KR101670330B1

KR101670330B1 - 비브리오 피셔리 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101670330B1
Application number: KR1020140153713A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 이문종; 이상희; 조성진
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2016-10-31
Also published as: WO2016072653A1; KR20160054295A

Abstract

본 발명은 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 DNA 앱타머는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 표면에 높은 특이도로 결합할 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머를 사용하면 표본 시료내에서 비브리오 피셔리 생균의 존재 여부를 검출 및 확인할 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머에 항균물질이 접합된 DNA 앱타머-항균물질 복합체를 사용하면 비브리오 피셔리 균의 생장을 억제할 수 있으며, 이 균에 의해 형성되는 바이오필름도 효과적으로 저해할 수 있다.

Description

비브리오 피셔리 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA Aptamer Specifically Binding to Surface of Living Cell of Vibrio fischeri and Uses Thereof}

본 발명은 비브리오 피셔리 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.

비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)는 비브리오(Vibrio) 속 중에서 심해 오징어의 발광기관에 붙어 생장하는 균주로 통성 혐기성 그람 음성 간균이며 운동성이 있고 하나 이상의 편모가 있는 특징을 갖는 균이다. 비브리오 피셔리는 해양 생태계에서 서식하는 다양한 균주 중 하나이며 생존력을 증가하기 위한 전략으로 바이오필름을 형성하는데 이는 여러 스트레스에 대한 저항성이 비형성군에 비해 현저히 증가되어 생존전략에 있어서 필수적인 단계라고 인식되고 있다. 하지만 바이오필름이 형성되면 유영상태일 때에 비해 비브리오 피셔리에 대한 치료제 및 항생제의 내성이 약 500배가 증가하게 되는 문제가 발생한다. 따라서 바이오필름 형성은 생물체의 생존전략의 수단으로 자연스런 현상일지라도 경제 산업적으로 많은 악영향을 낳는다. 바이오필름의 형성은 대표적으로 임플란트 시술에서 발생하는 부작용 원인의 80％를 차지하는 것으로 밝혀져 있다.

종래의 바이오필름의 생성을 제어하는 방법은 항생제나 방오제에 의한 세균사멸에 기초하여 시도되었으나, 내성이 증가된 균주에 대한 항생제의 무분별한 사용은 항생제 내성 균주로의 변이를 유발할 수 있어 그 사용이 매우 제한적이다. 또한, 방오제는 타 생물체에 독성을 나타내는 비선택적 생물독소이므로 방오제의 사용은 환경 생태계에 큰 피해를 안길 뿐만 아니라 이를 회복하기 위한 경제적인 피해도 심각하다. 방오제의 위해성은 1970년대 이후 선박이나 양식어업에 가장 많이 사용된 화학 방오물질인 TBT (tributyl tin)가 각종 해양생물의 암컷에 수컷 생식기가 발생하는 것과 같은 성변이 현상을 유발하는 것을 확인하면서 해양환경을 심각하게 위협하는 환경 호르몬인 것으로 지목되었다. TBT는 1 ppt 이하의 농도에서도 성변이를 유발할 수 있으며, 남해안에서도 TBT 오염에 의한 성변이 현상이 지속적으로 발견되고 있다. 이에 따라 선진국에서는 1982년부터 대형선박에 방오제로서 사용되는 TBT 농도를 규제하였고 연안을 운항하는 소형선박에는 사용을 금지시켜 왔다. 국내에서는 2005년부터 TBT 규제가 시작되었으며, 대체 물질로는 황산구리 등의 물질이 사용되고 있지만 이 또한 오염물질로 지목되어 TBT와 같은 방오제의 대체물질 개발이 필요한 상황이다.

앱타머는 짧은 길이의 올리고머로 구성되어 자체적인 다양한 삼차원 구조를 형성하게 되는데 이 올리고머 구조체 라이브러리들은 다양한 표적물질들과 구조적으로 결합할 수 있는 능력이 있으며 이 중 표적물질에만 특이적인 앱타머를 선별하는 과정을 거쳐 확보하게 된다. 선별된 앱타머는 서열분석을 통해 서열을 획득하고 화학적 합성 기법을 이용하여 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며 한번 제작, 생산 후 동일한 능력을 가지는 앱타머를 지속적으로 생산 가능한 탁월한 장점을 갖고 있다. 뿐만 아니라, DNA로 구성되어 있고 부가적인 화학적 치환 과정을 거쳐 보다 안정성을 부여할 수 있어 주변의 pH와 온도에 매우 안정하며 바이오틴과 같은 화합물을 부착시켜 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서 활용될 수 있어 그 가능성이 높이 평가되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

한국공개특허 제10-2014-0002362호 한국공개특허 제10-2012-0133408호 한국공개특허 제10-2013-0015645호

본 발명자들은 생균 상태의 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)균에 특이적으로 결합함으로써 이 균의 검출과 성장 억제 등 다양한 용도로 사용될 수 있는 DNA 앱타머(aptamer)를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 비브리오 피셔리의 생균 표면에 높은 특이도로 결합할 수 있는 DNA 앱타머를 합성 및 선별하는데 성공하였으며, 이 DNA 앱타머를 이용하여 시료 중에서 비브리오 피셔리를 쉽게 검출할 수 있는 래피드 키트 플랫폼을 개발하였고, 비브리오 피셔리의 생장을 억제하여 비브리오 피셔리가 생성하는 바이오필름을 효율적으로 차단할 수 있는 가능성을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출용 조성물 및 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 13의 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 13 서열 중 어느 하나 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 DNA 앱타머는 이의 5' 말단 또는 3' 말단이 화학적으로 변형, 개질 또는 표지물질로 결합되어 있으며, 바람직하게는 바이오틴(biotin), 아민기, 티올기, Cy3, Cy5, 플루오레세인(fulorescein), 또는 방사성 물질이 결합된 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태이다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 마이크로 어레이 형태이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출 방법을 제공한다: (a) 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 확인하는 단계.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 상기 DNA 앱타머; 및 (ⅱ) 상기 DNA 앱타머에 링커(linker)를 통해 접합된 항균물질을 포함하는 앱타머-항균물질 복합체를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 앱타머-항균물질 복합체를 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)의 생장을 억제하는 방법을 제공한다.

이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

비브리오 피셔리( Vibrio fischeri ) 생균 표면에 결합하는 DNA 앱타머

본 발명은 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 표면에 높은 특이도로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 “DNA 앱타머(aptamer)”는 특정 타겟 분자에 고친화성 및 특이성을 갖고 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 상기 용어 “DNA 앱타머”는 “DNA 올리고뉴클레오타이드”와 실질적으로 동등한 의미로서 혼용하여 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에 형광물질과 같은 표지(label) 물질이 결합될 수 있으며, 안정성 향상을 위해 화학적으로 변형 또는 개질될 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머에는 예를 들어 바이오틴(biotin), 아민기, 티올기, 방사성 물질, Cy3, Cy5, 플루오레세인과 같은 형광물질이 5′말단 또는 3′말단에 결합 또는 도입될 수 있다. 또한, DNA 앱타머의 안정성과 효율성 향상을 위해 뉴클레오타이드의 당(sugar) 2번 탄소에 위치한 수소를 불소원자(-F), 아미노기(-NH₂), 또는 메톡시기(-OCH₃)로 치환할 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 표적 분자가 될 수 있다.

앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본 명세서에서 용어 “SELEX 방법”이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566). DNA 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973(1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726(1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610(1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665(1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.

한편, 본 발명의 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 DNA 앱타머는 특정 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.

본 발명의 DNA 앱타머는 비브리오 피셔리 생균 표면에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열번호 1 내지 13에 개시된 염기서열 중 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

Live Cell SELEX 기법을 통한 비브리오 피셔리 생균 표면 결합 DNA 앱타머의 선별

본 발명의 비브리오 피셔리 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 Cell-SELEX 방법에 의해 선별된다.

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 DNA 앱타머는 다음의 단계를 통해 선별된다: (ⅰ) PCR(Polymerase Chain Reaction) 기법을 통해 DNA 앱타머를 증폭하고, ssDNA 앱타머를 제작하는 단계; (ⅱ) 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)를 배양하고 세척하는 단계; (ⅲ) 비브리오 피셔리 생균을 이용한 Live Cell SELEX 기법을 통해 비브리오 피셔리 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계.

(ⅰ) PCR 방법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, ssDNA 앱타머를 제작하는 단계:

먼저, PCR을 이용하여 랜덤 dsDNA 라이브러리를 증폭한다. 증폭된 랜던 dsDNA 라이브러리에서 ssDNA 만을 증폭하기 위해 비대칭 PCR을 수행한다. 비대칭 PCR은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 10 : 1의 비율, 예를 들면, 동일한 농도(25 μM)에서 정방향 프라이머를 10 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕를 사용하여 PCR을 수행함으로써 ssDNA를 수득하는 방법이다. ssDNA 앱타머를 선별하는 방법은 예를 들면, PCR 수행시 역방향 프라이머에 바이오틴(biotin)을 부착시켜 dsDNA를 증폭하고, 증폭 산물에 스트렙트아비딘을 처리하여 바이오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성하여 복합체를 선택적으로 제거함으로써 ssDNA 앱타머만을 선별할 수 있게 된다. 제조한 ssDNA 앱타머는 SELEX 방법에 사용하기 위해 ssDNA를 가열하여 변성시킨 후 상온에서 천천히 식혀 3차원 구조를 형성시킨다.

(ⅱ) 비브리오 피셔리를 배양하고 세척하는 단계:

비브리오 피셔리의 생균 표면에 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위해, 비브리오 피셔리를 배양한다. 생균 상태를 유지하기 위해 비브리오 피셔리는 예컨대 LBS 배지 [트립톤 1％ (w/v), 효모 추출물 0.5％ (w/v), NaCl 2％ (w/v), 한천 1.5％ (w/v) 및 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)]에서 배양할 수 있다.

(ⅲ) 상기 배양한 비브리오 피셔리 생균을 이용하여 Live Cell SELEX 기법을 통해 비브리오 피셔리 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계:

상기 준비한 비브리오 피셔리 생균과 ssDNA 앱타머를 서로 접촉하여 반응시킨 후, 결합하지 않는 ssDNA 앱타머는 세척하여 제거하고 특이적으로 결합하는 ssDNA만을 용출시킨다. 이 단계에서 다른 세균, 예를 들어 그람 음성 균인 대장균과 그람 양성균인 바실러스 균에 결합하는 ssDNA를 제거하는 네가티브 (Negative) SELEX 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서는 비브리오 피셔리 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 최대로 용출되는 최적의 SELEX 라운드를 선별하기 위해, 용출된 ssDNA를 나노-드랍을 이용한 ssDNA 농도를 정량하는 방법을 사용할 수 있다.

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 방법에서 최적 SELEX 라운드 중 비브리오 피셔리와 최적 결합력을 보이는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 최적 SELEX 라운드 선별과 마찬가지로 최적 라운드에서 확보한 앱타머 서열 각각을 모두 확보하여 동일한 농도의 ssDNA로 제작 후 SELEX를 진행한 뒤 나노드랍(Nano-drop)을 이용하여 용리된 앱타머 농도를 나노드랍 방법을 통해 측정함으로서 최적 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머를 선별하였다.

비브리오 피셔리 생균의 표면에 결합하는 앱타머를 이용한 비브리오 피셔리 생균의 검출 방법 및 생장 억제 방법

본 발명은 상기 선별된 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출용 조성물에 관한 것이다.

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 DNA 앱타머는 비브리오 피셔리 생균 표면에 특이적으로 결합하므로, 시료 내에 살아있는 비브리오 피셔리균의 존재 여부를 검출하는데 유용하다.

본 발명은 상기 선별된 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출용 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태일 수 있으며, 또는 DNA 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태일 수 있다. DNA 앱타머를 칩이나 기판상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 칩 또는 기판을 스트렙트아비딘(streptavidin)을 도입하여 개질하고, DNA 앱타머의 5′말단은 바이오티닐화(biotinylation)시킨 후, DNA 앱타머의 바이오틴과 칩 또는 기판상에 도입된 스트렙트아비딘과의 결합을 이용하여 고정화한다.

본 명세서에서 용어 “마이크로 어레이”는 기판의 특정의 영역에 DNA 핵산 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “마이크로어레이의 기판”은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기판에 결합될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어, 바이오티닐화 (biotinylated)될 수 있고, 이는 스트랩트아비딘이 코팅된 기판상에 성공적으로 결합될 수 있다. 기판 상에 고정화된 본 발명의 DNA 앱타머는 비브리오 피셔리 생균과 결합하여 이를 포획할 수 있으며, 이와 같이 포획된 비브리오 피셔리 생균은 다시 비브리오 피셔리 생균과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 포획 유무를 시각화 할 수 있다.

본 발명의 키트는 시료 중의 비브리오 피셔리 생균 검출에 사용하기 위한 설명서 또는 표지(label) 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 설명된 DNA 앱타머를 접촉시키고, 상기 DNA 앱타머와 결합된 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 확인하는 단계를 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명의 DNA 앱타머는 비브리오 피셔리 생균의 표면에 특이적으로 결합하므로 DNA 앱타머를 비브리오 피셔리 생균을 함유할 것으로 예상되는 시료를 접촉시켜 상기 비브리오 피셔리 생균을 검출하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 상기 DNA 앱타머에 결합된 비브리오 피셔리의 검출은 DNA 앱타머와 비브리오 피셔리 결합 복합체를 검출하는 방법에 기초하여 행할 수 있다. 상기 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 DNA 앱타머가 형광물질, 예를 들어 플루오레세인(fulorescein), Cy3 또는 Cy5; 방사성물질, 또는 화학물질, 예를 들어 바이오틴(biotin)으로 표지되거나 1차 아민(primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

본 발명은 (i) 상기 설명된 DNA 앱타머; 및 (ⅱ) 상기 DNA 앱타머에 링커(linker)를 통해 접합된 항균물질을 포함하는 DNA 앱타머-항균물질 복합체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머-항균물질 복합체를 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 접촉시켜 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)의 생장을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 DNA 앱타머에 항균물질을 접합시켜 DNA 앱타머-항균물질 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 접촉시키면, 상기 복합체와 비브리오 피셔리 균간의 접촉 회수가 증가하여 비브리오 피셔리의 생장을 효과적으로 억제할 수 있다.

본 발명에서 DNA 앱타머와 항균물질간의 접합(conjugate)은 당업계에 공지된 적합한 방법을 통해 행할 수 있으며, 바람직하게는 링커(linker)를 통해 접합을 행할 수 있다. 상기 링커는 예를 들어 SPDP ((N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate)), S-Hynic (succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide), S-4FB (N-succinimidyl-4-formylbenzamide)를 단독 또는 2이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 결합하고자 하는 항균물질이 단백질인 경우 단백질의 N-말단과 DNA 앱타머 3′-말단 또는 5′-말단의 아민기, 바이오틴기 등의 다양한 변형을 이용하여 항균물질과 DNA 앱타머를 접합할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항균제는 비브리오 피셔리 균에 대해 항균활성을 나타내는 물질을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 무기화합물 유래 무기계 항균제, 유기화합물 유래 유기계 항균제, 나노실버(nano-silver), 나노촉매(nano-catalyst), 바이오세라믹스(bioceramics), 이온 방출(ion emitters) 효과를 갖는 금속염, 천연 항균물질, 프로폴리스, 락토페린, 라이소자임, 키토산 등의 동물유래 항균물질 및 나이신, 폴리라이신 등의 미생물 유래 항균물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 이점 및 효과를 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 DNA 앱타머는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 표면에 높은 특이도로 결합할 수 있다.

(ⅱ) 본 발명의 DNA 앱타머를 사용하면 표본 시료내에서 비브리오 피셔리 생균의 존재 여부를 검출 및 확인할 수 있다.

(ⅲ) 본 발명의 DNA 앱타머에 항균물질이 접합된 DNA 앱타머-항균물질 복합체를 사용하면 비브리오 피셔리 균의 생장을 억제할 수 있으며, 이 균에 의해 형성되는 바이오필름도 효과적으로 저해할 수 있다.

도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과와 PCR로만 증폭한 결과를 나타낸다. 레인 1: 100bp DNA size 마커; 레인 2: DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과; 레인 3: PCR 기법으로 증폭한 후, 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 이용하여 ssDNA만을 회수한 결과이다.
도 2는 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머의 제작을 위한 SELEX 과정 전체 10개 라운드 중 각 라운드에서 회수된 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머군의 용리 액의 농도를 나노-드랍을 이용하여 정량적으로 측정한 결과이다.
도 3은 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정 후 선별된 라운드에서 확보한 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머 후보군들 각각에 대한 1차(패널 (a)), 2차(패널 (b)) 용리액을 나노-드랍을 이용하여 정량적으로 측정한 결과이다.
도 4는 m-fold 프로그램을 이용하여 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머 VFCA-03의 예상 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머를 스트렙트아비딘이 코팅된 센서 칩(Sensor chip) SA의 표면에 고정시키고 비브리오 피셔리 생균을 결합시키는 과정을 나타낸 도면이다.
도 6은 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머를 스트렙트아비딘이 코팅된 센서 칩(Sensor chip) SA (GE healthcare, USA)의 표면에 고정시키고 비브리오 피셔리 이외의 균인 쉬겔라 소네이, 리스테리아 모노사이토제네스, 대장균, 비브리오 파라해모라이티쿠스를 흘려서 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머의 특이성을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머를 이용하여 시료 상에 비브리오의 존재 여부를 시각적으로 빠른 시간 내에 확인하기 위하여 만든 래피드 키트 (Rapid kit)의 모식도이다. 골드 나노 입자 (Gold Nano Particle)에 DNA 앱타머를 부착시킨 후에 샘플 패드에 시료를 흘려주게 되면 시료 속의 비브리오 피셔리와 DNA 앱타머가 결합하게 되고 테스트라인의 다른 앱타머와 비브리오 피셔리가 고정되면서 라인이 나타나게 된다. 이를 통해 시료 상의 비브리오 피셔리의 존재 여부를 확인할 수 있다.
도 8은 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머를 항균물질인 락토페린과 결합시킨 후, 균 배양액에 락토페린과 DNA 앱타머가 결합된 락토페린-앱타머 결합체를 첨가하였을 때 표적 균주와 락토페린 간의 접촉 기회가 늘어날 수 있다는 것을 보여주는 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.

실시예

실시예 1 : DNA 앱타머 풀의 준비

1-1. 프라이머(primer) 및 DNA 앱타머 풀의 합성

비브리오 피셔리(Vibrio fisheri) 균에 특이적으로 결합하는 비브리오 피셔리 표면결합 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 양 말단에 앱타머 풀을 쉽게 증폭하기 위한 부위로서 5`-ATACCAGCTTATTCAATT의 부위와 AGATAGTAAGTGCAATCT-3`를 구성하고 중심부에는 40개의 연속 랜덤 뉴클레오타이드를 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1의 비율로 가지는 서열[5′-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3′(서열번호 14)]과 이 DNA 라이브러리를 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 단일 가닥 DNA를 회수하기 위해 바이오티닐화된 역방향 프라이머를 바이오니아(Bioneer, Korea)에 주문하여 제작하였다 [정방향 프라이머 : 5′-ATACCAGCTTATTCAATT-3′(서열번호 15), 바이오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머 : 5′-바이오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3′(서열번호 16)].

1-2. PCR 기법을 활용한 DNA 앱타머 풀의 증폭

합성한 프라이머 및 40개의 연속 랜덤 서열을 가지는 임의의 DNA 라이브러리를 PCR (Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭하였다. 76 bp의 DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성으로는 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물(mixture) 4㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, 주형 DNA 라이브러리 1 - 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (TaKaRa, Japan) 0.3㎕ (1 unit/㎕)와 증류수 34.7 - 35.7 ㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기를 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후에 3 ㎕를 취하여, 2％ 아가로스 젤을 이용하여 정확한 크기인 76 bp에서 밴드가 나타나는지 확인하였다. 확인된 DNA는 PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 DNA 앱타머 풀을 회수하였다.

1-3. DNA 앱타머 풀의 ssDNA 제작 및 정제

상기한 바와 같이 5′말단에 바이오티닐화된 dsDNA 앱타머 풀을 ssDNA 앱타머 풀로 제작하기 위하여 5′말단에 바이오티닐화된 dsDNA 앱타머 풀 200 ㎕를 85℃에서 5분간 끓인 후에 얼음에 신속히 냉각시켰다. 이후에 스트렙트아비딘 아가로스 레진 (Streptavidin agarose resin)을 dsDNA 앱타머 풀의 1/2배인 100 ㎕를 넣고 상온에서 스트렙트아비딘과 1시간 이상 반응을 유도하였다. 이후에, 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 침전시킴으로써 스트렙트아비딘과 바이오틴 결합을 통해 바이오티닐화된 dsDNA 앱타머 풀 중 한쪽 서열을 제거하여 ssDNA 앱타머 풀을 제작하였다. 이후 순수한 ssDNA 앱타머 풀을 확보하기 위하여 상층 200 ㎕를 새 튜브에 옮겼다. 통상적으로 본 업계에서 사용하는 PCI 처리 및 에탄올 침전법을 활용하였다. 본 방법은 옮긴 ssDNA 앱타머 풀에 동량의 PCI 200 ㎕를 처리하고 교반하여 ssDNA에 잔류하는 지질과 단백질을 제거한 후에 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 15분간 수행한 후에 상층 200 ㎕를 새 튜브에 옮겨 페놀을 제거하였다. 이 후에 에탄올을 DNA양의 3배인 600 ㎕를 넣고 3M 소듐 아세테이트(Sodium Acetate)를 1/10 배인 20 ㎕ 그리고 1 - 2㎕의 tRNA를 첨가한 후에 -70℃의 초저온 냉동고(Deep freezer)에 1시간 이상 반응시켰다. 그 후에 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 20분간 수행하여 DNA를 침전시키고 상층을 제거한 후에 85℃ 히팅블록(Heat block)에서 건조시킨 후 증류수 100㎕를 첨가하여 ssDNA 앱타머 풀을 확보하였다.

1-4. ssDNA 앱타머 풀 확인을 위한 PAGE

스트렙트아비딘과 바이오틴 결합을 통해 회수된 ssDNA 앱타머 풀을 0.5X TBE 아크릴아마이드 젤 (Acrylamide gel) 상에서 전기영동하여 확인하였다. 0.5X TBE (Tris-borate-EDTA) 아크릴아마이드 젤의 조성으로는 40％ 아크릴아마이드 3.75 ml, 10X TBE 완충액 0.75 ml을 넣고 증류수로 15 ml을 채운 후에 10％ APS (Ammonium per sulfate) 용액 135 ㎕, TEMED (Tetramethylethylenediamine) 10.5 ㎕로 구성하였다. 아크릴아마이드 젤에 ssDNA 앱타머 풀 10㎕와 DNA 로딩 다이(loading dye) 2 ㎕를 섞어 넣었고 래더 마커(Ladder marker)로는 100bp DNA 마커를 사용하였다. 제작한 PAGE (Poly-acrylamide Gel Electrophoresis)용 ssDNA 앱타머 풀 확인용 아크릴아마이드 젤을 파워서플라이 (Major science, USA) 150 V(volt)에 45분간 전기영동하였다. 전기영동한 아크릴아마이드 젤은 ETBR 용액에 5분간 염색한 후에 Gel-doc (Bio-rad, USA)으로 자외선을 조사하여 관찰하였다(도 1 참고).

1-5. DNA 앱타머의 3차원 구조 형성

상기 실시예 1-4에서 PAGE로 확인한, ssDNA 앱타머의 풀은 자체 3차원의 구조를 형성하기 위하여 기 제작 확보한 ssDNA 앱타머 풀 100 ㎕와 동량의 2X LBS 배지 100㎕를 첨가한 후 85℃로 예열된 히팅 블록(Heat block)에서 5분간 가열하여 ssDNA 앱타머 풀의 변성을 유도하였다. 변성된 ssDNA는 상온에서 2시간 이상 서서히 식혀 자체 3차원 구조 형성을 유도하였다.

실시예 2 : 비브리오 피셔리( Vibrio fischeri ) 생균 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 생균(Live-cell)의 준비

2-1. 비브리오 피셔리의 준비 및 배양

비브리오 피셔리 생균 결합 DNA 앱타머를 제작하기 위하여, 비브리오 피셔리는 배양을 통해 확보하였다. 배양 배지로는 LBS (10 mM Tris-HCl내의 1％ 트립톤, 0.5％ 효모 추출물 및 2％ NaCl)를 사용하였으며, 37℃ 교반배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 또한, 생균 자체에만 결합하도록 배양시 형성되는 타 물질의 제거를 위하여 Tris base 10 mmol/L, NaCl 0.85％, pH 8.0 조성의 세척용액을 사용하여 배양된 비브리오 피셔리를 세척하였다. 세척방법은 먼저 배양된 비브리오 피셔리를 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 비브리오 피셔리를 침전시키고 상층액을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200 ㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 비브리오 피셔리의 표면을 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 비브리오 피셔리를 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 비브리오 피셔리 표면을 세척하였다.

2-2. 네가티브 선별(Negative selection) 진행 및 결합력 비교를 위한 타세균 배양 및 확보

비브리오 피셔리에 특이적으로 결합하는 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군 중에 다른 균주에도 결합하는 비특이적인 앱타머 후보군을 제거하기 위하여 대장균 및 바실러스 서브틸리스를 이용한 네가티브 선별(negative selection)을 수행하였다. 또한, SPR측정에서 비브리오 피셔리에 대한 DNA 앱타머의 결합력을 비교하기 위해 배양된 타 균주들을 사용한 결합력 측정을 행하였다.

2-2-1. 대장균( Escherichia coli )의 배양 및 확보

네가티브 선별(Negative selection) 대상 균주인 대장균의 배양배지로는 LB broth를 사용하였다. LB broth 5 ml에 균을 접종하여 37℃에서 12시간동안 배양하였다. 그 후에 배양된 대장균을 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200 ㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 대장균의 표면을 세척하고 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기 과정을 3회 반복하여 대장균 표면을 세척하였다.

2-2-2. 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis )의 배양 및 확보

네가티브 선별(Negative selection) 대상 균주인 바실러스 서브틸리스의 배양배지로는 LB broth를 사용하였다. LB broth 5 ml에 바실러스 서브틸리스를 접종하여 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 그 후에 배양된 바실러스 서브틸리스를 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200 ㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 바실러스 서브틸리스의 표면을 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 바실러스 서브틸리스 표면을 세척하였다.

2-2-3. 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes )의 배양 및 확보

SPR 측정시 앱타머의 비특이성을 측정하기 위한 균주인 리스테리아 모노사이토제네스의 배양배지로는 NA broth를 사용하였다. NA broth 5 ml에 리스테리아 모노사이토제네스를 접종하여 37℃에서 12시간동안 배양하였다. 그 후에 배양된 리스테리아 모노사이토제네스를 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 리스테리아 모노사이토제네스의 표면을 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 리스테리아 모노사이토제네스 표면을 세척하였다.

2-2-4. 비브리오 파라해모라이티쿠스( Vibrio parahaemolyticus )의 배양 및 확보

SPR 측정시 앱타머의 비특이성을 확인하기 위한 균주인 비브리오 파라해모라이티쿠스의 배양배지로는 3％ NaCl을 포함한 NA broth를 사용하였다. 3％ NaCl을 포함한 NA 브로쓰(broth) 5 ml에 비브리오 파라해모라이티쿠스를 접종하여 37℃에서 14시간동안 배양하였다. 그 후에 배양된 비브리오 파라해모라이티쿠스를 원심분리(4℃, 13,000 rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 그 후에 세척 용액 200 ㎕를 첨가하여 파이펫팅을 통해 비브리오 파라해모라이티쿠스의 표면을 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000 rpm)를 10분간 수행하여 침전시키고 상층을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 비브리오 파라해모라이티쿠스 표면을 세척하였다.

실시예 3 : 비브리오 피셔리와 특이적으로 결합하는 비브리오 피셔리 표면 결합 앱타머의 제작

3-1. 비브리오 피셔리 생균에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 선별 및 확보

상기 실시예 1과 2에서 설명된 방법을 통해 확보한 비브리오 피셔리 생균을 세척한 후에, 자체 3차원 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 풀 200 ㎕에 넣고 Thermo mixer (Eppendorf, USA) 4℃, 500rpm으로 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 튜브를 꺼내 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행함으로서 ssDNA 앱타머 풀이 결합되어 있는 비브리오 피셔리를 침전시키고 상층액을 제거하였다. 비브리오 피셔리 생균 결합 DNA 앱타머는 비브리오 피셔리의 무게에 의해 침전되고, 결합되지 않은 ssDNA 앱타머들은 상층에 남아 제거하였다.

침전된 비브리오 피셔리와 비브리오 피셔리 생균 결합 DNA 앱타머 후보군 중 비브리오 피셔리와 결합하지 않은 ssDNA 앱타머 풀을 제거하기 위하여 세척용액 200 ㎕를 첨가하여 파이펫팅한 후에 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 비브리오 피셔리를 침전시키고 상층액을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복하여 비브리오 피셔리에 비특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 풀을 제거하였다. 이 후에 침전물에 10 mM Tris(pH 7.5), 1 mM EDTA로 구성된 DNA 앱타머 용출 용액 100 ㎕를 첨가하였다. 그 후에 85℃로 예열된 히팅 블록(Heat block)에 5분간 반응시킨 후 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 비브리오 피셔리를 침전시키고 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머가 용리된 상층액은 새로운 튜브에 옮겨 비브리오 피셔리에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군을 회수하였다. 상기의 과정을 2회 반복하여 DNA 앱타머 풀 각 100 ㎕를 회수하였다.

3-2. 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 네가티브 선별

제 6 라운드의 선별과정 후에 비특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 네가티브 선별을 수행하였다. 상기 실시예 1과 2에서 설명된 방법을 통해 대장균 및 바실러스 서브틸리스 생균을 확보하고 먼저 대장균에 자체 3차원 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 풀 200 ㎕를 넣고 Thermo mixer (Eppendorf, USA) 4℃, 500rpm으로 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 튜브를 꺼내 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행함으로서 비특이적인 ssDNA 앱타머 풀이 결합되어 있는 대장균을 침전시키고 상층액을 획득하였다. 획득한 상층액은 준비된 바실러스 서브틸리스에 넣고 Thermo mixer (Eppendorf, USA) 4℃, 500rpm으로 1시간 동안 반응시켰다. 표적 균주가 아닌 대장균과 바실러스 서브틸리스에 결합된 앱타머는 상층액을 회수하는 과정에서 제거되었다.

3-3. 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 정제 및 용리 농도 측정

비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머 풀에 잔류하는 단백질과 지질을 제거하고 DNA만을 회수하기 위하여 업계에서 통상적으로 사용되는 PCI 처리법 및 에탄올 침전법을 사용하였다. 회수한 각 DNA 앱타머 풀 10 0㎕에 PCI 용액 100 ㎕를 각각 처리하여 섞어주었다. 이 후 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 15분간 수행한 뒤에 상층액 100 ㎕를 새로운 튜브에 옮겼다. 이후에 에탄올(100％ Ethanol) 300 ㎕를 넣고 3M 소듐아세테이트(sodium acetate) 10 ㎕ 그리고 1 ㎕의 tRNA를 첨가한 후에 -70℃의 초저온 냉동고(Deep freezer)에 1시간 이상 반응하였다. 그 후에 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 20분간 수행하여 DNA를 침전시키고 상층을 제거한 후에 85℃ 히팅 블록(Heat block)에서 건조시킨 후 증류수 50 ㎕를 각각 첨가하여 용출된 DNA 앱타머 풀을 확보하였다. 확보한 DNA 앱타머 풀 1 ㎕를 나노-드랍(Nano-drop)에서 측정하여 DNA 농도를 확인하였다.

실시예 4 : 비브리오 피셔리와 최적 결합력을 보이는 DNA 앱타머 후보군의 선별

4-1. 각 라운드(round) DNA 앱타머 풀의 선별 및 확보

상기 기술한 방법을 이용하여 각 라운드(round)의 용리 DNA 앱타머 풀을 이용하여 ssDNA를 제작한 후에 확보한 각 라운드(round)의 ssDNA 앱타머 풀 50 ㎕를 상기 기술한 방법과 동일한 방식으로 제작한 비브리오 피셔리의 침전물에 넣고 Thermo mixer (Eppendorf, USA) 4℃, 500 rpm으로 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 튜브를 꺼내 원심분리 (4℃, 13,000 rpm)를 10분간 수행하여 구조 형성 ssDNA 앱타머 풀이 결합되어 있는 비브리오 피셔리를 침전시키고 상층을 제거한 후에 세척용액 200 ㎕를 넣어 파이펫팅한 후에 원심분리 (4℃, 13,000 rpm)를 10분간 수행하여 상층을 제거하여 세척하는 과정을 3회 수행하고 용출용액 100 ㎕를 넣어 85℃에서 5분간 가열한 후에 원심분리 (4℃, 13,000 rpm)를 10분간 수행하여 각 라운드(round)의 용출된 DNA 앱타머를 확보하였다.

4-2. 나노-드랍(Nano-drop)을 이용한 각 라운드(round) 용리 DNA 앱타머 풀의 분석

각 라운드(round)의 DNA 앱타머 풀에 잔류하는 단백질과 지질을 제거하고 DNA만을 회수하기 위하여 당업계에서 통상적으로 사용하는 PCI 처리법 및 에탄올 침전법을 사용하여 정제하였다. 확보한 각 라운드의 DNA 앱타머 풀 1㎕를 나노-드랍(Nano-drop)으로 측정하여 DNA 농도를 확인하여 네가티브 선별(Negative selection)이 끝난 후, 가장 농도가 높은 라운드인 8 라운드의 앱타머 후보군을 선별하였다(도 2 참고).

실시예 5 : 선별된 라운드(round)에서 비브리오 피셔리에 특이적으로 결합하는 비브리오 피셔리 표면결합 DNA 앱타머 후보군 분석

5-1. DNA 앱타머 후보군 확보를 위한 T-벡터 클로닝(T-vector cloning) 수행 및 선별

선별된 8 라운드에 대한 DNA 앱타머 후보군 확보를 위하여 8 라운드 DNA 앱타머 풀의 증폭을 위한 반응 조성으로는 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물(mixture) 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 역방향 프라이머 2㎕, 주형 DNA 라이브러리 1-2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (TaKaRa, Japan) 0.3㎕ (1unit/㎕)와 증류수 34.7-35.7 ㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. 증폭시킨 DNA 앱타머를 T-벡터 클로닝 키트(Solgent, Korea)를 이용하여 T-블런트 벡터 1 ㎕, 6X 클로닝 완충액 1 ㎕, PCR 산물 4 ㎕의 조성으로 25℃에서 10분간 리게이션(ligation)을 실시한 후에 컴피턴트 세포(Competent cell; E. coli DH5α) 100 ㎕에 6 ㎕를 넣고 20분간 얼음 안에서 반응시켰다. 그 후에 열충격법을 이용하여 42℃에서 30초간 반응시켜 형질전환하였고 암피실린(ampicillin, 50 ㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin, 50 ㎍/㎖), X-gal(50 ㎍/㎖), IPTG(5 ㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩하여 배양하였다. 배지에 배양되어 자란 콜로니 중 흰색 콜로니 31개를 선별하여 각각 앰피실린과 카나마이신이 첨가된 LB broth 5 ml에 접종한 후 플라스미드 DNA prep kit (Intron, USA)을 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 확보한 각 콜로니에 대한 플라스미드 DNA는 솔젠트(Solgent, Korea)사에 서열분석을 의뢰하였다.

5-2. Clustal-X를 통한 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군 서열 간의 그룹핑

각 콜로니들에 대한 서열 중에서 클로닝을 통해 삽입된 DNA 앱타머 서열을 확인하고 나열하여 Clustal-X 프로그램을 이용해 분석하였다. 각 서열에 대한 그룹을 형성하여 각 서열간의 서열 유사도를 분석하고 동일 서열 7개를 포함한 6개로 그룹핑된 13개의 서열을 확보하였다(아래 표 1 참고).

그룹	클론명칭	서열(5′→ 3′)	Size (bp)	Identical sequences
그룹-1	VFCA-01	GGTCGTGTGGACTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGTG (서열번호 1)	40	7
	VFCA-02	GGGCATGTGGACTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG (서열번호 2)	40	1
	VFCA-03	GGGCATGTGGGCTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG (서열번호 3)	40	1
	VFCA-04	TGGCATGTGGACTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG (서열번호 4)	40	1
	VFCA-05	GGGCATGTGGACTTGCGGTTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG (서열번호 5)	40	2
	VFCA-06	GGGCGTGTGGACTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG (서열번호 6)	40	1
	VFCA-07	GGGCATGTGGACTTGCGATTTCGGTTGGTGTGGTTGGGG (서열번호 7)	39	1
	VFCA-08	GGGCATGTGGACTTGCGACTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG (서열번호 8)	40	1
그룹-2	VFCA-09	AGACAGCATAGCACTGTAACGATTGGTTTGGTGTGGTTGG (서열번호 9)	40	1
그룹-3	VFCA-10	CCAGAATTGGTGGGTCGACTGCTGGTGTCCTATAAAGGGG (서열번호 10)	40	1
그룹-4	VFCA-11	CGTGGGCGGTAGAGCCAATGCTACTGGAGCGCGTATCCTA (서열번호 11)	40	1
그룹-5	VFCA-12	GTCGGAGAGCCCGGCCGTCTGCTCGTAAGTACTATCATAGC (서열번호 12)	41	1
그룹-6	VFCA-13	GCGGACGGATAGTAAATAGCCCATGTACGCTGCTGGCGTC (서열번호 13)	40	1

실시예 6 : 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화성 평가

6-1. 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 정제

기 확보한 비브리오 피셔리 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 정제를 위하여 상기의 PCI 처리법 및 에탄올 침전법을 이용하여 정제된 순수 비브리오 피셔리 특이 결합 DNA 앱타머 후보군을 확보하였다.

6-2. Nano-drop을 활용한 비브리오 피셔리 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화성 평가

기 확보한 정제된 비브리오 피셔리 특이 결합 DNA 앱타머 후보군들에 대한 친화성을 평가하기 위하여 확보한 각 비브리오 피셔리 특이 결합 DNA 앱타머 후보군 각 1㎕를 Nano-drop으로 측정하여 DNA 농도를 확인해 1차 용리시와 2차 용리시 가장 농도가 높게 측정된 DNA 앱타머 후보군인 2번과 3번 후보군을 선별하였다(도 3 참고).

실시예 7 : 선별된 DNA 앱타머의 예상 구조 모식도 확보

7-1. 각 DNA 앱타머 후보군의 예상 2차 구조 분석

선별한 비브리오 피셔리 특이 결합 DNA 앱타머 중에서 특이성이 가장 높았던 VFCA-03의 예상 구조를 확인하기 위하여 http://mfold.rna.albany.edu/의 M-fold 프로그램을 이용하여 예상 구조를 분석하였다. 구조 분석 조건으로는 DNA 앱타머의 서열을 선형가닥으로 지정하였으며 구조 제작 온도는 상온인 25℃로 지정하였다. 구조에 영향을 줄 수 있는 나트륨의 농도는 배양 배지인 LBS의 농도인 0.3M로 지정하여 예상 구조를 제작하였다(도 4 참고).

실시예 8 : SPR 측정을 위한 DNA 앱타머와 비브리오 피셔리의 준비

8-1. SPR (Surface Plasmon Resonance) 측정을 위한 DNA 앱타머의 준비

실시예 1에 제시된 방법을 이용하되 PCR 시료 중 10 pM 바이오티닐화된 역방향 프라이머와 10 pM 정방향 프라이머 대신 10 pM 바이오티닐화된 정방향 프라이머와 10 pM 역방향 프라이머를 첨가한 시료를 이용하여 PCR을 진행하였다. 이후 과정은 실시예 1에 따라 진행하여 PCR 정제를 수행하였다. 기 확보한 PCR 시료는 ssDNA를 제작하기 위하여 비대칭 PCR을 사용하였다. 비대칭 PCR의 반응 조성으로는 10X PCR 완충용액 10 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 8 ㎕, 10 pM 바이오티닐화된 정방향 프라이머 10 ㎕, 10 pM 역방향 프라이머 1 ㎕, 주형 DNA 라이브러리 10 ㎕, Ex Taq 중합효소 (TaKaRa, Japan) 0.5 ㎕ (1 unit/㎕)와 증류수 60.5 ㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 15주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. 이 후에 통상적으로 당업계에서 사용하는 PCI 처리법 및 에탄올 침전법을 이용하여 순수 DNA 앱타머를 정제 및 확보하였다.

8-2. ssDNA 앱타머의 구조 제작

확보한 ssDNA는 나노-드랍(Nano-drop)에 1 ㎕를 넣고 ssDNA 농도를 측정한 후에 나머지 99 ㎕의 ssDNA 앱타머에 99 ㎕의 2X LBS를 첨가하여 85℃에서 5분간 가열하고 상온에서 1시간 이상 천천히 냉각하였다. 그 후에 DNA의 농도가 25 μM이 되도록 1X LBS에 희석하여 준비하였다.

8-3. SPR (Surface Plasmon Resonance) 측정을 위한 비브리오 피셔리의 준비

SPR 측정을 하기 위하여 실시예 2에 제시된 방법을 근거로 하여 비브리오 피셔리를 배양하였다. 이후 실시예 2에 따라 세척용액을 이용하여 생균 표면을 세척하였다.

실시예 9 : SPR 측정을 통한 최적 DNA 앱타머의 선별

9-1. 센서 칩(Sensor chip) SA에 DNA 앱타머 고정

GE healthcare에서 제공한 프로토콜(protocol)에 제시된 방법에 의하여 금(Gold) 판막 위에 덱스트란(Dextran)으로 고정된 스트렙트아비딘을 활성화하였다. 활성화시킨 센서 칩(Sensor chip) SA의 표면에 DNA 앱타머를 고정시키기 위해 시료의 유속을 10 ㎕/min으로 지정하였다. 센서 칩(Sensor chip) SA의 4개 채널 중에서 1번은 검사용으로 앱타머를 붙이지 않았고, 2, 3, 4번의 채널에만 각각의 선별된 앱타머를 결합시켰다. DNA 앱타머의 결합 조건으로는 유속 10 ㎕/min으로 1분간 접종하는 일련의 과정을 각각 3회 반복 수행하였다. 그 후에 10분간 유속을 10 ㎕/min으로 HBS-EP 완충액(buffer)을 흘려주어 결합된 ssDNA 앱타머가 안정화되도록 하였다.

9-2. 비브리오 피셔리의 결합

준비된 비브리오 피셔리를 배양한 배양액 1 ㎖을 튜브에 옮긴 후 센서 칩(Sensor chip) SA 위에 유속 5 ㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 과정동안 1번 채널과 2, 3, 4 채널의 Sensogram 비교, 분석을 통하여 결합력을 확인하였다. 이 후에 50 mM NaOH를 유속 10 ㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 비브리오 피셔리와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다(도 5 참고). 이 과정에서 최종 VPCA-03를 최적의 비브리오 피셔리 생균 결합 DNA 앱타머로 선별하였다(표 2 참고).

앱타머	표적 미생물	K _D value
VFCA-02	비브리오 피셔리(V. fischeri)	1.79e^-8± 0.97
VFCA-03	비브리오 피셔리(V. fischeri)	1.28e^-8± 1.24

실시예 10 : 최적 비브리오 피셔리 생균 결합 DNA 앱타머의 특이성 평가

10-1. 비브리오 파라해모라이티쿠스의 친화성 측정

비브리오 피셔리와의 결합력 비교를 위하여 비브리오 파라해모라이티쿠스를 배양하였다. 비브리오 파라해모라이티쿠스의 배양은 상기 실시예 2에서 설명된 방법에 따라 행하였다. 그 후에 배양액 1 ㎖을 튜브에 옮긴 후 센서 칩(Sensor chip) SA 위에 유속 5 ㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 후에 50 mM NaOH를 유속 10 ㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 비브리오 파라해모라이티쿠스와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다.

10-2. 리스테리아 모노사이토제네스의 친화성 측정

비브리오 피셔리와의 결합력 비교를 위하여 리스테리아 모노사이토제네스를 배양하였다. 리스테리아 모노사이토제네스의 배양은 상기 실시예 2에 설명된 방법에 따라 행하였다. 그 후에 배양액 1 ㎖을 튜브에 옮긴 후 센서 칩(Sensor chip) SA 위에 유속 5 ㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 후에 50 mM NaOH를 유속 10 ㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 리스테리아 모노사이토제네스와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다.

10-3. 쉬겔라 소네이의 친화성 측정

비브리오 피셔리와의 결합력 비교를 위하여 쉬겔라 소네이를 배양하였다. 쉬겔라 소네이의 배양방법은 상기 실시예 2에 설명된 방법을 따라 행하였다. 그 후에 배양액 1 ㎖을 튜브에 옮긴 후 센서 칩(Sensor chip) SA 위에 유속 5 ㎕/min으로 20 분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 후에 50 mM NaOH를 유속 10 ㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 쉬겔라 소네이와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다.

10-4. 대장균의 친화성 측정

비브리오 피셔리와의 결합력 비교를 위하여 대장균을 배양하였다. 대장균의 배양은 상기 실시예 2에서 설명된 방법에 따라 행하였다. 그 후에 배양액 1 ㎖을 튜브에 옮긴 후 센서 칩(Sensor chip) SA 위에 유속 5 ㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 후에 50 mM NaOH를 유속 10 ㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 대장균과 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다(표 3 참고).

표적 미생물	K _D 값
비브리오 피셔리 (V. fischeri)	1.28e^-8± 2.50
대장균 (E. coli)	4.73e^-8± 0.15
리스테리아 모노사이토제네스 (L. monocytogenes)	1.37e^-5± 1.76
살모넬라 소네이 (S. soneii)	2.17e^-6± 0.59
비브리오 파라해모라이티쿠스 (V. parahaemolyticus)	4.75e^-8± 3.33

실시예 11 : 비브리오 피셔리의 신속한 검출을 위한 래피드 키트 (Rapid kit) 플랫폼 개발

상기의 실시예를 통해 제작, 확보한 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머의 산업적 활용을 위하여 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머를 이용한 검출 방법 및 응용 가능성을 확인하기 위하여 다양한 시료에서의 비브리오 피셔리의 검출 능력을 확인하기 위한 래피드 키트의 플랫폼을 개발하였다. 래피드 키트는 스트렙트아비딘-바이오틴 결합을 이용할 수 있으며, 래피드 키트의 구성에 대한 간략한 모식도를 도 7에 나타내었다. 비브리오 피셔리의 래피드 키트를 이용하여 비브리오 피셔리를 검출하기 위하여 먼저 니트로셀룰로오스 멤브레인에 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머와 스트렙트아비딘을 고정하도록 설계하였다(도 7(a) 참고). 이후 비브리오 피셔리 생균이 포함된 시료를 처리하여 실제로 검출 가능한지 확인하기 위하여, 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머의 5′-말단에 아민기를 치환하고 10 nm 카르복실화된 골드 나노 입자(Carboxylated gold nanoparticles)에 아민결합 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머를 고정하기 위해 NHS/EDC (Amine coupling kit) 완충용액을 넣어 1시간 동안 25℃에 처리한 후, 준비한 아민 결합 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머와의 반응을 유도하여 확인할 수 있다. 본 과정으로 제작된 나노 입자에 고정된 비브리오 피셔리 생균 특이 결합 DNA 앱타머에 비브리오 피셔리가 포함되어있는 시료를 함께 혼합하여 1 시간 동안 25℃에서 처리한 후, 10X 로딩 완충액(loading buffer, 2.5％ Triton X-100, 500 mM Tris-HCl, 10％ Tween 20, 1.5M NaCl)를 1X가 되도록 혼합한 후, 샘플 패드에 로딩하여 처리하였다.

시료 내에 비브리오 피셔리가 존재하는 경우 두 개의 선으로 나타나게 되며(도 7(b) 참고), 존재하지 않을 경우 하나의 선만 나타나도록 하였으며, 제작한 비브리오 피셔리 생균 검출 키트의 능력을 확인하기 위하여 시료를 넣지 않은 경우, 비브리오 피셔리가 존재하지 않는 시료, 비브리오 피셔리가 존재하는 시료를 준비하여 컨트롤 라인과 테스트 라인의 발색 여부를 확인할 수 있다. 상기의 실험을 통하여 제작한 비브리오 피셔리 검출 키트가 정상적으로 만들어진 것을 확인할 수 있게 설계하였다.

실시예 12 : 최적 비브리오 피셔리 생균 결합 DNA 앱타머에 항균물질인 락토페린을 접합시켜 비브리오 피셔리 제어 및 바이오필름 형성 억제능 확인

12-1. 비브리오 피셔리 생균 결합 DNA 앱타머와 락토페린(lactoferrin)와 접합

비브리오 피셔리와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 락토페린을 접합시키기 위하여 아민기가 도입된 DNA 앱타머를 합성하였다. 합성된 DNA 앱타머는 바이오링커(Biolinker)인 SPDP 시약(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate, Thermo scientific사)를 이용하여 양 말단을 활성화한 후 접합시켰다. 제조사(Thermo scientific)에서 제공한 프로토콜에 제시된 방법에 따라 SPDP 접합을 수행하였다. 락토페린의 농도는 10 ㎎/㎖로 고정하여 사용하였으며 표적 균주에 따른 농도 조절이 가능하다.

12-2. 비브리오 피셔리 생균 배양액에 수정된 앱타머 처리

비브리오 피셔리 생균을 실시예 2에 설명된 방법에 따라 배양하였다. 배양된 생균을 다시 3개의 100 ml의 LBS 배지(medium)에 재접종하였으며 아무것도 첨가하지 않은 네가티브 대조군(Negative control), 락토페린 및, 앱타머와 접합시킨 락토페린을 각각 첨가한 실험군을 비교하여 생장 억제를 확인하였다. 배양액들은 30℃ 교반 배양기에서 24시간 동안 계속적으로 배양하고, 이 배양액들은 업계에서 통상적으로 사용하는 브래드포드 분석법을 이용하여 1시간 마다 O.D.(Optical Density)를 측정하여 생장곡선으로 생장 억제 정도를 확인할 수 있다.

12-3. 비브리오 피셔리 생장 억제 및 바이오필름 형성 억제 가능성 확인

상기 실시예 12-2에서 수행하는 실험을 통해, 시간별로 측정된 O.D.를 이용하여 생장곡선을 도출하여 비브리오 피셔리의 생장이 억제되는 것을 확인할 수 있다. 본 실험에서는 앱타머와 접합시킨 락토페린을 첨가한 경우에서 가장 효과적으로 비브리오 피셔리의 생장이 억제되었고, 그 다음은 락토페린, 네가티브 대조군(negative control)의 순으로 측정되었다. 바이오필름의 형성량을 확인하기 위한 방법으로 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용한 염색법을 수행하여 확인할 수 있다. 비브리오 피셔리를 5 ㎖ LBS 배지(medium)에 접종하여 30℃에서 밤새 배양한 후 OD₆₀₀ 값이 0.1이 되도록 희석하여 96 웰-플레이트에 200 ㎕씩 분주하였다. 24 시간 이상 충분히 배양한 후, 상층액을 제거하고 1x PBS를 이용하여 웰을 2-3회 세척하였다. 그 후, 1.0％ 크리스탈 바이올렛 200 ㎕를 이용하여 20분간 염색하면 바이오필름 및 세포 추출물에 염색되었다. 염색된 웰을 1x PBS를 이용하여 2-3회 충분히 세척한 후 건조시켜 웰 표면에 부착된 바이오필름을 제외한 세포 추출물을 제거하였다. 100％ 에탄올 200 ㎕를 이용하여 바이오필름에 염색된 크리스탈 바이올렛을 탈색하여 그 시료를 OD₅₅₀에서 측정하여 염색된 바이오매스를 정량화할 수 있었다. 본 실험에서는 생장억제와 유사하게 앱타머와 접합된 락토페린에서 가장 우수한 바이오필름 억제능을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 13 : 최종 선별된 비브리오 피셔리 표면결합 DNA 앱타머의 바이오필름 형성 억제능의 산업적 활용을 위한 연구

상기의 실시예들을 통해 제작 및 확보한 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머의 바이오필름 형성 억제능의 산업적 활용을 위하여 비브리오 피셔리가 감염된 환경에서의 비브리오 피셔리가 바이오필름 형성을 하는 초기 단계에 비브리오 피셔리 표면 결합 DNA 앱타머가 비브리오 피셔리의 생장을 억제하여 바이오필름을 제어하는 실험을 통하여 바이오필름 형성 억제에 대한 다양한 응용 가능성을 확인하였다. 이를 통해 다양한 시료에서의 활용력을 이용하여 다양한 환경에서의 바이오필름의 제한이 가능할 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> DNA Aptamer Specifically Binding to Surface of Living Cell of Vibrio fischeri and Uses Thereof <130> MP14-0207 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 1 ggtcgtgtgg acttgcgatt tcggtttggt gtggttggtg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 2 gggcatgtgg acttgcgatt tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 3 gggcatgtgg gcttgcgatt tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 4 tggcatgtgg acttgcgatt tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 5 gggcatgtgg acttgcggtt tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 6 gggcgtgtgg acttgcgatt tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 7 gggcatgtgg acttgcgatt tcggttggtg tggttgggg 39 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 8 gggcatgtgg acttgcgact tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 9 agacagcata gcactgtaac gattggtttg gtgtggttgg 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 10 ccagaattgg tgggtcgact gctggtgtcc tataaagggg 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 11 cgtgggcggt agagccaatg ctactggagc gcgtatccta 40 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 12 gtcggagagc ccggccgtct gctcgtaagt actatcatag c 41 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 13 gcggacggat agtaaatagc ccatgtacgc tgctggcgtc 40 <210> 14 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA library for preparing DNA aptamer <400> 14 ataccagctt attcaattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 ataccagctt attcaatt 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 agattgcact tactatct 18

Claims

비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머로서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 3에 개시된 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 5' 말단 또는 3' 말단에 바이오틴(biotin), 아민기, 티올기, Cy3, Cy5, 플루오레세인(fulorescein), 또는 방사성 물질이 결합된 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
상기 제 1 항 또는 제 4 항에 기재된 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출용 조성물.
상기 제 1 항 또는 제 4 항에 기재된 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출용 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 상기 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 상기 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 마이크로 어레이 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
다음의 단계를 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균의 검출 방법:
(a) 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 제 1 항 또는 제 4 항에 기재된 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 확인하는 단계.
(i) 상기 제 1 항 또는 제 4 항에 기재된 DNA 앱타머; 및 (ⅱ) 상기 DNA 앱타머에 링커(linker)를 통해 접합된 항균물질을 포함하는 DNA 앱타머-항균물질 복합체로서, 상기 항균물질은 락토페린인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머-항균물질 복합체.
상기 제 10 항에 기재된 앱타머-항균물질 락토페린 복합체를 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)의 생장을 억제하는 방법.