CN116143893B - 一种增强型单体StayGold蛋白及其应用 - Google Patents

一种增强型单体StayGold蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116143893B
CN116143893B CN202210949273.5A CN202210949273A CN116143893B CN 116143893 B CN116143893 B CN 116143893B CN 202210949273 A CN202210949273 A CN 202210949273A CN 116143893 B CN116143893 B CN 116143893B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
staygold
monomer
enhanced
mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210949273.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116143893A (zh
Inventor
王峰
吴家权
陈倩
杨益虎
桂文君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Baiaode Biological Science Co ltd
Original Assignee
Wuxi Baiaode Biological Science Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Baiaode Biological Science Co ltd filed Critical Wuxi Baiaode Biological Science Co ltd
Priority to CN202210949273.5A priority Critical patent/CN116143893B/zh
Priority to PCT/CN2023/089027 priority patent/WO2024032020A1/zh
Publication of CN116143893A publication Critical patent/CN116143893A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116143893B publication Critical patent/CN116143893B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种增强型单体StayGold蛋白及其应用，涉及重组蛋白技术领域，该增强型单体StayGold蛋白序列为野生型二体StayGold蛋白的突变序列，且所述突变序列中的突变为N137、Q140、Y187中至少一个氨基酸进行突变成任意氨基酸。本发明首次提供了一种新的单体的StayGold蛋白，mStayGold，该绿色荧光蛋白具有很强的热稳定性和荧光强度，其Tm约为95℃，比市场上常用的EGFP的Tm值高出15℃，与二体的StayGold的热稳定相当，产量也高出2.5倍；其荧光强度也比常用EGFP的荧光强度高5倍。其单体的性质解决了其野生型二体蛋白在与目标蛋白融合进行追踪和定位目标蛋白时因自身聚集状态影响标记和定位的功能，在指导蛋白表达、细胞定位等应用中具有更好的应用场景。

Description

一种增强型单体StayGold蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及重组蛋白技术领域，具体涉及一种增强型单体StayGold蛋白及其应用。
背景技术
如今，荧光蛋白(FPs)作为标记蛋白和报告蛋白被广泛应用于生命科学研究的诸多领域，以研究生命系统的组织和功能。其中绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)是一类存在于水母、水媳等肠腔生物的应用最早的荧光蛋白。GFP广泛应用后，一系列相关的荧光蛋白产品已经被开发。虽然已经开发了大量明亮的绿色发射FPs，但大多数都不如增强型的光稳定绿色荧光蛋白(EGFP)，主要的原因在于当前很多FPs的光稳定性不好，限制了其应用，因此发现和设计出应该强度和光稳定性产品对于荧光蛋白的应用非常重要。
Hirano，Masahiko等人在2022年从Cytaeis uchidae水母中发现了一种新的绿色荧光蛋白StayGold，该荧光蛋白的光稳定性比目前常用的荧光蛋白都高出一个数量级，已经很好地应用于观察内质网的动态成像[1.Hirano，Masahiko et al.“Ahighlyphotostable andbright green fluorescent protein.”Nature biotechnology，10.1038/s41587-022-01278-2.25Apr.2022]。将荧光蛋白与目标蛋白进行融合，从而追踪、定位目标蛋白及检测其表达情况等是荧光蛋白较为广泛的应用。在这方面的应用中对于荧光蛋白的一个重要的考量标准就是荧光蛋白的单体性质，大部分荧光蛋白都容易形成低亲和力的二体或者多聚体，限制了它们与感兴趣的蛋白质产生融合的适用性。虽然说StayGold与其他常用荧光相比具有很好的光稳定性，但是StayGold属于一个二体蛋白，研究人员在使用其检测微管动态变化时还需要创建一个串联的二聚体，这样才能增加其光稳定性。如果开发一种单体的StayGold蛋白可以很好地解决其应用过程中的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种增强型单体StayGold蛋白及其应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供一种增强型单体StayGold蛋白，该增强型单体StayGold蛋白序列为野生型二体StayGold蛋白的突变序列，且所述突变序列中的突变为N137、Q140、Y187中至少一个氨基酸进行突变成任意氨基酸。
进一步改进在于，所述N137突变包括N137A、N137R、N137G、N137H、N137I、N137L、N137P和N137S。
进一步改进在于，所述Q140突变包括Q140S、Q140A、Q140G、Q140H、Q140I、Q140L、Q140P和Q140Y。
进一步改进在于，所述Y187突变包括Y187F、Y187A、Y187N、Y187D、Y187I、Y187L、Y187P、Y187S和Y187V。进一步改进在于，所述突变序列中的突变为以下四种情形之一：
(1)N137和Q140两个突变组合；
(2)N137和Y187两个突变组合；
(3)Q140和Y187两个突变组合；
(4)N137、Q140和Y187三个突变组合。
进一步改进在于，所述增强型单体StayGold蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述增强型单体StayGold蛋白。
进一步改进在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒为含有上述多核苷酸且能够翻译表达出上述增强型单体StayGold蛋白的表达载体。
进一步改进在于，所述表达载体为pET-28a载体。
本发明还提供一种蛋白表达系统，为转入上述重组质粒的大肠杆菌BL21菌株。
本发明还提供一种上述增强型单体StayGold蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：利用基因合成技术获得StayGold蛋白的基因，将该基因构建在pET28a载体上，获得pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-StayGold重组质粒；
步骤S2:以pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-StayGold重组质粒作为模板，设计需要进行突变的氨基酸的饱和突变引物，进行PCR扩增，获得单体的StayGold基因的目的片段，将目的片段构建在pET28a载体上，获得StayGold饱和突变质粒；
步骤S3：利用大肠杆菌表达系统表达上述饱和突变体蛋白，利用荧光检测尺寸排除色谱(FSEC)鉴定出饱和突变中的单体StayGold蛋白，使用LC-MS检测饱和突变体的分子量鉴定出突变后概率较高的潜在氨基酸位点；
步骤S4：设计由LC-MS筛选出的潜在突变后氨基酸的定点突变引物，按照步骤S2获得单体突变蛋白，使用Ni-NTA亲和纯化的凝胶过滤层析验证后获得所述增强型单体StayGold蛋白。
本发明还提供一种上述增强型单体StayGold蛋白在检测蛋白的标记、表达定位中的应用。
本发明具有如下有益效果：本发明首次提供了一种新的单体的StayGold蛋白，mStayGold，该绿色荧光蛋白具有很强的热稳定性和荧光强度，其Tm约为95℃，比市场上常用的EGFP的Tm值高出15℃，与二体的StayGold的热稳定相当，其荧光强度也比常用EGFP的荧光强度高5倍。其单体的性质解决了其野生型二体蛋白在与目标蛋白融合进行追踪和定位目标蛋白时因自身聚集状态影响标记和定位的功能，在指导蛋白表达、细胞定位等应用中具有更好的应用场景。
附图说明
图1 StayGold镍柱纯化图；
图2 StayGold质量检测图；
图3 mStayGold饱和突变后平板图；
图4 mStayGold饱和突变产物FSEC快速检图；
图5 mStayGoldN137饱和突变样品的小量纯化图；
图6 mStayGold Q140饱和突变样品的小量纯化图；
图7 mStayGoldN137饱和突变样品的LC-MS检测图；
图8 mStayGold Q140饱和突变样品的LC-MS检测图；
图9 mStayGoldY187饱和突变样品的LC-MS检测图
图10 mStayGold与其他绿色荧光蛋白Tm值检测图；
图11 mStayGold与其他绿色荧光蛋白荧光强度检测图；
图12 mStayGold定点单突变蛋白镍柱纯化图；
图13 mStayGold定点单突变蛋白聚集状态检测图；
图14 mStayGold(N137A，Q140S，Y187F)蛋白镍柱纯化图；
图15 mStayGold(N137A，Q140S，Y187F)蛋白聚集状态检测图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1 mStayGold蛋白表达及纯化
2.1.1 StayGold质粒构建及表达
本发明用基因合成技术获得二体的StayGold的基因，其基因是合成在pET28a载体上。将构建成功且测序正确的pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-StayGold重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，将菌株接种至50mL LB液体培养基中37℃培养过夜，将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1L LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600为0.6-0.8时加入0.5mM IPTG 15℃培养过夜，5000rpm离心收集菌体。
2.1.2 StayGold重组蛋白镍柱纯化
将收集的菌块进行称重，按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，500mM NaCl，5％甘油)，使用高压均质机破碎菌体，16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析His FF富集纯化蛋白，纯化前先用裂解buffer平衡His FF柱，将所有细胞上清挂柱后，用不同梯度的咪唑溶液洗脱，收集不同梯度咪唑洗脱下的蛋白进行SDS-PAGE检测，纯化结果如图1所示，StayGold蛋白均明显表达且纯度较好且产量高达78.4mg/L。
2.1.3 StayGold重组蛋白分子筛纯化及质量检测
收集镍柱纯化后的蛋白进行分子筛纯化，分子筛缓冲液为50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl。分子筛纯化后的蛋白均一性好且纯度高，收集少量样品进行质量检测，结果如图2所示，StayGol蛋白纯度高，LC-MS结果现在分子量为24760Da与StayGold的理论分子量24778Da非常接近，且分析型分子筛的结果显示蛋白分子量约为45kD，说明StayGold蛋白在溶液状态下为二体。
2.2 mStayGold质粒构建
本发明通过设计饱和突变引物，使用常规的分子生物学手段获得突变后的mStayGold基因，将其基因构建在pET28a载体上，具体操作步骤包括：
分别设计6个突变氨基酸N137、E138、Q140、Y187、W189、R191的饱和突变引物，其引物见表1，其中加粗划线字体为对应的需要突变氨基酸位点，NNN代表3个碱基可以为任意氨基酸，其引物为混合引物，以StayGold的基因作为模板，按照常规PCR手段进行PCR扩增，PCR后的产物使用体外连接试剂盒将PCR产物与pET28a载体进行连接，连接后的产物转化DH5α菌株中，之后将转化后的菌液涂布在LB固体培养基上，37℃，过夜培养。
将过夜培养后的平板分成四个区域(图3)。把每个区域上的菌落都刮下来分别接到5mL LB液体培养基中，37℃过夜培养，分别收集每个区域的菌体进行质粒抽提。
表1 mStayGold蛋白饱和突变引物
2.3 mStayGold重组质粒小量表达
将抽提后的重组质粒按照常规分子生物学手段转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，分别挑取单克隆菌斑至5mL LB液体培养基中，37℃培养，待菌液OD600至0.6-0.8时，加入0.5mM IPTG，15℃诱导16个小时。分别收集菌体，用裂解buffer将菌体吹匀后，使用超声破碎仪超声10秒，将超声后的样品用16000rpm高速离心10分钟收集上清。
2.3.1 FSEC快速检测蛋白聚集状态
取部分上清稀释至0.1mg/ml，稀释后的上清取100μL样品进行FSEC系统检测，检测结果如图4所示，N137、Q140和Y187三个氨基酸的饱和突变产物在FSEC上均只有少量高聚峰和单一的分子量约为19kDa的单峰，StayGold单体的理论分子量为27kD，初步判断为单体的mStayGold蛋白；E138、W189和R191三个氨基酸的饱和突变产物在FSEC上除了少量高聚峰和比例较高的19kDa的单峰外还有部分分子量约为41kD的峰。
这表明，N137、Q140和Y187饱和突变成任意氨基酸大概率都能获得单体mStayGold蛋白，而E138、W189和R191三个氨基饱和突变成某些氨基酸可以获得单体mStayGold蛋白或者突变成任意氨基酸都不能够获得完全的mStayGold蛋白。
2.3.2小量纯化验证FSEC筛选的准确性
为了进一步验证FSEC筛选的N137、Q140和Y187的单体mStayGold是否为目标蛋白，我们将2.3.1中N137和Q140剩余的上清液进行了镍柱纯化，纯化的具体操作是将上清液与少量Ni胶质在4℃孵育30min，16000rpm高速离心5分钟去除上清液并取少量进行SD-PAGE检测，再在反应液中加入200μL含500mM咪唑的裂解缓冲液，16000rpm高速离心5分钟去除收集上清液并取少量进行SD-PAGE检测。N137饱和突变样品的小量纯化结果如图5所示，4个区域蛋白均可以洗脱，且分子量与目标蛋白接近，说明FSEC筛选出的～19kD的峰为mStayGold蛋白。
Q140饱和突变的纯化结果与N137相似，如图6所示，分子量与StayGold蛋白分子量接近。说明本发明通过FSEC筛选出的N137、Q140和Y187中任一氨基酸的饱和突变均为单体的mStayGold蛋白。
2.4 N137饱和突变位点验证
为了进一步确认N137位氨基酸突变成何种氨基酸可以实现StayGold蛋白从二体变成单体。将镍柱纯化后的样品进行LC-MS检测，通过检测N137饱和突变蛋白样品的分子量，对照突变后氨基酸的理论分子量推断出N137突变后潜在的氨基酸。LC-MS的检测结果如图7所示，N137饱和突变蛋白样品的主要分子量为27623Da，与N137A突变的分子量非常接近，说明饱和突变样品中N137A突变体的比例较高。
此外，在27623Da附近还有一些峰，这些峰对应的分子量分别对应的潜在突变体为N137R、N137G、N137H、N137I、N137L、N137P和N137S。
2.5 Q140饱和突变位点验证
为了确认Q140位氨基酸突变成何种氨基酸可以实现StayGold蛋白从二体变成单体。将镍柱纯化后的样品进行LC-MS检测，通过检测Q140饱和突变蛋白样品的分子量，对照突变后氨基酸的理论分子量推断出Q140突变后潜在的氨基酸。LC-MS的检测结果如图8所示，Q140饱和突变蛋白样品的主要分子量为27621Da，与Q140S突变的分子量非常接近，说明饱和突变样品中Q140S突变体的比例较高。此外，在27621Da附近还有一些峰，这些峰对应的分子量分别对应的潜在突变体为Q140A、Q140G、Q140H、Q140I、Q140L、Q140P、Q140Y。
2.6 Y187突变位点验证
为了确认Y187位氨基酸突变成何种氨基酸可以实现StayGold蛋白从二体变成单体。将镍柱纯化后的样品进行LC-MS检测，通过检测Y187饱和突变蛋白样品的分子量，对照突变后氨基酸的理论分子量推断出Y187突变后潜在的氨基酸。LC-MS的检测结果如图9所示，Y187饱和突变蛋白样品的主要分子量为27600Da，与Y187P突变的分子量非常接近，说明饱和突变样品中Y187P突变体的比例较高。此外，在27600Da附近还有一些峰，这些峰对应的分子量分别对应的潜在突变体为Y187F、Y187A、Y187N、Y187D、Y187I、Y187L、Y187S和Y187V。
2.7 mStayGold饱和突变蛋白热稳定检测
为了研究单体的mStayGold蛋白的热稳定性，选择小量纯化后的N137的饱和突变蛋白将其与市场上常用的热稳定好的几种绿色荧光蛋白：超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)、增强绿色荧光蛋白(EGFP)和热稳定性的绿色荧光蛋白(TGP)进行Tm值的比较。具体的实验操作如下：
取20μL浓度为上述4种蛋白分别加到384孔实验板中，震荡离心后，将实验板置于取样架上，使用Nano DSF毛细管吸样，保证样品充满整个毛细管。将毛细管放入nanoDSF仪器中，设置初始温度为20℃，以每分钟升温2.0℃的速度最终上升到90℃终止。仪器将会依照设置好的参数进行升温和实时检测。Tm值测试的结果如图10所示，TGP、EGFP和sfGFP的Tm值分别为71.95、80.7和87℃；mStayGold的Tm值太高，超出了仪器检测的最高值，根据其Tm的曲线来看，其Tm值约为95℃。表明本发明的mStayGold的热稳定性比市场上常用的绿色荧光蛋要好，具有更好的应用场景。
2.8 mStayGold饱和突变蛋白荧光强度检测
为了研究单体的mStayGold蛋白的荧光强度，选择小量纯化后的N137的饱和突变蛋白将其与市场上常用的热稳定好的几种绿色荧光蛋白：超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)、增强绿色荧光蛋白(EGFP)和热稳定性的绿色荧光蛋白(TGP)进行Tm值的比较。具体的实验操作如下：
分别取10μL 4种不同的荧光蛋白于384孔的反应板中，加入10μL反应缓冲液(20mMTris-HCl pH 7.0，150mM NaCl)，用全波长扫描仪进行读数，设置激发波长为488nm，发射波长为510nm。实验数据如图11所示，mStayGold呈现出最高的荧光信号，分别比sfGFP、EGFP和TGP分别高出3、5.3和3.3倍。表明本发明的mStayGold的荧光强度比市场上常用的绿色荧光蛋要好，具有更广泛的应用场景。
2.9 mStayGold定点单突变蛋白表达及纯化
2.9.1mStayGold定点单突变蛋白表达
通过LC-MS检测，推测出mStayGold潜在的突变体后，随机构建了mStayGoldN137A、mStayGold Q140S和mStayGold Y187F单突变，其构建方法为常规生物学方法。将构建成功且测序正确的pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-mStayGold N137A、pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-mStayGold Q140S和pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-mStayGold Y187F重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，将菌株接中至5mL LB液体培养基中37℃培养过夜，将过夜培养的细菌按1:100的比例接至0.1L LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600为0.6-0.8时加入0.5mM IPTG 15℃培养过夜，5000rpm离心收集菌体。
2.9.2 mStayGold定点单突变蛋白镍柱纯化
将收集的菌块进行称重，按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，500mMNaCl，5％甘油)，使用高压均质机破碎菌体，16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析His FF富集纯化蛋白，纯化前先用裂解buffer平衡His FF柱，将所有细胞上清挂柱后，用不同梯度的咪唑溶液洗脱，收集不同梯度咪唑洗脱下的蛋白进行SDS-PAGE检测，纯化结果如图12所示，mStayGold N137A、mStayGold Q140S和mStayGoldY187F蛋白均明显表达且纯度较好。
2.9.3 mStayGold定点突变蛋白聚集状态检测
为了进一步明确mStayGold N137A和mStayGold Q140S蛋白的聚集状态，分别收集镍柱纯化后的蛋白进行分子筛纯化，分子筛缓冲液为50mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mMNaCl。分子筛的结果如图13所示，mStayGold N137A、mStayGold Q140S和mStayGold Y187F蛋白通过分析型分子筛计算出的分子量分别约为29、34和22kD，与其理论分子量28kD接近，说明三个突变体均为单体mStayGold蛋白。
2.10 mStayGold组合突变蛋白表达及纯化
2.10.1 mStayGold(N137A，Q140S，Y187F)蛋白表达
为了进一步明确N137、Q140和Y187组合突变后，是否还能获得单体的mStayGold蛋白，利用常规生物学方法构建了用mStayGold(N137A，Q140S，Y187F)重组质粒。将构建成功且测序正确的pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-mStayGold(N137A，Q140S，Y187F)重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，将菌株接中至50mL LB液体培养基中37℃培养过夜，将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1L LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600为0.6-0.8时加入0.5mM IPTG 15℃培养过夜，5000rpm离心收集菌体。
2.10.2 mStayGold(N137A，Q140S，Y187F)蛋白纯化
将菌体进行称重后按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，500mM NaCl，5％甘油)，使用高压均质机破碎菌体，16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析His FF富集纯化蛋白，纯化前先用裂解buffer平衡His FF柱，将所有细胞上清挂柱后，用不同梯度的咪唑溶液洗脱，收集不同梯度咪唑洗脱下的蛋白进行SDS-PAGE检测，纯化结果如图14所示，mStayGold(N137A，Q140S，Y187F)蛋白均明显表达且纯度较好，产量可达193mg/L，是二体的2.5倍。
2.10.3mStayGold(N137A，Q140S，Y187F)蛋白聚集状态检测
收集镍柱纯化后的蛋白进行分子筛纯化，分子筛缓冲液为50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl。分子筛的结果如图15所示，mStayGold(N137A，Q140S，Y187F)蛋白的分子量约为22.7kD，其理论分子量为24.6kD，即三突变体为单体mStayGold蛋白。说明N137、Q140和Y187的组合突变也能获得单体的mStayGold蛋白。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种增强型单体StayGold蛋白，其特征在于，该增强型单体StayGold蛋白序列为野生型二体StayGold蛋白的突变序列，且所述突变序列中的突变为N137A、Q140S和Y187F，所述增强型单体StayGold蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的增强型单体StayGold蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为含有如权利要求2-3任一所述的多核苷酸且能够翻译表达出如权利要求1所述增强型单体StayGold蛋白的表达载体。
5.根据权利要求4所述的一种重组质粒，其特征在于，所述表达载体为pET-28a载体。
6.一种蛋白表达系统，其特征在于，为转入权利要求5所述重组质粒的大肠杆菌BL21菌株。
7.一种如权利要求1所述的增强型单体StayGold蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：利用基因合成技术获得StayGold蛋白的基因，将该基因构建在pET28a载体上，获得pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-StayGold重组质粒；
步骤S2:以pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-StayGold重组质粒作为模板，设计需要进行突变的氨基酸的饱和突变引物，进行PCR扩增，获得单体的StayGold基因的目的片段，将目的片段构建在pET28a载体上，获得StayGold饱和突变质粒；
步骤S3：利用大肠杆菌表达系统表达上述饱和突变体蛋白，利用荧光检测尺寸排除色谱FSEC鉴定出饱和突变中的单体StayGold蛋白，使用LC-MS检测饱和突变体的分子量鉴定出突变后概率较高的潜在氨基酸位点；
步骤S4：设计由LC-MS筛选出的潜在突变后氨基酸的定点突变引物，按照步骤S2获得单体突变蛋白，使用Ni-NTA亲和纯化的凝胶过滤层析验证后获得所述增强型单体StayGold蛋白。
8.一种如权利要求1所述的增强型单体StayGold蛋白在检测蛋白的标记和表达定位中的应用。
CN202210949273.5A 2022-08-09 2022-08-09 一种增强型单体StayGold蛋白及其应用 Active CN116143893B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210949273.5A CN116143893B (zh) 2022-08-09 2022-08-09 一种增强型单体StayGold蛋白及其应用
PCT/CN2023/089027 WO2024032020A1 (zh) 2022-08-09 2023-04-18 一种增强型单体StayGold蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210949273.5A CN116143893B (zh) 2022-08-09 2022-08-09 一种增强型单体StayGold蛋白及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116143893A CN116143893A (zh) 2023-05-23
CN116143893B true CN116143893B (zh) 2023-11-10

Family

ID=86349501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210949273.5A Active CN116143893B (zh) 2022-08-09 2022-08-09 一种增强型单体StayGold蛋白及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116143893B (zh)
WO (1) WO2024032020A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117430698B (zh) * 2023-10-26 2024-04-26 无锡佰翱得生物科学股份有限公司 与mStayGold荧光蛋白相互作用的纳米抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002244199A1 (en) * 2001-02-26 2002-09-12 The Regents Of The University Of California Non-oligomerizing tandem fluorescent proteins
CN103160528A (zh) * 2013-03-07 2013-06-19 西北农林科技大学 增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB及其应用
WO2022215532A1 (ja) * 2021-04-07 2022-10-13 国立研究開発法人理化学研究所 蛍光特性を示す新規なポリペプチド、およびその利用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5625048A (en) * 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
FR2827292B1 (fr) * 2001-07-12 2004-06-18 Centre Nat Rech Scient Photoproteines mutees et leurs applications
CN1438239A (zh) * 2002-02-11 2003-08-27 厦门大学 一种新型荧光蛋白,编码其的多核苷酸序列及其用途
US20110126305A1 (en) * 2009-11-25 2011-05-26 National Cheng Kung University Mutant blue fluorescent protein and method of using the same for fluorescence resonance energy transfer and blue fluorescent fish
CN105585625B (zh) * 2014-10-31 2020-06-26 北京义翘神州科技股份有限公司 一种增强型绿色荧光蛋白

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002244199A1 (en) * 2001-02-26 2002-09-12 The Regents Of The University Of California Non-oligomerizing tandem fluorescent proteins
CN103160528A (zh) * 2013-03-07 2013-06-19 西北农林科技大学 增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB及其应用
WO2022215532A1 (ja) * 2021-04-07 2022-10-13 国立研究開発法人理化学研究所 蛍光特性を示す新規なポリペプチド、およびその利用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A highly photostable and bright green fluorescent protein;Masahiko Hirano等;《nature biotechnology》;第1132-1142页 *
单体红色荧光蛋白基因DsRed2的克隆及其原核表达;康泽然 等;《吉林农业大学学报》;第420-425页 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024032020A1 (zh) 2024-02-15
CN116143893A (zh) 2023-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109627344B (zh) cAMP荧光探针及其应用
CN116143893B (zh) 一种增强型单体StayGold蛋白及其应用
CN113061591B (zh) 一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用
CN113801866B (zh) 一种高效表达具有高活性及稳定性的重组tev酶及其制备方法和应用
CN110218735B (zh) 一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶
CN116023460B (zh) 一种StayGold黄色荧光蛋白及其应用
CN112661820B (zh) 天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白及其在刀豆氨酸生物传感器中的应用
CN112175980B (zh) 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用
CN117025559A (zh) 重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用
CN113462688B (zh) 一种蓝光调节启动子、蓝光调节启动子的融合基因、蓝光介导调节质粒及构建方法和应用
CN111254143B (zh) 具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用
CN114199848B (zh) 一种基于蛋白连接酶的高通量检测蛋白表达的方法
CN110951760B (zh) 一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用
CN116042555B (zh) 一种乙醇脱氢酶突变体及其应用
CN114634965B (zh) 一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法及突变体和3-羟基丙酸合成的应用
CN116333157B (zh) 一种改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用
CN109266780B (zh) 海州常山盐胁迫下荧光定量内参基因及其引物和应用
CN117050152A (zh) 一种耐高温的黄素单核苷酸结合荧光蛋白及其应用
CN116063571A (zh) 重组ssb抗原的制备方法和应用
Ibinola Recombinant Production and Purification of Green Fluorescent Protein (GFP)-Fused Metal Binding Protein for Palladium Nanoparticle Synthesis
CN117264859A (zh) 一种原核表达系统及其制备方法和应用
CN107987137B (zh) 一种abc转运蛋白及其制备方法
CN116891866A (zh) 一种月桂烯生物传感器及其对月桂烯的可视化检测方法
CN113999299A (zh) 人肌红蛋白的高效表达方法
CN116926034A (zh) 重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: No. 6 Dongsheng West Road, Chengdong Street, Jiangyin City, Wuxi City, Jiangsu Province, 214000 (C5 Building, Yangtze River Biomedical Accelerator)

Applicant after: Wuxi Baiaode Biological Science Co.,Ltd.

Address before: 214400 No.6 Dongsheng West Road, Chengdong street, Jiangyin City, Wuxi City, Jiangsu Province

Applicant before: BIORTUS BIOSCIENCES Co.,Ltd.

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant