CN113528563B - 一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用 - Google Patents

一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器制备方法及其应用。所述可视化生物感应器是在大肠杆菌细胞中表达爆炸物分子降解基因，包括：dntA、orf和dntB，这些基因可以降解2,4‑二硝基甲苯（2,4‑DNT）生成2‑羟基‑5‑甲基苯醌，该物质呈现红色，肉眼可见，并且在420 nm处有最大吸光值。本发明的可视化生物传感器通过降解不同浓度的爆炸物分子，生成不同浓度的降解产物2‑羟基‑5‑甲基苯醌，将爆炸物分子浓度与产生的红色降解产物含量进行偶联，实现了爆炸物分子的可视化检测，该检测操作简单、方便、安全性高。

Description

一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备 方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用。
背景技术
生物传感技术是利用基因工程手段对菌株进行改造，使得该微生物在感应特定化合物或者特定化合物在微生物中的代谢产物后，微生物发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。这种生物传感器主要由感应元件和报告元件两部分构成，其中感应元件可特异性地感应靶标化合物，感应元件是负责基因转录的启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控因子等；而报告元件可在感应元件的作用下产生感应信号，一般常用的报告元件包括各种荧光蛋白和荧光素酶，分别产生各种颜色荧光和自发光等可以被检测的感应信号。这种生物传感技术被广泛应用于特定化合物的检测，其中包括2,4-DNT。2,4-DNT是爆炸物有效成份TNT分解后产生的一种挥发性物质，由于其较高的挥发性能，常被用作检测爆炸物存在的特征化学物质。以色列科学家Shimshon Belkin曾报道一种检测2,4-DNT的大肠杆菌生物传感器，这个生物传感器主要是由爆炸物分子2,4-DNT的感应元件yqjF启动子和GFP报告元件两部分组成，对于2,4-DNT的检测可达到0.01 mg/L（NewBiotechnology, 2020, 59, 65-73），目前处于国际领先水平。然而，无论是依赖荧光蛋白产生的荧光还是依赖荧光素酶的自发光都需要仪器进行信号的采集和处理，依赖荧光蛋白产生荧光时更是需要使用仪器进行特定波长的光激发，无法达到肉眼可以观察到的程度。
洋葱伯克霍尔德氏菌中的dnt操纵子（dntABDEG）表达的蛋白能够降解2,4-DNT，其中DntA与DntB蛋白能够将2,4-DNT降解为一种红色物质2-羟基-5-甲基苯醌，使培养基的颜色变为肉眼可见的红色。因此我们利用这个操纵子中的dntA、dntB两个基因构建一种生物传感器，这种生物传感器可以感应爆炸物分子2,4-DNT，并将其降解为肉眼可见的红色物质。此外，我们还通过启动子串联和优化RBS的方法来提高生物感应器性能，使之能够更高效的实现颜色变化，从而达到可视化检测的目的。
发明内容
为了实现爆炸物分子的可视化检测，本发明提供了一种利用爆炸物分子降解途径基因合成生物感应器的制备方法及其在爆炸物分子可视化检测中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）克隆爆炸物分子降解基因，纯化回收后，与pACYCDuet-1质粒同时双酶切，然后将质粒酶切片段与爆炸物分子降解基因片段以2:1的质量比进行连接，连接产物转化感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-dntAB；
（2）扩增启动子yqjF基因片段，纯化回收后，酶切启动子yqjF基因片段和重组质粒p-dntAB，然后将质粒酶切片段与启动子yqjF基因片段以25:1的质量比进行连接，连接产物转化感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-yqjF-dntAB；
（3）对重组质粒p-yqjF-dntAB的RBS进行预测优化，得到RBS优化序列插入到重组质粒p-yqjF-dntAB上，得到重组质粒p-yqjF-RBS-dntAB；
（4）将所述重组质粒p-yqjF-dntAB或重组质粒p-yqjF-RBS-dntAB分别转化感受态细胞，筛选到的阳性克隆，得到工程菌株；
（5）将所述工程菌株于含抗生素的LB液体培养基活化，再转接至M9培养基中培养，得到可视化生物感应器。
进一步的，所述爆炸物分子降解基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其来源于伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia，包括dntA基因、orf基因、dntB基因。
进一步的，所述启动子yqjF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其来源于大肠杆菌Escherichia coli。
进一步的，所述RBS优化序列为RBS1和RBS2，其核苷酸序列如下：
RBS1：GTTTGCCCAGGGAAGTAGTTAAGAAAGGAGGTCTTTTT；
RBS2：AAGGTATGAGCTTATGCGCC。
进一步的，所述优化方法包括以下步骤：
（1）利用PCR克隆重组质粒p-yqjF-dntAB，使p-yqjF-dntAB质粒线性化，扩增启动子yqjF基因，再利用平末端连接的方式连接p-yqjF-dntAB质粒片段和启动子yqjF基因片段，从而使两个yqjF启动子串联在一起，得到重组质粒p-yqjF-yqjF-dntAB；
（2）选择两种较高强度的RBS1和RBS2序列，分别设计引物，将RBS1和RBS2序列分别插入到p-yqjF-yqjF-dntAB质粒上，得到重组质粒p-yqjF-yqjF-RBS1-dntAB和p-yqjF-yqjF-RBS2-dntAB。
进一步的，所述步骤（5）中将工程菌株于含氯霉素的LB液体培养基中，过夜培养活化，再转接至M9培养基中培养至OD600为0.2，得到可视化生物感应器。
进一步的，所述利用启动子串联方法能够加强爆炸物分子降解基因dntAB的启动。
进一步的，所述RBS优化能够增强核糖体的结合效率，从而增强爆炸物分子降解基因dntAB的翻译过程，更快的降解2,4-DNT，产生颜色物质。
本发明还提供了所述的利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法中制备得到的可视化生物感应器。
本发明还提供了所述的可视化生物感应器在用于爆炸物分子的可视化检测中的应用。
进一步的，所述可视化生物感应器的使用方法为：将可视化生物感应器培养活化后，加入待测样品后进行共培养，肉眼观察培养液颜色，红色越明显则待测样品中爆炸物分子的浓度越高。
进一步的，所述可视化检测使用白色酶标板进行。
进一步的，所述爆炸物分子为2,4-DNT。
进一步的，所述生物感应器能够感应不同浓度的爆炸物分子，从而产生不同程度的颜色反应，根据2,4-DNT降解后产生的2-羟基-5-甲基苯醌，该物质表现为肉眼可见的红色，肉眼观察颜色的变化达到可视化检测爆炸物分子的目的。
进一步的，所述生物感应器能够将爆炸物分子浓度与爆炸物分子降解后产生的2-羟基-5-甲基苯醌的量进行偶联。
本发明还提供了所述的可视化生物感应器在用于制备提高爆炸物分子检测可视度的生物制剂中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、本发明将含有爆炸物分子降解基因的报告质粒作为基础质粒，通过连接启动子yqjF，得到重组质粒后，再利用启动子串联和优化RBS的方法对重组质粒进行改良，得到了一种能够感应爆炸物分子的生物感应器，该生物感应器能够响应不同浓度的爆炸物分子，降解产生不同浓度的2-羟基-5-甲基苯醌代谢物（该物质为红色），进而只需通过肉眼观察红色的强烈程度即可达到检测爆炸物分子的目的，无需仪器进行信号检测，使用方便、简单。
2、本发明将爆炸物分子降解基因与感应特定化合物的感应元件进行连接，构建的可降解爆炸物分子产生红色降解物的生物传感器，获得可视化生物感应系统，可以实现对爆炸物的可视化检测，且该检测方法可直接通过肉眼观察结果，方便快捷、在爆炸物检测中安全性高，因此本发明的降解2,4-DNT产生红色降解物的生物感应器具有很大的应用前景。
附图说明
图1为构建的载体p-dntAB的质粒图谱。
图2为构建的载体p-yqjF-dntAB的质粒图谱。
图3为构建的载体p-yqjF-yqjF-dntAB的质粒图谱。
图4为构建的载体p-yqjF-yqjF-RBS-dntAB的质粒图谱。
图5为 E.coli (p-yqjF-dntAB)重组菌株在白色酶标板中的检测结果。
图6为串联启动子方法优化的E.coli (p-yqjF-yqjF-dntAB)重组菌株在白色酶标板中的检测结果。
图7为优化RBS1的E.coli (p-yqjF-yqjF-RBS1-dntAB)重组菌株在白色酶标板中的检测结果。
图8为优化RBS2的E.coli (p-yqjF-yqjF-RBS2-dntAB)重组菌株在白色酶标板中的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。
实施例1：基因的获得和载体的构建
1、基因的获得
将一种来源于伯克霍尔德氏菌R34（Burkholderia cepacia）的dntAB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括dntA基因、orf基因、dntB基因，由华大基因公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-dntAB载体。
将yqjF启动子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，由华大基因公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-yqjF载体。
2、p-dntAB表达载体的构建
以pUC-dntAB为模版，引物dntAB-F和引物dntAB-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增dntAB片段，其PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
PCR程序为：95ºC 3 min；30循环 ×（95ºC 15 s，58ºC 15 s，72ºC 4 min）；72ºC 5min；16ºC ∞。引物序列如下所示：
dntAB-F：
5’-GAATTCATGGAACTGGTAGTAGAACCCC-3’（SEQ ID NO.3）；
dntAB-R：
5’-GCGGCCGCTTAGGCAGCTACGACCGATG-3’ （SEQ ID NO.4）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。
利用限制性内切酶1 EcoRІ（TaKaRa，货号1611）和限制性内切酶2 Not I（TaKaRa，货号1615）双酶切pACYCDuet-1质粒和dntAB扩增片段，其酶切体系为：
质粒或PCR产物 3 μg
10 ×Q.Cut Buffer 10 μL
限制性内切酶1 5 μL
限制性内切酶2 5 μL
超纯水 补至100 μL
酶切体系置于37 ºC孵育1h，进行胶回收纯化。
利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：
质粒酶切片段 100 ng
PCR产物酶切片段 50 ng
10 × T4 DNA Ligase Buffer 2 μL
T4 DNA Ligase 0.5 μL
超纯水 补至20 μL
连接体系置于22 ºC孵育 90 min。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34 mg/L氯霉素的LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p-dntAB（图1），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
3、p-yqjF-dntAB表达载体的构建
以pUC-yqjF为模版，引物yqjF-F和引物yqjF-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增yqjF片段，其PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
PCR程序为：95ºC 3 min；30循环×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 30 s）；72ºC 5min；16ºC ∞。引物序列如下所示：
yqjF-F：
5’-ACAGCCAGGATCCGAATTCCGGTTTTGGCGTATGGAGCGCCTGG-3’（SEQ ID NO.5）；
yqjF-R：
5’-CTACCAGTTCCATGAATTCGCCACTCAGGCTGCTGATTGTTT-3’ （SEQ ID NO.6）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。
利用限制性内切酶EcoRІ（TaKaRa，货号1611）酶切p-dntAB质粒，其酶切体系为：
质粒 3 μg
10 ×Q.Cut Buffer 10 μL
限制性内切酶 5 μL
超纯水 补至50 μL
酶切体系置于37 ºC孵育1h，进行胶回收纯化。
利用无缝克隆将yqjF片段克隆p-dntAB质粒上，其体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
连接体系置于50 ºC孵育30 min。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34mg/L卡那霉素的LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p-yqjF-dntAB（图2），再通过测序进行鉴定。
实施例2：生物感应器的构建
将p-yqjF-dntAB重组质粒转化Escherichia coli BW25113 感受态细胞（购买自Weidi Biotechnology，货号DL2050），涂布到含34 mg/L氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有载体p-yqjF-dntAB的工程菌株。
实施例3：生物传感器性能的优化
串联yqjF启动子：以pUC-yqjF为模版，引物yqjF-2F和引物yqjF-2R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增yqjF片段，其PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002AA
PCR程序为：95ºC 3 min；30循环×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 30 s）；72ºC 5min；16ºC ∞。引物序列如下所示：
yqjF-2F：
5’-CGGTTTTGGCGTATGGAGCGCCT-3’（SEQ ID NO.7）；
yqjF-2R：
5’-GCCACTCAGGCTGCTGATTGTT-3’ （SEQ ID NO.8）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。
以p-yqjF-dntAB为模版，引物yqjF-dntAB-F和引物yqjF-dntAB-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增p-yqjF-dntAB载体片段，使载体线性化，其PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAA
PCR程序为：95ºC 3 min；30循环×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 30 s）；72ºC 8min；16ºC ∞。引物序列如下所示：
yqjF-dntAB-F：
5’-GAATTCATGGAACTGGTAGTAG-3’（SEQ ID NO.9）；
yqjF-dntAB-R：
5’-GCCACTCAGGCTGCTGATTGTTTT-3’ （SEQ ID NO.10）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。
利用DNA连接酶进行平末端连接，连接体系如下所示：
质粒片段 100 ng
PCR产物片段 50 ng
10 × T4 DNA Ligase Buffer 2 μL
T4 DNA Ligase 0.5 μL
50% PEG 4000 solution 2 μL
超纯水 补至20 μL
连接体系置于22 ºC孵育 90 min。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34 mg/L氯霉素的LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p-yqjF-yqjF-dntAB（图3），再通过测序进行鉴定。
优化RBS区域：选择两种较高强度的RBS1和RBS2序列，其核苷酸序列如下：RBS1：GTTTGCCCAGGGAAGTAGTTAAGAAAGGAGGTCTTTTT（SEQ ID NO.11）；RBS2：AAGGTATGAGCTTATGCGCC（SEQ ID NO.12）。
华大基因公司化学合成yqjF-yqjF-RBS至pMV载体上，获得pMV-yqjF-yqjF-RBS1和pMV-yqjF-yqjF-RBS2载体。以pMV-yqjF-yqjF-RBS1为模版，引物yqjF-RBS1-F和引物yqjF-RBS1-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增yqjF-yqjF-RBS1片段，PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAA
PCR程序为：95ºC 3 min；30循环×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 30 s）；72ºC 5min；16ºC ∞。引物序列如下所示：
yqjF-RBS1-F：
5’-ACAGCCAGGATCCGAATTCCGGTTTTGGCGTATGGAGCGCCTGG-3’（SEQ ID NO.13）；
yqjF-RBS1-R：
5’-ACTACCAGTTCCATGAATTCAAAAAGACCTCCTTTCTTAAC-3’ （SEQ ID NO.14）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。
利用限制性内切酶EcoRІ（TaKaRa，货号1611）酶切p-dntAB质粒，其酶切体系为：
质粒 3 μg
10 ×Q.Cut Buffer 10 μL
限制性内切酶 5 μL
超纯水 补至50 μL
酶切体系置于37 ºC孵育1h，进行胶回收纯化。
利用无缝克隆将yqjF-yqjF-RBS1片段克隆p-dntAB质粒上，其体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE005A
连接体系置于50 ºC孵育30 min。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34mg/L卡那霉素的LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pMV-yqjF- yqjF-RBS1（图4），再通过测序进行鉴定。
以pMV-yqjF-yqjF-RBS2为模版，引物yqjF-RBS2-F和引物yqjF-RBS2-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增yqjF-yqjF-RBS2片段，PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002_5A
PCR程序为：95ºC 3 min；30循环×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 30 s）；72ºC 5min；16ºC ∞。引物序列如下所示：
yqjF-RBS1-F：
5’-ACAGCCAGGATCCGAATTCCGGTTTTGGCGTATGGAGCGCCTGG-3’（SEQ ID NO.13）；
yqjF-RBS2-R：
5’-CTACCAGTTCCATGAATTCGGCGCATAAGCTCATACCTTGC-3’ （SEQ ID NO.15）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。
利用限制性内切酶EcoRІ（TaKaRa，货号1611）酶切p-dntAB质粒，其酶切体系为：
质粒 3 μg
10 ×Q.Cut Buffer 10 μL
限制性内切酶 5 μL
超纯水 补至50 μL
酶切体系置于37 ºC孵育1h，进行胶回收纯化。
利用无缝克隆将yqjF-yqjF-RBS2片段克隆p-dntAB质粒上，其体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE005AA
连接体系置于50 ºC孵育30 min。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34mg/L卡那霉素的LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pMV-yqjF- yqjF-RBS2（图4），再通过测序进行鉴定。
实施例4：可视化检测爆炸物分子的应用
白色酶标板检测：挑取实施例2获得的工程大肠杆菌和实施例3获得的优化的工程大肠杆菌单菌落于10 mL含有34 mg/L氯霉素的LB液体培养基中，于37ºC摇床过夜培养活化，再转接至100 mL M9培养基中，培养至OD600为0.2，分别转移至96孔白色酶标板的孔中，每孔200 μL中，分别设置不加2,4-DNT的对照组，加入终浓度为25 mg/L、50 mg/L的2,4-DNT两个实验组，每组3个平行，于37℃震荡培养，按照不同培养时间分别拍照。
结果如图5表明，在利用p-yqjF-dntAB质粒构建的生物传感器检测时，加入2,4-DNT的瓶/管中培养液比不加2,4-DNT的对照组红色更明显，而且2,4-DNT浓度越高，红色越明显；图6-8显示在p-yqjF-dntAB质粒构建的生物传感器基础上进行优化的生物传感器比未优化的生物传感器能够更高效的产生红色代谢物。其中，以优化RBS2的E.coli (p-yqjF-yqjF-RBS2-dntAB)重组菌株构建的爆炸物分子生物感应器产生的红色代谢物可视化最为明显（图8）。说明本发明构建并且进行启动子串联和RBS优化的工程菌株作为一种感应爆炸物分子的生物传感器，能够更高效的感应DNT而产生肉眼可见的红色代谢物，而且DNT浓度越高，红色越明显，结果表明这种降解2,4-DNT产生颜色反应的生物传感器检测爆炸物分子的效果非常显著。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7026
<212> DNA
<213> 基因(dntAB)
<400> 1
atggaactgg tagtagaacc cctcaatttg catctgaacg cggagaccgg cagcaccctg 60
cttgacgtgc tcaggtccaa cgaggtcccc atttcttata gctgcatgtc gggccgctgc 120
ggcacttgcc gttgccgtgt gattgccggc catcttcgcg ataacggccc cgagacaggg 180
cgcccgcagg caggaaaggg ggcctatgtc ctggcctgtc aggcggttct gaccgaagac 240
tgcacgatcg agattcctga atctgacgag atcgtggttc acccggcgcg catcgtcaag 300
gggacggtca cagcgataga cgaagccacc catgacatcc ggcgcctgcg catcaaactg 360
gccaaaccgc ttgagttcag ccctggccag tacgcaacgg tgcagttcac gcccgaatgc 420
gtccgcccct attcgatggc cgggctgcct agcgatgcgg aaatggagtt tcagattcgc 480
gcggttccgg gcgggcatgt cagcaactac gttttcaatg aactgtccgt aggcgcttcg 540
gtgcggatca gcggccccct cggaacggcc tatctgcggc gcacgcacac cggccccatg 600
ctttgtgtgg ggggtggaac aggtctggcg cccgtccttt cgatcgttcg aggcgcactg 660
gaaagcggga tgagcaaccc catccatctg tacttcggtg tgcggagcga gcaggacatc 720
tatgacgagg aacgccttca cgcattggct gcaaggtttc cgaatctcaa ggtgaatgtc 780
gttgttgcaa caggccctgc cggccctggt catcgatccg gcctggtcac cgatctgatc 840
ggccgtgact tgcccaattt ggcgggatgg cgcgcctacc tgtgtggcgc tccggccatg 900
gtcgaggccc tgaacctgct cgttgctcgc ctaggcatag tacccgggca catccatgcc 960
gatgcgttct atcccagcgg cgtctgagcg aaggcaccat gcgaacccaa ttcaacccaa 1020
ggataccaag ccatgagtga accccaacga ttaaaacccg tgtttcccca agatccgaaa 1080
tggccgggcg aaggtagcag ccgcgttccc ttctgggcct acacccgcga agacctgtac 1140
aagcgcgaat tggagcgcct gttctatgca aaccactggt gctatgtagg cctggaagcc 1200
gagattccga atccaggcga cttcaagcga acggtgatcg gtgagcgctc ggtcatcatg 1260
gtgcgtgatc cggatggcgg catcaacgtg gtggagaacg tctgcgccca ccgtggcatg 1320
cgcttttgcc gcgagcgcca cggcaacgcc aaggacttct tctgccccta ccaccagtgg 1380
aactacagcc tcaagggtga cctgcagggc gtgcccttcc gccgtggcgt caagcaggac 1440
ggcaaggtca acggcggcat gcccaaggac ttcaaactcg aagaacacgg cctgaccaag 1500
ctcaaggtgg ccgcccgagg cggtgcagtg tttgcctctt tcgaccacga tgtcgagcct 1560
ttcgaggact tcctgggccc aaccatcctg cactacttcg atcgcgtctt caatggccgc 1620
aagctcaaga tcctgggcta ccgccgccag cgcatcccgg gcaactggaa gctgatgcag 1680
gagaacatca aggaccccta ccacccgggc ctgctgcaca cctggttctc gaccttcggg 1740
ctctggcgcg ccgacaacaa gtcggaactg aagatggacg ccaagttccg ccacgccgca 1800
atgatctcca cgcgcggtca gggcggcaag aacgaggagg tcgtgtccgg cgtggacagc 1860
ttcaaggaac agatgaaggt gaacgacccg cgcctgctcg acatcgtgcc gagccctggt 1920
ggggcggtcc gactgcggtg atgaccacga tcttccccag cgtgatcatc cagcagcagg 1980
tcaacagcgt atcgacccgc cacatccagc ccaacggtca cggctccttc gatttcgtct 2040
ggacccactt cggcttcgag gacgacaacg aggagtggac ccagcgccgc ctgatccagg 2100
ccaacctgtt cgggccggcg ggcttcgtgt cggccgatga cggcgaggtg atcgagtggt 2160
cgcaggaagg ctttgagcaa aaaccgacgc accgcaccgt gatcgagatg ggcggtcacg 2220
aaatcggcga cacggaccac atggtcaccg agacgctgat ccgcggcatg tacgactact 2280
ggcgcaaggt gatgggggaa taaacatggt cgacttcaaa acctatttcg aactgctgaa 2340
cctgtacagc gactacgcca tggtgtgcga ctccgccaat tgggagaagt ggcctgattt 2400
cttcatcgag accggcacct accgcctgca accgcgcgaa aacttcgagc aggacttgcc 2460
gctgtgtctg ctggcgctgg agagcaaggc catgattcgt gaccgagtgt acggtgtcaa 2520
ggaaaccatg taccacgatc cctactacca gcgccacatc gtaggcacgc cgcgcgtgct 2580
gtcagtggag cgtgatgcgg acggcgagcg catcaccgcc gaagccagct atgccgtgat 2640
tcgcaccaag tacgacggcg attccacgat tttcaacgcc ggctattacc gagacgtgat 2700
cgtgcgcacg cccgagggcc tcaagctgaa gtcgcgcctg tgcgtgtacg acagcgaaat 2760
gattcccaac tccatcatct accctatctg agaaggaatc caatgagcga gaactggatc 2820
gacgccgccg cccgcgacga ggtgcccgag ggcgacgtga tcggcatcaa tatcgtcggc 2880
aaggagattg ccctctacga ggtggcgggc gagatctacg ccaccgacaa cacctgcact 2940
cacggcgccg cccgcatgag cgatggcttt ctcgaaggcc gggaaattga atgtcctttg 3000
catcaaggcc gattcgatgt ttgcacgggt aaagccttgt gcacacccct gacacaggac 3060
atcaaaacct accccgtaaa aatcgaaaac atgcgcgtga tgctcaagct ggactaaatg 3120
ctcaagctgg actaaaactc tttgcaggag gaaagccaaa tccggaaatc accccatcac 3180
tacccgtttt caaacaagat gagacaagca attatgagtt accaaaactt agtgagtgaa 3240
gcagggctga cgcaaaagca cctgatttat ggcgacaaag aacttttcca gcacgaattg 3300
aagaccatct tcgcgcggaa ctggcttttt ctgacccatg acagtctgat tccctccccc 3360
ggcgactatg tcaaagccaa aatgggcgtc gatgaagtca tcgtctcccg ccagaacgat 3420
ggctcggtgc gagccttttt gaatgtttgc cgtcaccggg gcaagacaat agttgacgct 3480
gaagccggaa atgcgaaagg ctttgtgtgc ggttaccacg gctggggcta tggctccaac 3540
ggcgaactgc aaagcgttcc ctttgaaaaa gagttgtacg gagatgcgat caaaaagaaa 3600
tgcctgggct tgaaagaagt cccccgcatc gaaagctttc atggctttat ctatggctgt 3660
tttgatgcag aagctccccc gctcatcgat tatctgggtg atgcagcctg gtacctggaa 3720
cccaccttca agcactctgg tggcctggaa cttgtaggcc cccccggcaa agtggtggtt 3780
aaggccaact ggaagcctct tgcggaaaac tttgtaggtg acgtctacca cattggttgg 3840
acgcacgcat ctattttgcg cgcagggcag tcgatatttg ctcctcttgc gggcaacgct 3900
atgtttccac ccgaaggcgc gggcttgcaa atgaccacca agtatggcag tggaattggc 3960
gtattgtggg acgcctactc cggtatccag agcgctgata tggttcccga aatgatggca 4020
ttcggcggcg caaaacagga aaagctcgcc aaagaaatcg gcgatgtccg ggcgcggatt 4080
taccgcagcc aactgaacgg cacggttttc ccgaacaaca gctttttgac ctgctccggt 4140
gtcttcaagg tctttaaccc gatcgatgaa aacacgaccg aggtttggac gtatgccatc 4200
gtagaaaaag acatgcctga ggacttaaag cgtcgcttgg ctgacgcggt tcagcgcagt 4260
gtcggaccag caggatactg ggaaagcgac gacaacgaca acatggggac gttgtcgcaa 4320
aatgccaaga aataccaatc cagcaacagt gatctgattg ccgatttggg tttcggcaag 4380
gacgtctacg gcgacgaatg ctatccgggc gtcgttggca aatcggcaat cagcgaaacc 4440
agctatcgcg gattctaccg tgcctaccag gctcacatca gcagctccaa ttgggccgag 4500
ttcgaaaaca cctcccgaaa ttggcacacc gaactcacca agacgactga tcgctaatcc 4560
aggagccaat catgatgatc aatacccagg aagacaagct ggtctccgcg cacgacgccg 4620
aagaatttca ccgtttcttc gtcgggcacg acagcgatct gcagcaagaa gtcaccacac 4680
tcctgacccg cgaagcgcac ctgctggaca ttcaggccta caaagcctgg cttgaacact 4740
gcgttgcccc cgagatcaaa taccaagtga tctcgcgaga acttcgctcc acttccgagc 4800
gtcgatacca actgaatgat gcggtgaata tctacaacga gaactatcaa cagctgaaag 4860
ttcgagttga acaccagatg gatcctcaga actggtacaa cagcccgaag atccgcttca 4920
cccgcttcgt caccaatgtc acggcggcca aggacaagag cgcaccggaa atgctgcatg 4980
tgcggtccaa cctcattctc catcgcgcca gacgaggaaa ccaagttgac gtcttctatg 5040
caacgcgaga agacaaatgg aaacgcatcg aaggtggtgg catcaaattg gtcgaacgct 5100
ttgtggacta cccggagcgc agtccccaaa cccacaacct gataatcttc ctgtgagccc 5160
tggggatgcc tgcctcccaa cgagacggca cgattttgca aagcggagtg ttctttcttg 5220
atatccatgg gcaacctccc gagggaagaa tcgacactag ccgataggcc agttgatgcg 5280
agcctcgctc ccaaggcgtt gattgaggcg tctgcatcta acttaatgga aaaggaataa 5340
accgtgcatc acgtttctac taagtcgccg tctaccttgt cggcggagtg tgaagttctc 5400
atcgtcgggg gtagcttggt cggcttgtcg cttgcaaact ttctcggcca ccacggcgta 5460
agcgctgcag tcgtcgagcg gcacaaggga acggccatcc accctcgtgc tggccacttt 5520
cacctgagga ccattgaagc atttcgatat gcaggaatcg agccagaagt catgcaggag 5580
tctcttcgac agttcgatcc ggacggcggt atcaacgtcg tcgaatcgct tgccggcaag 5640
gagatcgcca gcctgattgg caacttgaac gaaggcgtcg aaaaactcag tccaagtaag 5700
cgcctgttca tgacacaaca aagtctcgaa cccttgctta gaaagaacgc tgaaaagctg 5760
ggggcccaac ttaactacca gatggaattg gtttcattcg agcaggacgc cacgggtgtg 5820
actgcgcgag tcaggtacat cccatccggg gccgtgagcc aagtgcgtgc caagtaccta 5880
atcgccgccg acggtaaccg cagcccagtc cgagagaagc tcggaattga aatgcgcggc 5940
tacggattac tctccaacag tatcaccatc tacttcaagg cggactgcac aaaatggatg 6000
gctggacgca acctcggcgt ggtctatgtc aacaatcctg acgttcgcgg cttcttccgc 6060
ttgacgcggg aggccaagag tggcttcttg ggtgtgaaca ccgtaggaga tgtcagccgc 6120
ccggaggcga acaatgtcgc tgaaggtatc acggcagagc gctgcgtcga aattgtacgt 6180
tccgctgtgg gcattcccga tctggaagtt gaaattgagg gcattgcccc gtggcgcgcc 6240
gttgccgatg tggctgaccg ttacagaagt ggaaatgtgt ttctcatcgg cgacgccgca 6300
cacgtcgttc ctcctaccgg cggattcggc gggaacactg gtgttcagga cgcgcacaac 6360
cttggttgga agctggcttc agtactaaag ggtcaagcag ggccggctct gctcgacacc 6420
tacgaggagg agcggcgccc ggtcggtcaa cttacgatcg agcaggccta ttcccgatat 6480
gtgctgcgga tcgcacctga actgggccgt gaaacgatga agcctgtggt cgacgacttg 6540
agcatggaaa ttggctaccg ctatttctca tcagccatct tgtcgaacga aaagcgggga 6600
gatcgtgttt acgttgatcc gcgcacgtcg ttcagcttgc ctgggaccag agtgggacac 6660
ctcgtctttc agcgagacgg gaaatcgatg gcgaccctgg acgtttgtgc cggtggtatg 6720
acccttcttg ccggagcggg cggcgtcgcc tggtgtcagt cgacgactga agctgccgta 6780
aagctgggta tcgaggtcga gtcgaacgtc attggaaacg cgggtggact gacagatgtt 6840
tcaggtcgcg cgctcgaggt tctcggaatc gaaagcgcag gtgcaattct ggtgcgcccc 6900
gacggtttcg tggcttggcg ctcagaaccc ggtgaggccg cgagtgtcgc gaggatgatc 6960
aacgtgctga ccgctgtaat gtgtctccag agtcagcgcg tagatgcatc ggtcgtagct 7020
gcctaa 7026
<210> 2
<211> 240
<212> DNA
<213> 启动子基因(yqjF)
<400> 2
cggttttggc gtatggagcg cctggcatct ggttaaaacg actctcaagc agcaacagct 60
ccgcggttag cttccctctg gccggagcca ttccggcctt atccctcaaa ttttttggag 120
atctttgtca attttccttg ctaacaatca tcattcacca catttatgat tctctccatc 180
gacaacaacg acgccaatac cgcgcctttg cacaaaaaaa caatcagcag cctgagtggc 240
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaattcatgg aactggtagt agaacccc 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggccgctt aggcagctac gaccgatg 28
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acagccagga tccgaattcc ggttttggcg tatggagcgc ctgg 44
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctaccagttc catgaattcg ccactcaggc tgctgattgt tt 42
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggttttggc gtatggagcg cct 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccactcagg ctgctgattg tt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaattcatgg aactggtagt ag 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccactcagg ctgctgattg tttt 24
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acagccagga tccgaattcc ggttttggcg tatggagcgc ctgg 44
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
actaccagtt ccatgaattc aaaaagacct cctttcttaa c 41
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctaccagttc catgaattcg gcgcataagc tcataccttg c 41
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtttgcccag ggaagtagtt aagaaaggag gtcttttt 38
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaggtatgag cttatgcgcc 20

Claims (6)

1.一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）克隆爆炸物分子降解基因，纯化回收后，与pACYCDuet-1质粒同时双酶切，然后将质粒酶切片段与爆炸物分子降解基因片段以2:1的质量比进行连接，连接产物转化感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-dntAB；
（2）扩增启动子yqjF基因片段，纯化回收后，酶切启动子yqjF基因片段和重组质粒p-dntAB，然后将质粒酶切片段与启动子yqjF基因片段以25:1的质量比进行连接，连接产物转化感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-yqjF-dntAB；
（3）利用PCR克隆重组质粒p-yqjF-dntAB，使p-yqjF-dntAB质粒线性化，扩增启动子yqjF基因，再利用平末端连接的方式连接p-yqjF-dntAB质粒片段和启动子yqjF基因片段，从而使两个yqjF启动子串联在一起，得到重组质粒p-yqjF-yqjF-dntAB；针对RBS1和RBS2序列分别设计引物，将RBS1和RBS2序列分别插入到p-yqjF-yqjF-dntAB质粒上，得到重组质粒p-yqjF-yqjF-RBS1-dntAB和p-yqjF-yqjF-RBS2-dntAB；
（4）将所述重组质粒p-yqjF-dntAB或重组质粒p-yqjF-yqjF-RBS1-dntAB或重组质粒p-yqjF-yqjF-RBS2-dntAB 分别转化感受态细胞，筛选到的阳性克隆，得到工程菌株；
（5）将所述工程菌株于含抗生素的LB液体培养基活化，再转接至M9培养基中培养，得到可视化生物感应器；
所述爆炸物分子降解基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其来源于伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia，包括dntA基因、orf基因、dntB基因；
所述启动子yqjF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其来源于大肠杆菌Escherichia coli；
所述RBS1、RBS2的核苷酸序列分别如下：
RBS1：GTTTGCCCAGGGAAGTAGTTAAGAAAGGAGGTCTTTTT；
RBS2：AAGGTATGAGCTTATGCGCC。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中将工程菌株于含氯霉素的LB液体培养基中，过夜培养活化，再转接至M9培养基中培养至OD600为0.2，得到可视化生物感应器。
3.权利要求1或2所述的利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法中制备得到的可视化生物感应器。
4.权利要求3所述的可视化生物感应器在用于爆炸物分子的可视化检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述可视化生物感应器的使用方法为：将可视化生物感应器培养活化后，加入待测样品后进行共培养，肉眼观察培养液颜色，红色越明显则待测样品中爆炸物分子的浓度越高。
6.权利要求3所述的可视化生物感应器在用于制备提高爆炸物分子检测可视度的生物制剂中的应用。
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