CN106831971B - 一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用 - Google Patents

一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用，属于生物医学光学与分子影像学技术领域。本发明公开的远红色荧光蛋白相对于荧光蛋白mMaroon1包括以下氨基酸突变位点：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226‑234位氨基酸片段的缺失。本发明提供的远红色荧光蛋白具有良好的单体性，易于与其他蛋白融合或相互作用，能够提高成像效率和改善成像效果。

Description

一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用
技术领域
本发明涉及生物医学光学与分子影像学技术领域，具体而言，涉及一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用。
背景技术
荧光蛋白可以通过基因调控使其在特定的时间和空间上进行表达，它能够与其它的蛋白序列融合从而被用作光学探针或者生物光学反应器的组成成分。但荧光蛋白应用于活体内成像时，常常存在组织细胞自发荧光、光散射以及血红蛋白光吸收等干扰，导致成像效率低、成像效果差等问题。远红色荧光蛋白由于它的激发峰和发射峰的波长较长(600nm以上)，因此，它可以很好的解决上述问题。
但是，现有的远红色荧光蛋白存在较为典型的缺陷：蛋白呈二聚体或四聚体，这将导致其融合性能差，不利于检测蛋白间的相互作用；此外，还存在蛋白具有较低的消光系数和量子产率，这将导致成像效果差，清晰度低，敏感性弱等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种远红色荧光蛋白，该远红色荧光蛋白具有较好的单体性，融合性能好，有助于检测蛋白间的相互作用。
本发明的再一目的在于提供一种融合蛋白，该融合蛋白含有上述的远红色荧光蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸，用于编码上述的远红色荧光蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种载体，其含有上述的核酸。
本发明的另一目的在于提供含有上述载体的重组细胞。
本发明的另一目的在于提供上述的远红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述的远红色荧光蛋白在活体成像中的应用。
本发明是这样实现的：
一种远红色荧光蛋白，其相对于荧光蛋白mMaroon1包括以下氨基酸突变位点：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失。
一种融合蛋白，其含有上述的远红色荧光蛋白。
一种分离的核酸，其编码上述的远红色荧光蛋白。
一种载体，其含有上述的核酸。
含有上述载体的重组细胞。
上述的远红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用。
上述的远红色荧光蛋白在活体成像中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用的有益效果是：
本发明提供的远红色荧光蛋白，其相对于现有的荧光蛋白mMaroon1包括S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失等氨基酸突变位点，通过上述氨基酸位点的突变和缺失，避免了二聚体的形成，大大地改善了远红色荧光蛋白的单体性，是的该远红色荧光蛋白具有了良好的单体性能，使其易于与其他蛋白融合或相互作用，有助于提高成像效率和改善成像效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例4提供的远红色荧光蛋白与荧光蛋白mMaroon1的氨基酸序列对比结果；
图2为本发明实施例4提供的远红色荧光蛋白的HPLC检测结果；
图3为本发明实施例4提供的远红色荧光蛋白的光谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用进行具体说明。
荧光蛋白可以作为光学探针或者生物光学反应器的组成成分来检测生物体内的各种各样生理生化反应。
20世纪初，来自多管水母属的绿色荧光蛋白第一次被突变为蓝色、青色和黄色荧光蛋白，且突变后的荧光蛋白的发射峰位于424到530nm之间，在这些突变体中，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白可配对在活细胞中进行双通道荧光成像，从而实现了荧光蛋白的双色同步成像，解决了在活细胞内同时检测两个生化反应的难题。
后来，人们在海洋里的珊瑚虫属中发现了一系列发射峰位于537至660nm范围内的橙色荧光蛋白和红色荧光蛋白。其中，一种具有代表性的单体红色荧光蛋-mCherry可以与青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白结合进行三色成像，应用于活细胞内观察细胞周期的三个不同时期的变化。现有的远红色荧光蛋白(如mMaroon系列等)虽然具有较高的消光系数和量子产率，但大都为二聚体，并不适用于细胞内融合蛋白等实验。2015年发现的一株远红色荧光蛋白-mGarnet已被证实具有良好的单体性，但它的量子产率相较于其他二聚体远红色荧光蛋白却比较低，并不十分适用于活体内的多色成像。
总之，现有的远红色荧光蛋白均不能同时满足单体性能好以及高量子产率和消光系数的条件，导致其无法同时兼顾良好的融合性能和较高的成像效率等，因此，无法高质量的应用于活体内同步多色成像。
基于此，本发明的发明人在现有的远红色荧光蛋白mMaroon1的基础上，通过对mMaroon1的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)和结构的分析，采用定点诱变技术，将mMaroon1基因通过聚合酶链式反应扩增，然后在组成型表达载体pNCS上对突变体进行表达和筛选，所用表达菌株为Stellar(购买自安捷伦科技公司)，为确保文库的完整性，每个突变体设置10个克隆，最后通过肉眼分辨以及CCD相机DCU223C检测突变体的荧光性质，筛选得到了新的且具有较好单体性能、较高成熟率和亮度，以及较高消光系数和量子产率的远红色荧光蛋白，命名为mMaroon2。
因此，在本发明的一方面提供了远红色荧光蛋白，其相对于荧光蛋白mMaroon1包括以下氨基酸突变位点：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失。
通过对mMaroon1的第128位的丝氨酸突变为丙氨酸，第157位的精氨酸突变为酪氨酸，第194位的苯丙氨酸突变为丙氨酸以及通过上述氨基酸位点的突变以及第226-234位氨基酸片段的缺失，使得本发明的远红色荧光蛋白不会形成二聚体，其单体性远远地强于现有的远红色荧光蛋白mMaroon1，且易于与其他蛋白融合或相互作用，将其用于成像领域中，有助于提高成像效率和改善成像效果。
进一步地，在上述mMaroon2的序列基础上，发明人为改善mMaroon2的其他方面的性能如成熟率，采用定点诱变技术，在mMaroon2序列的基础上进一步进行定点诱变，得到了同时具有单体好和成熟率高的mMaroon2。
其相对于荧光蛋白mMaroon1还包括以下氨基酸突变位点：E2R、E3L、N8E、H10T、T38K、C114V、H214Y、V216H、Y221H、C222T以及L224V。
将第2位的谷氨酸突变为精氨酸，第3位的谷氨酸突变为亮氨酸，第8位的天冬酰胺突变为谷氨酸，第10位的组氨酸突变为苏氨酸，第38位的苏氨酸突变为赖氨酸，第114位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第214位的组氨酸突变为酪氨酸，第216位的缬氨酸突变为组氨酸，第221位的酪氨酸突变为组氨酸，第222位的半胱氨酸为苏氨酸，第224位的亮氨酸突变为缬氨酸。由于这些位点位于荧光蛋白的碳端与氮端，因此可以使蛋白结构折叠更为紧密，不仅可以提高荧光蛋白的成熟率，还能进一步提高其单体性。
进一步地，在上述得到单体性好的mMaroon2的基础上，发明人为改善mMaroon2的其他方面的性能如提高亮度，采用定点诱变技术，在mMaroon2序列的基础上进一步进行定点诱变，得到了具有亮度高的mMaroon2。
其相对于荧光蛋白mMaroon1还包括以下氨基酸突变位点：V46I、Q134R、L138R、V165E、L170Y以及E175V。
将mMaroon1的第46位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第134位的谷氨酰胺突变为精氨酸，第138位的亮氨酸突变为精氨酸，第165位的缬氨酸突变为谷氨酸，第170位的亮氨酸突变为酪氨酸，第175位的谷氨酸突变为缬氨酸。这些位点的突变可以使单体远红色荧光蛋白氨基酸之间的静电相互作用更加紧密，从而稳定结构，提高亮度。
经过上述的定点诱变，本发明的远红色荧光蛋白不仅具有良好的单体性能，可避免二聚体的形成，同时还具有成熟率和亮度高等特点，以及还具有高量子产率和高消光系数等光物理性质，使其具有了良好的融合性能，易于与其他蛋白融合或相互作用，提高了成像效率和改善成像效果。
一方面，本发明提供的远红色荧光蛋白mMaroon2可用于作为荧光共振能量转移受体或供体。若将本发明的红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体时，可将其他蛋白例如发射光谱与mMaroon2的激发光谱重叠的蛋白作为荧光共振能量转移供体。若将本发明的红色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体时，可将其他蛋白例如激发光谱与mMaroon2的光谱重叠的蛋白作为荧光共振能量转移受体。
另一方面，mMaroon2也可以用于到活体内成像中，具有良好的成像率和成像效果，尤其适用于活体内进行多色成像中；更适用于在活体内与青色、黄色以及红色荧光蛋白组合或者配对进行同步四色成像中。其与其他蛋白进行融合或单独作为光学探针或者生物光学反应器的组成成分来检测生物体内的各种各样生理生化反应例如通过对该远红色荧光蛋白的成像来检测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育以及疾病等方面。
在本发明的另一方面，还提供了一种融合蛋白，其含有上述的远红色荧光蛋白。由于本发明提供的远红色荧光蛋白具有良好的单体性，因此，可通过基因工程的技术将其与其他感兴趣的蛋白进行融合，也或者是将远红色荧光蛋白标记其他感兴趣的蛋白。得到的融合蛋白同样具有良好的融合性能，不会形成多聚体。
在本发明的另一方面，还提供了一种分离的核酸，该核酸可编码上述的远红色荧光蛋白。根据密码子的简并性，在远红色荧光蛋白的氨基酸序列确定的情况下，其相应的编码核酸序列也有很多种情况，其均属于本发明的保护范围。需要说明的是，这类核酸的应用也属于本发明的保护范围。
在本发明的另一方面，还提供了含有上述核酸的载体。载体可以是克隆载体或表达载体等，优选为表达载体。其中，表达载体可以是真核表达载体或原核表达载体，优选为真核表达载体。又或者是其他类型的载体，均属于本发明的保护范围。
在本发明的另一方面，还提供了含有上述载体的重组细胞。重组细胞可以是原核细胞也可以是真核细胞。当然，重组细胞也可以是大肠杆菌、酵母菌或动物细胞或人类细胞，或者是其他类型的细胞或细菌均属于本发明的保护范围。
综上，所述本发明提供的远红色荧光蛋白，通过在mMaroon1的第128位的丝氨酸突变为丙氨酸，第157位的精氨酸突变为酪氨酸，第194位的苯丙氨酸突变为丙氨酸以及以及第226-234位氨基酸片段的缺失，改变了其原蛋白的二聚体性质，使得本发明的远红色荧光蛋白不会形成二聚体，成为了一个具有良好单体性好的远红色荧光蛋白，其有利于蛋白间的相互作用，可适用于众多领域的成像检测中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的远红色荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其相对于荧光蛋白mMaroon1(SEQ ID NO:1)具有以下氨基酸突变位点：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失。
即本实施例的远红色荧光蛋白的氨基酸序列由mMaroon1第128位的丝氨酸突变为丙氨酸，第157位的精氨酸突变为酪氨酸，第194位的苯丙氨酸突变为丙氨酸以及通过上述氨基酸位点的突变以及第226-234位氨基酸片段的缺失后得到。
通过上述位点的氨基酸位点突变以及第226-234位氨基酸片段的缺失，改变了原先的荧光蛋白mMaroon1二聚体性质，使得本实施例的远红色荧光蛋白(SEQ ID NO:2)具有了较好的单体性能，易于和其他蛋白融合或相互作用，有助于提高成像率和成像效果。
实施例2
在实施例1的远红色荧光蛋白(SEQ ID NO:2)的基础上，对其进行进一步的定点突变，以提高其成熟率。
本实施例提供的远红色荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其相对于荧光蛋白mMaroon1(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1)不仅具有以下氨基酸突变：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失；还具有以下氨基酸突变位点：E2R、E3L、N8E、H10T、T38K、C114V、H214Y、V216H、Y221H、C222T以及L224V；即第2位的谷氨酸突变为精氨酸，第3位的谷氨酸突变为亮氨酸，第8位的天冬酰胺突变为谷氨酸，第10位的组氨酸突变为苏氨酸，第38位的苏氨酸突变为赖氨酸，第114位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第214位的组氨酸突变为酪氨酸，第216位的缬氨酸突变为组氨酸，第221位的酪氨酸突变为组氨酸，第222位的半胱氨酸为苏氨酸，第224位的亮氨酸突变为缬氨酸。
由于这些位点位于荧光蛋白的碳端与氮端，因此可以使蛋白结构折叠更为紧密，不仅可以提高本实施例的远红色荧光蛋白(SEQ IDNO:3)的成熟率，还能进一步提高其单体性。
实施例3
在实施例1的远红色荧光蛋白(SEQ ID NO:2)的基础上，对其进行进一步的定点突变，以提高其亮度。
本实施例提供的远红色荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其相对于荧光蛋白mMaroon1不仅具有以下氨基酸突变：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失；还具有以下氨基酸突变位点：V46I、Q134R、L138R、V165E、L170Y以及E175V，即mMaroon1的第46位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第134位的谷氨酰胺突变为精氨酸，第138位的亮氨酸突变为精氨酸，第165位的缬氨酸突变为谷氨酸，第170位的亮氨酸突变为酪氨酸，第175位的谷氨酸突变为缬氨酸。
这些位点的突变可以使本实施例的远红色荧光蛋白(SEQ IDNO:4)氨基酸之间的静电相互作用更加紧密，从而稳定结构，不仅具有良好的单体性，还具有较高的亮度。
实施例4
在实施例1的远红色荧光蛋白(SEQ ID NO:2)的基础上，对其进行进一步的定点突变，以提高其成熟率和亮度。
本实施例提供的远红色荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。本实施例的远红色荧光蛋白与荧光蛋白mMaroon1的氨基酸序列比对结果如图1所示。其相对于荧光蛋白mMaroon1不仅具有以下氨基酸突变：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226-234位氨基酸片段的缺失(如图1中方框标注所示)；还具有以下氨基酸突变位点：V46I、Q134R、L138R、V165E、L170Y和E175V(如图1中下划线标注所示)，以及E2R、E3L、N8E、H10T、T38K、C114V、H214Y、V216H、Y221H、C222T和L224V(如图1中圆点标注所示)。
通过上述几个氨基酸位点突变的综合作用，使得本实施例的远红色荧光蛋白(SEQID NO:5)不仅同时具有了良好单体性、较高的成熟率和亮度，以及还具有了较高的量子产率和消光系数等特性。
实施例5
本实施例提供了获得实施例4的远红色荧光蛋白(SEQ ID NO:5)的方法，当然，实施例1-3所提供的远红色荧光蛋白的获得方法也可可参考本实施例。需要说明的是，本发明的远红色荧光蛋白的获得方法并不限于本实施例所提供的方法，在其他的实施例中，采用其他方法所得到的本发明的远红色荧光蛋白(SEQ ID NO:2-5)同样属于本发明的保护范围。
本实施例提供的获得远红色荧光蛋白(SEQ ID NO:5)的方法，如下。
(1)根据实施例4提供的远红色荧光蛋白(SEQ ID NO:5)的氨基序列设计出相应的核酸序列。该核酸编码远红色荧光蛋白(SEQID NO:5)。
优选地，在本实施例中，编码该红色荧光蛋白mMaroon2的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。为了便于后续纯化，可在红色荧光蛋白mMaroon2的N端连接一个六组氨酸标签。
(2)通过基因合成方法获得上述编码mMaroon2的核酸片段(SEQ ID NO:6)，将该核酸片段连接至表达载体上，并转化感受态细胞，并涂布培养。
(3)挑取单菌落，接种培养，然后测序，取测序正确的单克隆继续培养。
(4)对培养液进行离心、纯化，得到远红色荧光蛋白。
实施例6
对实施例4提供的远红色荧光蛋白的单体性检测
HPLC检测远红色荧光蛋白的单体性，样品上样浓度为5mg/mL，上样量为100uL，流动相为50mM的PBS，流速设置为0.5mL/min。相关检测方法及参数可参考相关文献(Shemiakina,I.I等，A monomeric red fluorescent protein with lowcytotoxicity.Nat Commun,2012.3)。
结果如图2所示(图中：a代表mKate2；b代表mMmaroon1；c代表FusionRed；d代表mMaroon2)，HPLC采用的是分子筛的原理，分子越大出峰时间越早，分子越小出峰时间越晚，二聚体是两个单体的组合，分子自然比单体大的多，因此二聚体的出峰时间比单体要快。基于以上原理，鉴于Fusionred已被证实是目前已知的一个单体性非常好的荧光蛋白，mMaroon2的出峰时间与它相近，因此可说明mMaroon2的单体性如Fusionred一样好。另外，mKate2已被证实是一个公认的二聚体蛋白，mMaroon1的出峰时间远远早于mMaroon2，且在mKate2的出峰时间附近出现第一个峰，在mMaroon2的出峰时间附近出现第二个峰，因此判定mMaroon1为一个单体与二聚体混合的蛋白。
实施例7
实施例4提供的远红色荧光蛋白的光物理性质检测
激发光谱和发射光谱的相关检测步骤：采用B-PER II(购买自皮尔斯公司)对表达目的蛋白的菌株进行裂解，然后采用HisPur CobaltResin(购买自皮尔斯公司)纯化蛋白，紧接着通过Econo-Pac 10DG重力流色谱柱(购买自美国Bio-Rad公司)去盐。完成以上蛋白纯化步骤后，使用爱丁堡FS920荧光光谱仪检测目的蛋白的激发光谱和发射光谱。
mMaroon2的激发光谱和发射光谱如图3所示。图中：ex为激发光谱，em为发射光谱，横坐标为波长(λ)，纵坐标为归一化的荧光强度值。
图3的结果显示，mMaroon2的激发光谱为450～670nm；发射光谱为550～800nm，其激发峰(607nm)和发射峰(652nm)的波长较长(600nm以上)，由此说明，本发明提供的远红色荧光蛋白很好的解决现有荧光蛋白组织细胞自发荧光、光散射以及血红蛋白光吸收等干扰导致的成像效率低、成像效果差等问题。此外，三色同步成像技术已较为成熟(由青色、黄色、红色荧光蛋白组成的系统)，但是，为了能够在活体内同步观察更多的生理生化反应，引入本发明提供的远红色荧光蛋白，其光谱明显区别于青色、黄色、红色荧光蛋白，因此，本发明的远红色荧光蛋白可以与青色、黄色、红色荧光蛋白组合或配对实现活体内的四色同步成像。
(1)荧光蛋白的摩尔消光系数、量子产率和亮度的测量
由于荧光蛋白的N-末端连接有六个组氨酸，所以使用钴树脂纯化(HisPur CobaltResin)。消光系数通过变性方法(对于每个蛋白样品，准备完全一样两份溶液，蛋白溶解在PBS中。其中一份测量吸收峰，另外一份在1N NaOH作用下测量吸收峰，通过公式“变性前/变性后*44000”计算出消光系数)测出，而量子产率则分别测量待测样品和参考蛋白的发射谱和吸收谱，然后分别计算发射谱面积和获得发射谱的吸收值，然后将发射谱面积除以吸收值，然后将待测样品的上述比值除以参考蛋白的比值，然后乘以参考蛋白的量子产率，即可得知待测蛋白的量子产率，具体值见表1。荧光蛋白的亮度值则由消光系数与量子产率的乘积计算得出。
(2)荧光蛋白的酸解离常数(Pka)测量
完成以上蛋白纯化步骤后，得到纯度很高的蛋白液，将蛋白的浓度调到同一浓度。配置不同PH值的(PH＝1.5～13，每种反应液PH相差0.5)的检测液，分别将各种PH的检测液加入到96孔板(黑色，底透明，康宁生产)中，每孔120ul，然后每孔再加入30ul荧光蛋白液，摇床摇5分钟混匀，然后放到多功能酶标仪上(Tecan)检测蛋白激发峰出处的荧光强度。荧光强度随着PH由小到大逐渐增强再减弱，在由小到大过程中，当荧光强度达到最大值和最小值之和二分之一处所对应的PH值即为该蛋白的酸解离常数(PKa)，具体值见表1。
结果如表1所示
表1实施例4提供的远红色荧光蛋白mMaroon2的光物理性质
蛋白名称 mMaroon1 mMaroon2 mGarnet
激发峰(nm) 607 607 600
发射峰(nm) 652 656 656
消光系数(M<sup>-1</sup>cm<sup>-1</sup>) 84000 72000 29000
量子产率 0.11 0.12 0.09
亮度 9.24 8.64 2.61
pKa 6.1 6.5 7.5
mGarnet是目前已被报道的唯一的一个600nm以上的单体远红色荧光蛋白，但由表1可知，mGarnet的量子产率和消光系数均较低，且pKa值较高，这意味着mGarnet更易受环境酸碱度改变的影响；相较于现有的远红色荧光蛋白mGarnet，实施例4提供的远红色荧光蛋白mMaroon2都具有较高的消光系数(72000)、量子产率(0.12)和亮度(8.64)以及较低的pKa(6.5)，这些指标的值与现有的二聚体荧光蛋白mMaroon1接近，这表明，实施例4提供的远红色荧光蛋白mMaroon2在成像率和成像效果方面更好，且不易受受环境酸碱度改变的影响。也进一步说明本发明得到的远红色荧光蛋白mMaroon2与青色、黄色、红色荧光蛋白结合进行活体内四色同步成像时更具优势。
综上所述，本发明提供的远红色荧光蛋白mMaroon2具有以下优点：
(1)相较于二聚体荧光蛋白mMaroon1，该远红色荧光蛋白mMaroon2具有很好的单体性，有利于和其他蛋白间的相互作用；
(2)相对于其它单体远红色荧光蛋白来说，本发明提供的远红色荧光蛋白mMaroon2的消光系数、量子产率和亮度高，具有更好的成像率和成像效果；
(3)该远红色荧光蛋白mMaroon2与其它蛋白质具有良好的融合性，不会干扰到被研究的蛋白在细胞内的定位；
(4)该远红色荧光蛋白mMaroon2的pKa值比目前已知的唯一一个600nm以上的单体远红色荧光蛋白mGarnet低，更不易受酸碱环境的影响；
(5)该远红色荧光蛋白mMaroon2可以与常用的青色、黄色、红色荧光蛋白结合，形成一种新的活体内四色同步成像系统。
总之，本发明提供的新的远红色荧光蛋白，能够同时满足单体性能好以及高量子产率和消光系数这两个条件，可较好的应用于活体内的同步多色成像。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Thr Lys Leu Tyr Leu Thr
1 5 10 15
Gly Thr Val Asn Asn His Tyr Phe Glu Cys Thr Ala Glu Gly Glu Gly
20 25 30
Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Asn Arg Ile Lys Val Val Arg Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Phe Met Tyr
50 55 60
Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Pro Pro Asp Ile Pro Asp Tyr Phe
65 70 75 80
Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Val Tyr
85 90 95
Glu Asp Gly Gly Thr Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp
100 105 110
Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Gln Val Arg Gly Glu Asn Phe Pro Ser
115 120 125
Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Ser Thr
130 135 140
Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Ser Leu Glu Gly Arg Leu Asp Trp
145 150 155 160
Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu His Cys Arg Leu Glu Thr
165 170 175
Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val
180 185 190
Tyr Phe Ile Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Asn Glu
195 200 205
Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp Leu
210 215 220
Pro Ser Lys Leu Gly His Lys Leu Asn Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235 240
<210> 2
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Thr Lys Leu Tyr Leu Thr
1 5 10 15
Gly Thr Val Asn Asn His Tyr Phe Glu Cys Thr Ala Glu Gly Glu Gly
20 25 30
Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Asn Arg Ile Lys Val Val Arg Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Phe Met Tyr
50 55 60
Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Pro Pro Asp Ile Pro Asp Tyr Phe
65 70 75 80
Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Val Tyr
85 90 95
Glu Asp Gly Gly Thr Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp
100 105 110
Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Gln Val Arg Gly Glu Asn Phe Pro Ala
115 120 125
Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Ser Thr
130 135 140
Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Ser Leu Glu Gly Tyr Leu Asp Trp
145 150 155 160
Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu His Cys Arg Leu Glu Thr
165 170 175
Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val
180 185 190
Tyr Ala Ile Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Asn Glu
195 200 205
Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Thr Thr Val
210 215 220
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230
<210> 3
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Thr Lys Leu Tyr Leu Thr
1 5 10 15
Gly Thr Val Asn Asn His Tyr Phe Glu Cys Thr Ala Glu Gly Glu Gly
20 25 30
Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Asn Arg Ile Lys Val Ile Arg Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Phe Met Tyr
50 55 60
Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Pro Pro Asp Ile Pro Asp Tyr Phe
65 70 75 80
Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Val Tyr
85 90 95
Glu Asp Gly Gly Thr Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp
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Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Gln Val Arg Gly Glu Asn Phe Pro Ala
115 120 125
Asn Gly Pro Val Met Arg Lys Lys Thr Arg Gly Trp Glu Ala Ser Thr
130 135 140
Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Ser Leu Glu Gly Tyr Leu Asp Trp
145 150 155 160
Ala Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr His Cys Arg Leu Val Thr
165 170 175
Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val
180 185 190
Tyr Ala Ile Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Asn Glu
195 200 205
Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Thr Thr Val
210 215 220
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230
<210> 4
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Arg Leu Leu Ile Lys Glu Glu Met Thr Thr Lys Leu Tyr Leu Thr
1 5 10 15
Gly Thr Val Asn Asn His Tyr Phe Glu Cys Thr Ala Glu Gly Glu Gly
20 25 30
Lys Pro Tyr Glu Gly Lys Gln Thr Asn Arg Ile Lys Val Val Arg Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Phe Met Tyr
50 55 60
Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Pro Pro Asp Ile Pro Asp Tyr Phe
65 70 75 80
Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Val Tyr
85 90 95
Glu Asp Gly Gly Thr Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp
100 105 110
Gly Val Leu Ile Tyr Asn Val Gln Val Arg Gly Glu Asn Phe Pro Ala
115 120 125
Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Ser Thr
130 135 140
Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Ser Leu Glu Gly Tyr Leu Asp Trp
145 150 155 160
Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu His Cys Arg Leu Glu Thr
165 170 175
Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val
180 185 190
Tyr Ala Ile Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Asn Glu
195 200 205
Thr Tyr Val Glu Gln Tyr Glu His Ala Val Ala Arg His Thr Thr Val
210 215 220
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230
<210> 5
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Arg Leu Leu Ile Lys Glu Glu Met Thr Thr Lys Leu Tyr Leu Thr
1 5 10 15
Gly Thr Val Asn Asn His Tyr Phe Glu Cys Thr Ala Glu Gly Glu Gly
20 25 30
Lys Pro Tyr Glu Gly Lys Gln Thr Asn Arg Ile Lys Val Ile Arg Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Phe Met Tyr
50 55 60
Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Pro Pro Asp Ile Pro Asp Tyr Phe
65 70 75 80
Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Val Tyr
85 90 95
Glu Asp Gly Gly Thr Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp
100 105 110
Gly Val Leu Ile Tyr Asn Val Gln Val Arg Gly Glu Asn Phe Pro Ala
115 120 125
Asn Gly Pro Val Met Arg Lys Lys Thr Arg Gly Trp Glu Ala Ser Thr
130 135 140
Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Ser Leu Glu Gly Tyr Leu Asp Trp
145 150 155 160
Ala Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr His Cys Arg Leu Val Thr
165 170 175
Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val
180 185 190
Tyr Ala Ile Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Asn Glu
195 200 205
Thr Tyr Val Glu Gln Tyr Glu His Ala Val Ala Arg His Thr Thr Val
210 215 220
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230
<210> 6
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggtgagca agggccggct cctgatcaag gaggagatga ccaccaagct gtacctgaca 60
ggcaccgtga acaaccacta cttcgaatgc accgccgaag gggagggcaa accctacgag 120
ggcaagcaga ccaacaggat caaggtgatc cgcggaggcc ccctgccgtt cgcattcgac 180
atcctggccc cctgctttat gtacgggagc aagaccttca ttaaccatcc acctgacatt 240
cccgattatt ttaagcagtc cttccctgag ggcttcacat gggagagaac caccgtttac 300
gaggacgggg gcacactcac tgctacacag gacaccagcc tccaggacgg cgtgctgatc 360
tacaacgtcc aagtcagagg ggagaacttc ccagccaacg gccctgtgat gcggaagaaa 420
acaagaggct gggaggcaag taccgagacc ctgtaccccg ccgacggcag cctggaaggc 480
tacctggact gggccctgaa gctcgagggc gggggccact accactgcag gctggtgacc 540
acatacagat ccaagaaacc cgcaaagaac ctcaagatgc ccggcgtcta tgccattgac 600
aggagactgg aaagaatcaa ggaggccgac aatgagacct acgtcgagca gtacgagcac 660
gctgtggcca gacacaccac cgtcggcatg gacgagctgt acaag 705

Claims (6)

1.一种远红色荧光蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
2.一种融合蛋白，其特征在于，其含有权利要求1所述的远红色荧光蛋白。
3.一种分离的核酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的远红色荧光蛋白。
4.一种载体，其特征在于，其含有权利要求3所述的核酸。
5.含有权利要求4所述的载体的重组细胞。
6.权利要求1所述的远红色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用。
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