CN114839171A - 一种基于深紫外发射碳点检测牛奶中四环素类抗生素的方法 - Google Patents

一种基于深紫外发射碳点检测牛奶中四环素类抗生素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于深紫外发射碳点检测牛奶中四环素类抗生素的方法，属于分析检测领域。本发明基于深紫外发射碳点检测牛奶中四环素类抗生素的方法包括如下步骤：(1)将富含羟基、氨基和羧基的物质制备为碳点溶液；(2)牛奶与四环素混合后进行简单的预处理，再与(1)中碳点混合，荧光光谱检测得到混合溶液荧光淬灭程度，最后构建四环素浓度和混合溶液荧光强度淬灭程度标准曲线；(3)根据步骤(2)的标准曲线，达到检测牛奶样品中四环素类抗生素的目的。本发明首次以深紫外发射碳点为荧光探针实现对牛奶中的四环素类抗生素的定量检测，且有灵敏度高、操作简单、安全、能量利用率高和成本低廉的优点，适合常规分析。

Description

一种基于深紫外发射碳点检测牛奶中四环素类抗生素的方法
技术领域
本发明涉及一种基于深紫外发射碳点检测牛奶中四环素类抗生素的方法，属于分析检测领域。
背景技术
抗生素在细菌感染的治疗和预防中起着重要作用，其中四环素类抗生素(TCs)是最常用的抗生素之一，四环素类抗生素中常见的为四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)和强力霉素(DOX)等，这类抗生素因其广谱抑菌效果好被广泛使用。但是四环素的滥用会导致四环素残留于乳制品中，并最终富集于人体中，这会对人体健康造成一定的影响。
目前，检测牛奶中四环素的方法有很多，例如，高效液相色谱(HPLC)、免疫分析法(immunoassays)、毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)、比色法(colorimetry)和化学发光法(chemiluminescence method)等。然而，这些方法大多需要昂贵的仪器，复杂的操作和长的时间消耗。
荧光法具有灵敏度高、操作简单、成本低和省时等优点。利用荧光纳米材料作为荧光探针进行检测，极大地提高了检测的灵敏度，且检测具有操作简单、检测时间短和灵敏度高的优点，目前荧光光谱技术已广泛地应用于环境、化学、医药食品等领域，也有一些学者提出使用荧光光谱技术对牛奶中四环素类抗生素进行检测，据我们调查，将深紫外发射碳点应用于食品检测还没有被报道过。
发明内容
[技术问题]
目前检测牛奶中四环素类抗生素的主要方法有：高效液相色谱、免疫分析法、毛细管电泳法、比色法和化学发光法等。其检测大多耗时且涉及复杂的样品处理过程，或是需要专业技术人员和昂贵的成本。而利用深紫外发射碳点应用于食品检测还没有被报道过。
[技术方案]
针对上述问题，本发明提供了一种基于深紫外发射碳点检测牛奶中四环素类抗生素的方法，本发明基于内滤效应和氢键作用这两个机理的共同作用下，提出了基于深紫外发射碳点用于牛奶中四环素类抗生素的检测方法，可以实现便捷、安全和灵敏地定量检测牛奶中的四环素类抗生素。
本发明提供了一种基于深紫外发射碳点作为新型荧光探针检测牛奶中的四环素类抗生素的方法，包括以下步骤：
(1)制备深紫外发射碳点：将2，4-二羟基苯甲酸和赖氨酸加入到水中，混匀进行水热反应，结束后，固液分离、收集滤液，得到深紫外发射碳点溶液(DUV-CDs)；
(2)将一系列已知浓度的四环素牛奶溶液与乙腈混合、膜过滤，获得相应四环素测试样品；
(3)稀释步骤(1)所得深紫外发射碳点溶液，然后与步骤(2)的四环素测试样品混合，采集相应的荧光光谱信息，分别获得四环素浓度为0时样品的荧光强度峰值F0、以及其他浓度时样品的荧光强度峰值F；通过(F0-F)/F0计算得到淬灭程度C，以淬灭程度C与相应样品的四环素浓度进行线性关联，获得定量检测模型。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，2，4-二羟基苯甲酸和赖氨酸质量比为(0.8-1.2)：1。具体可选1：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，赖氨酸相对水的浓度为6-8mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，水热反应是在180℃下反应10h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，四环素牛奶溶液通过如下过程配置：将四环伺溶于水中，获得四环素水溶液；然后与牛奶混合，获得四环素牛奶溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，四环素牛奶溶液的浓度范围为0-200mg/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，四环素牛奶溶液与乙腈的体积比为2：3。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，与乙腈混合的过程中，采用震荡，超声，离心，收集清液。
在本发明的一种实施方式中，所述超声时间为10分钟；离心转速为12000转/分钟，离心时间为15分钟。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，稀释步骤(1)所得深紫外发射碳点溶液的稀释倍数为9倍。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述荧光强度峰值是指在308nm处荧光强度峰值。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中利用采用英国Edinburg生产的FLS980型荧光光谱仪测量荧光发射光谱，激发波长为273nm，峰值波长为308nm，激发和发射狭缝宽度分别为1nm和1nm。
本发明提供了上述方法在食品检测领域的应用。
有益效果：
1.本发明使用的DUV-CDs的荧光发射在深紫外波段，斯托克斯位移小，能量利用率高。且DUV-CDs的荧光发射与四环素的吸收有很大程度的重叠，为实现四环素的检测提供了良好的基础。
2.本发明中使用的DUV-CDs浓度经过优化，在牛奶中应用具有较好的效果，从而增加了检测的灵敏度。
3.本发明方法首次使用深紫外发射碳点实现了对牛奶这类复杂体系中四环素类抗生素的定量检测，本方法检测操作简单，检测时只需对牛奶进行简单的去除蛋白质预处理后测量荧光发射光谱即可。
4.本发明对四环素类抗生素都有着类似的检测能力，由于几种四环素类抗生素的结构相似，理化性质也较为接近，使得DUV-CDs可以对这一类抗生素进行检测。
5.本发明构建的线性模型线性范围为0.5-40mg/L，标准曲线方程为C＝0.00795I+0.01535(C为碳点的猝灭程度与I为四环素浓度)，决定系数R2＝0.991，检测限计算低至70.61μg/L，方法得到的回收率为93.47％～97％。检测限低于国家标准，且具有好的检测准确性，对于监督牛奶中四环素类抗生素的残留问题具有重要意义。
附图说明
图1为DUV-CDs检测牛奶中四环素的流程图。
图2为实施例1中DUV-CDs水溶液的吸收光谱(黑线)、荧光激发光谱(红线)和发射光谱(蓝线)。
图3DUV-CDs分别与四环素、金霉素、土霉素和强力霉素混合后的发射光谱(激发波长为273nm)。
图4(a)四环素浓度为0-200mg/L时碳点-四环素牛奶溶液的荧光发射光谱(激发波长为273nm)；(a)插图为：荧光峰值强度与四环素浓度的折线图；(b)猝灭程度((F0-F)/F0)与四环素浓度的拟合图(四环素浓度为0.5-40mg/L，F0和F分别为不存在和存在四环素时溶液的峰值强度)。
图5(a)碳点、碳点-牛奶预处理和牛奶预处理的归一化光谱对比，(b)牛奶和标准添加了四环素的牛奶预处理后加入不同浓度碳点的猝灭程度柱状图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1深紫外发射碳点的制备
对深紫外发射碳点的制备，包括如下步骤：
(1)将0.257g的2，4-二羟基苯甲酸和0.244g赖氨酸加入40毫升超纯水中。搅拌后将混合物移至100毫升以四氟乙烯为内衬的高压釜中，并在电炉中从室温加热至180℃并保持10小时。
(2)加热完成后将反应产物自然冷却至室温，过滤去除反应产物中的固体沉淀，得到的DUV-CDs原液，将得到的DUV-CDs原液稀释9倍后储存在4℃冰箱中以待后续使用。
(3)DUV-CDs的吸收光谱(方形)、荧光激发光谱(圆形)和发射光谱(三角形)如图2所示。
实施例2深紫外发射碳点对四环素类抗生素的响应
深紫外发射碳点对四环素类抗生素的响应实验：
将0.4mL稀释9倍的DUV-CDs分别与2mL的水、100mg/L四环素、100mg/L金霉素、100mg/L土霉素和100mg/L强力霉素混合，对样品进行荧光光谱检测，扫描条件：激发波长为273nm，发射波长扫描范围为280-500nm，每隔1nm扫描一次，狭缝宽度设为1/1nm(激发狭缝/发射狭缝)，得到图3，相同浓度的4种四环素类抗生素对碳点的荧光都有猝灭，且猝灭程度接近。
实施例3标准曲线的构建
一种基于实施例1所述的基于深紫外发射检测牛奶中四环素类抗生素的方法中标准曲线的构建，以这类抗生素中常见的四环素为例进行了检测实验，包括如下步骤：
(1)配置0-400mg/L的四环素水溶液，与牛奶1:1(各2mL)混合后，得到浓度为4mL0-200mg/L的四环素牛奶溶液，再加入6mL乙腈，震荡后超声10分钟，12000转/分钟离心15分钟，再使用0.22μm过滤膜过滤，得到预处理后的四环素牛奶溶液。取0.4mL稀释9倍的DUV-CDs原液与2mL预处理样品混合。
(2)将(1)中样品进行荧光光谱检测，扫描条件：激发波长为273nm，发射波长扫描范围为280-500nm，每隔1nm扫描一次，狭缝宽度设为1/1nm(激发狭缝/发射狭缝)，得到在308nm处荧光强度峰值F；将四环素浓度为0的牛奶溶液进行荧光光谱检测，得到在308nm处荧光强度峰值F0；通过式(1)计算得到不同四环素浓度的淬灭程度C；
C＝(F0-F)/F0 (1)
(4)通过不同浓度的四环素牛奶溶液的荧光强度淬灭程度的关系曲线如图4(a)插图，淬灭程度C和四环素浓度I的拟合曲线如图4(b)，从图4(a)(b)可以看出：当四环素浓度为25-500mg/L范围内，碳点的猝灭程度C与四环素浓度I成线性关系，线性回归方程为C＝0.00795I+0.01535，决定系数R2＝0.991，检测限为70.61μg/L。
实施例4加标回收验证
表1中为DUV-CDs方法检测牛奶中四环素的加标回收率和RSD
Figure BDA0003573273620000051
实施例5碳点浓度的优化
由于牛奶本身的荧光光谱的存在，检测牛奶中四环素时需要先对DUV-CDs的浓度进行优化。将DUV-CDs原液进行稀释，分别为3倍，6倍，9倍，15倍，30倍，60倍，将2mL牛奶分别与2mL水和2mL 100mg/L四环素混合，得到50mg/L的四环素牛奶溶液。再加入6mL乙腈，震荡后超声10分钟，12000转/分钟离心15分钟，再使用0.22μm过滤膜过滤，得到清澈透明的无四环素的牛奶预处理样品和有四环素的牛奶预处理样品。取0.4mL各浓度的碳点与2mL无四环素的牛奶预处理样品和2mL有四环素的牛奶预处理样品分别混合，测量273nm激发下的发射光谱得到图5。图5(a)为碳点、碳点-牛奶预处理和牛奶预处理的归一化光谱对比，可以看出牛奶的加入会对碳点的光谱产生一定影响，最为明显的是在325nm-400nm之间出现的变化，碳点的峰值波长也出现了一定的偏移，对比可以确定是由于牛奶本身的荧光光谱与碳点叠加而成的光谱。所以当实验中碳点浓度较低时，会受到牛奶本身光谱较大的影响，碳点浓度需要进行优化。图5(b)为牛奶和标准添加了四环素的牛奶中加入不同浓度碳点的猝灭程度柱状图，当碳点浓度为稀释9-60倍时，此时碳点的荧光逐渐变弱，受到牛奶本身光谱越来越大，导致猝灭程度逐渐降低。当碳点浓度为稀释3-9倍时，此时碳点浓度较高，四环素对其的影响减小，对比之后选择碳点浓度为原液稀释9倍，此时碳点的荧光已经可以基本不受牛奶本身荧光的影响。

Claims (10)

1.一种基于深紫外发射碳点作为荧光探针检测牛奶中的四环素类抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备深紫外发射碳点：将2，4-二羟基苯甲酸和赖氨酸加入到水中，混匀进行水热反应，结束后，固液分离、收集滤液，得到深紫外发射碳点溶液；
(2)将一系列已知浓度的四环素牛奶溶液与乙腈混合、膜过滤，获得相应四环素测试样品；
(3)稀释步骤(1)所得深紫外发射碳点溶液，然后与步骤(2)的四环素测试样品混合，采集相应的荧光光谱信息，分别获得四环素浓度为0时样品的荧光强度峰值F0、以及其他浓度时样品的荧光强度峰值F；通过(F0-F)/F0计算得到淬灭程度C，以淬灭程度C与相应样品的四环素浓度进行线性关联，获得定量检测模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，2，4-二羟基苯甲酸和赖氨酸质量比为(0.8-1.2)：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，赖氨酸相对水的浓度为6-8mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，水热反应是在180℃下反应10h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，，步骤(2)中，四环素牛奶溶液通过如下过程配置：将四环素溶于水中，获得四环素水溶液；然后与牛奶混合，获得四环素牛奶溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，四环素牛奶溶液的浓度范围为0-200mg/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，四环素牛奶溶液与乙腈的体积比为2：3。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，稀释步骤(1)所得深紫外发射碳点溶液的稀释倍数为9倍。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述荧光强度峰值是指在308nm处荧光强度峰值。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法在食品检测领域中的应用。
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CN116814256A (zh) * 2023-06-28 2023-09-29 江南大学 一种双发射碳点荧光探针及其制备方法与应用

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