CN112964701B - 基于可视化bpe-ecl技术检测大肠杆菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于免疫磁珠分离的试剂盒，以及该试剂盒的应用。本发明还公开了基于可视化BPE‑ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法。本发明内容还公开了所述的试剂盒以及检测方法在检测食品中的大肠杆菌浓度的应用。本发明建立的可视化BPE‑ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法，可通过裸眼观察待测样品中是否存在大肠杆菌，它具有原理简单、快速（实验周期为45 min）、特异性强、检测灵敏度高（检测限为101 CFU/mL）的优点，其次其操作简便，液体实际样品（牛奶、自来水）无需进行前处理，固体实际样品（碎牛肉）按照国标进行简单前处理；同时因无需在双极电极表面进行生物化学修饰，电极可以重复使用，能有效降低检测成本。

Description

基于可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌的方法
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及基于可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌的方法，尤其涉及基于可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌O157：H7浓度的方法。
背景技术
食源性致病菌，指在食品的加工和流通过程中引入的病原菌，这些病原菌在食品中存活、生长代谢引起食物的变质和破坏，同时有些病原菌分泌有毒物质，直接或间接导致人患病，常见的食源性病原菌有致病性大肠杆菌(特别是出血性大肠杆菌O157：H7)、空肠弯曲菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌等。食源性致病菌的危害并不随着经济的发展而减少，世界范围内的食品安全事件接连发生。食源性致病菌轻则导致恶心、呕吐、发烧、腹泻等，重则出现呼吸、神经、循环系统的损伤，长期食用某些变质食品会表现致畸、致癌、致突变的作用，具有严重的潜在作用。大肠杆菌O157：H7作为食源性致病菌之一，常常在受污染的食品如奶制品，叶用蔬菜等中发现它的身影，引起了社会各界的广泛关注，因此开发一种快速、灵敏的用于检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法显得尤为重要。
目前，检测大肠杆菌O157：H7的方法十分繁多，传统的平板计数法准确但是耗费太多的人力和材料，且时间太长，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)较快但敏感度较低，PCR准确但其操作复杂，需要技术熟练的操作人员。免疫磁分离技术(ImmunomagneticSeparation，IMS)是利用抗原抗体的特异性识别和纳米磁珠的磁响应性对目标物进行分离富集的技术。其拥有灵敏度高、特异性强、分离速度快等优点，可排除基质对于后期检测方法的影响，在食源性病原微生物的检测中得到了广泛的应用。
近年来，联用双极电极和电致化学发光技术制备的传感器在生物分析(如小分子检测)和临床诊断(如肿瘤标志物检测)等领域的基础研究引发了热烈关注。BPE-ECL技术大大降低了获得和检测信号的难度，与BPE结合，ECL保留了其灵敏度高、可控性好、仪器简单、分析速度快，且可以获得与反应有关的多种信息等优点。当采用双极电极进行ECL检测时，一方面，原本在双极电极表面产生的电流信号直接转变为更易检测的光信号，而且完全摆脱了导线的束缚；另一方面，ECL所获得的光信号为发光物质发生电化学反应产生的激发态所释放，此过程与电极表面的法拉第过程直接相关，可以消除传统电化学中充放电电流以及迁移电流等一系列背景电流的干扰。已有文献报道BPE-ECL技术用于检测黄曲霉毒素，在双极电极阴极上发生抗原抗体反应，并结合HRP催化聚苯胺原位生成的原理，运用聚苯胺这一电化学活性物质可以引发ECL变化的性质，定量检测黄曲霉毒素，由于电化学反应的灵敏度极高，在检测黄曲霉毒素过程中需要严格控制其检测环境等条件，重复性很难保证。在其他报道中，BPE-ECL技术被用于检测前列腺特异抗原(PSA)，在双极电极阴极端进行金纳米离子复合材料的功能界面的组装，降低了单位样品的检测效率。双极电极还可以通过其结构将待检测物和信号分子分隔开，不仅降低了杂质引入的干扰，也为原位、活体检测提供了一种可靠的手段。但是并没有报道表明能够不借助其他化学反应直接利用菌株本身的特性联用可视化BPE-ECL技术可以对食品中的大肠杆菌进行检测。
基于此，开发一种更为简便的免疫磁分离技术与可视化BPE-ECL技术联用用于定量检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法迫在眉睫。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于免疫磁珠分离的试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种可视化BPE-ECL技术用于检测食品中大肠杆菌的方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供了该试剂盒以及检测方法在食品中检测大肠杆菌O157：H7的应用。本发明基于抗原抗体反应，免疫磁珠特异性地捕获大肠杆菌O157：H7，利用磁珠的磁响应性对IMBs-E.coli O157：H7复合物进行分离富集，将复合物滴加在双极电极阴极端，由于E.coli O157：H7的存在导致双极电极阴极端电阻抗的变化，从而引起双极电极阳极端电致化学发光体系光强变化，进而实现对待测样品中E.coliO157：H7进行定量可视化检测。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种基于免疫磁珠分离的试剂盒，所述试剂盒包括大肠杆菌免疫磁珠、丝网印刷双极电极、电致化学发光试剂及共反应剂。
其中，所述电致化学发光试剂为Ru(bpy)3Cl2·6H2O，共反应剂为TPA。
其中，所述大肠杆菌免疫磁珠为E.coli O157：H7免疫磁珠。
本发明内容还包括基于可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌的方法，所述方法是通过大肠杆菌免疫磁珠特异性识别并捕获不同浓度的大肠杆菌，孵育形成IMBs-E.coli复合物，利用免疫磁分离技术，复合物实现快速分离，双极电极施加外接恒电压，阴极端上不同浓度的大肠杆菌导致复合物电阻抗变化，从而引发阳极端ECL信号变化，联用荧光仪检测得到ECL值，从而得到E.coli浓度与ECL的标准曲线，根据ECL的标准曲线确定待测样品中E.coli的浓度。
其中，作为优选，所述大肠杆菌为E.coli O157：H7。
其中，作为优选，所述大肠杆菌免疫磁珠为E.coli O157：H7免疫磁珠。
其中，作为优选，所述大肠杆菌的浓度为101-108CFU/mL。
其中，作为优选，所述大肠杆菌免疫磁珠粒径为200～1000nm。
其中，作为优选，所述大肠杆菌免疫磁珠与大肠杆菌的体积比为1∶25。
其中，作为优选，所述孵育温度为20～45℃。
其中，作为优选，所述恒电压为5.0～7.5V。
本发明内容还包括所述的试剂盒、所述的检测方法在检测食品基质或配料或辅料或食品中大肠杆菌中的应用。
其中，所述食品包括但不仅限于所述食品为牛肉、火腿肠、鸡蛋、纯牛奶、脱脂牛奶、橘子汁、苹果汁、番茄汁、蜂蜜、啤酒、醋、酱油、苹果、生菜、豆干、酱菜、干紫菜、蛋糕、面包、巧克力、干脆面、海苔或其他食品或饮料，食品基质或配(辅)料：葡萄糖、氯化钠、大豆油等均可用于其他食品中的关于E.coli O157：H7的检测。
其中，上述双极电极为丝网印刷双极电极，所述丝网印刷双极电极长约3.4cm，宽约1cm，双极电极导线长约12mm。
其中，作为进一步优选的，上述E.coli O157：H7的培养：(1)从-80℃冰箱取出保藏在50％(v/v)甘油中的菌种，解冻后，以1％接种量接种至10mL的LB(Luria-Bertani)液体培养基中，在37℃、160rpm恒温摇床中培养18-24h；(2)将上述得到的菌液按照相同的比例转接入10mL的LB液体培养基中，37℃，160rpm培养2.5h；(3)取1mL菌液至1.5mL离心管中，使用冷冻离心机在4℃、8000rpm，离心10min，弃上清得菌体沉淀；(4)加入1mL无菌生理盐水重悬菌体，于4℃、8000rpm，离心10min，以洗去残留的培养基，加入1mL无菌生理盐水(0.85％NaCl)重悬菌体；重复该操作2次；(5)将得到的菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释，得到浓度为101-107CFU/mL的菌悬液。
作为进一步优选的，所述的LB液体培养基为：NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，用超纯水定容至1L。
其中，上述利用免疫磁分离技术，具体地，免疫磁珠上的单克隆抗体会特异性识别并捕获不同浓度的E.coli O157：H7，形成IMBs-E.coli O157：H7复合物，利用磁场的作用，复合物与其他杂质实现快速分离：(1)取40μL免疫磁珠加入至1mL浓度为101-107CFU/mL的菌悬液中，孵育后形成IMBs-E.coli O157：H7复合物；(2)磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；(3)取1mL缓冲液洗涤IMBs-E.coliO157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。
作为进一步优选的，孵育时间为45min。
作为进一步优选的，孵育温度为37℃。
作为进一步优选的，孵育时转速为20rpm。
作为进一步优选的，所述的缓冲液为8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.5g Tween20定容于1L超纯水，pH为7.2-7.4。
其中，利用双极电极工作原理，检测信号采集界面(双极电极阳极端)ECL，得到E.coli O157：H7浓度与ECL的标准曲线的具体步骤为：在丝网印刷双极电极的阳极端加入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA)，阴极端加入10μL IMBs-E.coli O157：H7复合物，利用双极电极工作原理，检测信号采集界面上的电致化学发光信号(ECL)，使用电化学工作站在丝网印刷电极两端施加恒电压，根据不同浓度的E.coli O157：H7呈现出不同的ECL，联用荧光仪，检测E.coli O157：H7的峰值，得到E.coliO157∶H7浓度与ECL的标准曲线。
本发明还包括对免疫磁珠在优化后的工作条件下捕获率的测定，具体步骤如下：将上述得到的IMBs-E.coli O157：H7复合物与菌液进行磁分离，统计不同浓度的上清液中的细菌数，按照以下公式计算捕获率：
捕获率＝(N-n)/N*100％
其中，N为空白对照中的细菌数，单位为CFU/mL；所述空白对照为不加样品的细菌纯培养物；n为上清液中的细菌数，单位为CFU/mL。
本发明的工作原理：免疫磁珠上的单克隆抗体会特异性识别并捕获不同浓度的E.coli O157：H7，形成IMBs-E.coli O157：H7复合物，利用磁场的作用，复合物与其他杂质实现快速分离，复合物滴加到丝网印刷电极的阴极上，阳极滴加固定浓度的电致化学发光试剂和共反应剂，复合物浓度的不同会导致ECL信号的不同，利用光检测器测量其发光信号峰值，从而定量检测食品中大肠杆菌O157：H7。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：
(1)本发明通过基于可视化BPE-ECL技术检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法，基于抗原抗体反应特异性地捕获E.coli O157：H7，以及食源性致病菌本身携带大量的负电荷的性质，利用样品中浓度不同的IMBs-E.coli O157：H7复合物在恒定的电压下显示出不同的ECL，利用荧光仪定量检测其ECL峰值；同时，ECLIMBs-E.coli O157：H7与ECLIMBs明显的差别，肉眼可明显分辨，从而建立可视化BPE-ECL技术用于检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法。建立可视化BPE-ECL技术用于检测食品中大肠杆菌O157∶H7的方法，它具有原理简单、快速(实验周期为45min)、特异性强、成本低等优点。本发明检测灵敏度高(检测限为101CFU/mL)，特异性强。
(2)本发明采用丝网印刷双极电极，无需进行生物化学修饰，可重复使用，降低检测成本，同时该双极电极和外加电源之间无需导线相连，故检测装置的构建更简便，BPE可以将反应体系与信号测量体系进行物理隔离，被分析物不需要参与阳极的电致化学发光反应，避免了光活性分子与复杂反应体系的直接接触从而极大地拓宽了ECL的应用范围。
(3)本发明在检测过程中，仅需将待测物直接滴加在无任何功能界面构建的BPE阴极端，待测物无需再进行任何信号放大处理，“一步法”对大肠杆菌O157∶H7定量检测，操作简便，其次，利用BPE阴极端电阻抗不同引发ECL信号的变化，与其他研究中引入酶、探针等利用聚苯胺等电化学活性物质导致检测信号放大相比，本工作灵敏度可达到101CFU/mL。同时，免疫磁珠富集食源性致病菌后具有良好的稳定性，故其检测过程中无需控制严格的环境条件，重复性好。检测过程中无需使用昂贵试剂、精密仪器等，成本低。
(4)可视化检测：肉眼可明显分辨，适用于现场快速检测。
(5)磁分离技术，实现快速分离富集，解决食源性致病菌分离的数量少、干扰大、分离难、效率低问题。
(6)本发明操作简便，液体实际样品(牛奶、自来水)无需进行前处理，固体实际样品(碎牛肉)按照国标进行简单前处理；同时因无需在双极电极表面进行生物化学修饰，电极可以重复使用，能有效降低检测成本。
附图说明
图1、显示了基于免疫磁分离技术和BPE-ECL技术检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法的流程图；
图2、显示了丝网印刷双极电极制备的设计图；
图3、显示了丝网印刷双电级阳极电致化学发光剂的发光稳定性图；
图4、显示了食品基质或实际样品对电致化学发光检测影响图(A：单一食品基质，B：实际样品)；
图5、显示了免疫磁珠工作条件优化图(A：电压优化，B：磁珠添加量优化，C：磁珠粒径优化，D：孵育时间优化，E：孵育温度优化)；
图6、显示了免疫磁珠工作电压优化图(A-F：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5V)；
图7、显示了免疫磁珠添加量优化图(A-D：20、40、200、400μL)；
图8、显示了免疫磁珠粒径(200nm、600nm、1000nm)优化图；
图9、显示了免疫磁珠捕获率图；
图10、显示了免疫磁珠灵敏度测试图(A：0CFU/mL、101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL浓度下对应的ECL发光图，B∶0CFU/mL、101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL浓度对应的ECL信号图；C：0CFU/mL、101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL浓度与ECL信号拟合的线性曲线图)；
图11、显示了特异性测试图；
图12、显示了实际样品测试图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
本实验中用到的试剂和仪器：
大肠杆菌O157：H7菌株(CICC10907)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)系本实验室保藏，三联吡啶氯化钌六水合物(Ru(bpy)3(Cl)2·6H2O)，三正丙基胺(TPA)，氯化钠(NaCl)，葡萄糖(Glucose)，蛋白胨，牛血清白蛋白(BSA)，酵母浸粉，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，吐温20均购置于上海阿拉丁生化科技有限公司，大肠杆菌O157：H7免疫磁珠购自于北京勤邦生物技术有限公司，丝网印刷双极电极购自于上海谦素生物科技有限公司，纯牛奶，脱脂牛奶均购自于当地超市，电化学工作站(CHI750E)，离心机(EppendorfGerman)，混合涡旋仪(IKA German)，组合式摇床(HYL-C1)，荧光分光光度计(F-4700，日立)。
实施例1：大肠杆菌O157：H7的培养
1、从-80℃冰箱取出保藏在50％(v/v)甘油中的菌种大肠杆菌O157：H7，解冻后，以1％接种量接种至10mL的LB(Luria-Bertani)液体培养基中，在37℃、160rpm恒温摇床中培养18-24h；
2、将上述得到的菌液按照相同的比例转接入10mL的LB液体培养基中，37℃，160rpm培养2.5h；
3、取1mL菌液至1.5mL离心管中，使用冷冻离心机在4℃、8000rpm，离心10min，弃上清得菌体沉淀；
4、加入1mL无菌生理盐水重悬菌体，于4℃、8000rpm，离心10min，以洗去残留的培养基，加入1mL无菌生理盐水(0.85％NaCl)重悬菌体；重复该操作2次；
5、将得到的菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释，得到浓度为101-107CFU/mL的菌悬液。
实施例2丝网印刷双极电极的制备
首先选用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)廉价电惰性材料为基质，然后在基质的两端利用银油墨印制两条工作电极引线；接着烘干基片，在两条工作电极中间用碳糊浆料印制碳电极并烘干作为双极电极；再接着采用光固绝缘浆印制电极规范层并用紫外光固化；最后采用光固绝缘浆印制电极绝缘层并用紫外光固化。丝网印刷电极长约3.4cm，宽约1cm，双极电极导线长约12mm。如图2所示。
实施例3：丝网印刷双电极阳极发光剂电致化学发光稳定性测量
在实施例2制备的丝网印刷双电极阳极上滴加10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)，阴极上滴加10μL IMBs-E.coliO157：H7(其中，富集E.coli O157：H7的浓度为104)，外接电化学工作站，施加恒电压5.5V、联用荧光仪于620nm恒定波长处扫描70s，定量检测阳极发光剂信号值，如图3所示，IMBs-E.coliO157：H7的发光值在最初达到顶峰，在25s内逐渐下降并慢慢达到稳定，随后一直趋于稳定，所以在选择于发光30s时进行ECL的测量。
实施例4：食品基质对电致化学发光检测的影响探究
一、单一食品基质：
1、取40μL、200nm大肠杆菌O157：H7免疫磁珠分别加入至1mL不同浓度的食品基质(matrix)液中，37℃、孵育45min形成IMBs-matrix复合物；
2、所述的食品基质为0.1％葡萄糖溶液、1％葡萄糖溶液、10％葡萄糖溶液、85％葡萄糖溶液、0.1％BSA溶液、10％BSA溶液、20％BSA溶液、30％BSA溶液、0.1％氯化钠溶液、1％氯化钠溶液、10％氯化钠溶液、20％氯化钠溶液、0.1％大豆油溶液、1％大豆油溶液、10％大豆油溶液、40％大豆油溶液。
3、磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；
4、取1mL缓冲液(8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.5g Tween 20定容于1L超纯水，pH为7.2-7.4)洗涤IMBs-matrix复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。
5、取该复合物重悬液10μL滴加于实施例2制备的双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)在5.5V的恒电压下联用荧光仪检测其ECL峰值。如图4(A)，ECLIMBs-matrix基本与ECLIMBs-E.coli O157：H7保持一致或在其上下略微浮动，验证了基质对电化学反应的影响可忽略不计。
二、实际样品：
1、取40μL、200nm大肠杆菌O157：H7免疫磁珠加入至1mL实际样品(sample)处理液中，37℃、孵育45min形成IMBs-sample复合物；
2、所述的实际样品为鸡肉、牛肉、火腿肠、鸡蛋、纯牛奶、脱脂牛奶、橘子汁、苹果汁、番茄汁、饮料1、饮料2、蜂蜜、啤酒、醋、酱油、苹果、生菜、豆干1、豆干2、酱菜1、酱菜2、干紫菜、蛋糕1、蛋糕2、面包1、面包2、巧克力、干脆面、海苔；该实际样品均购自于当地超市。对于液体类实际样品(鸡蛋、纯牛奶、脱脂牛奶、橘子汁、苹果汁、番茄汁、饮料1、饮料2、蜂蜜、啤酒、醋、酱油)，以无菌吸管吸取2.5mL加入至22.5mL1×PBS缓冲液中，充分振荡混匀，制成1：10的样品匀液；对于固体类实际样品(鸡肉、牛肉、火腿肠、苹果、生菜、豆干1、豆干2、酱菜1、酱菜2、干紫菜、蛋糕1、蛋糕2、面包1、面包2、巧克力、干脆面、海苔)，称取2.5g，放入含有22.5mL1×PBS缓冲液的无菌均质袋中，拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。
3、磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；
4、取1mL缓冲液(8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.5g Tween 20定容于1L超纯水，pH为7.2-7.4)洗涤IMBs-sample复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。
5、取该复合物重悬液10μL滴加于实施例2制备的双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)在5.5V的恒电压下联用荧光仪检测其ECL峰值。如图4(B)，ECLIMBs-sample基本与ECLIMBs-E.coli O157：H7保持一致或在其上下略微浮动，验证了实际样品中复杂的混合基质对电化学反应的影响甚微。
实施例4：免疫磁珠工作条件的优化
一、工作电压的优化：
1、取40μL、200nm大肠杆菌O157：H7免疫磁珠加入至1mL的菌悬液(菌悬液为实施例1所述，浓度为104CFU/mL)中，37℃、孵育45min形成IMBs-E.coli O157：H7复合物；
2、磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；
3、取1mL缓冲液(8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.5g Tween 20定容于1L超纯水，pH为7.2-7.4)洗涤IMBs-E.coli O157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。
4、取该复合物重悬液10μL滴加于实施例2制备的双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)分别在恒电压(5.0V、5.5V、6.0V、6.5V、7.0V、7.5V)条件下，联用荧光仪检测其ECL，记为ECLIMBs-E.coli O157：H7；同时，在相同的条件下检测仅是免疫磁珠的ECL，记为ECLIMBs；ΔECL＝ECLIMBs-E.coli O157∶H7-ECLIMBs。如图6(A-F：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5V)所示，随着电压的上升，ΔECL在5.5V时达到最高，而后又慢慢下降，发现该在5.5V恒电压条件电传感器影响很大，更加直观地，如图5(A)所示。
二、磁珠添加量的优化：
1、分别取20μL、40μL、200μL、400μL的200nm大肠杆菌O157∶H7免疫磁珠加入至1mL的菌悬液(菌悬液为上述实施例1所述，浓度为104CFU/mL)中，37℃、孵育45min形成IMBs-E.coli O157：H7复合物；
2、磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；
3、取1mL缓冲液(8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.5g Tween 20定容于1L超纯水，pH为7.2-7.4)洗涤IMBs-E.coli O157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。
4、取该复合物重悬液10μL滴加于双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)在恒电压5.5V条件下，联用荧光仪检测其ECL，记为ECLIMBs-Ecoli O157：H7；同时，在相同的条件下检测仅是免疫磁珠的ECL，记为ECLIMBs；ΔECL＝ECLIMBs-Ecoli O157：H7-ECLIMBs。如图7(A-D：20μL、40μL、200μL、400μL)所示，随着免疫磁珠添加量的上升，ECLIMBs、ECLIMBs-E.coliO157：H7均先上升后下降，ΔECL在磁珠添加量为40μL时最高，更直观地，如图5(B)所示。
三、磁珠粒径的优化：
1、分别取200nm、600nm、1000nm大肠杆菌O157：H7免疫磁珠40μL加入至1mL的菌悬液(菌悬液为上述实施例1所述，浓度为104CFU/mL)中，37℃、孵育45min形成IMBs-E.coliO157：H7复合物；
2、磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；
3、取1mL缓冲液(8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.5g Tween 20定容于1L超纯水，pH为7.2-7.4)洗涤IMBs-E.coli O157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。
4、取该复合物重悬液10μL滴加于双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)在恒电压5.5V条件下，联用荧光仪检测其ECL，记为ECLIMBs-Ecoli O157：H7；同时，在相同的条件下检测仅是免疫磁珠的ECL，记为ECLIMBs；ΔECL＝ECLiMBs-E.coli O157：H7-ECLIMBs。不同粒径下ECLIMBs、ECLIMBs-E.coli O157：H7如图8所示，比较其ΔECL，更直观的如图5(C)所示，免疫磁珠粒径的大小对ECL有较大的影响，200nm时其ΔECL最大。
四、孵育时间优化：
1、取粒径为200nm的大肠杆菌O157：H7免疫磁珠40μL加入至1mL的菌悬液(菌悬液为上述实施例1所述，浓度为104CFU/mL)中，37℃、分别孵育5min、10min、15min、30min、45min、60min、90min、120min形成IMBs-E.coli O157∶H7复合物；
2、磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；
3、取1mL缓冲液(8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.5g Tween 20定容于lL超纯水，pH为7.2-7.4)洗涤IMBs-E.coli O157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。
4、取该复合物重悬液10μL滴加于双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)在恒电压5.5V条件下，联用荧光仪检测其ECL，记为ECLIMBs-E.coli o157：H7；如图5(D)所示，孵育时间是影响ECLIMBs-Ecoli O157：H7的重要因素之一，随着孵育时间的上升，ECLIMBs-E.coli O157：H7逐渐上升，当孵育时间为45min时，信号值达到最大。
五、孵育温度优化：
1、取粒径为200nm的大肠杆菌O157：H7免疫磁珠40μL加入至1mL的菌悬液(菌悬液为上述实施例3所述，浓度为104CFU/mL)中，分别于20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃孵育45min形成IMBs-E.coli O157：H7复合物；
2、磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；
3、取1mL缓冲液(8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，1.15g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.5g Tween20定容于1L超纯水，pH为7.2-7.4)洗涤IMBs-E.coli O157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。
4、取该复合物重悬液10μL滴加于双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)在恒电压5.5V条件下，联用荧光仪检测其ECL，记为ECLIMBs-E.coli O157：H7；如图5(E)所示，随着孵育温度的上升，ECLIMBs-E.coli O157：H7逐渐上升，在37℃时达到最大，随着温度的继续上升，其ECL逐渐下降并趋于平缓。
实施例5捕获率检测
将大肠杆菌O157：H7免疫磁珠与大肠杆菌O157：H7的体积比为1∶25、37℃、孵育45min得到的IMBs-E.coli O157：H7复合物与菌液进行磁分离，统计不同浓度的上清液中的细菌数，按照以下公式计算捕获率：
捕获率＝(N-n)/N*100％
其中，N为空白对照中的细菌数，单位为CFU/mL；所述空白对照为不加样品的细菌纯培养物；n为上清液中的细菌数，单位为CFU/mL。
如图9所示，菌浓为101-106CFU/mL时，其捕获率均能达到90％以上，当菌浓度为107CFU/mL时，其捕获率明显下降。
实施例6灵敏度检测
1、取40μL、200nm大肠杆菌O157：H7免疫磁珠加入至1mL所述步骤3)中浓度为101-107CFU/mL的菌悬液中，37℃、孵育45min后形成IMBs-E.coli O157：H7复合物；
2、磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；
3、取1mL实施例4配制的缓冲液洗涤IMBs-E.coli O157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。
4、取该复合物重悬液10μL滴加于实施例2制备的双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)在5.5V的恒电压下联用荧光仪检测其ECL峰值，同时用数码相机拍摄其暗室下电致化学发光图，其发光图片如图10(A)所示，当不添加大肠杆菌O157：H7时，双极电极阳极端无发光信号，随着大肠杆菌O157：H7浓度的上升，其发光信号也越来越高，可视化程度愈发强烈，极适合用于现场检测，如图10(B)(a-h∶0、101、102、103、104、105、106、107CFU/mL)及图10(C)所示，检测限可达到101CFU/mL，菌浓在101-107CFU/mL范围内呈现良好的线性关系。
实施例7特异性检测
1、取40μL、200nm大肠杆菌O157：H7免疫磁珠加入分别加入至1mL浓度为104CFU/mL的大肠杆菌O157：H7菌液、沙门氏菌(Salmonella)菌液、金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌液、热致死(121℃、15min)的大肠杆菌O157(heated-killed E.coliO157：H7)菌液、混合样品液(mixture，104CFU/mL的大肠杆菌O157：H7菌液、沙门氏菌菌液、金黄色葡萄球菌菌液、热致死的大肠杆菌O157菌液)中，37℃、孵育45min；
2、磁分离5min至管内液体澄清，分别形成IMBs-E.coli O157：H7复合物、IMBs-Salmonella复合物、IMBs-S.aureus复合物、IMBs-heated-killed E.coli O157：H7复合物、IMBs-mixture复合物，从各复合物对侧轻轻吸去上清液；
3、取1mL缓冲液洗涤各复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬各复合物。
4、取各复合物重悬液以及大肠杆菌O157免疫磁珠10μL滴加于实施例1制备的双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mMTPA，现配现用)在恒电压5.5V条件下，联用荧光仪检测其ECL，如图11所示，与ECLIMBs-E.coli O157∶H7以及ECLIMBs-mixture相比，其余复合物电致化学发光信号均较低，验证了该传感器良好的特异性。
实施例8：实际样品检测
实际样品为纯牛奶、脱脂牛奶、去除蛋白质的脱脂牛奶、饮用水、碎牛肉。
纯牛奶、脱脂牛奶、去除蛋白质的脱脂牛奶：①取上述实施例3中的102-108CFU/mL的菌悬液100μL分别加入至900μL纯牛奶、脱脂牛奶、去处蛋白质的脱脂牛奶中，制成浓度为101-107CFU/mL的样品液；②分别取40μL、200nm大肠杆菌O157∶H7免疫磁珠加入分别加入至1mL上述3种样品液中，37℃、孵育45min后形成IMBs-E.coliO157：H7复合物；③磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；④取1mL实施例4配制的缓冲液洗涤IMBs-E.coli O157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。⑤取该复合物重悬液10μL滴加于实施例1制备的双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)在5.5V的恒电压电压下联用荧光仪检测其ECL峰值，如图12(A)所示，上述三种实际样品的ECL与细菌纯培养液的ECL相差无几，说明基质对该传感器的影响较小，牛奶样本可无需进行前处理且回收率较高。
饮用水：①取上述实施例3中的102-108CFU/mL的菌悬液100μL分别加入至900μL饮用水中，制成浓度为101-107CFU/mL的样品液；②分别取40μL、200nm大肠杆菌O157：H7免疫磁珠分别加入至1mL上述样品液中，37℃、孵育45min后形成IMBs-E.coliO157：H7复合物；③磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；④取1mL实施例4配制的缓冲液洗涤IMBs-E.coli O157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。⑤取该复合物重悬液10μL滴加于双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mMRu(bpy)3Cl2·6H2O，250mM TPA，现配现用)在5.5V的恒电压电压下联用荧光仪检测其ECL峰值，如图12(B)所示，饮用水实际样品的ECL与细菌纯培养液的ECL相差无几，饮用水样本可无需进行前处理且回收率较高。
碎牛肉：①根据国标处理固体实际样品的方法，取25g碎牛肉于225mL无菌的生理盐水中放入均质袋中拍打1-2min，制成牛肉样品液，取上述实施例3中的102-108CFU/mL的菌悬液100μL分别加入至900μL牛肉样品液中，制成浓度为101-107CFU/mL的所需样品液；②分别取40μL、200nm大肠杆菌O157：H7免疫磁珠加入分别加入至1mL上述样品液中，37℃、孵育45min后形成IMBs-E.coli O157：H7复合物；③磁分离5min至管内液体澄清，从复合物对侧轻轻吸去上清液；④取1mL缓冲液洗涤IMBs-E.coli O157：H7复合物，磁分离5min后吸去上清液，重复该操作2次，并用40μL缓冲液重悬复合物。⑤取该复合物重悬液10μL滴加于双极电极阴极，阳极上滴入10μL电致化学发光试剂和共反应剂(50mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250mMTPA，现配现用)在5.5V的恒电压电压下联用荧光仪检测其ECL峰值，如图12(B)所示，碎牛肉实际样品的ECL与细菌纯培养液的ECL相差无几，牛肉样品只需依照国标进行简单前处理即可，且回收率较高。
对于实际样本的检测，依据图12可知，对于液体实际样品(牛奶、饮用水)可无需进行前处理，固体实际样品(牛肉)需按照国标进行前处理，其回收率均在95％以上，参见表1，非常适合用于食源性致病菌的快速检测。
表1实际样品回收率
Figure BDA0002938900890000141

Claims (5)

1.基于免疫磁珠分离的试剂盒的可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，所述方法是：通过大肠杆菌免疫磁珠特异性识别并捕获大肠杆菌，孵育形成IMBs-E.coli复合物，利用免疫磁分离技术，复合物实现快速分离，丝网印刷 双极电极施加外接恒电压，阴极端上不同浓度的大肠杆菌导致复合物电阻抗变化，从而引发阳极端ECL信号变化，联用荧光仪检测得到ECL值，从而得到E.coli浓度与ECL的标准曲线，根据ECL的标准曲线确定待测样品中E.coli的浓度，所述试剂盒包括大肠杆菌免疫磁珠、丝网印刷双极电极、电致化学发光试剂及共反应剂，所述大肠杆菌免疫磁珠为E.coliO157:H7免疫磁珠，所述电致化学发光试剂为Ru(bpy)3Cl2·6H2O，共反应剂为TPA，所述恒电压为5.5V。
2.根据权利要求1所述的可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，所述大肠杆菌的浓度为101-108 CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，所述大肠杆菌免疫磁珠粒径为200~1000 nm。
4.根据权利要求1所述的可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，所述孵育温度为20~45℃。
5.根据权利要求1所述的可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，所述待测样品为鸡肉、牛肉、火腿肠、鸡蛋、纯牛奶、脱脂牛奶、橘子汁、苹果汁、番茄汁、蜂蜜、啤酒、醋、酱油、苹果、生菜、豆干、酱菜、干紫菜、蛋糕、面包、巧克力、干脆面、海苔中的一种或几种。
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