KR101438531B1

KR101438531B1 - 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머 및 이를 이용한 대장균 검출방법

Info

Publication number: KR101438531B1
Application number: KR1020120086395A
Authority: KR
Inventors: 김병찬; 김연석; 정종수
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2014-09-12
Also published as: US20140045192A1; US8969537B2; KR20140020042A

Abstract

본 발명은 대장균에 선택적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머 및 이를 이용한 대장균 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법, 키트 또는 센서는 수계에 존재하는 미생물 중 대장균을 특이적으로 검출할 수 있을 뿐 아니라 식품 위생이나 의료 진단 등의 분야에도 활용될 수 있다.

Description

대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머 및 이를 이용한 대장균 검출방법 {Single-stranded nucleic acid aptamers specifically binding to E.coli and method for detecting E.coli using the same}

본 발명은 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머 및 이를 이용한 대장균 검출방법에 관한 것이다.

현재 수계 중의 유해미생물 존재 여부를 확인하기 위한 지표로 지표수에서는 총 대장균군(Total Coliforms)만을 검출하도록 규정되어 있다. 먹는 물에 대해서는 젖당(lactose)을 분해하는 능력에 근거해 대장균군의 존재 유무를 정량하고 있다. 그러나, 이 시험법은 과정이 복잡하여 4일 이상의 기간이 소요되며, 결과를 통계표에 근거해 산출하므로 오차가 크고 불명확하다. 따라서, 수계의 유해미생물 오염을 신속하게 검사할 수 있도록 병원성 미생물의 존재를 실시간으로 모니터링 할 수 있는 고선택성 대장균 모니터링 센서 시스템이 요구된다. 특히, 높은 민감도와 안정성을 갖는 센서 시스템 개발을 위해, 대장균을 고선택성으로 인지하는 리셉터의 확보가 반드시 필요하다.

앱타머는 다양한 표적물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 핵산을 말한다. 기존의 질병 진단이나 유해미생물 검출을 위한 센서 기술들은 대부분 항체를 이용한 면역학적 분석기법을 활용하였다. 최근에는, 대상 물질에 대한 높은 특이성과 친화도를 갖는 앱타머를 이용하여 질병 진단이나 바이오센서 기술에 활용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 앱타머는 말단에 다양한 화학 작용기를 부여할 수 있고, 시험관 조건에서 선별되는 과정을 통해 특이성과 친화도를 극대화할 수 있다. 또한, 화학적 합성이 용이하여 고순도로 저비용으로 대량 생산이 가능하며, 열에 안정하여 실온에서 장기간 보존이 가능하다. 게다가, 앱타머는 선별과정에서 표적과 유사한 구조이거나 실제 샘플에 많이 존재하는 다양한 물질들에 대한 역선별법(counter selection)을 수행함으로써 표적물질에 대한 특이성을 증가시킬 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 이용하여 간단하고, 빠르며, 정확한 수계 내의 대장균 검출 방법을 제공하고자 한다.

일 양상은 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 제공하는 것이다.

다른 양상은 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 이용하여 시료에서 대장균을 검출하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 포함하는 대장균 검출 키트 및 대장균 검출 센서를 제공한다.

일 양상은, 대장균에 특이적으로 결합하는, DNA, RNA, PNA 또는 이들의 조합을 포함하는 단일가닥핵산 앱타머를 제공한다. 용어 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정한 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥핵산 분자이다. 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 28 또는 이들의 조합, 예를 들면, 서열번호 1, 2, 10, 12 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의하여 검출될 수 있는 모이어티일 수 있다. 예를 들면, 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 표지는 앱타머의 특정 염기, 특정 구조 예를 들면, 헤어핀-루프(hairpin-loop) 구조의 특정 부위 또는 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 부착될 수 있다.

상기 광학적 표지는 예를 들면, 형광물질일 수 있다. 상기 형광물질은 플로레세인(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550, 이의 콘쥬게이트화물 및 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 형광물질은 플로레세인, Cy3 또는 Cy5일 수 있다.

또한, 상기 광학적 표지는, 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 발색소 및 형광 수용자 발색소를 포함하고 도너의 형광 발광이 수용자에 의하여 억제되어 있는 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍일 수 있다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있다. 수용자 발색소는 그의 여기 스펙트럼이 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 또한, 상기 수용자는 넓은 범위의 도너를 켄칭 (quenching)하는 비형광 수용자일 수 있다. 도너-수용자 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다.

상기 전기화학적 표지는 당업계에 알려진 전기화학적 표지를 포함한다. 예를 들면, 상기 전기화학적 표지는 methylene blue일 수 있다.

다른 양상은 시료와 대장균에 특이적으로 결합하는, DNA, RNA, PNA 또는 이들의 조합을 포함하는 단일가닥핵산 앱타머를 접촉시켜 대장균-앱타머 복합체를 형성하는 단계;

상기 대장균-앱타머 복합체로부터 신호를 측정하는 단계; 및

상기 측정 신호로부터 시료 중 대장균의 존재 또는 농도를 확인하는 단계를 포함하는 대장균 검출 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 시료와 상기 앱타머 간의 접촉은 반응 용액 중에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 앱타머가 대장균과 잘 결합할 수 있는 염의 조성과 비특이적 결합을 방지하는 요소가 포함된 반응 용액 중에서 수행될 수 있다. 상기 비특이적 결합을 방지하는 요소는 예를 들면, salmon sperm DNA, BSA 및/또는 Tween-20을 포함할 수 있다. 반응 온도는 예를 들면, 5 내지 35℃, 10 내지 30℃, 15 내지 25℃, 또는 20 내지 25℃일 수 있다. 반응 시간은 예를 들면, 1시간 이상, 10 내지 60분, 20 내지 60분, 30 내지 50분, 또는 40 내지 50분일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 28 또는 이들의 조합, 예를 들면, 서열번호 1, 2, 10, 12 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 예를 들면, 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 대장균-앱타머 복합체로부터의 신호는 광학적 표지, 전기화학적 표지 또는 이들의 조합에 의해 발생되는 것일 수 있다. 상기 광학적 표지는, 예를 들면, 도너-수용자 FRET 쌍일 수 있다. 상기 전기화학적 표지는, 예를 들면, methylene blue일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 시료 중 대장균의 존재 또는 농도 확인은 대조군과 비교하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 대조군은 대장균과 결합하지 않은 상태의 앱타머일 수 있다. 예를 들면, 앱타머에 부착되는 표지가 도너-수용자 FRET 쌍인 경우, 대조군은 형광 도너 발색소의 형광 신호가 수용자 발색소에 의해 억제되어 있는 앱타머일 수 있다. 대장균-앱타머 복합체가 형성되면 FRET 효율이 감소됨으로써 형광 신호가 변화하고, 상기 신호 변화로부터 대장균의 존재 또는 농도를 확인할 수 있다. 예를 들면, 앱타머에 부착되는 표지가 전기화학적 표지인 경우, 대조군은 전극에 고정된, 상기 표지된 앱타머일 수 있다. 대장균과 결합한 앱타머의 구조 변화로 인해 전기화학적 표지가 전극으로부터 멀어지거나, 가까워지거나 또는 앱타머로부터 분리됨으로써 전기화학적 신호가 변화하고, 상기 신호 변화로부터 대장균의 존재 또는 농도를 확인할 수 있다.

상기 방법은, 상기 시료와 앱타머를 포함하는 반응물로부터 대장균-앱타머 복합체를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리 단계는 대장균-앱타머 복합체가 형성된 후, 상기 복합체로부터 신호를 측정하기 전에 수행되는 것일 수 있다. 상기 분리는 예를 들면, 막 여과법 또는 원심분리법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 분리는 상기 앱타머가 기판에 고정된 경우 이를 세척하는 것일 수 있다. 상기 앱타머에 부착되어 있는 광학적 표지는, 상기한 바와 같은 형광물질일 수 있다. 예를 들면, 상기 형광물질은 플로레세인, Cy3 또는 Cy5일 수 있다. 상기 분리된 대장균-앱타머 복합체로부터 발생되는 신호는 예를 들면, 형광측정법 또는 방사성 동위원소 검출법에 의해 측정될 수 있다.

다른 양상은 대장균에 특이적으로 결합하는, DNA, RNA, PNA 또는 이들의 조합을 포함하는 단일가닥핵산 앱타머를 포함하는 대장균 검출용 키트를 제공한다.

상기 키트에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 28 또는 이들의 조합, 예를 들면, 서열번호 1, 2, 10, 12 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 예를 들면, 광학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 키트는 대장균-앱타머 복합체 형성에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 특이적 대장균-앱타머 복합체 형성 촉진 또는 비특이적 대장균-앱타머 복합체 형성 억제에 요구되는 요소 예를 들면, salmon sperm DNA, BSA 및/또는 Tween-20을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기 앱타머로 시료 중 대장균을 확인하는 방법이 기재되어 있는 설명서를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 대장균에 특이적으로 결합하는, DNA, RNA, PNA 또는 이들의 조합을 포함하는 단일가닥핵산 앱타머를 포함하는 대장균 검출 센서를 제공한다.

상기 센서에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 28 또는 이들의 조합, 예를 들면, 서열번호 1, 2, 10, 12 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 예를 들면, 광학적 표지, 전기화학적 표지 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지를 포함하는 센서는 예를 들면, FRET 효과를 이용하는 것일 수 있다. 상기 전기화학적 표지를 포함하는 센서는 예를 들면, 표적 물질과 결합한 앱타머의 구조 변화로 인해 표지 물질이 전극으로부터 멀어지거나, 가까워지거나 또는 앱타머로부터 분리되어 전기화학적 신호가 변화되는 원리에 의한 것일 수 있다.

상기 센서는, 둘 이상의 상기 앱타머가 고정화되어 있는 기판을 포함하는 것, 예를 들면 어레이 형태일 수 있다. 어레이는 복수 개의 특정 분자가 기판 상의 일정 부분에 고정화되어 있는 것을 말한다. 상기 어레이는 기판 및 상기 기판에 형성된, 대장균과 결합할 수 있는 앱타머를 포함하는 고정화 영역을 포함할 수 있다. 상기 앱타머는 상기 고정화 영역 내에 공유적으로 부착된 것일 수 있다. 상기 앱타머는 공유적으로 부착시킬 수 있는 관능기를 갖는 복수의 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 관능기는 상기 앱타머를 부착할 수 있도록 하는 것이면 어느 것이나 사용될 수 있다. 예를 들면, 알데히드, 에폭시 또는 아민기가 될 수 있으며, 상기 화합물은 말단에 알데히드, 에폭시 또는 아민기를 갖는 실록산이 될 수 있다. 상기 기판의 재질은 예를 들면, 유리, 실리콘, 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌과 같은 물질이 사용될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 이용함으로써, 수계 내 대장균의 존재 및 농도를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.

도 1은 대장균에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머를 선별하기 위한 Bacteria Cell-SELEX 방법 모식도이다.
도 2는 각각의 선별과정 (selection round)에서 사용된 단일가닥 DNA 라이브러리 중 대장균에 결합하는 단일가닥 DNA의 퍼센트 그래프이다.
도 3은 mfold 프로그램을 이용하여 예측한 대장균에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 대한 2차 구조 모식도이다.
도 4는 대장균에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 대한 결합력 분석 결과 그래프이다.
도 5는 대장균에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 대한 특이성 분석 결과 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1 : 대장균에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조

1. 대장균 배양

분변 유래 대장균 KCTC2571을 영양배지 (nutrient broth) (beef extract 37%, pepton 63%, 8g broth/L D.W, pH 6.8)에 접종한 후 37℃에서 배양하였다. 대장균의 농도가 10⁸ CFU/ml에 도달한 후, PBS 버퍼로 3회 씻어 배양액을 제거하고 바인딩 버퍼 (1x PBS, 0.1mg/ml salmon sperm DNA, 1% BSA, 0.05% Tween-20)에 현탁하였다.

2. 랜덤 ssDNA 라이브러리의 제조

하기와 같은 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드로 구성된 ssDNA 라이브러리를 합성하였다. 그 결과 10¹⁵개의 서로 다른 염기서열을 가지는 랜덤 ssDNA 라이브러리를 제조하였다.

5'-GCAATGGTACGGTACTTCC-N₄₅-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3' (서열번호 29)

상기에서 밑줄 친 부분은 하기 프라이머 쌍이 어닐링 되는 고정된 서열을 의미하고, N₄₅는 각 위치에 A, G, T, C 염기가 무작위로 존재함을 의미한다.

3. Whole - Cell SELEX

10¹⁵개의 서로 다른 염기서열을 가지는 랜덤 ssDNA 라이브러리를 바인딩 버퍼 (1x PBS, 0.1mg/ml salmon sperm DNA, 1% BSA, 0.05% Tween-20)에 녹여 95 ℃에서 5분 동안 가열하고 곧바로 온도를 낮춰 4 ℃에서 10분 동안 처리한 후 1 mL의 대장균 현탁액 (10⁷ cells)과 섞어 상온에서 1시간 동안 잘 혼합하였다. 상기 혼합액으로부터 대장균/ssDNA 복합체를 원심분리법 (13,000 rpm, 10분)으로 분리하였다. 분리된 대장균/ssDNA 복합체를 PBS 버퍼에 현탁한 후 이러한 과정을 3회 반복하였다. 최종적으로 대장균/ssDNA를 멸균된 증류수 중에 재현탁하였다. 상기 재현탁액을 95℃에서 10분 동안 가열한 후 즉시 4℃에서 10분 동안 놓아둠으로써 대장균/ssDNA 복합체로부터 ssDNA를 분리하였다. 분리된 ssDNA는 원심분리법 (13,000 rpm, 10분)으로 회수하였다.

위 과정을 통해 선별된 ssDNA는 PCR 반응을 통해 양을 증폭하였다. 포워드 (forward) 프라이머는 5'-말단에 플로레세인이 표지되어 있고 리버스 (reverse) 프라이머는 5'-말단에 바이오틴 (biotin)이 표지된 것을 사용하였다. 이는 PCR 산물이 dsDNA이므로 이를 단일가닥의 DNA로 분리하기 위한 것이다.

forward: 5‘-fluorescein-GCAATGGTACGGTACTTCC-3' (서열번호 30)

reverse: 5'-biotin-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3' (서열번호 31)

PCR은 약 100 ng에 해당하는 ssDNA 10 ul, 10 uM의 프라이머 각각 1.25 ul, PCR master mix 12.5 ul를 혼합하여 총 25 ul의 양으로, 95℃ (30초), 56.3℃ (30초), 72℃ (10초) 하에서 수행하였고 반복 횟수는 10번으로 하였다. 2%의 아가로즈 젤 (agarose gel)에서 전기영동하여 PCR이 제대로 수행되었는지 확인하였다. 그 후, PCR 정제 키트 (MinElute PCR Purification kit, QIAGEN)로 PCR 산물을 정제하였다. 정제된 100 uL의 PCR 산물을 50 uL의 아비딘이 코팅된 자성비드 (Dynabeads MyOne™ Streptavidin, Invitrogen)와 혼합하여 상온에서 10분 동안 반응시키고 자석을 이용하여 1 ml의 PBS 버퍼로 씻어주었다. 여기에 500 uL의 가성소다 (NaOH) 200 mM을 넣고 5분 동안 반응시켜 dsDNA를 ssDNA로 분리한 후, 자석을 이용하여 바이오틴이 부착된 ssDNA를 반응액으로부터 제거하고 플로레세인이 부착된 ssDNA를 회수하였다. 회수된 ssDNA는 PCR 정제 키트를 이용하여 정제/농축한 후 농도를 분석하였다. 농축된 ssDNA는 다음 라운드의 선별과정에 사용하였으며 이러한 선별과 증폭과정은 도 2에서와 같이 여러 번 반복되었다. 총 10번의 선별 과정을 거친 후, 최종적으로 대장균과 혼합된 ssDNA 중 93.7 %의 ssDNA가 대장균과 결합한 것으로 나타났다.

상기 SELEX 과정 중 5, 6, 9번째 선별과정 다음에 표적 대장균과 같이 하수 등과 같은 수계에서 많이 발견되고 있는 클렙시엘라 (Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 (Citrobacter freundii), 엔테로박터 (Enterobacter aerogenes), 포도상구균 (Staphylococcus epidermidis)의 4 종의 박테리아들을 이용하여 총 3회에 걸쳐 역선별 (counter selection)을 수행하였다. 실험 방법과 조건은 선별과정과 동일하나 역선별 과정에서는 상기 박테리아에 결합하는 ssDNA는 버리고 이들과 결합하지 않는 ssDNA들을 회수하여 증폭한 후 다음 단계의 선별 과정에 사용하였다.

최종적으로 얻어진 ssDNA들은 상기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR한 후 클로닝 키트 (TOPO TA cloning kit)를 이용하여 클로닝하였다. 각각의 콜로니에서 플라스미드를 추출하여 염기서열분석을 수행하였으며 총 28개의 서로 다른 염기서열 정보를 획득하였다. 하기 표 1은 SELEX 방법에 의해 선별된 총 28종의 ssDNA 염기서열이다.

	랜덤 부위 염기서열
E1	5’-ACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGTCTTGCTGGCGCATCCACTGAGCG-3’(서열번호 1)
E2	5’-CCATGAGTGTTGTGAAATGTTGGGACACTAGGTGGCATAGAGCCG-3’(서열번호 2)
E3	5’-AGGTTCGAACGTCATGATGCCCCAGTTGACATCATTCAAACGGAT-3' (서열번호 3)
E4	5’-TGTTCGTCGCCGCGTGGCCTGGGGGGAGGGTTGCTTGATTGCCTA-3' (서열번호 4)
E5	5’-CCACTGCGGTTGGCGCGCCGACCTTTCTGTTAGCCTGAAACGCAG-3’(서열번호 5)
E6	5’-GGGTTTGGTTTGGGACGGGGACCAGATTTTCAGCTTCACTCGTGG-3’(서열번호 6)
E7	5’-GTGATACGTAGGTAGTGGTGTGGGTCCTCTTTGCACCTTATGGTC-3’(서열번호 7)
E8	5’-GGGGTGCTCGGGGTCGCAGTCGGTGCCCGCTTGTCACAGATCAGC-3’(서열번호 8)
E9	5’-TGGTGTAATCAGCCTAGGAGTGGGTCGTGACAGGTTGTATATCTC-3’(서열번호 9)
E10	5’-GTTGCACTGTGCGGCCGAGCTGCCCCCTGGTTTGTGAATACCCTGGG-3’(서열번호 10)
E11	5’-GCGTGTGTGTTAGCGACGAGTTGGGGCAACGATAGTCATATGACT-3’(서열번호 11)
E12	5’-GCGAGGGCCAACGGTGGTTACGTCGCTACGGCGCTACTGGTTGAT-3’(서열번호 12)
E13	5’-AAAGGAGGCATGGTCTCTGCTAAGCCATCCTACCTATACTGAGGC-3’(서열번호 13)
E14	5’-TTGGGCATGAGTTGGTGATGCGGGTTTCGATTACGGGTTACTGCG-3’(서열번호 14)
E15	5’-GCGCTCTACCGCCAGGCTACTCTTGGAGAGTCTTTTGGGCTCTTG-3’(서열번호 15)
E16	5’-GAAAGGCTGTTTGCGCGCGAGTCTGTAAGATGTGCACTGATCGGT-3’(서열번호 16)
E17	5’-GAAATAGTGCTGGCTCTTCATCCGTCGGTTGTGTGAGGGGTAGTG-3’(서열번호 17)
E18	5’-GATGAACTAATCGTGCGCCTCGGGTGGGTTTCCTGCTGCATCCAT-3’(서열번호 18)
E19	5’-TGAGGGCAGGCCTTAGTATTCTGCCTCTTAGAAAGGCAGGTGCGG-3’(서열번호 19)
E20	5’-CTACCTGCTATTCACTGACTTTCGTCGCTTGTTTCACAGTGGGAC-3’(서열번호 20)
E21	5’-CAATTTGCAATTTGGGTATGTCATTATTAGCGTTATTTGACTCAT-3’(서열번호 21)
E22	5’-ATTCAAGTCCATCTTACCGGTTGTGCTCCTCCTGTGCTACTTACT-3’(서열번호 22)
E23	5’-GGCCGTGTTCGGACGGTTTCATGCTCTATGAGGGCCCTTTACCCT-3' (서열번호 23)
E24	5’-CAGTTGAGGTCCCGATTTCACACGTATATCAGGACATTTATCTGA-3’(서열번호 24)
E25	5’-GCTGTAGATCTATGGGTGGTTGCCTGTTCTGGTTTCCATCGATTT-3’(서열번호 25)
E26	5’-GCCTTGTTTTGCATTGTATGCACGTACGTGGGGTGCTGCGTCAGAG-3’(서열번호 26)
E27	5’-AACGCATAGTTTCGGGAATTCTACATGAGCACGCCCATTACCCCG-3’(서열번호 27)
E28	5’-GCTAGTACGCGTTGTTCTGCAGATTATTTTTGCGAGTTTGTTCGT-3’(서열번호 28)

실시예 2 : 대장균에 대한 결합력 및 선택성 분석

염기서열이 분석된 28개의 ssDNA들 중 mfold 프로그램 (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold; Zuker, M. Nucleic Acids Res. 2003, 31, 3406)을 이용하여 2차 구조 분석을 수행하였다. 분석 결과, 대장균에 대한 결합력이 높을 것으로 예측되는 10여 종의 ssDNA에 대해 대장균에 대한 결합력과 선택성을 분석하였다.

먼저 대장균에 대한 결합력 분석을 위해 대장균 KCTC2571을 영양배지 (nutrient broth) (beef extract 37%, pepton 63%, 8g broth/L D.W, pH 6.8)에 접종한 후 37℃에서 배양하였다. 대장균의 농도가 10⁸ CFU/ml에 도달한 후, PBS 버퍼로 3회 씻어 배양액을 제거하고 바인딩 버퍼 (1x PBS, 0.1mg/ml salmon sperm DNA, 1% BSA, 0.05% Tween-20)에 현탁하였다. 대장균 100 uL (10⁷ cells)를 다양한 농도의 형광 표지된 ssDNA (0, 10, 25, 50, 100, 250, 500 nM) 100 uL와 혼합한 후 상온에서 45분 동안 반응시켰다. 반응 후 대장균 표면에 결합하지 않은 ssDNA는 PBS 버퍼로 2회에 걸쳐 씻어준 후 형광분석기 (LS50B, PerkinElmer Co., USA)를 이용하여 대장균/ssDNA 복합체의 형광 강도를 측정하였다 (Ex/Em= 494nm/521nm, slit width: 10nm, exposure time: 1s). 각각의 ssDNA 농도 조건에서의 형광의 세기는 비선형 회귀법과 단일 부위 포화형 리간드 결합법으로 시크마플랏(SigmaPlot) 프로그램을 이용하여 그래프화(plotting) 되었고, 여기에 F= B_max* C/(Kd + C) 식이 이용되었다 (F는 형광의 세기, B_max는 최대 결합 위치, Kd는 해리상수, C 는 ssDNA의 농도). 결합력 분석결과 대장균에 높은 친화도를 보이는 4 종의 ssDNA 서열에 대한 친화도 분석 결과는 도 4와 같다. 대장균에 높은 친화도를 보이는 4종의 ssDNA의 결합력(Kd: 해리상수)은 각각 다음과 같다;

E1 (Kd=12.4 nM), E2 (Kd=25.2 nM), E10 (Kd=14.2 nM), E12 (Kd=16.8 nM)

위 4종의 ssDNA의 대장균에 대한 선택성 확인을 위해 클렙시엘라(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터(Citrobacter freundii), 엔테로박터(Enterobacter aerogenes), 포도상구균(Staphylococcus epidermidis) 4종의 다른 박테리아들과 표적과 다른 종류의 대장균류(KCTC1682, KCTC2617, KCTC2618)를 이용하여 선택성 분석을 수행하였다. 실험은 각각의 박테리아 100 uL (10⁷ cells)와 500 nM의 ssDNA 100 uL를 상온에서 45분 동안 반응시킨 후 PBS 버퍼를 이용해 씻어주고 박테리아/ssDNA 복합체의 형광 세기를 측정하여 비교하는 방법으로 수행되었다. 도 5에서와 같이 E1, E2, E10, E12 모두 표적 대장균(KCTC2571)에 비해 클렙시엘라, 시트로박터, 엔테로박터, 포도상구균와 혼합하였을 때의 형광세기가 10% 미만으로 매우 낮았으며 표적 대장균이 아닌 다른 대장균류(KCTC1682, KCTC2617, KCTC2618)에 대해서는 표적 대장균 대비 절반 또는 비슷한 정도의 형광 세기를 나타내었다.

<110> KIST <120> single-stranded nucleic acid aptamers for selective binding to E.coli and detection method of E.coli using thereof <130> PN097344 <160> 31 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E1 <400> 1 acttaggtcg aggttagttt gtcttgctgg cgcatccact gagcg 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E2 <400> 2 ccatgagtgt tgtgaaatgt tgggacacta ggtggcatag agccg 45 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E3 <400> 3 aggttcgaac gtcatgatgc cccagttgac atcattcaaa cggat 45 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E4 <400> 4 tgttcgtcgc cgcgtggcct ggggggaggg ttgcttgatt gccta 45 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E5 <400> 5 ccactgcggt tggcgcgccg acctttctgt tagcctgaaa cgcag 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E6 <400> 6 gggtttggtt tgggacgggg accagatttt cagcttcact cgtgg 45 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E7 <400> 7 gtgatacgta ggtagtggtg tgggtcctct ttgcacctta tggtc 45 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E8 <400> 8 ggggtgctcg gggtcgcagt cggtgcccgc ttgtcacaga tcagc 45 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E9 <400> 9 tggtgtaatc agcctaggag tgggtcgtga caggttgtat atctc 45 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E10 <400> 10 gttgcactgt gcggccgagc tgccccctgg tttgtgaata ccctggg 47 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E11 <400> 11 gcgtgtgtgt tagcgacgag ttggggcaac gatagtcata tgact 45 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E12 <400> 12 gcgagggcca acggtggtta cgtcgctacg gcgctactgg ttgat 45 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E13 <400> 13 aaaggaggca tggtctctgc taagccatcc tacctatact gaggc 45 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E14 <400> 14 ttgggcatga gttggtgatg cgggtttcga ttacgggtta ctgcg 45 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E15 <400> 15 gcgctctacc gccaggctac tcttggagag tcttttgggc tcttg 45 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E16 <400> 16 gaaaggctgt ttgcgcgcga gtctgtaaga tgtgcactga tcggt 45 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E17 <400> 17 gaaatagtgc tggctcttca tccgtcggtt gtgtgagggg tagtg 45 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E18 <400> 18 gatgaactaa tcgtgcgcct cgggtgggtt tcctgctgca tccat 45 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E19 <400> 19 tgagggcagg ccttagtatt ctgcctctta gaaaggcagg tgcgg 45 <210> 20 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E20 <400> 20 ctacctgcta ttcactgact ttcgtcgctt gtttcacagt gggac 45 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E21 <400> 21 caatttgcaa tttgggtatg tcattattag cgttatttga ctcat 45 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E22 <400> 22 attcaagtcc atcttaccgg ttgtgctcct cctgtgctac ttact 45 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E23 <400> 23 ggccgtgttc ggacggtttc atgctctatg agggcccttt accct 45 <210> 24 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E24 <400> 24 cagttgaggt cccgatttca cacgtatatc aggacattta tctga 45 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E25 <400> 25 gctgtagatc tatgggtggt tgcctgttct ggtttccatc gattt 45 <210> 26 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E26 <400> 26 gccttgtttt gcattgtatg cacgtacgtg gggtgctgcg tcagag 46 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E27 <400> 27 aacgcatagt ttcgggaatt ctacatgagc acgcccatta ccccg 45 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA E28 <400> 28 gctagtacgc gttgttctgc agattatttt tgcgagtttg ttcgt 45 <210> 29 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA library <400> 29 gcaatggtac ggtacttccn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnncaaaag tgcacgctac tttgctaa 88 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 30 gcaatggtac ggtacttcc 19 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 31 ttagcaaagt agcgtgcact tttg 24

Claims

서열번호 2의 염기서열을 갖는, 대장균 (Escherichia coli)에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것인 앱타머.
청구항 3에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합인 것인 앱타머.
시료와 청구항 1, 3 및 4 중 어느 하나의 앱타머를 접촉시켜 대장균-앱타머 복합체를 형성하는 단계;
상기 대장균-앱타머 복합체로부터 신호를 측정하는 단계; 및
상기 측정 신호로부터 시료 중 대장균의 존재 또는 농도를 확인하는 단계를 포함하는 대장균 검출 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 시료 중 대장균의 존재 또는 농도 확인은 대조군과 비교하여 이루어지는 것인 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 시료와 앱타머를 포함하는 반응물로부터 대장균-앱타머 복합체를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 1 또는 3의 앱타머를 포함하는 대장균 검출용 키트.
청구항 8에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있고, 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합인 것인 키트.
청구항 1, 3 및 4 중 어느 하나의 앱타머를 포함하는 대장균 검출용 센서.
청구항 10에 있어서, 둘 이상의 상기 앱타머가 고정화되어 있는 기판을 포함하는 것인 센서.