JPH10509881A - 改変緑色蛍光タンパク質 - Google Patents
改変緑色蛍光タンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】
Aequorea野性型GFP の配列を改変することにより、野性型GFP からの対応する生成物とは顕著に異なる励起及び発光スペクトルを有する生成物が得られる。改変の一つの種類においては、改変GFP から誘導された生成物は、野性型GFP から誘導された生成物により観察される二つの主要励起ピークの比率における変化を示す。別の種類においては、改変GFP から誘導された生成物は、野性型GFP からの対応する生成物よりも短い波長で蛍光を発する。さらに別の改変の種類においては、改変GFP から誘導された生成物は単一の励起ピークのみを示し、野性型GFP から誘導された生成物よりも強い発光を示す。
Description
【発明の詳細な説明】
改変緑色蛍光タンパク質 発明の背景
本発明は、一般的には生物学及び化学の分野に関する。より特定的には、本発
明は改変された蛍光タンパク質及びその製造方法と使用に関するものである。
本発明は、国立保健研究所より与えられた認可番号NS27177 のもとに政府援助
によりなされたものである。政府は本発明に対し一定の権利を有する。
生化学、分子生物学及び医療診断においては、蛍光標識をタンパク質に付加し
て、タンパク質を容易に追跡し定量できるようにすることが望まれることが多い
。通常の標識方法では、タンパク質をin vitroで蛍光染料に共有結合し、再精製
して過剰な染料と損傷したタンパク質を除去することが必要である。標識タンパ
ク質を細胞内で使用する場合には、通常はそれをマイクロインジェクションによ
り注入する必要があるが、これは困難で時間もかかる作業であり、多数の細胞に
ついて行うことは不可能である。しかしこのような問題は、対象のタンパク質を
コードするヌクレオチド配列を天然の蛍光タンパク質の配列と結合し、その融合
タンパク質を発現させることにより解決することができる。
クラゲAequorea victoria の緑色蛍光タンパク質(GFP)はp-ヒドロキシベンジ
リデンイミダゾロン発色団からの強い可視吸収と蛍光を有する注目に値するタン
パク質であり、この発色団はそのタンパク質自体の位置65〜67のSer-Tyr-Gly 配
列の環化と酸化により生成する。GFP の一つのアイソタイプのｃＤＮＡ配列（配
列番号１）が報告されており(Prasher，D.C.ら、Gene 111，229-233(1992))、こ
のｃＤＮＡのクローニングによりGFP を種々の生物中で発現することができる。
発現されたタンパク質は、広範な種類の生物の細胞中で蛍光性となることが見出
されており(Chalfie，M.ら、Science 263，802-805(1994))、これによりGFP は
分子生物学及び細胞生物学において強力な新しいツールとなり得るものであり、
酸化的環化は自発的なものであるか、普遍的な酵素及び反応体のみに依存してい
るものであることが示されている。
タンパク質の光物理学における一つの主要な問題は、いかにして単一の発色団
がその局所的なタンパク質環境に依存して広範囲にわたり異なるスペクトルを与
え得るかということである。このことは、レチナールに基づく可視顔料の多数の
色彩について多くの関心が払われてきた問題であるが(Merbs，S.L．& Nathans，
J．Science 258，464-466(1992))、GFP においても重要である。Aequoreaからの
GFP 及びシーパンジー(sea pansy)Renilla reniformis のものは同じ発色団を有
するが、Aequorea GFPは395 nm及び475 nmに二つの吸収ピークを有するのに対し
、Renilla GFP は498 nmにおける単一の吸収ピークのみを有し、Aequoreaタンパ
ク質の主要な395 nmピークよりも5.5 倍高いモノマー吸光係数を有している(War
d，W.W.，Bioluminescence and Chemiluminescence（eds．DeLuca，M.A．& McEl
roy，W.D.）235-242(Academic Press，New York，1981))。単離された発色団及
び中性pHで変性されたタンパク質のスペクトルはいずれの天然タンパク質のスペ
クトルとも一致しない(Cody，C.W．ら、Biochemistry 32，1212-1218(1993))。
多くの実用的用途について、Renilla GFP のスペクトルがAequoreaのものより
好ましいとされており、これは成分スペクトルが低く広いよりは高く狭い場合の
方が、異なる蛍光団間の波長の区別と共鳴エネルギー移動の検出がより容易であ
ることによる。さらに、Aequorea GFPのより長い波長の励起ピーク(475 nm)はフ
ルオレセインフィルターセットに殆ど理想的であり、光漂白に耐性であるが、光
漂白に対する感受性が高い395 nmにおける短い波長の方のピークよりも強度が小
さい(Chalfieら、(1994)、上記)。これらの理由により、Aequorea GFP励起スペ
クトルを、好ましくはより長い波長における単一ピークに変換することが有利で
あることは明らかである。
また、当技術分野においては異なる波長において蛍光を発するタンパク質も必
要とされている。異なる色彩を有する種々の蛍光タンパク質は、複数のタンパク
質の最終的運命、発生系統及び遺伝子発現レベルを同時に比較するのにも非常に
有用である。
従って本発明の目的は、天然のAequorea GFPの欠点を有しない改良された蛍光
性タンパク質を提供することである。発明の要旨
本発明によれば、Aequorea野性型GFP のポリペプチド配列（配列番号２）の特
定の改変により、野性型GFP から得られる対応する生成物とは著しく異なる励起
及び発光スペクトルを有する生成物が生成することが確認された。視覚的に異な
る色彩及び／または発光強度の増加により、これらの生成物は、示差遺伝子発現
(differential gene expression)の追跡やタンパク質の位置決定等の種々の広範
な状況において有用である。図面の簡単な説明
添付の図面を参照することにより本発明はよりよく理解されよう。添付の図面
は以下の通りである。
図１は、ゲル電気泳動及びクーマーシーブルー染色により異なる種類のGFP を
比較したものである。
図２は、GFP の推定生合成経路を示す。
図3a及び3bは、野性型及び変異体GFP の第一のグループの励起及び発光スペク
トルを示す。
図4a及び4bは、野性型及び変異体GFP の第二のグループの励起及び発光スペク
トルを示す。
図５は野性型GFP 及びSer65→Thr 変異体における蛍光団形成速度を示す。
図6a及び6bは、紫外線を連続的に照射した場合の、野性型GFP 及びSer65→Thr
変異体の挙動を示す。
図７は、変異体GFP の第三のグループの励起及び発光スペクトルを示す。発明の詳細な説明
GFP をT7プロモーターの制御下に大腸菌中で発現させ、その組換えタンパク質
の特性の定量的分析に使用した。変性条件下のゲル電気泳動により、予想された
分子量(27 kDa)のタンパク質が主要なバンド（図１）として示され、これはクー
マーシーブルーでの染色による濃度測定のみによって定量することができた。可
溶性組換えGFP は、Aequorea victoria から精製されたGFP と同じスペクトルを
有し、タンパク質のモルあたり同じかやや高い蛍光を有することが示され、大腸
菌中のこの可溶性タンパク質は、クラゲ中と同様な高い効率で正しい折り畳みと
酸化的環化を受けることが示された。
また前記細菌は、変性ゲル上でクラゲタンパク質または可溶性組換えタンパク
質と区別できないタンパク質からなる封入体を含んでいた（図１）。しかしこの
物質は全く非蛍光性であり、発色団の可視吸収バンドを欠いており、可溶化しGF
P を復元する工程(Ward，W.W．& Bokman，S.H.，Biochemistry 21，4535-4540(1
982); Surpin，M.A．& Ward，W.W.，Photochem．Photobiol．49，Abstract，25S
(1989))にかけても蛍光性にすることはできなかった。従って、封入体からのタ
ンパク質は、どうしても内部発色団を生成することはできないもののようであっ
た。細菌を嫌気的に培養することにより、タンパク質成熟における興味深い中間
的段階が観察された。可溶性タンパク質は変性ゲル上でやはりGFP と同じようで
あったが(図１)、非蛍光性であった。この場合、蛍光は空気を導入した後に徐々
に発生し、プロマイシン及びテトラサイクリンを使用して新たなタンパク質合成
をブロックした場合も同様であった。嫌気条件下で合成された可溶性非蛍光性タ
ンパク質は大気中の酸素が再導入されると蛍光性になり得る状態にあることが明
らかである。単純指数的な時間の経過において、タンパク質合成阻害剤を有する
そのままの細胞あるいは可溶性タンパク質及び共同因子が1000倍以上希釈された
溶解物中で測定した0.24±.06 hr-1(22 ℃)の速度定数で、タンパク質分子あた
りの蛍光が最終的漸近値に近づいた。このような偽一次動力学は、GFP における
蛍光団形成の最終段階に酵素や共同因子が必要とされないことを強く示唆してい
る。
このように、最終的な蛍光団の形成は分子酸素を必要とし、22℃及び大気pO2
において〜4 h の一定時間で野性型タンパク質中で進行することが確認された。
これは希釈度から独立したものであり、酸化が酵素や共同因子を必要としないこ
とを示している。
分子についての説明は図２に示す。新たに翻訳されたアポタンパク質（上段左
）が封入体中に沈殿するのを逃れた場合、Gly 67のアミノ基はSer 65のカルボニ
ル基に環化してイミダゾリジン-5-オンを形成し、O2が存在しない場合はその工
程はそこで停止する（上段中央）。新たなN=C 二重結合は脱水素を促進して抱
合発色団を形成すると予測され、イミダゾリジン-5- オンは実際に4-位置で二重
結合の自動酸化的形成を起こすことが知られており(Kjaer，A．Acta Chem．Scan
d．7，1030-1035(1953); Kidwai，A.R．& Devasia，G.M．J．Org．Chem．27，45
27-4531(1962))、これはまさに蛍光団を完成させるのに必要なものである（上段
右）。プロトン化及び脱プロトン化された種（上段及び下段右）はそれぞれ395
nm及び470-475 nm励起ピークに関わるものである。励起状態のフェノールはその
基底状態よりも非常に酸性が強く、発光は脱プロトン化された種からのみ発せら
れる。
Aequorea GFPｃＤＮＡを、ヒドロキシルアミン処理あるいはポリメラーゼ連鎖
反応によりランダム突然変異誘発にかけた。アガープレート上の約6000の細菌コ
ロニーに、395 及び475 nmの励起を交互に照射し、変化する励起特性または発光
色について視覚的にスクリーニングした。
本発明の第一の見地によれば、酸化及び環化の後、野性型に対する、生成物の
二つの励起ピークの比率の変化を起こす改変が提供される。二つの主要な励起ピ
ークの比率が有意に変化した三種の変異体が発見された（表Ｉ）。二つの隣接す
る変異が分離されていないH9を除いて、変異を配列決定し種々の方法で野性型遺
伝子と組換えて中性変異を除去し、単一のアミノ酸の置換に蛍光効果を割り当て
た。それらは全て一次配列において残基65-67 から形成された発色団から離れた
、タンパク質のC 末端部分にある（表Ｉ）。
これらとその他の改変は、本明細書においては、報告されたｃＤＮＡ（配列番
号１）によりコードされたアミノ酸配列（配列番号２）を引用して定義され、特
定した第一のアミノ酸は、報告された配列の示された位置に見られるものであり
、第二のものは改変された形態に見られる置換物を示す。野性型または改変GFP
ポリペプチド配列から誘導された蛍光生成物は、酸化及び環化の後は厳密には単
純なポリペプチドではないが、本明細書においては簡潔さのためにそれが何を意
図しているか文脈から明らかな場合はポリペプチドという場合もある（例えば「
野性型GFP」または「改変GFP」）。野性型GFP と比較して、H9(Ser202→Phe，Th
r203→Ile)は395 nm励起において増加した蛍光を有しており、P9(Ile167→Val)
及びP11(Ile167→Thr)は475 nm励起においてより蛍光性が高い。
P9及びP11 におけるこれらのスペクトルの変動の一つの可能性は、Ile167にお
ける変異が正の電荷を蛍光団のフェノール基の近くへ少し移動させ、これにより
フェノール性アニオンの比率が増加して、これがおそらくは470-475 nm励起ピー
クに関連する種となり、そして発光ピークを浅色団側に変化させるということで
ある。しかし、この仮説的なイオン化可能フェノール基は通常のpHではタンパク
質中に埋没してしまっていなければならないはずで、それは変異体における471
と396 nmピークの比率は、変性の閾値の直下である10までpHが上昇しないと外部
pHによってはさらに影響を受けないからである。野性型GFP のpH感受性も同様で
ある(Ward，W.W．ら、Photochem．Photobiol．35，803-808(1982))。
本発明の別の見地によれば、変異体P4(Tyr66→His)が、紫外線により励起可能
であり、野性型タンパク質の緑色に対して明るい青色の蛍光を発するものとして
同定された。励起及び発光最大値は野性型GFP のものからそれぞれ14及び60 nm
浅色団側に移動していた。突然変異ＤＮＡを配列決定したところ、五個のアミノ
酸置換を含み、その一つのみ、即ち発色団の中央のTyr 66がHis に置き変わって
いること(GFPｃＤＮＡ配列（配列番号１）における196 〜198 のTAT からCAT へ
の変化に対応する)が臨界的であることが判った。
この鍵となる残基における置換に対する驚くべき許容度により、さらにこの位
置におけるTrp 及びPhe への部位指向突然変異を行うことが想起された。Trp に
より、Tyr 及びHis の中間の励起及び発光波長が得られたが（表Ｉ）、弱い蛍光
のみしか得られず、これはおそらく立体的な理由により折り畳みと発色団形成が
非効率的になったためと考えられる。Phe により358 nmでの励起最大値と442 nm
での発光最大値を示す弱い蛍光が得られた。従って、本発明のこの見地によれば
、天然のタンパク質とは異なる波長（好ましくは少なくとも10 nm、より好まし
くは少なくとも50 nm だけ異なる）において蛍光を発する、例えばTyr 66がPhe
、His またはTrp により置き換えられた、改変GFP タンパク質が提供される。
本発明のこの見地の別の態様によれば、単一変異体Y66Hと殆ど同じ波長を有す
るが、主として蛍光のより高い量子効率により輝度がほぼ二倍になった二重変異
体Y66H、Y145F が同定された。単一変異体は蛍光を生成するのに数日かかるのに
対し、この二重変異体は一晩の増殖によりその蛍光を生成する。
本発明のこの見地のさらに別の態様によれば、Y66Hの輝度を増加させるための
一回目の突然変異により、別の置換物として、M153T/V163A/N212K が得られた。
この変異体をもう一度突然変異させ、さらに二つのセット、N146I 及びI123V/Y1
45H/H148R(表II)を得た。これらの変異体の量子効率は野性型GFP のものに匹敵
するものである。残基145 〜163 に置換が集中していることは、これらの残基が
発色団の比較的近くにあり、その側鎖のサイズが減少することによりチロシンと
比較して大きいトリプトファンのサイズを補償され得るものであることを示唆し
ている。
本発明のさらに別の見地によれば、野性型タンパク質よりも実質的に高い強度
の分子あたりの蛍光を与える改変GFP タンパク質が提供される。Ser 65をAla、L
eu、Cys、Val、Ile またはThr に改変することにより、天然のタンパク質に対し
て赤色側に移動した、より輝度の高いスペクトルを有するタンパク質が提供され
る。特に、Thr 変異体(GFPｃＤＮＡ配列（配列番号１）における193 〜195 のTC
T からACT への変化に対応する)及びCys 変異体(GFPｃＤＮＡ配列（配列番号１
）における193 〜195 のTCT からTGT への変化に対応する）は、450 nmを越える
好ましい長波長バンドで励起された場合に野性型よりも約６倍高い輝度を有する
。従ってこれらの改変タンパク質は、実用上全ての用途について野性型タンパク
質よりも優れている。さらにこれらの改変タンパク質の輝度は、Renilla GFP に
ついて文献に報告された輝度に匹敵するものであり、従ってこれらのタンパク質
はAequorea GFPの暗さに対する否定的見解を明らかに解消するものである。実際
に、これらの改変タンパク質の発色団は、Aequorea GFP発色団から得られる全体
的構造により得られる最適な輝度を示し得ると考えられる。特にこれらの変異に
より、野性型GFP からの対応する生成物からそれらを明らかに区別する以下の顕
著な特性、即ち約350 及び420 nmの間の波長による励起の減少した効率、約450
nmよりも長い波長で励起した場合の増強された励起及び発光効率、励起スペクト
ルの光誘導シフトに対する増加した耐性、及び蛍光団生成におけるより速い動力
性、の一以上を示す生成物が提供される。これに対し、Trp、Arg、Asn、Phe 及
びAsp への変異は輝度の改善をもたらさない。
その波長をさらに赤色にシフトさせるS65Tの突然変異誘発により、S65Tについ
ての490 nmに対し、これまで記載された最長の波長の励起最大値、504 nmを有す
るそのGFP の変異体としてM153A/K238E(表II)が得られた。驚くべきことに、発
光ピークは殆ど変わらず(514 nm と511 nm)、励起及び発光ピークの差(ストーク
スシフト(stokes’shift))は極端に狭く、わずかに10 nm である。これは室温の
水溶液中のものについて報告されたあらゆる蛍光団の中で最も小さい値の一つで
ある。Y66Wシリーズにおけるように、M153の影響が強いように思われる。K238E
は重要なものであるとは思われず、それはこの置換がその他の変異体で効果を有
することが見出されなかったからである。
当分野で研究する者には容易に理解されるように、所望の蛍光性タンパク質を
与えるためにはGFP の全配列を含ませる必要はない。特に、タンパク質配列の何
れかの末端における小さな欠失は、タンパク質の蛍光スペクトルに殆どあるいは
全く影響を及ぼさないと考えられる。従って、本発明の目的のための変異体また
は野性型GFP 配列は、本明細書に記載した完全なポリペプチド及びオリゴヌクレ
オチド配列のみならず、機能的に等価なそれらの部分（即ち、所望の蛍光特性を
示すポリペプチド配列の部分及びこれらのポリペプチド配列をコードするオリゴ
ヌクレオチド配列）を包含するものである。例えば、発色団そのもの(位置65-67
)が重要であることは明らかであるとしても、既知の中性変異の位置は、アミノ
酸76-115は生成物の分光特性についてそれほど重要でないことを示している。さ
らに、当分野で研究する者には直ちに理解されるように、得られるタンパク質を
長くし、タンパク質の製造や精製における何らかの機能的な目的に役立つような
種々のタイプの融合配列を使用することも日常的なことであり、本発明の範囲内
にあるものとする。例えば、ポリヒスチジンタグを含むアミノ酸配列を付加する
ことにより生成物タンパク質の精製を容易にすることは実際によく行われている
ことである。そのような融合はそれを含む分子の重要な特性を有意に変化させな
いので、そのような融合配列をいずれかの末端に含む本明細書中に記載した改変
GFP も明らかに本発明の範囲内にあるものである。
同様に、本明細書中に記載した具体的な変異に加えて、多くの場合、ポリペプ
チド配列中の特定の位置における改変は得られるポリペプチドの特性に影響しな
いことは、当分野の研究者により十分に理解されている。本明細書中で詳細に記
載した具体的な変異とは異なり、その他の変異は、本明細書中に開示した具体的
なポリペプチドのものとは本質的にあるいは実質的に区別できない特性を有する
ポリペプチドを与える。例えば以下の置換、Lys3→Arg、Asp76→Gly、Phe99→Il
e、Asn105→Ser、Glu115→Val、Thr225→Ser 及びLys238→Gluは中性である（即
ち生成物の特性に有意な影響を及ぼさない）ことが判った。これらの等価なポリ
ペプチド（及びこれらのポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチド）も本発
明の範囲にあるものとみなされる。一般的には、本発明のポリペプチド及びオリ
ゴヌクレオチド配列は（本明細書中で同定した特異的な変異の少なくとも一つを
含むことに加えて）、本明細書に記載した野性型GFP に対して少なくとも約85%
相同であり、より好ましくは少なくとも約90% 相同であり、最も好ましくは少な
くとも約95% 相同である。GFP 配列への特定の改変の導入により特性の有意な差
が見られることから、野性型GFP についての対応する報告されている配列（配列
番号２）に対する特定の改変の存在が、本発明の中心をなすものと考えられる。
本発明のオリゴヌクレオチド配列は、例えば蛍光融合タンパク質をコードする
遺伝子を構築することによる、対象のポリペプチドを標識するための方法におい
て特に有用である。遺伝子融合による蛍光標識は部位特異的であり、タンパク質
をin vitroで精製して標識し、細胞中にマイクロインジェクションする現状の必
要性が排除される。本発明の改変GFP をコードする配列は、当分野の研究者に周
知の広範な目的に使用することができる。例えばこれらの配列は、それらに融合
した配列の発現をモニターするためのレポーター遺伝子として使用することがで
き、その他のレポーター遺伝子とは異なり、発現が得られたかどうかを評価する
のに基質を必要とせず、細胞を破壊する必要もない。同様に、本発明の配列は、
細胞あるいは生物の発生の間に、それに融合した遺伝子の系統を追跡する手段と
して使用することができる。さらに、本発明の配列は遺伝子マーカーとしても使
用することができる。この方法により標識された細胞あるいは生物は、例えば蛍
光活性化細胞選別により選択することができる。本発明の配列は、in vivo での
タンパク質の発現をモニターするための、あるいは蛍光共鳴エネルギー移動の供
与体あるいは受容体をコードするための蛍光タグとしても使用することができる
。
本発明の配列のその他の使用は当分野の研究者に容易に理解され、対象の遺伝子
を適当な読み取り枠中及び適当な発現ベクター中で本発明のオリゴヌクレオチド
配列に融合して結合配列を発現するための適当な方法も容易に理解されるであろ
う。
そのような異なるスペクトル特性を有するGFP の幾つかの形態を使用できるこ
とは、示差遺伝子発現、発生の結果、あるいはタンパク質移動の二色分析を容易
なものとする。例えば、遺伝子Ａの発現を活性化することに特異的であるが遺伝
子Ｂについてはそうではない薬剤をスクリーニングすることを望む場合、一つの
色のGFP のｃＤＮＡを遺伝子Ａのプロモーター領域に融合し、もう一つの色のｃ
ＤＮＡを遺伝子Ｂのプロモーター領域に融合することができる。両方の構築物を
ターゲット細胞中にトランスフェクトし、候補の薬剤をアッセイしてそれらが所
望の色の蛍光を促進するが、所望ではない色の蛍光はしないかどうかを判断する
ことができる。同様に、両方の色が同時に存在することを検知することによりＡ
及びＢ両方の同時の発現を試験することができる。
別の例としては、細胞あるいは生物内での組換え体タンパク質Ｘ及びＹの生成
あるいは位置の間の正確な時間的または空間的関係を調べるために、異なる色の
GFP の遺伝子をタンパク質Ｘ及びＹの遺伝子にそれぞれ融合することができる。
所望であれば、柔軟なオリゴペプチドスペーサーをコードするＤＮＡ配列を含め
て結合ドメインを生成し、一つの構築物中で自律的に機能させることができる。
まさに同じ細胞あるいは生物中で二つの蛍光の区別の可能な色の出現を調べるこ
とにより、それぞれがタンパク質ＸまたはＹに融合したGFP の一つの色のみを含
む細胞または生物の二つの別々のセットを比較しなければならない場合よりも極
めて高い正確さと低い生物学的な変動をもって、タンパク質Ｘ及びＹの発生ある
いは位置を比較し、対照させることができる。二色の有用性のその他の例は当技
術分野の技術者に明らかであろう。
GFP のY66H及びY66W変異体の輝度を高める別の変異によれば、示差遺伝子発現
、タンパク質位置決定、あるいは細胞の運命を追跡するのに蛍光の二種あるいは
三種の色を使用し得る可能性が高められる。例えば、変異体P4-3(Y66H/Y145F)、
W7(Y66W/N146I/M153T/V163A/N212K)及びS65Tは全て互いに区別できる。P4-3は、
29
0-370 nmで励起し、420-460 nmでの発光を収集することにより特異的に検出でき
る。W7は410-457 nmで励起し、465-495 nmでの発光を収集することにより特異的
に検出できる。S65Tは483-493 nmで励起し、510 nmより大きい波長での発光を収
集することにより特異的に検出できる。これらの三種のタンパク質を有する細菌
は、上記の波長のバンドパスフィルターを使用して顕微鏡下で容易に区別するこ
とができる。
GFP 中の発色団はタンパク質の残りの部分に十分に埋没しているので、当初の
点変異体の暗さの殆どはおそらく置換アミノ酸とチロシンに最適化された空隙と
の間の不適合によるものである。有用な変異の位置は、残基145-163 が発色団に
近いであろうことを示唆している。M153A/S65T変異体は、共同因子を使用しない
公知のあらゆる蛍光タンパク質のなかでもっとも長い波長ともっとも小さいスト
ークスシフト(stokes’shift)を有する。
以下の実施例を参照することにより本発明はさらによく理解されるであろう。
これらの実施例は例示することのみを目的とするものであり、いかなる意味にお
いても添付の請求の範囲により定義された本発明の範囲を限定するものと解して
はならない。実施例１
GFPクローン10.1(Prasherら、1992、上記)のコード領域をPCRで増幅し、5'末
端及び3'末端にそれぞれNdeI及びBamHI部位を形成し、pGEMEX2(Promega)のT7プ
ロモーターの後にクローン化してT7遺伝子10の大部分を置換した。得られたプラ
スミドをJM109(DE3)株(Promega Corp.，Madison，WI)中に形質転換し、IPTGで誘
導することなく24℃で飽和するまで培養物を増殖させて、高いレベルの発現を得
た。可溶性抽出物を調製するために、1.5 mlの細胞懸濁液を回収し、洗浄し、15
0 μlの50 mMトリス/HCl、pH 8.0、0.2 mM EDTA 中に再懸濁した。リゾチーム及
びDNアーゼIをそれぞれ0.2 mg/ml及び20μg/ml加え、溶解が生じるまで(１〜２
時間)試料を氷上でインキュベートした。次いで溶解物を12,000×gで15分間遠心
分離して清澄化した。封入体を文献(Sambrook，J.ら、Molecular Cloning: A La
boratory Manual Vol.2，17.37〜17.41(Cold Spring Harbor Press，Cold Sprin
g Harbor，New York，1989))に記載されたようにして得た。
図１に示すように、GFPを発現する大腸菌の可溶性抽出物は、対照細胞からの
抽出物にはない顕著なバンドを示し、これはクラゲA．victoriaから単離された
天然GFPと同じ電気泳動移動度を有している。発現細胞の封入体は、可溶性GFPと
同じ移動度を有する非蛍光性GFP を主としてなる。嫌気的に増殖された培養物の
非蛍光可溶性GFPもまた、正しい移動度を持つ主要バンドである。変異クローンH
9、P9、P11及びP4の可溶性抽出物も、実質的に同じ分子量の優勢なタンパク質を
含んでいる。
0.1 mM MnCl2、50μM dATP並びに200μM dGTP、dCTP及びdTTPでポリメラーゼ
連鎖反応のエラー割合を増加させることにより、GFP ｃＤＮＡのランダム突然変
異誘発を行った(Muhlrad，D.ら、Yeast 8，79-82(1992))。生成物をpGEMEX2に結
合し、その後JM109(DE3)中に形質転換した。アガー上のコロニーを、475と395 n
mとで励起したときの異なる発光色及び輝度比について視覚的にスクリーニング
した。
図3a及び3bは、野生型及び変異体GFPの励起及び発光スペクトルを示す。図3a
−・−・はY66Hである。試料は、Y66Wを除き、高レベルでタンパク質を発現する
大腸菌からの可溶性画分であり、それらは非常に低い収率で得られ、無傷の細胞
について測定した。自己蛍光は、Y66Wのものを除いて全てのスペクトルで無視で
きるものであった。Y66Wの380 nm未満の励起スペクトルは、自己蛍光が混入して
いる可能性がある。励起及び発光スペクトルは1.8 nmの帯域で測定し、スキャニ
ングしない波長は適当なピークに設定した。励起スペクトルは、ローダミンＢ量
子カウンターで補正し、発光スペクトル(Y66W以外)は、製造者が提供する補正用
スペクトルを用いて、モノクロメーター及び検出器の効率について補正した。全
ての強度は、最大値が1.0となるように任意に正規化した。同じタンパク質濃度
における輝度の比較を表１に示す。
実施例２
文献(Kunkel，T.A.（1985）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82，488)に記載され
た方法により、Muta-Gene Phagemid in Vitro Mutagenesis Kit Version 2（Bio
-Rad．Richmond，CA からの市販品）を用いて、GFP ｃＤＮＡのSer-65のコドン
におけるオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発を行った。この方法は、dUTPアー
ゼ(dut)及びウラシル-N-グリコシラーゼ(ung)欠損細菌宿主株を使用するもので
あり、新たに合成されるＤＮＡにおいてチミンのウラシルによる置換がときとし
て生じる。オリゴヌクレオチド誘導in vitro突然変異誘発のための野生型テンプ
レートとしてウラシル含有ＤＮＡを用いた場合、デオキシヌクレオチド、リガー
ゼ及びポリメラーゼの存在下で、ＤＮＡ合成を開始する突然変異誘発オリゴヌク
レオチドを使用して相補(変異体)鎖を合成することができる。Version 2 キット
は、非改変T7ＤＮＡポリメラーゼを使用し、相補鎖を合成する。ヘテロ２本鎖分
子を活性ウラシル-N-グリコシラーゼ（これは、ウラシル塩基とリボース分子と
の結合を開裂し、非ピリミジン部位を生成する）を有する宿主に形質転換すると
、ウラシル含有野生型鎖は不活性化され、その結果変異体鎖が濃縮される。
GFP ｃＤＮＡのコード領域を、Invitrogen(San Diego，CA)からのファージミ
ドpRSETBのBamHI 部位にクローン化した。この構築物をMuta-Gene キットで得ら
れたdut,ung二重変異体大腸菌株CJ236 に導入し、ヘルパーファージVCSM13(Stra
tagene，La Jolla，CA)で重感染し、チミンの代わりにある程度のウラシルを含
む単鎖ＤＮＡを有するファージミド粒子を生成した。このウラシル含有ＤＮＡを
精製し、突然変異誘発ヌクレオチドをプライマーとして用いた第２鎖のin vitro
合成におけるテンプレートとした。ＤＮＡハイブリッドをXL1blue 株(Stratagen
e から入手可能)に形質転換した。この株は機能性ウラシル-N-グリコシラーゼを
有しており、この酵素は野生型親ＤＮＡ鎖を不活性化して変異体クローンを選択
する。いくつかのコロニーのＤＮＡを単離し、配列決定により適当な変異体につ
いてチェックした。
変異体タンパク質を発現するために、突然変異誘発により得られたＤＮＡ構築
物を大腸菌株BL21(DE3)LysS(Novagen，Madison，WI)中に形質転換した。この大
腸菌株はT7ポリメラーゼの染色体コピーを有しており、強力なT7プロモーターか
らの発現を起こす。室温で3 mlの培養物を誘導なしに飽和するまで(典型的には
一晩)増殖させた。１mlの培養物から細胞を収集し、洗浄し、最終的に100μlの5
0 mM トリスpH 8.0、300 mM NaCl に再懸濁した。この細胞を凍結／解凍(液体窒
素/30 ℃水浴)を３サイクル繰り返すことによって溶解した。細胞破片及び壊れ
なかった細胞をマイクロ遠心分離(microfuge)でペレット化することにより
可溶性分画を得た。
組換えタンパク質の精製を容易にするために、使用したベクターは発現タンパ
ク質のN-末端にヒスチジンタグ(6個の連続したHis)を融合したものである。ヒス
チジン６量体とNi2+イオンとの間の強い相互作用によって、NI-NTA樹脂(Qiagen,
Chatsworth，CA から市販品として入手可能)によるタンパク質の精製が可能と
なる。マイクロカラム(吸着床容量10μl)に100μlの可溶性抽出物(50 mMトリス
、pH 8.0、300 mM NaCl中)を入れ、10吸着床容量の同じバッファー及び20 mM の
イミダゾールを含有する10容量バッファーで洗浄した。次いで100 mMのイミダゾ
ールを含有する同じバッファーで組換えタンパク質を溶出した。
精製された変異体GFP タンパク質のアリコートを、野生型GFP とともに変成ポ
リアクリルアミドゲル上で泳動した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、タンパ
ク質バンドを濃度計でスキャニングすることにより定量した。これらの結果に基
づき、同量の各種タンパク質を用いて蛍光発光及び励起スペクトル測定を行った
。
図4a及び4bは、野生型及びSer65変異体の励起及び発光スペクトルを比較した
S65Cを、・・・ は野生型(395 nmで励起)を、−・−・は野生型(475 nmで励起)を表
す。励起及び発光スペクトルを1.8 nmの帯域で測定し、非スキャニング波長は適
当なピークに設定した。図4bから明らかなように、３つの全ての変異体株が野生
型タンパク質に比較して実質的に高い発光強度を示した。
図５は、野生型GFP 及びSer65→Thr変異体における蛍光団生成速度を示す。野
生型または変異体GFP を発現する大腸菌を嫌気的に増殖させた。時間０において
各試料を空気に暴露し、さらに代謝阻害剤としてナトリウムアジドをも含む無栄
養培地に細胞を移すことによって、さらなる細胞の増殖及びタンパク質の合成を
抑制した。引き続き、蛍光を時間の関数としてモニターした。各培養について酸
化が完全に進行した後の、t=18〜20時間において得られた最終蛍光強度の分数と
して蛍光強度を表す。図５から、絶対輝度を正規化した後でも(図4a及び4b)、蛍
光の発生は野生型GFP よりも変異体においてずっと早く進行することが明らかで
ある。従って、GFP 蛍光の発生をプロモーター活性化及び遺伝子発現のアッセ
イとして用いた場合、変異体が野生型タンパク質よりも迅速で正確な測定手段と
なることは明らかである。
図6a及び6bは、紫外線を連続的に照射したときの野生型GFP 及びSer65→Thr変
異体のそれぞれの挙動を示すものである。数字は280 nmでの照射に暴露した時間
（分）を示し、強度は両試料で同じであった。野生型GFP(図6a)は、励起スペク
トル形の主要な変化によって示されるように、光異性化を受けた。広い帯域(240
〜400nm)の紫外線照射は、定性的には同様の挙動を引き起こしたが、スペクトル
の430〜500nm領域においては強度の増加は小さかった。暗所への放置では光異性
化は逆行できなかった。このタンパク質は395 nm近傍のその主ピークで励起され
たときに急速に輝度を失うことから、このような光異性化は野生型GFPを使用す
るほとんどの場合に明らかに望ましくない。変異体(図6b)ではこのような光異性
化、即ちスペクトルシフトは見られない。実施例３
Tyr66→His(Y66H)、Tyr66→Trp(Y66W)またはSer65→Thr(S65T)をコードするGF
P ｃＤＮＡをそれぞれポリメラーゼ連鎖反応によりさらに突然変異誘発し、大腸
菌に形質転換してコロニーを通常とは異なる強度あるいは色により視覚的にスク
リーニングした。単離、スペクトル特性化(表II及び図７)及びＤＮＡ配列決定に
よりさらにいくつかの有用な変異体を得た。
0.1 mMのMnCl2及びバランスのとれていないヌクレオチド濃度を用いてPCRのエ
ラー割合を増加することにより、gfp ｃＤＮＡのランダム突然変異誘発を行った
。GFP変異体S65T、Y66H及びY66Wを、T7プロモータ及びポリヒスチジンタグを含
む発現ベクターpRSETB(Invitrogen)のBamH1部位にクローン化した。GFPコード領
域(太字で示す)には、次の5'及び3'配列：5'-G GAT CCC CCC GCT GAA TTC ATG・・ ・
AAA TAA TAA GGA TCC-3' が隣接していた。突然変異誘発性PCRのための
5'プライマーはベクター配列にマッチしたT7プライマーであり、3'プライマーは
、GFPの3'末端に特異的な5'-GGT AAG CTT TTA TTT GTA TAG TTC ATC CAT GCC-3'
であり、終止コドンの隣にHindIII制限部位を形成する。Perkin ElmerのAmpl
iTaqポリメラーゼを用いて、25サイクル(94℃で１
分、52℃で1分、72℃で１分)にわたって増幅した。異なるヌクレオチドの濃度を
200μMから50μMに低下させる４つの別個の反応を行った。PCR生成物を合わせ、
BamHI及びHindIIIで消化し、BamHI及びHindIIIで切断されたpRSETBに結合した。
結合混合物を水に対して透析し、乾燥し、続いてエレクトロポレーション(0.1 c
m キュベット中の50μl のエレクトロコンピテント細胞、1900V、200Ω、25μF)
により細菌株BL21(DE3)中にに形質転換した。アガー上のコロニーを本明細書中
で前記したように輝度について視覚的にスクリーニングした。選択されたクロー
ンは、United State BiochemicalのSequenase version 2.0 キットで配列決定し
た。
新たに形質転換された細胞を含む培養物を、600 nmにおける光学濃度が0.8に
なるまで37℃で増殖させ、0.4 mMのイソプロピルチオガラクトシドで一晩室温で
誘導した。細胞をpH 7.4のPBS中で洗浄し、50 mM トリス、pH 8.0、300 mM NaCl
中に再懸濁し、フレンチプレスで溶解した。ポリヒスチジンタグを付加したGFP
タンパク質を、タンパク質を溶出する上記バッファー中の100 mMのイミダゾール
を用いて、ニッケルキレートカラム(Qiagen)で清澄な溶解物から精製した。
各ピーク波長における発光を測定することにより励起スペクトルを得、ローダ
ミンＢ量子カウンターによって補正した。発光スペクトルも同様に各励起ピーク
において測定し、蛍光計の製造者(Spex Industries，Edison，NJ)によるファク
ターを用いて補正した。開裂実験においては、発光スペクトルを励起368 nmで記
録した。モル吸光係数(molar extinction coefficient)を測定するために、20〜
30μgのタンパク質を1 mlのPBS pH 7.4中で用いた。野生型GFP、S65T及びP4-1変
異体の量子収率は、0.1 N NaOH中のフルオレセインの量子収率0.91を標準として
、それと比較することにより評価した[ed．Miller，J.N.，Standards in Fluore
scence Spectrometry(Chapman and Hall，New York，1981)]。変異体P4及びP4-3
も同様に水中の9-アミノアクリジン（量子収率0.98）と比較した。W2及びW7は両
方の標準と比較し、一致した結果を得ることができた。
図７は種々のGFP変異体の蛍光励起及び発光スペクトルを示す。すべてのスペ
クトルは、最大値１に正規化した。励起及び発光スペクトルの各対は、別個の線
で表す。
得られたGFP変異体の蛍光特性を表IIに示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ
Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ
Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，
ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ
Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ
，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，
ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ
(72)発明者 ハイム，ロジャー
アメリカ合衆国 92014 カリフォルニア
州 デル マー，ストラットフォード コ
ート ＃309ビー 510番地
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．Aequorea野性型GFP ポリペプチドの改変形態から誘導された蛍光生成物を含 む組成物であって、野性型GFP ポリペプチド配列（配列番号２）の位置65〜67に 対応する前記改変形態のアミノ酸残基の酸化及び環化により、野性型GFP ポリペ プチド配列から誘導された対応する生成物とは異なる励起及び／または発光スペ クトルを示す生成物が形成されることを特徴とする前記組成物。 ２．生成物が、野性型GFP から誘導された対応する生成物と比較して二つの主要 励起ピークの比率において変化している、請求項１に記載の組成物。 ３．二つの主要励起ピークの短い方の波長のピークにおいて増加した蛍光を示す 、請求項２に記載の組成物。 ４．野性型GFP 配列の改変形態が、野性型GFP 配列の位置202 に対応する位置に おけるSer のPhe による置換、及び位置203 に対応する位置におけるThr のIle による置換を含む、請求項３に記載の組成物。 ５．二つの主要励起ピークの長い方の波長のピークにおいて増加した蛍光を示す 、請求項２に記載の組成物。 ６．野性型GFP 配列の改変形態が、野性型GFP 配列の位置167 に対応する位置に おけるIle のVal またはThr による置換を含む、請求項５に記載の組成物。 ７．野性型GFP 配列の改変形態が、野性型GFP 配列の位置65に対応する位置にお けるSer のThr による置換、位置153 におけるMet のAla による置換、及び位置 238 におけるLys のGlu による置換を含む、請求項５に記載の組成物。 ８．生成物が、野性型GFP から誘導された対応する生成物よりも短い波長で蛍光 を発する、請求項１に記載の組成物。 ９．野性型GFP 配列の改変形態が、野性型GFP 配列の位置66に対応する位置にお けるTyr のPhe、His または Trpによる置換を含む、請求項８に記載の組成物。 10．野性型GFP 配列の改変形態が、野性型GFP 配列の位置66に対応する位置にお けるTyr のHis による置換、及び位置145 におけるTyr のPhe による置換を含む 、請求項８に記載の組成物。 11．野性型GFP 配列の改変形態が、野性型GFP 配列の位置66に対応する位置にお けるTyr のTrp による置換、位置146 におけるAsn のIle による置換、位置153 におけるMet のThr による置換、位置163 ににおけるVal のAla による置換、及 び位置212 におけるAsn のLys による置換を含む、請求項８に記載の組成物。 12．野性型GFP 配列の改変形態が、野性型GFP 配列の位置66に対応する位置にお けるTyr のTrp による置換、位置123 におけるIle のVal による置換、位置145 におけるTyr のHis による置換、位置148 におけるHis のArg による置換、位置 153 におけるMet のThr による置換、位置163 におけるVal のAla による置換、 及び位置212 におけるAsn のLys による置換を含む、請求項８に記載の組成物。 13．生成物が、野性型GFP から誘導された対応する生成物よりも増強された発光 を示す、請求項１に記載の組成物。 14．野性型GFP 配列の改変形態が、野性型GFP 配列の位置65に対応する位置にお けるSer の、Ala、Cys、Thr、Leu、Val 及びIle からなる群から選択されたアミ ノ酸による置換を含む、請求項13に記載の組成物。 15．アミノ酸がCys またはThr である、請求項14に記載の組成物。 16．請求項１〜15のいずれか１つに記載のAequorea野性型GFP ポリペプチド配列 の改変形態をコードする、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド配列。 17．ポリペプチドをコードする遺伝子の発現をモニターする方法であって、 前記遺伝子と請求項16に記載のオリゴヌクレオチド配列を含む結合配列であっ て、遺伝子及びオリゴヌクレオチド配列の両方が同じ読み取り枠中にある結合配 列を形成し、 前記オリゴヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド配列から誘導さ れた生成物の蛍光特性を観察することを含み、蛍光が結合配列によりコードされ る融合タンパク質の発現を示すものである前記方法。 18．単一の細胞、組織または生物中で、第一の遺伝子が第二の遺伝子によりコー ドされるポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードする、第一の遺伝子及び 第二の遺伝子の発現を同時にモニターする方法であって、 前記第一の遺伝子と請求項16に記載の第一のオリゴヌクレオチド配列を含む第 一の結合配列であって、第一の遺伝子及び第一のオリゴヌクレオチド配列の両方 が同じ読み取り枠中にある第一の結合配列を形成し、 前記第二の遺伝子と、野性型GFP をコードするオリゴヌクレオチド配列及び第 一のオリゴヌクレオチド配列とは異なる請求項16に記載のオリゴヌクレオチド配 列からなる群から選択される第二のオリゴヌクレオチド配列とを含む第二の結合 配列であって、第二の遺伝子及び第二のオリゴヌクレオチド配列の両方が同じ読 み取り枠中にある第二の結合配列を形成し、 前記第一及び第二のオリゴヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド 配列から誘導された生成物の蛍光特性を観察することを含み、蛍光が結合配列に よりコードされる融合タンパク質の発現を示すものである前記方法。 19．第一及び第二の遺伝子の少なくとも一つの発現を活性化することにおける有 用性について物質をスクリーニングする、請求項18に記載の方法。 20．第一及び第二の遺伝子から発現されたタンパク質の所在位置を比較する、請 求項18に記載の方法。 21．第一及び第二の遺伝子の発現の時間的順序を調べる、請求項18に記載の方法 。 22．遺伝子の転写をモニターする方法であって、 前記遺伝子の上流制御エレメントと請求項16に記載のオリゴヌクレオチド配列 を含む結合配列であって、上流制御エレメント及びオリゴヌクレオチド配列の両 方が同じ読み取り枠中にある結合配列を形成し、 前記オリゴヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド配列から誘導さ れた生成物の蛍光特性を測定することを含み、蛍光が前記遺伝子の上流制御エレ メントの制御下の前記オリゴヌクレオチドの転写を示すものである前記方法。 23．単一の細胞、組織または生物中で、第一の遺伝子が第二の遺伝子によりコー ドされるポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードする、第一の遺伝子及び 第二の遺伝子の発現を同時にモニターする方法であって、 前記第一の遺伝子の上流制御エレメントと請求項16に記載の第一のオリゴヌク レオチド配列を含む第一の結合配列であって、前記第一の遺伝子の上流制御エレ メント及び第一のオリゴヌクレオチド配列の両方が同じ読み取り枠中にある第一 の結合配列を形成し、 前記第二の遺伝子の上流制御エレメントと、野性型GFP をコードするオリゴヌ クレオチド配列及び第一のオリゴヌクレオチド配列とは異なる請求項16に記載の オリゴヌクレオチド配列からなる群から選択される、第二のオリゴヌクレオチド 配列を含む第二の結合配列であって、前記第二の遺伝子の上流制御エレメントと 第二のオリゴヌクレオチド配列の両方が同じ読み取り枠中にある第二の結合配列 を形成し、 前記第一及び第二のオリゴヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド 配列から誘導された生成物の蛍光特性を観察することを含み、蛍光が前記第一及 び第二の遺伝子の上流制御エレメントのそれぞれの制御下の転写を示すものであ る前記方法。
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