGACACAAACCGCTAAACTGAAAGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCATTTGCATGGGACATCTTATCGCCGCAGTTCATGTACGGAAGCAAGGCCTATGTGAAACATCCGGCCGACATCCCTGATTACTTAAAACTTTCTTTTCCTGAGGGCTTTAAGTGGGAACGCGTCATGAATTTCGAAGATGGCGGGGTTGTAACGGTCACACAGGATTCTTCCCTTCAGGATGGAGAGTTCATTTACAAAGTAAAACTGCGTGGGACTAATTTCCCGAGCGATGGCCCAGTTATGCAGAAAAAAACAATGGGCTGGGAAGCGAGTAGTGAACGGATGTATCCAGAAGATGGCGCTCTGAAAGGAGAGATTAAGCAAAGACTGAAACTGAAGGATGGCGGACATTATGATGCGGAAGTTAAGACTACGTATAAAGCCAAAAAACCGGTTCAACTGCCCGGCGCGTACAACGTCAACATCAAATTGGACATAACCTCACATAACGAGGACTATACTATAGTTGAGCAGTATGAACGCGCAGAGGGGCGTCATTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA
12 (I197T-F)	GGCGCGTACAACGTCAACACCAAATTGGACATAACC
13 (I197T-R)	GGTTATGTCCAATTTGGTGTTGACGTTGTACGCGCC
14 (I197S-F)	GGCGCGTACAACGTCAACTCCAAATTGGACATAACC
15 (I197S-R)	GGTTATGTCCAATTTGGAGTTGACGTTGTACGCGCC
16 (I197V-F)	GGCGCGTACAACGTCAACGTGAAATTGGACATAACC
17 (I197V-R)	GGTTATGTCCAATTTCACGTTGACGTTGTACGCGCC
18 (I197Y-F)	GGCGCGTACAACGTCAACTATAAATTGGACATAACCTCAC
19 (I197Y-R)	GTGAGGTTATGTCCAATTTATAGTTGACGTTGTACGCGCC

실시예 2. 단백질 생산 및 특성 분석(characterization)

mCherry와 그것의 돌연변이 DNA를 포함하고 있는 E. coli를 암피실린을 포함한 10 mL LB 배지에서 37℃, 하룻밤 동안(16 시간) 배양하였다. 그리고 암피실린을 포함한 400 mL의 LB 배지로 규모를 확대하였다. 광학 밀도(O.D., Optical Density) 값이 0.4-0.6에 도달하면, 진탕 배양기(shaking incubator)에서 20시간 동안 24℃에서 배양하여 단백질을 발현하도록 하였다. 단백질은 25 mM 트리스(Tris) 및 150 mM 염화나트륨(NaCl) pH 7.4 버퍼 환경에서 크기 배제 컬럼(size exclusion column, GE Healthcare 사의 Superdex™ 200 Increase 10/300 GL)을 이용하여 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC, fast protein liquid chromatography, GE Healthcare 사)를 수행하여 정제하였다. 그 후, Hitrap Q HP 컬럼((GE Healthcare사)을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 정제된 단백질은 비바스핀(vivaspin)을 이용하여 한외여과(ultrafilteration)하여, 25mM Tris pH 7.4 버퍼로 교환하였다. 흡광도 측정은 자외-가시선 분광광도계(UV-Vis spectrophotometer, Thermo Scientific™ Multiskan™ GO Microplate Spectrophotometer)로 수행하였다. 형광 측정은 형광 분광광도계(fluorescence spectrophotometer, Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer)로 들뜸 및 방출 스펙트럼을 측정하였다.

mCherry의 수소 결합 네트워크의 복구 및 적색 이동된 방출 스펙트럼

mCherry의 197번째 아미노산 이소루신을 트레오닌(T), 세린(S), 밸린(V) 또는 타이로신(Y)으로 치환한 돌연변이를 각각 I197T, I197S, I197V, I197Y 으로 명명하였다.

도 3은 mCherry와 I197T의 콜로니 색상을 비교한 것이다. 도 3을 참조하면, I197T의 콜로니에서 mCherry의 콜로니보다 짙은 보라색이 나타난 것을 확인할 수 있다. 도 4는 mCherry와 I197T의 정규화된 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 4를 참조하면, I197T의 최대 방출 또한 mCherry 보다 6 nm 더 적색 이동(red-shift) 된 것을 확인할 수 있다. 이러한 색 차이는 mCherry, I197T 및 mPlum과 나란히 비교하는 그림에서 더 두드러진다 (도 9). 도 9를 참조하면, I197T는 mCherry 보다 6 nm 더 적색이동 되었고 I197S, I197V 및 I197Y는 각각 mCherry 보다 7 nm, 4 nm, 11 nm 더 적색이동 되었다.

또한, 수소결합이 복구됨에 따라, I197T, I197S, I197V 및 I197Y는 pH 수용액에 더 민감해졌다. I197T, 197S, 197V 및 197Y는 pH 5 아래에서 응집되는 반면에, mCherry는 영향을 받지 않았다(도 5). 따라서, I197T, I197S, I197V 또는 I197Y는 pH 5를 기준으로 중성에서 약산성으로 변화했음을 감지할 수 있다. mCherry는 양성자 와이어가 연결되어 있지 않으므로 pH 5~10 사이에서 형광 발광이 조금씩 변했다. 이는 대부분의 avGFP 변이체들과 반대되는 성질이다. 그러나, I197T의 경우를 보면 그 변화가 mCherry보다 덜 가파른 것으로 관찰되었다 (도 6). 이는 pH 6이하에서는 응집 때문에 발광을 관찰할 수 없었기 때문이다. mCherry와 달리 I197T, I197S, I197V 또는 I197Y가 pH에 민감성을 보이는 것은 용매 안에서 수소 결합 네트워크가 복구되었다는 것을 명확히 증명한다. I197V와 I197Y는 응집되는 정도가 덜한 것을 관찰할 수 있었는데, 상대적으로 소수성인 밸린(V)과 타이로신(Y)의 경우 수소결합 네트워크의 복원이 완전하지 않은 것으로 보인다. 이러한 결과로부터 mCherry의 pH 저항성의 원인을 찾아내었고, 산성 환경에서 단백질 응집의 메커니즘을 밝혀내었다.

I197T, I197S, I197V 및 I197Y의 분광 성질

이러한 수소 결합으로 적색 이동된 I197T, I197S, I197V 및 I197Y는 mPlum의 적색 이동 메커니즘과 유사하다. mPlum에서는 Glu13과 발색단 사이의 수소 결합이 발색단의 컨주게이션 결합을 더 길게 만들어서 적색 이동된 방출을 일으킨다. I197T의 경우, 트레오닌(Thr197)과 발색단의 페놀기 말단이 수소 결합을 이루어 컨주게이션 시스템을 이루게 되어 비슷한 효과를 낸다. 수소 결합은 방출 스펙트럼에 주로 영향을 준다. mCherry의 흡수 스펙트럼은 I197T, I197S, I197V 및 I197Y의 흡수 스펙트럼과 거의 완전히 겹치는 것으로 나타났는데 (도 7), 이는 수소 결합이 유도한 적색 이동 메커니즘을 뒷받침한다. 흡수 스펙트럼을 살펴보면, mCherry의 발색단과 I197T, I197S, I197V 및 I197Y의 발색단이 탈양성자화된 페놀기를 가지는 것을 알 수 있는데, 이 때문에 근처의 히드록시기와 수소 결합을 하는 것이다. 흥미롭게도 mCherry, mPlum, I197T, I197S, I197V 및 I197Y의 흡수 스펙트럼은 530 nm에서 630 nm 범위에서 거의 일치한다 (도 7). 하지만 이들의 방출 스펙트럼은 mCherry의 최대 방출은 611 nm, I197T는 617 nm, I197S는 618 nm, I197V는 615 nm, I197Y는 622 nm, mPlum은 644 nm로 매우 차이가 나는 것을 볼 수 있다 (도 9).

mPlum은 다색 표지 연구를 할 때 문제가 될 수도 있는 녹색 형광을 내는 요소를 가지고 있다. 이는 흡수 스펙트럼에 395 nm 및 500 nm에서 강한 밴드가 관찰되는 것을 보면 알 수 있다 (도 7). 이는 발색단의 성숙 과정에서 적색과 녹색이 둘 다 막다른 생산물이기 때문이다. 반대로 I197T, I197S, I197V, I197Y 및 mCherry에서는 이러한 녹색 형광을 나타내지 않았다.

표 4에, mCherry, I197T 및 mPlum의 분광 성질을 나타내는 파라미터를 정리하였다. I197T의 최대 흡수파장과 흡광계수(extinction coefficient)는 mCherry와 mPlum의 것과 거의 동일하였다. 하지만 611 nm에서 빛을 방출하는 mCherry와 다르게, I197T는 617 nm에서 최대 방출(emission max)을 나타내었다. mCherry와 I197T 사이에 들뜸 파장의 차이가 6 nm 이긴 하지만, 같은 스토크스 이동(Stokes shift)을 나타냈다. 이것은 수소 결합의 도입이 적색 이동된 들뜸(excitation)을 발생하고 결과적으로 색에 변화를 준 것으로 볼 수 있다. 흡광계수가 거의 동일한 반면에, 양자수율은 I197T의 형광 양자수율 0.03, mCherry는 0.22 값을 나타내 I197T가 상당히 낮다. 이는 많은 양의 흡수된 에너지가 비복사 방출된 것으로, 보통 발색단 회전을 안정화시킨 효과이다. 이는 트레오닌이 이소루신보다 살짝 작은 크기이기 때문에 발색단에게 회전할 공간을 마련해주었기 때문으로 보인다.

구분	mCherry	I197T	mPlum
최대 들뜸 파장 (excitation max, nm)	587	593	593
최대 방출 파장 (emission max, nm)	611	617	644
양자 수율 (quantum yield)	0.22	0.03	0.1
흡광계수 (extinction coefficient, M^-1cm^-1)	72000	66000	41000

올리고머화 경향에 대한 비교

라벨링을 위한 형광 단백질의 올리고머화는, 공간 분포를 위한 단백질 트래킹 연구 및 단백질 상호작용 분석 연구에 있어 해로울 수 있다. 도 10은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 mCherry, avGFP 및 I197T의 올리고머화 정도를 측정한 결과이다. mCherry는 모노머 표준, avGFP는 이량체 표준으로 하여 분석하였다. 놀랍게도 I197T의 용리점이 mPlum과 mCherry보다 더 빠르게 나왔고 avGFP보다 느리게 나와, 약간 이량체화된 것으로 측정되었다 (도 10). 형광 단백질의 올리고머화는 일반적으로 단백질 표면의 소수성 부분이나 정전기 효과라고 알려져 있다. 하지만 이소루신(Ile197)은 mCherry 단백질 내부에 있는 발색단 근처에 위치해 있기 때문에, 이소루신(Ile197)의 돌연변이로 인한 올리고머화 성질은 무시할 수 있다. 한가지 가능성은 내부의 소수성 이소루신이 친수성 트레오닌으로 변화함에 따라 전체 단백질 구조를 재배열한다는 것이다. 그러나, 일반적인 I197T의 발색단 성숙은, 발색단 성숙에 참여하는 잔기들이 제자리에 있어야 하므로, 전체적인 구조는 mCherry와 같이 잘 유지됨을 알 수 있기 때문에 이 가능성은 배제할 수 있다. 이 원인은 상기 pH 실험에서 보듯이, 크로마토그래피 실험조건인 pH 7에서 일부분의 I197T가 응집하기 때문이라고 볼 수 있다. 이는 피크(peark)가 넓은 범위로 퍼져나온 것으로도 미루어 짐작할 수 있는데, 다양한 크기의 미량 응집체들의 혼합체 때문에 생기는 현상이다. I197S, I197V 및 I197Y는 I197T와 동일한 위치의 유전자 조작이기 때문에 I197T와 같은 모노머 형태일 것으로 예측 가능하다.

<110> Hongik University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel far-red fluorescent protein <130> 16P11031 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry <400> 1 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe 1 5 10 15 Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe 20 25 30 Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr 35 40 45 Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp 50 55 60 Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His 65 70 75 80 Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe 85 90 95 Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val 100 105 110 Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys 115 120 125 Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys 130 135 140 Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly 145 150 155 160 Ala Leu Lys Gly 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Lys Val Lys 115 120 125 Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys 130 135 140 Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly 145 150 155 160 Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly 165 170 175 His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val 180 185 190 Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Thr Lys Leu Asp Ile Thr Ser 195 200 205 His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly 210 215 220 Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 3 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> I197S <400> 3 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe 1 5 10 15 Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe 20 25 30 Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr 35 40 45 Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp 50 55 60 Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His 65 70 75 80 Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe 85 90 95 Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val 100 105 110 Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys 115 120 125 Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys 130 135 140 Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly 145 150 155 160 Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly 165 170 175 His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val 180 185 190 Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser 195 200 205 His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly 210 215 220 Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> I197V <400> 4 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe 1 5 10 15 Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe 20 25 30 Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg 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I197Y <400> 5 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe 1 5 10 15 Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe 20 25 30 Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr 35 40 45 Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp 50 55 60 Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His 65 70 75 80 Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe 85 90 95 Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val 100 105 110 Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys 115 120 125 Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys 130 135 140 Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly 145 150 155 160 Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly 165 170 175 His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val 180 185 190 Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Tyr Lys Leu Asp Ile Thr Ser 195 200 205 His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly 210 215 220 Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 6 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry <400> 6 atggtgagca agggcgagga ggacaatatg gcaattatta aagagtttat gcgctttaaa 60 gtgcacatgg aaggctcagt gaatggccac gaatttgaaa ttgaaggaga gggcgaaggt 120 cgcccttatg aagggacaca aaccgctaaa ctgaaagtga ccaagggcgg ccccctgcca 180 tttgcatggg acatcttatc gccgcagttc atgtacggaa gcaaggccta tgtgaaacat 240 ccggccgaca tccctgatta cttaaaactt tcttttcctg agggctttaa gtgggaacgc 300 gtcatgaatt tcgaagatgg cggggttgta acggtcacac aggattcttc ccttcaggat 360 ggagagttca tttacaaagt aaaactgcgt gggactaatt tcccgagcga tggcccagtt 420 atgcagaaaa aaacaatggg ctgggaagcg agtagtgaac ggatgtatcc agaagatggc 480 gctctgaaag gagagattaa gcaaagactg aaactgaagg atggcggaca ttatgatgcg 540 gaagttaaga ctacgtataa agccaaaaaa ccggttcaac tgcccggcgc gtacaacgtc 600 aacatcaaat tggacataac ctcacataac gaggactata ctatagttga gcagtatgaa 660 cgcgcagagg ggcgtcattc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg a 711 <210> 7 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197T <400> 7 atggtgagca agggcgagga ggacaatatg gcaattatta aagagtttat gcgctttaaa 60 gtgcacatgg aaggctcagt gaatggccac gaatttgaaa ttgaaggaga gggcgaaggt 120 cgcccttatg aagggacaca aaccgctaaa ctgaaagtga ccaagggcgg ccccctgcca 180 tttgcatggg acatcttatc gccgcagttc atgtacggaa gcaaggccta tgtgaaacat 240 ccggccgaca tccctgatta cttaaaactt tcttttcctg agggctttaa gtgggaacgc 300 gtcatgaatt tcgaagatgg cggggttgta acggtcacac aggattcttc ccttcaggat 360 ggagagttca tttacaaagt aaaactgcgt gggactaatt tcccgagcga tggcccagtt 420 atgcagaaaa aaacaatggg ctgggaagcg agtagtgaac ggatgtatcc agaagatggc 480 gctctgaaag gagagattaa gcaaagactg aaactgaagg atggcggaca ttatgatgcg 540 gaagttaaga ctacgtataa agccaaaaaa ccggttcaac tgcccggcgc gtacaacgtc 600 aacaccaaat tggacataac ctcacataac gaggactata ctatagttga gcagtatgaa 660 cgcgcagagg ggcgtcattc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg a 711 <210> 8 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197S <400> 8 atggtgagca agggcgagga ggacaatatg gcaattatta aagagtttat gcgctttaaa 60 gtgcacatgg aaggctcagt gaatggccac gaatttgaaa ttgaaggaga gggcgaaggt 120 cgcccttatg aagggacaca aaccgctaaa ctgaaagtga ccaagggcgg ccccctgcca 180 tttgcatggg acatcttatc gccgcagttc atgtacggaa gcaaggccta tgtgaaacat 240 ccggccgaca tccctgatta cttaaaactt tcttttcctg agggctttaa gtgggaacgc 300 gtcatgaatt tcgaagatgg cggggttgta acggtcacac aggattcttc ccttcaggat 360 ggagagttca tttacaaagt aaaactgcgt gggactaatt tcccgagcga tggcccagtt 420 atgcagaaaa aaacaatggg ctgggaagcg agtagtgaac ggatgtatcc agaagatggc 480 gctctgaaag gagagattaa gcaaagactg aaactgaagg atggcggaca ttatgatgcg 540 gaagttaaga ctacgtataa agccaaaaaa ccggttcaac tgcccggcgc gtacaacgtc 600 aactccaaat tggacataac ctcacataac gaggactata ctatagttga gcagtatgaa 660 cgcgcagagg ggcgtcattc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg a 711 <210> 9 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197V <400> 9 atggtgagca agggcgagga ggacaatatg gcaattatta aagagtttat gcgctttaaa 60 gtgcacatgg aaggctcagt gaatggccac gaatttgaaa ttgaaggaga gggcgaaggt 120 cgcccttatg aagggacaca aaccgctaaa ctgaaagtga ccaagggcgg ccccctgcca 180 tttgcatggg acatcttatc gccgcagttc atgtacggaa gcaaggccta tgtgaaacat 240 ccggccgaca tccctgatta cttaaaactt tcttttcctg agggctttaa gtgggaacgc 300 gtcatgaatt tcgaagatgg cggggttgta acggtcacac aggattcttc ccttcaggat 360 ggagagttca tttacaaagt aaaactgcgt gggactaatt tcccgagcga tggcccagtt 420 atgcagaaaa aaacaatggg ctgggaagcg agtagtgaac ggatgtatcc agaagatggc 480 gctctgaaag gagagattaa gcaaagactg aaactgaagg atggcggaca ttatgatgcg 540 gaagttaaga ctacgtataa agccaaaaaa ccggttcaac tgcccggcgc gtacaacgtc 600 aacgtgaaat tggacataac ctcacataac gaggactata ctatagttga gcagtatgaa 660 cgcgcagagg ggcgtcattc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg a 711 <210> 10 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197Y <400> 10 atggtgagca agggcgagga ggacaatatg gcaattatta aagagtttat gcgctttaaa 60 gtgcacatgg aaggctcagt gaatggccac gaatttgaaa ttgaaggaga gggcgaaggt 120 cgcccttatg aagggacaca aaccgctaaa ctgaaagtga ccaagggcgg ccccctgcca 180 tttgcatggg acatcttatc gccgcagttc atgtacggaa gcaaggccta tgtgaaacat 240 ccggccgaca tccctgatta cttaaaactt tcttttcctg agggctttaa gtgggaacgc 300 gtcatgaatt tcgaagatgg cggggttgta acggtcacac aggattcttc ccttcaggat 360 ggagagttca tttacaaagt aaaactgcgt gggactaatt tcccgagcga tggcccagtt 420 atgcagaaaa aaacaatggg ctgggaagcg agtagtgaac ggatgtatcc agaagatggc 480 gctctgaaag gagagattaa gcaaagactg aaactgaagg atggcggaca ttatgatgcg 540 gaagttaaga ctacgtataa agccaaaaaa ccggttcaac tgcccggcgc gtacaacgtc 600 aactataaat tggacataac ctcacataac gaggactata ctatagttga gcagtatgaa 660 cgcgcagagg ggcgtcattc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg a 711 <210> 11 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized mCherry <400> 11 atggtgagca agggcgagga ggacaatatg gcaattatta aagagtttat gcgctttaaa 60 gtgcacatgg aaggctcagt gaatggccac gaatttgaaa ttgaaggaga gggcgaaggt 120 cgcccttatg aagggacaca aaccgctaaa ctgaaagtga ccaagggcgg ccccctgcca 180 tttgcatggg acatcttatc gccgcagttc atgtacggaa gcaaggccta tgtgaaacat 240 ccggccgaca tccctgatta cttaaaactt tcttttcctg agggctttaa gtgggaacgc 300 gtcatgaatt tcgaagatgg cggggttgta acggtcacac aggattcttc ccttcaggat 360 ggagagttca tttacaaagt aaaactgcgt gggactaatt tcccgagcga tggcccagtt 420 atgcagaaaa aaacaatggg ctgggaagcg agtagtgaac ggatgtatcc agaagatggc 480 gctctgaaag gagagattaa gcaaagactg aaactgaagg atggcggaca ttatgatgcg 540 gaagttaaga ctacgtataa agccaaaaaa ccggttcaac tgcccggcgc gtacaacgtc 600 aacatcaaat tggacataac ctcacataac gaggactata ctatagttga gcagtatgaa 660 cgcgcagagg ggcgtcattc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg a 711 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197T-F <400> 12 ggcgcgtaca acgtcaacac caaattggac ataacc 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197T-R <400> 13 ggttatgtcc aatttggtgt tgacgttgta cgcgcc 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197S-F <400> 14 ggcgcgtaca acgtcaactc caaattggac ataacc 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197S-R <400> 15 ggttatgtcc aatttggagt tgacgttgta cgcgcc 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197V-F <400> 16 ggcgcgtaca acgtcaacgt gaaattggac ataacc 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197V-R <400> 17 ggttatgtcc aatttcacgt tgacgttgta cgcgcc 36 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197Y-F <400> 18 ggcgcgtaca acgtcaacta taaattggac ataacctcac 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I197Y-R <400> 19 gtgaggttat gtccaattta tagttgacgt tgtacgcgcc 40

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열에서 202번째 아미노산인 이소루신(Ile)이 밸린(Val)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 원적색 형광 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 원적색 형광 단백질.
청구항 1의 원적색 형광 단백질을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
청구항 3에 있어서, 상기 염기 서열은 서열번호 9의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
청구항 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
청구항 5의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
서열번호 1의 아미노산 서열에서 202번째 아미노산인 이소루신(Ile)이 밸린(Val)으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포로부터 원적색 형광 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 원적색 형광 단백질의 제조 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 염기 서열로 이루어진 것인, 원적색 형광 단백질의 제조 방법.
청구항 3의 폴리뉴클레오티드를 리포터 유전자로서 포함하는 융합 단백질.
청구항 9에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 염기 서열로 이루어진 것인 융합 단백질.
청구항 1의 원적색 형광 단백질을 포함하는 pH 측정용 조성물.