KR101372362B1

KR101372362B1 - 쉬겔라 소네이의 침입성 플라스미드 항원 ｈ 단백질과 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101372362B1
Application number: KR1020120012803A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 송명섭; 엄현주; 이상희
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-08
Filing date: 2012-02-08
Publication date: 2014-03-12
Also published as: KR20130091485A; WO2013118967A1

Abstract

본 발명은 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 생물학적 시료내에서 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질의 특이적 검출을 통해 쉬겔라 소네이의 존재 여부를 확인할 수 있고, 이를 통해 세균성이질의 진단에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다.

Description

쉬겔라 소네이의 침입성 플라스미드 항원 Ｈ 단백질과 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 앱타머 및 이의 용도{DNA Aptamer Specifically Binding to Invasion Plasmid Antigen H Protein from Shigella sonnei and Its Use}

본 발명은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 IpaH (Invasion Plasmid Antigen H, 침입성 플라스미드 항원 H) 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.

제 1 군 법정전염병에 속하는 수인성 전염병인 세균성이질은 쉬겔라 (Shigella)라고 불리는 이질균에 의해 유발되는 질환으로 인체 내 감염 시 수 일 간의 잠복기를 거쳐 구토, 복통, 발열 및 시간이 경과됨에 따라 점액성의 혈변이 나타나며, 독성이 강한 이질균에 감염 시 신경증상을 동반하여 라이터증후군, 용혈성 요독 증후군, 패혈증과 같은 합병증을 유발함으로써 사망에까지 이르게 하는 심각한 질환이다.

세균성이질은 전형적으로 대변-경구 경로를 통해 전파되지만 10-100 개의 적은 수로도 감염을 일으킬 수 있어 접촉감염도 흔히 발생한다. 세계적으로 매년 약 1억 6500만 명의 세균성이질 환자가 발생하는 것으로 보고되고 있으며 특히, 개발도상국에서는 세균성이질 환자의 69％가 5세 미만의 아이들에게서 발생하는 것으로 알려져 있어 심각한 사회적 문제를 유발하고 있다.

상기한 바와 같이 보건환경적, 사회경제적으로 피해를 초래하는 세균성이질의 주된 원인균인 쉬겔라 균들의 발생 기작은 쉬겔라 균이 인체의 결장의 점막을 침입한 후 점막 상피세포에서 증식해 상피세포를 파괴하여 이질을 일으킨다. 뿐만 아니라 개발도상국에서는 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)가 주로 분리되고, 쉬겔라 디센테리에(Shigella dysenteriae)가 토착적으로 혹은 유행적으로 발생하는 것으로 알려진 반면 선진국에서는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)가 주된 원인균으로 보고되고 있다.

우리나라의 세균성이질은 1998년 이후 발생빈도가 급격히 증가하여 2003년에는 1,117명 이상의 환자가 발생하였다. 1종 법정전염병으로 지정되어 있는 세균성 이질은 최근까지도 해마다 가장 많이 발생하는 전염병 중 하나로 조사되고 있다. 특히, 공식적인 발생건수가 균이 직접 분리된 예만을 집계한 것이므로 10-20％대의 국내 법정 전염병의 신고율을 감안하면 실제 발생 수는 적어도 5배 이상일 것으로 추정되어 그 피해가 매우 심각한 실정이다. 국내 세균성이질의 주된 원인균은 쉬겔라 소네이이며 감염원은 대량급식 혹은 급수로 인한 발생이 가장 일반적이며, 일부 접촉에 의한 발생도 보고되고 있다. 최근 3년 사이에는 발생이 점차적으로 감소하는 하는 양상을 나타내고 있으나, 지구 온난화 및 극심한 기후변화에 따른 각종 병원성 미생물에 의한 보건 환경성 질환 발생 건수 및 인체 감염 및 공공환경으로의 전염속도가 급속히 증가함에 따라 대유행을 일으킬 충분한 잠재력을 가지고 있으므로 이를 미연에 방지하기 위한 대책 마련이 시급한 실정이다.

종래 쉬겔라 소네이의 검출 및 확인을 위한 방법은 배양 기반의 진단방법이 주로 이용되고 있다. 국내에서는 쉬겔라 소네이 환자의 대변이나 직장 채변한 검체를 보건소에 의뢰해 이질균을 분리해내는 방법을 이용해 세균성이질을 진단하고 있다. 그러나 기존의 방법은 검체로부터 원인균을 분리 배양하는 단계를 거쳐야하기 때문에 쉬겔라 소네이를 검출 확인하는데 까지 긴 시간이 소요될 뿐만 아니라 쉬겔라 속의 균체들은 체외에서 24시간 이상 생존할 수 없다는 특징을 가지고 있어 샘플 수집과 실험실로의 수송에 상당한 주의 및 기술을 필요로 하여 정확한 검출이 어려운 실정이다. 특히 쉬겔라 속 균주들의 유전자 구조는 대장균(E. coli)과 매우 유사하여 생화학적 검사만으로는 두 균주의 구별이 매우 어려울 뿐만 아니라, 10-100 마리의 균체만으로도 충분히 병원성을 유발할 수 있는 고위험성 병원균주로 고도의 민감성을 가지는 진단기법의 개발이 필요한 실정이다.

보다 정확한 세균성이질의 진단을 위해서는 쉬겔라 소네이를 더욱 민감하게 검출할 수 있는 새로운 진단 방법의 개발이 절실히 필요한 실정이다. 이에 최근 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 기법을 이용한 진단 방법과 항원항체를 이용한 면역학적 진단방법 등의 검출 방법들이 개발 활용되고 있다. 이와 같은 방법들은 쉬겔라 소네이의 특징적인 병원성 인자를 표적으로 하고 있어 기존의 검체 배양 방법 보다 민감하고 빠르게 특정 원인균을 검출할 수 있다. 쉬겔라 소네이의 검출을 위해 주로 사용되는 주요 병원성 인자로는 IpaH (Invasion plasmid antigen H; 침입성 플라스미드 항원 H), 시가독소 (Shiga toxin), 쉬겔라 장내독소 1 (Shigella enterotoxin 1), 쉬겔라 장내독소 2 (Shigella enterotoxin 2) 등이 알려져 있으며, 특히 ipaH 유전자에 인코딩되어 있는 IpaH 단백질은 쉬겔라 소네이가 숙주의 상피세포 침입 후 발현이 증가하며, 상피세포 외부로 분비되어 숙주의 염증반응을 조절하는 효과인자 (effector)역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 특징은 다른 병원성 인자에 비해 균주 감염시 발생에 높은 특이성을 보이기 때문에 현재 쉬겔라 소네이를 조기 검출하기 위한 다양한 진단 기법에서 활용도가 높아지고 있는 추세이다(박진홍, 외 3명, 2005, Korean J Clin Microbiol 8 172-178).

상기한 PCR 기법 및 면역학적 진단방법을 기반으로 하는 쉬겔라 소네이 검출 방법은 종래 배양 기반의 검출법보다 민감하고 빠르다는 장점을 지니지만 검출 효율을 높이기 위해서는 샘플 내 DNA 추출 과정 및 단백질 추출 과정등의 샘플 전처리 과정과 결과를 분석하기 위한 고가의 분석 장비가 요구되어 현장에서의 적용 범위가 매우 낮다는 단점을 가지고 있다. 따라서 대규모의 시료를 정확하고 빠르며, 간단하게 처리 할 수 있는 고효율의 쉬겔라 소네이 검출 시스템 개발이 절실히 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 종래의 쉬겔라 소네이 검출 기법의 문제점들을 해결하고 보완할 수 있는 분자생물학적 검출방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 쉬겔라 소네이의 IpaH (Invasion plasmid antigen H; 침입성 플라스미드 항원 H)에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머(aptamer)를 개발하고 이 DNA 앱타머가 쉬겔라 소네이균의 IpaH 단백질에 매우 높은 특이도로 결합할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 쉬겔라 소네이의 IpaH에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이의 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용한 쉬겔라 소네이의 검출 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 세균성 이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료에서 쉬겔라 소네이의 IpaH 단백질의 존재 여부를 검출하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 IpaH (Invasion plasmid antigen H) 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 19의 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명의 다른 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 19 서열 중 어느 하나 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트는 DNA 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 검출 방법을 제공한다: (a) 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)를 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 설명된 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) IpaH 단백질을 확인하는 단계.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 세균성 이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료에서 쉬겔라 소네이의 IpaH 단백질의 존재 여부를 검출하는 방법으로서, (a) 상기 설명된 DNA 앱타머와 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) IpaH 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

이하에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

쉬겔라 소네이 IpaH 단백질

본 발명은 세균성 이질의 원인균 중에 하나인 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 IpaH (Invasion plasmid antigen H, 침입성 플라스미드 항원 H) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다. IpaH 단백질은 ipaH 유전자에 의해 인코딩된 쉬겔라 속의 주요 병원성 결정인자로서, 병원성 플라스미드 (virulence plasmid)에 존재하며, 일부는 염색체에도 존재한다. 쉬겔라 속의 ipaH 유전자의 발현은 숙주의 상피세포 침입 후 증가하고, 숙주의 상피세포 내로 침입한 쉬겔라는 IpaH 단백질을 분비하며, IpaH 단백질은 숙주의 염증반응을 조절하는 효과인자 역할을 한다.

쉬겔라 소네이 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머

본 명세서에서 용어 “DNA 앱타머(aptamer)”는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 “DNA 앱타머”는 “DNA 올리고뉴클레오타이드”와 혼용하여 사용한다.

본 명세서에서 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열번호 1 내지 19 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 서열번호 1 내지 19 서열의 DNA 앱타머는 본 명세서 도 6a 및 도 6b에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.

본 발명의 DNA 앱타머는 쉬겔라 소네이의 IpaH 단백질에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열번호 1 내지 19 서열 중 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

DNA 앱타머의 선별

본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본 명세서에서 “SELEX 방법”이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

DNA 앱타머를 이용한 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질 검출 및 이를 위한 키트

본 발명의 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 사용하여 쉬겔라 소네이의 IpaH 단백질을 검출할 수 있다. 본 발명에서 IpaH 단백질의 검출은 본 발명의 DNA 앱타머와 IpaH 단백질의 결합 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 결합 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 DNA 앱타머를 형광물질, 예를 들어 플루오레세인 (fulorescein), Cy3 또는 Cy5; 방사성물질, 또는 화학물질, 예를 들어 비오틴 (biotin)으로 표지하거나 1차 아민 (primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 DNA 앱타머에 포함시킬 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어, 비오티닐화 (biotinylated)화될 수 있고, 이는 스트랩타비딘 (streptavidin)이 코팅된 기판상에 성공적으로 고정시킬 수 있다. 기판상에 고정화된 본 발명의 DNA 앱타머는 IpaH 단백질과 결합하여 이를 포획할 수 있으며, 이와 같이 포획된 IpaH 단백질은 다시 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 포획 유무를 시각화 할 수 있다.

본 발명은 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트에서 DNA 앱타머는 칩 또는 기판상에 고정화할 수 있으며, 구체적으로 DNA 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태일 수 있다. DNA 앱타머를 칩이나 기판상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 본 명세서에서 상기 용어“마이크로 어레이”는 기판의 특정의 영역에 DNA 핵산 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다. 본 명세서에서 용어 마이크로어레이의 “기판”은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기판에 결합될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어, 비오티닐화화될 수 있고, 이는 스트랩타비딘이 코팅된 기판상에 성공적으로 결합될 수 있다. 본 발명에서의 키트는 시료 중의 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질 검출에 키트를 사용하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다.

DNA 앱타머를 이용한 세균성이질의 진단

본 발명의 DNA 앱타머를 사용하여 시료내 쉬겔라 소네이 유래 IpaH 단백질의 검출 및 분석을 통해 환자의 세균성이질 감염 여부의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 쉬겔라 소네이는 장의 상피세포 침입 후 IpaH 단백질을 발현, 분비함으로써, 환자의 분변 등에서 IpaH 단백질의 수준이 증가된다. 이에 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 본 발명의 DNA 앱타머를 이용하여 환자의 검체로부터 IpaH 단백질의 유무를 확인함으로써, 세균성 이질의 진단 또는 쉬겔라 소네이 검출에 활용할 수 있다.

본 발명은 세균성 이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료에서 쉬겔라 소네이의 IpaH 단백질의 존재 여부를 검출하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 본 발명의 DNA 앱타머와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 및 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질을 확인하는 단계를 포함한다. 상기 용어 “생물학적 시료”는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

도 1은 쉬겔라 소네이의 ipaH 유전자에 의해 발현되는 IpaH 단백질을 확보하기 위한 ipaH 유전자 클로닝 과정 및 결과를 나타낸 그림이다. 레인 M: 1 kb DNA 마커 (Elpis biotech, Korea)이고, 레인 1: ipaH 유전자를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과이며, 레인 2: pGEX-4T-1 발현 벡터의 DNA를 추출하여 확인한 결과이며, 레인 3: PCR 기법을 이용해 증폭한 쉬겔라 소네이의 ipaH 유전자를 BamHI / XhoI 제한효소를 이용하여 자른 결과이며, 레인 4: pGEX-4T-1 발현 벡터 DNA를 BamHI / XhoI 제한 효소를 이용하여 자른 결과이며, 레인 5: 쉬겔라 소네이의 ipaH 유전자를 pGEX-4T-1 발현 벡터에 클로닝한 결과이며, 레인 6: 쉬겔라 소네이의 ipaH 유전자로 클로닝된 pGEX-4T-1 발현 벡터를 BamHI / XhoI 제한 효소로 잘라 클로닝을 확인한 결과이며, 레인 M: 100 bp DNA 마커 (Elpis biotech, Korea)이다.
도 2는 재조합 IpaH 단백질을 발현하는 벡터를 대장균에 형질도입한 후 이들로부터 생산되는 GST 융합 IpaH 단백질을 정제 및 농축한 후 SDS-PAGE (12％)로 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 레인 M: 단백질 사이즈 마커 (Elpis biotech, Korea)이며, 레인 1: 정제 및 농축한 GST 융합 IpaH 단백질이다.
도 3은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과를 나타내는 도이다. 레인 M: 100 bp DNA 마커이고, 레인 1: DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과이다.
도 4는 PCR 기법을 통하여 제작한 dsDNA와 열-냉각기법과 스트랩타비딘을 이용하여 회수한 ssDNA를 10% 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 비교하여 확인한 결과이다. 레인 M: 100 bp DNA 마커이고, 레인 1: dsDNA이며, 레인 2: ssDNA이다.
도 5는 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위하여 실시한 각 SELEX 라운드에서 회수된 GST 융합 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 또는 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 양을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 6a 및 도 6b는 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서 선별된 19개의 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 IpaH-1 내지 IpaH-19의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
도 7은 카르복실기를 가지고 있는 센서 칩 CM5 표면에 IpaH 단백질 고정, IpaH 단백질과 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머간의 결합, IpaH 단백질에서 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 분리하여 센서칩을 재생하는 각 단계들을 도면으로 나타낸 도이다.
도 8은 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용한 세균성이질 진단 키트의 모식도를 나타낸 도면이다. 패널 [a]는 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 내장한 세균성 이질 진단 키트를 모식도로 나타내고 있으며, 패널 [b]는 세균성이질로 의심되는 시료를 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 내장하고 있는 세균성이질 진단 키트와 반응하였을 때, 샘플 내 IpaH 단백질과 IpaH 단백질 결합 앱타머의 결합에 의해 세균성이질을 진단하는 시스템을 모식도로 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 쉬겔라 소네이의 ipaH 유전자 선정, 클로닝 및 재조합 IpaH 단백질의 발현 및 정제

1-1. ipaH 유전자의 선정

쉬겔라 소네이를 특이적으로 검출할 수 있는 타겟을 선정하기 위해 쉬겔라 소네이의 병원성 유전자에 대해 문헌 조사를 실시하였다. 쉬겔라 소네이의 주요 병원성 유전자는 대부분 병원성 플라스미드에 존재하며 주요 병원성 유전자로는 침입성 플라스미드 항원(ipa; invasion plasmid antigen)인 ipaB, ipaC, ipaD, ipaH와 sen, ial 등이 있다. 특히, ipaH 유전자는 쉬겔라 속의 염색체와 플라스미드에 다수로 존재하기 때문에 보다 민감하게 진단할 수 있는 장점을 가지고 있다. 우선 ipaH 유전자로부터 발현되는 IpaH 단백질에 대한 앱타머를 제작하기 위해 NCBI로부터 IpaH 단백질의 서열정보를 얻었다(ABE28531.1). Clustal X 프로그램을 이용하여 여러 종류의 IpaH 단백질과 다중 서열 비교를 한 결과, NCBI에서 얻은 IpaH 단백질의 서열은 C-말단에 보존 서열을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.

1-2. 쉬겔라 소네이의 ipaH 유전자 클로닝

활성형의 재조합 IpaH 단백질을 대량으로 확보하기 위한 재조합 균주 개발을 위하여 일차적인 단계로 ipaH 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하였다. 우선 제한효소 자리를 포함한 DNA 프라이머 (primer) 한 쌍을 바이오니어 (Bioneer, Korea)로부터 주문 제작하였다. [정방향 프라이머: 5'-ATCGGATCCCTCACATGGAACAATCTC-3' (서열번호 20), 역방향 프라이머: 5'-ATCCTCGAGATTCTCTTCACGGCTTCT-3' (서열번호 21)]. 제한효소 자리를 첨가하여 제작한 프라이머를 이용한 PCR 기법을 이용하여 ipaH 유전자를 증폭하였으며 반응 조성은 주형 DNA 1 ㎕, 10 X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4 ㎕, 25 μM 정방향 프라이머 2 ㎕, 25 μM 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 ㎕ (1unit/㎕)와 35.7 ㎕의 물로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 64℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 30주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. 이후, 증폭된 ipaH 유전자와 pGEX-4T-1 벡터를 동일한 제한효소 (BamHI / XhoI)로 자른 후, 라이게이션하여 발현 벡터를 제조하였다 (도 1 참고).

1-3. 재조합 IpaH 단백질 발현 벡터를 갖는 형질전환 균주 제작과 IpaH 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예에서 제조한 재조합 IpaH 단백질 발현 벡터를 pTf16 샤페론 벡터 (chaperone vector; Takara, Japan)로 형질 전환된 BL21 (DE3) (Studier, F. A., and Moffatt, B. A., 1986, 189, 113-130)에 전기천공법 (electroporation)을 이용하여 형질전환 시킨 후, 암피실린 (ampicillin)과 클로람페니콜 (chloramphenicol)에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다.

상기 선별한 형질전환체의 단일 클론을 확보하여 암피실린 (ampicillin, 50 ㎍/㎖)과 클로람페니콜 (chloramphenicol, 50 ㎍/㎖)이 포함된 LB (0.5％ 효모 추출물, 1％ 박토-트립톤, 1％ NaCl) 배지에 12시간 이상 종균 배양하였다. 종균 배양액의 일부를 본 배양 배지에 접종 (1％)한 다음 18℃에서 180 rpm으로 배양하여, 재조합 IpaH 단백질의 발현을 세포의 성장과 함께 유도하였다. 단, pGEX-4T-1 발현 벡터에 클로닝된 재조합 ipaH 유전자의 발현은 배양액의 OD₆₀₀가 0.4에 이르렀을 때에 IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside)를 0.5 mM을 첨가하여 IpaH 단백질의 과발현을 유도하였다. IpaH 단백질을 과발현하기 위하여 IPTG 첨가 후 18℃에서 20시간 더 배양하였다. 이렇게 획득한 세포 배양액은 4℃에서 8,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 균체만을 따로 분리하였다. 원심분리를 통해 얻은 균체는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 재현탁한 후 다시 원심분리하여 균체만을 획득하는 과정을 통하여 균체를 세척하였다. 이후, 세척된 균체는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 재현탁한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 균체를 파괴한 후, 4℃에서 8,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 활성형 단백질과 비활성형 단백질로 분리하였다. 획득한 활성형 단백질에서 GST 융합 IpaH 단백질을 순수 분리 정제하기 위하여 글루타티온 세파로오스 4B (glutathione sepharose 4B) 정제 키트 (GE healthcare, UK)를 이용하였다. 순수 분리 정제한 GST 융합 IpaH 단백질은 SDS-PAGE (12％) 분석을 통하여 확인하였다. 정제한 단백질은 1 X PBS 버퍼로 투석을 3회 진행한 후, 단백질 농축 키트 (Sartorius stedim, Germany)를 이용하여 농축하였다. 이후, 농축한 IpaH 단백질을 SDS-PAGE (12％) 분석을 통하여 확인한 후 (도 2 참고), 브래드포드 분석 (Bradford assay)을 이용하여 단백질의 농도를 확인하였다.

실시예 2: DNA 앱타머의 제작

2-1. PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭

IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위해 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 100 bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATTGCACTTA CTATCT-3'; 서열번호 22)와 이를 76 bp로 증폭할 수 있는 세 개의 프라이머를 바이오니어로부터 주문하여 제작하였다 [정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열번호 23), 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 24), 비오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-비오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 25)]. 임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였으며, 76 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성은 주형 DNA 1 ㎕, 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4 ㎕, 25 μM 정방향 프라이머 2 ㎕, 25 μM 비오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 ㎕ (1 unit/㎕)와 35.7 ㎕의 증류수로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 아가로스 겔 전기영동을 통하여 증폭 산물을 확인하였다 (도 3 참고). PCR을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50 ㎕를 이용하여 회수하였다.

2-2. 가열-냉각 ( heating - coolong ) 기법을 활용한 ssDNA 제작

PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 라이브러리 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가하여 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 가열-냉각 (heating-coolong) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성(denaturation)하였다. 실험 방법을 구체적으로 표현하자면 상기 실시예에서 획득한 dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각시켜 ssDNA를 제작하였다.

2-3. ssDNA 의 선별 및 회수

가열-냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 비오틴이 결합되어 있는 ssDNA와 primer를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 상기 실시예에서 획득한 100 ㎕의 반응액에 스트렙타비딘 (Pierce, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 15분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트 (sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ㎕를 취하여 10％ 아크릴아마이드 겔을 이용하여 dsDNA와 비교하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 4 참고).

실시예 3: SELEX 기법을 이용한 재조합 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱 타머 선별

3-1. SELEX 에 이용되는 각 용액의 조성

SELEX에 이용한 각 용액은 GST bulk kit (GE healthcare, UK)를 이용하였으며, 조성은 다음과 같았다. 즉, 1 X 앱타머 선별 용액: 10 mM PBS (pH 7.4), 2 X 앱타머 선별 용액: 20 mM PBS (pH 7.4), 세척 용액: 앱타머 선별 용액, DNA 앱타머 용출 용액: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM glutathione.

3-2. SELEX 에 이용될 DNA 앱타머 구조 제작

상기 실시예 2-3 항목에서 설명된 방법을 통해 제작 확보한 ssDNA 40 ㎕에 증류수 10 ㎕를 첨가하고, 2X DNA 앱타머 선별 용액 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성 시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.

3-3. 글루타티온 세파로오스 4B ( glutathione sepharose )를 이용한 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별

상기 실시예 1-3 항목에서 설명된 방법을 통해 획득한 55 ng/㎕의 GST 융합 IpaH 단백질 10㎕ (14.5 pmol)를 상기 실시예 3-2 항목에서 설명된 방법을 통해 획득한 ssDNA 앱타머 풀 (145 pmol)과 혼합한 후, 1 X 앱타머 선별용액으로 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정하였으며, 이후 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 글루타티온 세파로오스 4B를 활성화하기 위하여 글루타티온 세파로오스 4B 200 ㎕에 1 X PBS 1 ㎖을 넣고 4℃에서 20분 동안 교반하며 반응시켜 활성화시킨 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 상기 과정을 2회 반복한 후 GST 융합 IpaH 단백질과 ssDNA 앱타머 풀을 반응시킨 반응액을 활성화된 글루타티온 세파로오스 4B와 4℃에서 1시간 동안 교반하며 반응시켰다. 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 1 X PBS 1 ㎖을 넣어 세척하는 과정을 3회 반복하여 GST 융합 IpaH 단백질과 결합하지 못한 ssDNA 앱타머를 제거하였다. 글루타티온 세파로오스 4B로부터 GST 융합 IpaH 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 용출하기 위하여 DNA 앱타머 용출 용액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM glutathione) 100 ㎕를 넣어 4℃에서 30분 동안 교반하며 반응시켰으며, 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층의 용출 용액을 얻었다. 상기 과정을 2회 반복하여 상층의 용출 용액을 획득하였다. GST 융합 IpaH 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머간의 결합물에서 GST 융합 IpaH 단백질을 제거하기 위하여, 용출 용액에 동일 부피의 PCI 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 이후, GST 융합 IpaH와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 만을 회수하기 위하여 PCI 법을 통하여 회수된 상층액에 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피의 3M 소듐 아세테이트(pH 4.5)와 3배부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰고, 반응액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 이를 통하여 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수할 수 있었으며, 회수된 DNA 앱타머는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다.

3-4. 네가티브 선별( Negative selection )을 통한 비특이적 DNA 앱타머 제거

IpaH 단백질이 아닌 GST 단백질과 글루타티온 세파로오스 4B에 결합하여 선별된 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 7회와 8회 사이에 IpaH 단백질 없이 GST 단백질만 고정되어 있는 글루타티온 세파로오스 4B에 DNA 앱타머 용액을 결합하는 네가티브 선별(negative selection)을 진행하였다. 1 X 앱타머 선별 용액을 이용하여 활성화된 글루타티온 세파로오스 4B에 GST 단백질을 고정 시킨 후, 상온에서 냉각시켜 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 풀을 반응시켰으며, 글루타티온 세파로오스 4B와 GST 단백질에 결합하지 않은 상층의 ssDNA 앱타머 용액을 8회 SELEX에 이용하였다. 이후 3-3과 같은 방법으로 SELEX를 총 10회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 증가할수록 ssDNA 앱타머 풀과 GST 융합 IpaH 단백질의 반응 시간을 줄였으며, 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적물질인 IpaH 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.

실시예 4: GST 융합 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 최적 DNA 앱타머 선별을 위한 SELEX 라운드 선별

4-1. 나노 드롭 ( Nano drop )을 이용한 각 라운드의 친화성 확인

SELEX를 10회 까지 마친 후 SELEX 계속 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA의 농도를 나노 드롭 (Nano drop)을 이용하여 측정하였다. 나노 드롭을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 네가티브 선별 이후에 8 라운드의 농도가 832.6 ng/㎕로 가장 높았으며, 9 라운드와 10 라운드의 농도는 각각 603.7 ng/㎕와 379.0 ng/㎕로 8 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 네가티브 선별 이후, GST 융합 IpaH 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 8 라운드 풀임을 확인할 수 있었다(도 5 참고).

4-2. 실시간( Real time ) PCR 기법을 이용한 최적 라운드 확인

SELEX를 10회 까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다. 우선 초기 DNA 라이브러리와 네가티브 선별 이후인 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR 기법을 이용하여 증폭하고, 가열- 냉각 기법을 이용하여 ssDNA를 확보하였다. 각 0, 8, 9, 10 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머 풀은 동일한 농도로 준비하여 동일한 농도의 GST 융합 IpaH 단백질과 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 반응액은 1 X PBS로 활성화된 글루타티온 세파로오스 4B와 1시간 동안 교반하며 반응시킨 후 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 이후, 1 X PBS로 3회 세척하여 GST 융합 IpaH 단백질과 결합하지 못한 ssDNA를 제거한 후 앱타머 용출 용액과 반응시켜 GST 융합 IpaH 단백질과 결합한 DNA 앱타머를 회수하였다. 회수한 GST 융합 IpaH 단백질과 결합한 DNA 앱타머에 동일 부피의 PCI를 처리하여 GST 융합 IpaH 단백질을 제거한 후, 회수 용액의 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트 (pH 4.5)와 3배 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 회수된 DNA는 85℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 이를 통하여 획득된 각 ssDNA들은 각각 10⁰, 10^-1, 10^-2로 희석하여 실시간 PCR의 주형 DNA로 사용하였다. 실시간 PCR은 Biorad사의 iQ SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 우선, 94℃에서 5분 변성 이후, 94℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 30주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 10^-2로 희석된 샘플을 주형 DNA로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다. 실시간 PCR 효율은 각 라운드별로 각각 73.2％, 71.66％, 56.45％였으며, 9 라운드와 10 라운드에서 획득한 ssDNA를 주형 DNA로 이용한 실시간 PCR 결과 효율은 71.66％, 56.45％로 8 라운드의 결과 보다 효율이 떨어지는 것으로 보아 더 이상 SELEX를 진행이 필요 없음을 확인할 수 있었다 (표 1 참고). 이는 나노 드롭을 이용하여 확인한 각 라운드에서 회수된 앱타머 농도 측정 결과와도 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 나노 드롭 결과 및 실시간 PCR 결과를 통하여 8 라운드의 앱타머 풀이 GST 융합 IpaH 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

	8R (1 X 10 ^-2 )	9R (1 X 10 ^-2 )	10R (1 X 10 ^-2 )
Efficiency(％)	73.2	71.66	56.45
C(t)	8.02	9.07	9.73

실시예 5 : 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 확보

나노 드롭과 실시간 PCR을 통하여 GST 융합 IpaH 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 8 라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 대해 정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열번호 20)와 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 21)를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트 (SolGent, Korea)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (10 ng/㎕) 1 ㎕와 PCR 산물 (20 ng/㎕) 4 ㎕, 6 X T-블런트 버퍼 1 ㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 6 ㎕는 100 ㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열충격 (heat shock)을 가한 후, 2분 동안 얼음에서 반응시켰다. 여기에 900 ㎕의 SOC (2％ 트립톤, 0.5％ 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM 글루코오스) 배지를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린 (ampicillin, 50 ㎍/ml), 카나마이신 (kanamycin, 50 ㎍/ml), X-gal (50 ㎍/ml), IPTG (5 ㎍/ml)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB plate)에 스프레딩하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 32개의 흰색 콜로니만을 선별하여 각 콜로니의 염기서열을 결정하였으며 (Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 중복되지 않는 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 19개를 확보할 수 있었다. 아래 표 2는 글루타티온 세파로오스 4B를 활용한 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 선별 SELEX 기법을 이용하여 획득한 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 19개에 대한 서열을 구체적으로 나타낸 것이다.

클론명칭	서열번호	선별된 서열	서열크기 ( bp )
IpaH-1	서열번호 1	GCACCTGATCGAGTGTTCATCTGTTAGCGTCTCACCGACA	40
IpaH-2	서열번호 2	CGGCAGTGGCAAACATAAAGCACATAGTGACAGCACCCGA	40
IpaH-3	서열번호 3	CCCAATAACGAAACGGCGTATAGACCGCGACCTCAGTTAG	40
IpaH-4	서열번호 4	CGCGAAGTGTGGAATTCGTAGATATTCCCATCTTGACGTG	40
IpaH-5	서열번호 5	CTATGTACAGTCGCCGGTACGAAGTGGGAAATCACGGCCC	40
IpaH-6	서열번호 6	GCAAGACCTATACGCTTACTTATTACTGTGTCTTACGCGT	40
IpaH-7	서열번호 7	CGGTGAGTCACGAATGTTCAACGAACCTACGTGCATTGAG	40
IpaH-8	서열번호 8	GTGGAAAGAGGTACAATCATTGCTGGGAGACAGGTAGCTAG	41
IpaH-9	서열번호 9	CGGCGCGAGGTTGGGGAGAGGCTGTGTCAACATTGGCGGC	40
IpaH-10	서열번호 10	GTCCGGATAGCCCAAAGGGCACGCAGTCATGCCGTTCCAC	40
IpaH-11	서열번호 11	TCGCGGATTCCGATGTGCATGTCACATAAAGTTGAGTCCG	40
IpaH-12	서열번호 12	CTACCTGTGGGGGGATCTGTTCCCTCATCTCTCTTCATG	39
IpaH-13	서열번호 13	CGACGTTAACAAGTGCACTAGTGCCGTGTTGTGGCCCGGA	40
IpaH-14	서열번호 14	CGTAAAGAACGCTGCCATGAATGTGCTATCCAAGCCCGGG	40
IpaH-15	서열번호 15	GGCTGACGGGGAGAACCAATGAAACGGCGTCCAACCACG	39
IpaH-16	서열번호 16	GTCCGGTAGCATGAAACACAAAACGCAGGTGGTTCGCTAG	40
IpaH-17	서열번호 17	CAGTTATAAAGCCTTCCGCCAATTTAGGTCTCTACCGTCG	40
IpaH-18	서열번호 18	AGGTGGCTCGGGAATTACCTGACCAGTGATTTGTGGTGG	39
IpaH-19	서열번호 19	GCGATGCGACCGATGGAATTATTCTGTAGGGCCCCGCTC	39

실시예 6 : 쉬겔라 소네이의 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정

IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다 (도 6a 및 도 6b 참고).

실시예 7 : SPR을 이용한 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질과 IpaH 결합 앱타머 후보군 간의 친화도 테스트

7-1. 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들 간의 각 친화도를 정량하기 위한 IpaH 단백질 코팅 센서 칩 제작 실험

IpaH 단백질과 상기 실시예 5 항목에서 설명된 방법으로 획득한 앱타머 후보군들간의 친화도를 정량하기 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000 (BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. IpaH 단백질과 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5 (GE Healthcare, UK)을 이용하였다. 우선 센서 칩 CM5에 0.1 M Nhydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려 센서칩 표면의 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-히드록시석신이미드 에스테르 (N-Hydroxy- succinimide ester; NHS-에스테르)로 활성화시켰다. NHS-에스테르로 활성화된 센서칩 CM5의 표면에 IpaH 단백질을 고정하기 위하여 10 mM 소듐 아세테이트 (pH 4.5) 완충액에 60 ㎍/㎖의 농도로 녹아 있는 IpaH 단백질 용액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하여 칩 표면을 IpaH 단백질로 코팅하였다(도 7 참고). 이후 GST 융합 IpaH 단백질이 고정된 센서 칩에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)를 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려줌으로써 센서 칩 표면에 남아 있는 카르복실 반응기를 불활성화시켰다. 이를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서칩은 1 M NaCl, 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)으로 수득하여 정량하였다.

7-2. 쉬겔라 소네이 균주 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정

IpaH 단백질과 가장 높은 친화력을 가지는 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군을 HBS2P 버퍼 (GE Healthcare, UK)에 각 100 nM, 300 nM, 500 nM의 농도로 녹여 준비하였다. 기 제작 준비된 IpaH 결합 DNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서 칩 (채널 1), IpaH 단백질이 고정된 센서 칩 (채널 2)에 다양한 농도 (각 100 nM, 300 nM, 500 nM)의 IpaH 결합 DNA 앱타머 후보군을 주입함으로써 IpaH 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화하였다. 각 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (K _d , dissociation) 수득 결과 GST 융합 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 중 IpaH-17 앱타머의 해리상수가 2.82 X 10^-12M으로 표적하는 IpaH 단백질에 대해 가장 높은 친화도 값을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다 (표 3 참고).

클론 명칭	K _d (nM)	클론 명칭	K _d (nM)
IpaH-1	112.2000 ± 7.4138	IpaH-11	0.2180 ± 0.019
IpaH-2	0.1874 ± 0.0131	IpaH-12	0.2420 ± 0.018
IpaH-3	0.0047 ± 0.0002	IpaH-13	0.0449 ± 0.035
IpaH-4	0.0206 ± 0.0013	IpaH-14	289.0000 ±9.8520
IpaH-5	0.0368 ± 0.0032	IpaH-15	0.0338 ± 0.0014
IpaH-6	0.0700 ± 0.0085	IpaH-16	0.0078 ± 0.0007
IpaH-7	0.0056 ± 0.003	IpaH-17	0.0028 ± 0.0002
IpaH-8	0.0032 ± 0.004	IpaH-18	0.0291 ±0.0023
IpaH-9	0.0224 ± 0.0012	IpaH-19	0.0284 ±0.0036
IpaH-10	0.1640 ± 0.027

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 IpaH (Invasion plasmid antigen H) 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머로서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 19의 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
삭제
삭제
상기 제 1 항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 검출용 조성물.
상기 제 1 항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 검출용 키트.
제 5 항에 있어서, 상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
다음의 단계를 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 검출 방법:
(a) 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)를 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 제 1 항의 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) IpaH 단백질을 확인하는 단계.
세균성 이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료에서 쉬겔라 소네이의 IpaH 단백질의 존재 여부를 검출하는 방법으로서, (a) 상기 제 1 항의 DNA 앱타머와 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이 IpaH 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 방법.