CN103626852B - 一种AraC突变体蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种AraC突变体蛋白及其应用，具体涉及AraC突变体蛋白在高通量筛选合成四氢嘧啶的菌株中的应用。本发明提供的AraC突变体蛋白为序列表的序列3所示的蛋白质。编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。本方法提供的AraC突变体蛋白能够特异性结合四氢嘧啶并受其诱导开启PBAD启动子表达下游报告基因，建立报告基因表达强度和四氢嘧啶浓度之间的对应关系，从而可以通过荧光强度或者颜色反应来筛选高产四氢嘧啶的菌株。本方法为四氢嘧啶高产菌株的筛选提供一种快速高效的高通量筛选方法，将促进四氢嘧啶工业化应用的发展。

Description

一种AraC突变体蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及一种AraC突变体蛋白及其应用，具体涉及AraC突变体蛋白在高通量筛选合成四氢嘧啶的菌株中的应用。
背景技术
四氢嘧啶，中文全称为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，英文全称为1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylicacid;ectoine。结构式见式（Ⅰ）。
四氢嘧啶是微生物应答环境渗透压胁迫合成的一种渗透压补偿性溶质，可以平衡细胞的渗透压，在高温、冷冻和干燥等逆境下，对酶、DNA、细胞膜和整个细胞提供保护作用，可作为化妆品保湿剂和酶蛋白稳定剂等，在化妆品、生物制剂、酶制剂和制药等领域具有广泛的应用前景和开发价值。
目前四氢嘧啶的研究主要集中在提高四氢嘧啶产量，但是由于缺乏高通量筛选手段，限制了四氢嘧啶生物合成途径的改造研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种AraC突变体蛋白及其应用，具体涉及AraC突变体蛋白在高通量筛选合成四氢嘧啶的菌株中的应用。
本发明提供的AraC突变体蛋白，命名为AraCm蛋白，属于人工序列，为序列表的序列3所示的蛋白质。
编码所述蛋白质的基因（araCm基因）也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下1）至3）中任一所述的DNA分子：
1）序列表的序列4所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有araCm基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体可为将araCm基因插入pMAL-p2x载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体更具体可为在pMAL-p2x载体的NdeI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒。
本发明还保护一种试剂盒，包括质粒甲和质粒乙；所述质粒甲为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒；所述质粒乙为在表达载体的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组质粒；所述特异DNA片段包括序列表的序列5中自5’末端第329至402位核苷酸所示的PBAD启动子和荧光蛋白的编码基因。所述质粒甲具体为在pMAL-p2x载体的多克隆位点插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒；所述质粒乙具体为在pDHC29载体的多克隆位点插入所述特异DNA片段得到的重组质粒。
所述荧光蛋白具体可为GFPuv蛋白。所述GFPuv蛋白为序列表的序列5自5’末端第445至1164位核苷酸编码的蛋白质。所述荧光蛋白的编码基因（gfpuv基因）具体可如序列表的序列5自5’末端第445至1164位核苷酸所示。所述特异DNA片段具体可如序列表的序列5所示。
所述质粒乙更具体可为在pDHC29载体的KpnI酶切位点插入序列表的序列5所示双链DNA分子得到的重组质粒。
所述质粒甲更具体可为在pMAL-p2x载体的NdeI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒。
所述试剂盒还可包括宿主菌；所示宿主菌为敲除大肠杆菌基因组中的araC基因得到的工程菌。所述宿主菌具体可为JW0063-1菌株。所述araC基因如序列表的序列2所示。
所述蛋白质、所述基因、所述重组表达载体或所述试剂盒的应用，为如下（a）或（b）或（c）：（a）鉴定四氢嘧啶；（b）检测四氢嘧啶的含量；（c）筛选生产四氢嘧啶的菌株（特别是高产菌株）。
本发明还保护一种筛选受四氢嘧啶特异诱导的AraC突变体蛋白的方法，包括如下步骤：
（1）将AraC突变体文库和辅助质粒共转化宿主菌，得到重组菌；
（2）阴性筛选
将步骤（1）得到的重组菌进行IPTG诱导，分选荧光最低的细胞；
（3）阳性筛选
将步骤(2)得到的细胞进行四氢嘧啶诱导，用流式细胞分选仪分选荧光最强的细胞；
反复进行所述阴性筛选和所述阳性筛选，直至挑选得到的单克隆在四氢嘧啶存在情况下的荧光值比无四氢嘧啶存在时荧光值高，且差值为2000以上，所述单克隆即为含有所述突变体蛋白的细胞；
所述AraC突变体文库为将序列表的序列2所示野生型araC基因进行突变(如定点饱和突变)并将突变得到的DNA分子插入表达载体(如pMAL-p2x载体)得到的DNA文库；
所述辅助质粒为在表达载体(如pDHC29载体)的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组质粒；所述特异DNA片段包括序列表的序列5中自5’末端第329至402位核苷酸所示的PBAD启动子和荧光蛋白的编码基因；
所述宿主菌为敲除大肠杆菌(如大肠杆菌BW25113)基因组中的所述野生型araC基因得到的重组菌。
所述荧光蛋白具体可为GFPuv蛋白。所述GFPuv蛋白为序列表的序列5自5’末端第445至1164位核苷酸编码的蛋白质。所述荧光蛋白的编码基因(gfpuv基因)具体可如序列表的序列5自5’末端第445至1164位核苷酸所示。所述特异DNA片段具体可如序列表的序列5所示。
所述辅助质粒更具体可为在pDHC29载体的KpnI酶切位点插入序列表的序列5所示双链DNA分子得到的重组质粒。
所述宿主菌具体可为JW0063-1菌株。
AraC是大肠杆菌L-阿拉伯糖操纵子的调控蛋白，AraC既是激活子又是阻遏子，无L-阿拉伯糖存在时，AraC二聚体和DNA结合形成环结构，PBAD启动子被关闭，不能启动其下游基因的表达。当AraC与其天然诱导物L-阿拉伯糖结合时，形成另一种二聚体构象结合于DNA的I1和I2位点，开启PBAD启动子表达下游基因。本方法提供了一种AraC突变体蛋白能够特异性结合四氢嘧啶并受其诱导开启PBAD启动子表达下游报告基因，建立报告基因表达强度和四氢嘧啶浓度之间的对应关系，从而可以通过荧光强度或者颜色反应来筛选高产四氢嘧啶的菌株。本方法为四氢嘧啶高产菌株的筛选提供一种快速高效的高通量筛选方法，将促进四氢嘧啶工业化应用的发展。
附图说明
图1为质粒pSM01的结构示意图。
图2为质粒pSM02的结构示意图
图3为AraC突变体蛋白发现过程中野生型AraC的流式细胞仪检测结果。
图4为在各个四氢嘧啶浓度的条件下，发酵液GFPuv荧光值除以OD600数值的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。野生型AraC蛋白如序列表的序列1所示，其编码基因（野生型araC基因）如序列表的序列2所示。
pDHC29载体：参考文献：PhillipsGJ,ParkSK,HuberD.Highcopynumberplasmidscompatiblewithcommonlyusedcloningvectors.Biotechniques.2000;28(3):400-2,404,406passim.）；公众可以从中国科学院微生物研究所获得。
pMAL-p2x载体：NewEnglandBiolabs，ER2272。
JW0063-1菌株（为敲除大肠杆菌BW25113的基因组中的araC基因的重组菌）：NBRPE.coli,MicrobialGeneticsLaboratory,NationalInstituteofGenetics1111Yata,Mishima,Shizuoka,411-8540Japan。
实施例1、质粒pSM01的构建
1、合成序列表的序列5所示的双链DNA分子。序列表的序列5中自5’末端第329至402位核苷酸为PBAD启动子，第445至1164位核苷酸为gfpuV基因。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用gfp-for-1和gfp-rev-1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（PBAD-gfpuv片段）。
gfp-for-1：5`-GGCGGTACCATCGGCGTTAAACCC-3`；
gfp-rev-1：5`-GGTGGTACCGAGCTCGAATTCATTATTT-3`。
3、用限制性内切酶KpnI酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶KpnI酶切pDHC29载体，回收载体骨架（约3600bp）。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到质粒pSM01。质粒pSM01的结构示意图见图1。根据测序结果，对质粒pSM01进行结构描述如下：在pDHC29载体的KpnI酶切位点插入了序列表的序列5所示的双链DNA分子。
实施例2、AraC突变体蛋白的发现
一、AraC突变文库的构建
以大肠杆菌DH5a(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司MCC001）的基因组DNA为模版，用引物F0（5`-TATCATATGGCTGAAGCGCAAAATGAT-3`）和R0（5`-TTAACTCGAGTTATGACAACTTGACGGCTACAT-3`）扩增野生型araC基因，纯化后用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切并回收片段1。以pMAL-p2x载体为模版，用引物pmal-rev-NdeI（5`-TATCATATGCTATGGTCCTTGTT-3`）和pmal-for-XhoI（5`-AATCTCGAGGAATTCGGATCCTCTAGA-3`）扩增pMAL-p2x载体的部分片段，纯化后用NdeI和XhoI双酶切并回收片段2，片段1和片段2用T4DNA连接酶酶连，得到质粒pSM02。质粒pSM02的结构示意图见图2。
以质粒pSM02为模版，利用突变引物AraCl-for(5`-GCTGAAGCGCAAAATGATNNSCTGCTGCCGGATACTCGTTTAACGCCCATCTGGTGGCGGGTTTANNSCCGATTGAG-3`)和AraC1-rev(5`-CGAGCCTCCGGATGACGACCSNNGTGSNNAATCTCTCC-3`)，AraC2-for(5`-GGTCGTCATCCGGAGGCTCGCGAATGGTATNNSCAGTGGGTT-3`)和AraC2-rev(5`-ATTGCTGTCTGCCAGGTGATC-3`)分别扩增F1和F2片段，纯化回收后用F1和F2片段相互做为模版和引物，利用重叠延伸PCR技术，将两基因连接起来，得到融合基因FC1，再用引物F0（5`-TATCATATGGCTGAAGCGCAAAATGAT-3`）和R02(5`-GACAAGCTTCGCGTACCCGATTATCCATCGGT-3`)扩增FC1得到片段FC2，FC2纯化回收后用限制性内切酶NdeI和HindIII进行双酶切；以pSM02为模版，用引物pmal-rev-NdeI（5`-TATCATATGCTATGGTCCTTGTT-3`）和pSM02-for-HindIII（5`-ATTAAGCTTGTCAGTACATCAGCGATCACCTGGCA-3`）扩增pSM02载体骨架，纯化后用NdeI和HindIII双酶切并回收片段3，片段3和经同样双酶切处理的FC2用T4DNA连接酶酶连，即建成AraC突变体文库。
二、细胞的培养和诱导
阳性对照：将质粒pSM01和质粒pSM02共转化JW0063-1菌株，37℃培养至单菌落产生。分别接种单菌落至3mL含LB液体培养基（含0.1mg/ml氨苄青霉素、0.025mg/ml氯霉素和0.4mMIPTG），37℃、200rpm振荡培养10小时(实际应用中8-15小时均可)，然后按1%的接种量接种至新鲜的LB培养基（含0.1mg/ml氨苄青霉素、0.025mg/ml氯霉素、0.4mMIPTG和5mML-阿拉伯糖；实际应用中，可采用0.1-1mMIPTG和0.1-10mML-阿拉伯糖），37℃继续培养10小时(实际应用中8-15小时均可)。
阴性对照：将质粒pSM01和质粒pSM02共转化JW0063-1菌株，37℃培养至单菌落产生。分别接种单菌落至3mL含LB液体培养基（含0.1mg/ml氨苄青霉素、0.025mg/ml氯霉素和0.4mMIPTG），37℃、200rpm振荡培养10小时(实际应用中8-15小时均可)，然后按1%的接种量接种至新鲜的LB培养基（含0.1mg/ml氨苄青霉素、0.025mg/ml氯霉素和0.4mMIPTG；实际应用中，可采用0.1-1mMIPTG），37℃继续培养10小时(实际应用中8-15小时均可)。
筛选组：（1）将质粒pSM01导入JW0063-1菌株，得到重组菌；（2）将AraC突变体文库转化步骤（1）得到的重组菌，转化液中加入氨苄青霉素（使其浓度为0.1mg/ml）、氯霉素（使其浓度为0.025mg/ml）和IPTG（使其浓度为0.4mM；实际应用中，0.2-1mM均可），37℃培养5小时（实际应用中，3-8小时均可），然后以10%接种量接种至LB培养基（含0.1mg/ml氨苄青霉素、0.025mg/ml氯霉素、0.4mMIPTG和100mM四氢嘧啶；实际应用中，可采用0.1-1mMIPTG和25-300mM四氢嘧啶）。
各组取200ul用酶标仪测其OD600和GFPuv荧光值(激发光波长为395nm,发射光波长为509nm)，并将GFPuv荧光值除以OD600数值。
三、流式细胞仪筛选
1、将AraC突变体文库和质粒pSM01共转化入JW0063-1菌株，得到重组菌。
2、阴性筛选
用LB培养基重悬步骤1得到的重组菌，使其OD600=0.2，加入氨苄青霉素（使其浓度为0.1mg/ml）、氯霉素（使其浓度为0.025mg/ml）和IPTG（使其浓度为0.4mM；实际应用中，0.2-1mM均可），37℃培养10小时(实际应用中8-16小时均可)，用分选型流式细胞分选仪分选荧光最低的细胞。
3、阳性筛选
培养步骤2得到的细胞，然后用LB培养基调整菌液浓度为OD600=0.2，加入氨苄青霉素（使其浓度为0.1mg/ml）、氯霉素（使其浓度为0.025mg/ml）、IPTG（使其浓度为0.4mM；实际应用中，0.2-1mM均可）和四氢嘧啶（使其浓度为20mM；实际应用中10-50mM均可），37℃培养10小时(实际应用中8-16小时均可)，用流式细胞分选仪分选荧光最强的细胞。
反复进行上述阴性和阳性筛选，直至挑选得到的单克隆在四氢嘧啶存在情况下的荧光值比无四氢嘧啶存在时荧光值高，且两者荧光强度之差为2000以上），该单克隆即为含有显著被四氢嘧啶诱导的AraC突变体蛋白的细胞。
四、AraC突变体蛋白的发现
通过上述步骤三，发现一株能够受四氢嘧啶诱导的菌株（BWM菌株），其含有序列表的序列3所示的AraC突变体蛋白，将该蛋白命名为AraCm蛋白。将编码AraCm蛋白的基因命名为araCm基因，如序列表的序列4所示。AraCm蛋白在各个饱和突变位点分别发生了下列突变：P8Y、T24M、H80T、Y82V和H93V。AraCm蛋白受四氢嘧啶诱导并能够激活PBAD启动子启动下游报告基因表达。
AraC突变体蛋白发现过程中野生型AraC的流式细胞仪检测结果见图3（采用5mML-阿拉伯糖）。
实施例3、AraCm蛋白的应用（特异性结合四氢嘧啶并受其诱导开启PBAD启动子表达下游报告基因）
一、质粒pSM03的构建
1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F0和R0组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F0：5`-TATCATATGGCTGAAGCGCAAAATGAT-3`；
R0：5`-TTAACTCGAGTTATGACAACTTGACGGCTACAT-3`。
3、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、以pMAL-p2x载体为模版，用pmal-rev-NdeI和pmal-for-XhoI组成的引物对进行PCR扩增（靶序列为除了几十bp的多克隆位点的整个载体骨架，且在两端添加NdeI和XhoI酶切识别序列），回收PCR扩增产物。纯化后用NdeI和XhoI双酶切并回收片段2
pmal-rev-NdeI（5`-TATCATATGCTATGGTCCTTGTT-3`）；
pmal-for-XhoI（5`-AATCTCGAGGAATTCGGATCCTCTAGA-3`）
5、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切步骤4的PCR扩增产物，回收酶切产物（即约5487bp的pMAL-p2x载体骨架）。
6、将步骤3的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到质粒pSM03。根据测序结果，对质粒pSM03进行结构描述如下：在pMAL-p2x载体的多克隆位点区域取代为了序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示的DNA分子。
二、AraCm蛋白的应用
1、将质粒pSM01导入JW0063-1菌株，得到重组菌甲。
2、将质粒pSM03导入重组菌甲，得到重组菌乙。
3、用LB培养基重悬重组菌乙，使其OD600=0.2，加入氨苄青霉素（使其浓度为0.1mg/ml）、氯霉素（使其浓度为0.025mg/ml）、IPTG（使其浓度为0.5mM；实际应用中，0.2-1mM均可）和四氢嘧啶（使其浓度为0、25、50、100、200或300mM），37℃培养10小时（实际应用中，8-15小时均可），各组取200ul用酶标仪测其OD600和GFPuv荧光值(激发光波长为395nm,发射光波长为509nm)，并将GFPuv荧光值除以OD600数值。
结果见图4。随着四氢嘧啶浓度的升高，荧光值显著增加。
三、对照试验
将质粒pSM02代替质粒pSM03进行步骤二的实验。结果表明，各个四氢嘧啶浓度下，荧光信号基本一致，GFPuv荧光值除以OD600数值为2500-3500。
上述实施例3表明，采用质粒pSM01、质粒pSM03和JW0063-1菌株可以检测菌株胞内中是否含有四氢嘧啶，如果含有四氢嘧啶则GFPuv荧光值显著高于不含有四氢嘧啶的对照样品，该功能可以用于筛选生产四氢嘧啶的菌株，即将菌株的发酵液作为待测溶液进行检测。

Claims (10)

1.序列表的序列3所示的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是序列表的序列4所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入pMAL-p2x载体的多克隆位点得到的重组质粒。
6.一种试剂盒，包括质粒甲和质粒乙；
所述质粒甲为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒；
所述质粒乙为在表达载体的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组质粒；所述特异DNA片段为序列表中序列5。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括宿主菌；所示宿主菌为敲除大肠杆菌基因组中的araC基因得到的工程菌。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述宿主菌为JW0063-1菌株。
9.权利要求1所述蛋白、权利要求4或5所述重组表达载体、或权利要求6、7或8所述试剂盒的应用，为如下(a)或(b)或(c)：
(a)鉴定四氢嘧啶；
(b)检测四氢嘧啶的含量；
(c)筛选生产四氢嘧啶的菌株。
10.一种筛选受四氢嘧啶特异诱导的AraC突变体蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将AraC突变体文库和辅助质粒共转化宿主菌，得到重组菌；
(2)阴性筛选
将步骤(1)得到的重组菌进行IPTG诱导，分选荧光最低的细胞；
(3)阳性筛选
将步骤(2)得到的细胞进行四氢嘧啶诱导，用流式细胞分选仪分选荧光最强的细胞；
反复进行所述阴性筛选和所述阳性筛选，直至挑选得到的单克隆在有四氢嘧啶存在的情况下荧光蛋白荧光值比无四氢嘧啶存在时荧光蛋白荧光值高，且差值为2000以上，所述单克隆即为含有所述突变体蛋白的细胞；
所述AraC突变体文库为将序列表的序列2所示野生型araC基因进行突变并将突变得到的DNA分子插入表达载体得到的DNA文库；
所述辅助质粒为在表达载体的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组质粒；所述特异DNA片段为序列5；
所述宿主菌为敲除大肠杆菌基因组中的所述野生型araC基因得到的工程菌。
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