CN103160528A - 增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。以及所述的增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB作为生物发光报告基因的应用。本发明将luxA和luxB基因融合表达后形成的单体蛋白经过易错PCR突变和化学随机突变，克隆到pBluescriptII载体中，筛选得到9个荧光强度增强的突变体，然后经过shuffling技术，得到一个增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB。从实验结果我们看出该增强型单体细菌荧光素酶不仅可以在革兰氏阴性菌种表达出有活性的荧光蛋白而且还可以应用到革兰氏阳性菌中，是很有前景的生物发光报告基因。

Description

增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的是一种增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB及其应用。

背景技术

细菌发光基因操纵子luxCDABE来源于Photorhabdus luminescens。因为检测灵敏方便而被作为报告基因广泛应用于基因表达分析、快速检测、有毒有害物质分析等领域。其中luxA和luxB基因分别编码细菌荧光素酶异二聚体的α（催化亚基，40kD）和β（调节亚基，36kD）亚基，只有两个亚基共存时才有活性，当将luxA和luxB基因融合表达后形成的单体蛋白仍然具有与野生型异二聚体蛋白相当的发光活性，经密码子优化后该融合蛋白在真核生物中也具有很高的活性。luxCDE编码脂肪酸还原酶和合成酶，用于合成细菌荧光素酶所作用的底物十四烷醛。为了克服真核生物来源荧光素酶报告系统需要外加底物的缺点，最近国外有研究人员通过将luxC、luxD和luxE基因在哺乳动物细胞中共表达成功构建了产细菌荧光素酶底物的稳定细胞系[30]，由于luxA和luxB基因融合型单体蛋白和非融合型二聚体蛋白均可在真核生物细胞系中功能表达，这一研究就此宣告了细菌荧光素酶真核活体实时自动化报告基因检测系统的成功，也为基于细菌荧光素酶的自动化双分子互补活体实时动态蛋白相互作用检测系统今后在真核生物中的应用提供了担保，奠定了基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB。

本发明的技术方案如下：

增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB作为生物发光报告基因的应用。

本专利申请发明人将luxA和luxB基因融合表达后形成的单体蛋白经过易错PCR突变和化学随机突变，克隆到pBluescriptII载体中，筛选得到9个荧光强度增强的突变体，然后经过shuffling技术，得到一个增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB。

附图说明

图1为pDM4-luxCDABE基因及MCS；

图2为pBluescriptII质粒图谱；

图3为luxA和luxB基因融合单体克隆示意图；

图4为易错PCR突变luxAB融合单体蛋白发光强度检测；

图5为shuffling过程图解；

图6为突变体经过shuffling后筛选结果；

图7为不同浓度的底物（十四醛）对细菌荧光素酶luxAB荧光强度的影响；

图8为增强型单体细菌荧光素酶luxAB基因在大肠杆菌E.coli DH5α荧光强度检测结果，pB-luxABs为增强型单体细菌荧光素酶的荧光强度，pB-luxAB是阴性对照组；

图9为增强型单体细菌荧光素酶luxAB基因在谷氨酸棒状杆菌中荧光强度检测结果，1组为增强型单体细菌荧光素酶的荧光强度，2组是阴性对照组；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

一.材料与方法

1.分子生物学试剂

各种限制性内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司，T4DNA连接酶为New England Biolab公司产品，DNA分子量标准：MakerIII和DL5000+2000购自天根生物科技（北京）有限公司。

研究中用到的抗生素浓度如下：氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素100μg/mL，氯霉素30μg/mL，萘啶酸15μg/mL。培养大肠杆菌一律采用LB培养基：10%蛋白胨，5%酵母膏，10%NaCl；培养Yp采用YLB培养基：10%蛋白胨，5%酵母膏，5%NaCl。

2.实验材料：

大肠杆菌E.coli DH5α；YPIII假结核耶尔森氏菌菌株由英国诺丁汉大学购买；pDM4-lux Box（含有luxCDABE基因序列）由英国诺丁汉大学购买；质粒pBluescipt II购自大连宝生物公司（如图2）;质粒pKT25；pDM4均从天根生物公司购买。

3.克隆构建

本研究中所有克隆均采用此方法构建。首先以YpIII基因组为模板扩增目的基因。PCR的反应体系为50μL：去离子水（ddH2O）33.5μL，10×PCR buffer5μL，dNTPs(2mM each)5μL，MgSO4(25mM)2μL，正反向引物（10μM）各1.5μL，模板DNA0.5μL，KOD-Plus-(1U/μL)1μL。PCR程序为：94°C，2.5min；(94°C,15s；60°C to50°C,30s,每个循环降低0.5°C；68°C,0.5min)×20；(94°C,15s；50°C,30s；68°C,0.5min)×10。PCR产物用含0.5μg/mL溴化乙锭（EB）的1%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电泳条件为：

1×TAE缓冲液，电压5V/cm，电泳40min。在紫外灯下切下目的条带，用上海生工凝胶回收试剂盒进行胶回收，回收操作方法见试剂盒说明书。

扩增产物50μL双酶切反应体系包括：PCR产物20μL，buffer5μL，限制性内切酶各1μL；载体50μL酶切体系：8μL载体质粒，buffer5μL，限制性内切酶各1μL，最后用ddH2O补足体积至50μL。酶切后回收。连接反应：连接体系包括目的片段6.5μL，酶切后的载体2.5μL，

T4buffer1μL，T4DNA连接酶0.3μL，充分混匀后16°过夜连接。

4.感受态的制备及转化方法

研究中所有E.coli感受态制备及转化均采用Ca2+转化方法进行。10μL连接产物加入到100μL E.coli S17-1钙转感受态细胞并轻轻混匀，冰浴30min，42°C水浴热激90s，再冰浴3min，加入1mL新鲜LB培养基，置恒温摇床中37°C80rpm复苏45min，5000rpm离心3min，去除800μL上清，用剩余的培养基重悬菌体后涂含有Cm的LB平板，37°C培养过夜。

YpIII野生型及突变体感受态的制备及转化转化方法，在-80°冰箱中取出感受态冰上融化，同时电转杯也放在冰上，电转化电压1800V，将产物与100μL感受态混合，放入电转杯中，脉冲结束后尽快取出电转杯将电转产物加入到900μL LB培养基中，随后30°C复苏1h。

二．luxA和luxB基因异二聚体的融合：

细菌发光基因操纵子luxCDABE来源于Photorhabdus luminescens，我们实验室的luxCDABE操纵子序列在pDM4质粒中（如图1），luxA和luxB基因分别编码细菌荧光素酶异二聚体的α（催化亚基，40kD）和β（调节亚基，36kD）亚基，luxCDE分别编码脂肪酸转移酶、还原酶和合成酶，用于合成细菌荧光素酶所作用的底物十四烷醛。LuxA和luxB基因是两个分开的亚基，即异二聚体，可以直接在原核中表达，作为报告基因。luxA和luxB基因融合型单体蛋白和非融合型二聚体蛋白均可在真核生物细胞系中功能表达，但是融合型的单体蛋白更容易表达，所以我们通过overlap PCR设计引物将luxA亚基和luxB亚基融合到一起，我们在luxA和luxB基因异二聚体间插入(GGGGS)3linker，以减少两个亚基间的空间位阻。LuxA和luxB的单体融合蛋白基因序列（突变后）序列特征见SEQ ID No：1的信息。

我们根据SEQ ID No.1的序列信息设计引物，其中luxA基因的上游引物LuxA-F-Xbal含XbaI酶切位点和下游引物LuxA-R-L15含(GGGGS)3linker。LuxB基因上游引物luxB-F-L15含(GGGGS)3linker和下游引物LuxB-R-BglII含有BglII酶切位点。luxA和luxB基因异二聚体overlap PCR引物序列如下：

LuxA-F-Xbal：5’-GCTCTAGAATGAAATTTGGAAACTTTTTGC-3’

LuxA-R-L15：

5                                                            ’-GCTACCTCCGCCACCACTTCCACCGCCTCCAGAACCTCCTCCACCATATAATAGCGAACGTTGTTTTTC-3’

luxB-F-L15:5                                                 ’-GGTGGAGGAGGTTCTGGAGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGAGGTAGCATGAAATTTGGATTGTTCTTCC-3’

LuxB-R-BglII：5’-GAAGATCTTTAGGTATATTCCATGTGGTACTTC-3’

LuxA和luxB基因异二聚体的第一次扩增：我们先用luxA基因的上游引物LuxA-F-Xbal含XbaI酶切位点和下游引物LuxA-R-L15含(GGGGS)3linker两对引物扩增luxA基因片段。然后用LuxB基因上游引物luxB-F-L15含(GGGGS)3linker和下游引物LuxB-R-BglII含有BglII酶切位点扩增luxB基因片段。两个片段分别纯化回收，然后用回收之后的片段作为模板，进行第二轮PCR的扩增，使用LuxA-F-Xbal和LuxB-R-BglII两个正反向引物扩增，扩增体系为：第一轮PCR扩增得到的luxA和luxB基因共同作为模板各10μL，primers正反向引物（10μM）LuxA-F-Xbal和LuxB-R-BglII各5μL，DNA聚合酶1μL，DNA聚合酶10×PCR buffer5μL，dNTP5μL，然后用ddH2O补充至50μL。PCR程序为：94°C，3min；(94°C,30s；50°C,30s,；72°C,2.5min)×30。PCR产物经过琼脂糖凝胶纯化回收之后得到luxA和luxB基因的融合单体基因序列，中间用引物中的序列(GGGGS)3linker做连接。纯化所用到的试剂和方法参见一。

三．pBluescriptII-Plac::luxAB质粒的构建：

我们将luxA和luxB基因融合的单体序列插入到pBluescriptII质粒中（如图2酶切位点为XbaI和BamHI），然后再XbaI和SacI位点插入lac启动子，得到构建的质粒pBluescriptII-Plac，以提高luxAB融合单体蛋白的表达量（如图3是pBluescriptII-Plac-luxAB构建的示意图）。

四．随机化学突变：

取5ug的pBluescriptII-Plac::luxAB融合蛋白单体质粒DNA，放于100ul的反应体系中，其中包括0.5M盐酸羟胺;5mMTris-Hcl PH6.0;0.5mM Na2EDTA;

表1100ul反应体系

然后65°反应1小时，然后用DNA纯化回收柱回收经过化学突变之后的质粒DNA，然后将突变的质粒用XbaI和BamHI酶切，之后连接到构建好的pBluescriptII-Plac质粒上，所用位点为XbaI和BamHI，从而得到突变克隆，然后通过

M200PRO多功能酶标仪检测荧光素酶的发光强度，筛选到了4个荧光强度增强的突变体。

五．易错PCR突变：

材料：

1.亲本质粒

2.突变序列引物如下（LuxA-F-Xbal LuxB-R-BglII）

3.易错PCR buffer包括:10*100mMTris-Hcl(PH8.3)，500mM Kcl，70mMMgcl2，

0.1%Gelatin。

4.10mM Mncl2

5.dNTPs

6.Taq polymerase

表2100uL反应体系

所用引物序列：

LuxA-F-Xbal   5’-GCTCTAGAATGAAATTTGGAAACTTTTTGC-3’

LuxB-R-Bgl2                            5           ’-GAAGATCTAATAGCGGCCGCGGATCCGGTATATTCCATGTGGTACTTC-3’

通过表2中的体系和引物做易错PCR，对luxAB基因进行随机突变，得到一系列的突变产物，然后克隆插入到pBluescriptII-Plac质粒中（酶切位点为XbaI和BamHI），然后我们通过TECAN 

M200PRO多功能酶标仪检测荧光素酶的发光强度，同样筛选荧光强度增强的突变体，最终得到5个荧光强度增强的突变体，检测其中两个突变体，结果如图4，可以看出突变体1和突变体2比突变前荧光强度分别增强8倍和10倍。

六．Shuffling对筛选到的突变体进行优化；

我们通过DNA洗牌（重组）技术对得到的9个突变体进行有益突变位点的优化。我们先将9个突变体中的luxAB单体融合序列进行PCR扩增，扩增后将扩增产物分别取5ul进行随机DNaseI消化，然后将消化后的片段使用2%的低熔点胶纯化回收10-50bp的片段，纯化后的短片段用Primerless PCR进行重新组合，再次回收大小正确的片段，最后用普通PCR with primers进行扩增，得到大量的突变的luxAB单体融合基因片段，shuffling过程如图5。

将经过shuffling优化之后突变的luxAB单体融合基因序列克隆到pBluescriptII-Plac质粒上，得到pBluescriptII-Plac::luxAB克隆（其中的luxAB为突变后的luxAB单体融合基因片段），然后通过TECAN 

M200PRO多功能酶标仪检测荧光素酶的发光强度，最终筛选到一个荧光强度增强40多倍的luxAB单体融合蛋白结果（如图6）。我们将筛选到的最终荧光强度增强40倍突变体测序（序列由生工生物工程上海有限公司测定），结果在luxA序列中有三个位点发生突变。图6中pB-8linker和pB-15linker为突变前的对照菌株荧光强度，shuffling为突变筛选之后的菌株，由图6中我们看出荧光强度增强40多倍。

从图7中我们可以看出浓度越高增强型单体细菌荧光素酶的荧光强度越强，其中“-”为阴性对照，1‰代表所用底物量为实验时总体积的千分之一，我们使用的时候选用1%的底物量，以防止底物量过大而影响细菌的生理形态。

七．增强型单体细菌荧光素酶luxAB基因的应用

经过随机突变、化学突变和shuffling筛选之后得到的增强型单体细菌荧光素酶luxAB基因表达的荧光蛋白可以作为报告基因检测启动子活性，蛋白表达量等，我们除了在YPIII假结核耶尔森氏菌中表达了该增强型单体细菌荧光素酶luxAB基因外，还在大肠杆菌E.coli DH5α和谷氨酸棒状杆菌中分别做了表达的实验，结果如图8、9，从结果我们得知该增强型单体细菌荧光素酶luxAB基因能很好的在大肠杆菌E.coli DH5α中表达，且比没有突变的luxAB荧光素酶基因荧光强度增强4倍多；但是在谷氨酸棒状杆菌中该增强型单体细菌荧光素酶虽然可以表达，但荧光强度减弱很多，我们猜测是由于谷氨酸棒状杆菌的革兰氏阳性细胞壁阻碍了细菌荧光素酶底物十四醛的渗透，使渗透量过少底物不足所致，不过并没有影响该增强型单体荧光蛋白的表达和应用。而且该蛋白的底物十四醛价格低廉，经过实验我们得知该底物在几秒种就可以渗透进细胞和细菌内部，而且我们的用量不会影响细菌生理活性，如图7为不同浓度的底物对细菌荧光素酶luxAB荧光强度的影响，从图7中我们可以看出，底物的使用量越大，该增强型单体细菌荧光素酶的荧光强度越强，我们使用的时候选用1%的底物量，以防止底物量过大而影响细菌的生理形态。从实验结果我们看出该增强型单体细菌荧光素酶不仅可以在革兰氏阴性菌种表达出有活性的荧光蛋白而且还可以应用到革兰氏阳性菌中，是很有前景的生物发光报告基因。

通过上述实验获得的增强型单体细菌荧光素酶基因突变位点为700bp的C突变为T;967bp位的A突变为G；1009bp位的A突变为G。

SEQ ID No：1的信息

（i）序列特征：

（A）长度:2109bp

(B)类型：核酸

（C）链性：单链

（D）拓扑结构：线性

（ii）分子类型：DNA

(iii)序列描述：SEQ ID No：1luxAB单体融合蛋白突变序列，其中带框的碱基为突变位点。

ATGAAATTTGGAAACTTTTTGCTTACATACCAACCTCCCCAATTTTCTCAAACAGAGGTAATGAAACGTTTGGTTAAATTAGGTCGCATCTCTGAGGAGTGTGGTTTTGATACCGTATGGTTACTGGAGCATCATTTCACGGAGTTTGGTTTGCTTGGTAACCCTTATGTCGCTGCTGCATATTTACTTGGCGCGACTAAAAAATTGAATGTAGGAACTGCCGCTATTGTTCTTCCCACAGCCCATCCAGTACGCCAACTTGAAGATGTGAATTTATTGGATCAAATGTCAAAAGGACGATTTCGGTTTGGTATTTGCCGAGGGCTTTACAACAAGGACTTTCGCGTATTCGGCACAGATATGAATAACAGTCGCGCCTTAGCGGAATGCTGGTACGGGCTGATAAAGAATGGCATGACAGAGGGATATATGGAAGCTGATAATGAACATATCAAGTTCCATAAGGTAAAAGTAAACCCCGCGGCGTATAGCAGAGGTGGCGCACCGGTTTATGTGGTGGCTGAATCAGCTTCGACGACTGAGTGGGCTGCTCAATTTGGCCTACCGATGATATTAAGTTGGATTATAAATACTAACGAAAAGAAAGCACAACTTGAGCTTTATAATGAAGTGGCTCAAGAATATGGGCACGATATTCATAATATCGACCATTGCTTATCATATATAACATCTGTAGATATGACTCAATTAAAGCGAAAGAGATTTGCCGGAAATTTCTGGGGCATTGGTATGATTCTTATGTGAATGCTACGACTATTTTTGATGATTCAGACCAAACAAGAGGTTATGATTTCAATAAAGGGCAGTGGCGTGACTTTGTATTAAAAGGACATAAAGATACTAATCGCCGTATTGATTACAGTTACGAAATCAATCCCGTGGGAACGCCGCAGGAATGTATTGACATAATTCAAAAAGACATTGATGCTACAGGAATATCAAAT

TTTGTTGTGGATTTGAAGCTAATGGAACAGTAGACGAAATTTTGCTTCCATGAAGCTCTTCCAGTCTGATGTCATGCCATTTCTTAAAGAAAAACAACGTTCGCTATTATATGGTGGAGGAGGTTCTGGAGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGAGGTAGCATGAAATTTGGATTGTTCTTCCTTAACTTCATCAATTCAACAACTGTTCAAGAACAAAGTATAGTTCGCATGCAGGAAATAACGGAGTATGTTGATAAGTTGAATTTTGAACAGATTTTAGTGTATGAAAATCATTTTTCAGATAATGGTGTTGTCGGCGCTCCTCTGACTGTTTCTGGTTTTCTGCTCGGTTTAACAGAGAAAATTAAAATTGGTTCATTAAATCACATCATTACAACTCATCATCCTGTCCGCATAGCGGAGGAAGCTTGCTTATTGGATCAGTTAAGTGAAGGGAGATTTATTTTAGGGTTTAGTGATTGCGAAAAAAAAGATGAAATGCATTTTTTTAATCGCCCGGTTGAATATCAACAGCAACTATTTGAAGAGTGTTATGAAATCATTAACGATGCTTTAACAACAGGCTATTGTAATCCAGATAACGATTTTTATAGCTTCCCTAAAATATCTGTAAATCCCCATGCTTATACGCCAGGCGGACCTCGGAAATATGTAACAGCAACCAGTCATCATATTGTTGAGTGGGCGGCCAAAAAAGGTATTCCTCTCATCTTTAAGTGGGATGATTCTAATGATGTTAGATATGAATATGCTGAAAGATATAAAGCCGTTGCGGATAAATATGACGTTGACCTATCAGAGATAGACCATCAGTTAATGATATTAGTTAACTATAACGAAGATAGTAATAAAGCTAAACAAGAGACGCGTGCATTTATTAGTGATTATGTTCTTGAAATGCACCCTAATGAAAATTTCGAAAATAAACTTGAAGAAATAATTGCAGAAAACGCTGTCGGAAATTATACGGAGTGTATAACTGCGGCTAAGTTGGCAATTGAAAAGTGTGGTGCGAAAAGTGTATTGCTGTCCTTTGAACCAATGAATGATTTGATGAGCCAAAAAAATGTAATCAATATTGTTGATGATAATATTAAGAAGTACCACATGGAATATACCTAA

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB作为生物发光报告基因的应用。

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