CN104914099A - 一种基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，包括：以单链核酸布洛芬适配体为布洛芬的识别探针，将不同浓度的布洛芬标准溶液与金纳米颗粒溶液、单链核酸布洛芬适配体溶液和盐溶液混合，得到不同浓度的标准检测液，经过反应后，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，通过紫外分光光度计检测体系的吸光值，绘制标准曲线，利用该标准曲线检测待测样品中的布洛芬的浓度。本发明的检测工作可在较短时间内完成并得到定性和定量检测结果，本发明还具有特异性高，稳定性好，应用范围广，成本低廉等优点，易于推广常规应用。
Description
技术领域
本发明涉及属于比色分析和环境检测技术领域，尤其涉及一种检测布洛芬的适配体生物传感器，以及该传感器的制备与检测方法。
背景技术
近几年，人们开始关注药品和个人护理用品(pharmaceuticals and personal careproducts，PPCPs)这类微量污染物对人类健康和生态环境的影响，并发展成全世界的热点问题。药品和个人护理用品(PPCPs)包括各种处方药和非处方药(中药、固醇激素、消炎药、抗生素、类止痛剂、镇定剂、降压药等各种药物)、个人护理及护肤化妆品、香料、保健品、染发剂、诊断剂、消毒剂、清洁剂和其它在生产制造中添加的组分如防腐剂等，涵盖范围十分广泛。目前，在西方发达国家和第三方检测报告中已经开始尝试对部分PPCPs药品的环境含量作限量要求，从而引起人们对由PPCPs引起的水体污染及其迁移转化及去除的关注。国外已有研究表明，部分PPCPs药物能够对人类及其他生物具有生殖、神经等方面的毒理学效应或具有致癌的可能性。
布洛芬的化学名称为2-(-4-异丁基苯基)丙酸，分子式为C13H18O2，分子量为206.3。该药具有抗炎、镇痛、解热作用，是一种临床常用的非甾体抗炎药物，也是PPCPs中的一种。环境中的布洛芬浓度通常为ng/L～μg/L，因此要想研究它们引起的水体污染及其迁移转化及去除方法，就需要建立有效的富集方法和灵敏的分析检测方法。依靠传统仪器检测虽然具有检测灵敏度高，检测结果稳定性好等优点，但是大型仪器通常价格较为昂贵，并且需要具备相关知识的专业操作人员，同时存在检测成本高昂等缺点，限制了大型仪器的大规模检测和现场快速检测。基于免疫分析的酶联免疫吸附法可以解决大型仪器的检测成本高和不能够用于现场检测的缺点，但由于酶联免疫吸附法在检测过程中需要多步的反复洗涤和分离的过程，以及需要具有一定专业知识的人进行操作，一定程度上也限制了该方法的广泛推广使用。金纳米粒子核酸适配体探针的检测方法的推广和使用，将是应对大规模样品高通量、快速检测的有效方法，金纳米粒子探针的相关检测方法的使用不需要操作人员具有较深的专业知识背景即可使用。本发明针对传统大型仪器检测方法不能够实现现场、高通量、快速检测的缺点，利用金纳米粒子和核酸适配体制备金纳米粒子核酸适配体复合物探针，用于实现环境污染中布洛芬的快速超灵敏检测。
发明内容
本发明的目的就是针对现有检测布洛芬技术的灵敏度不高、操作复杂等不足而提供一种基于布洛芬适配体传感器的电化学分析方法，本发明描述了使用一段可特异性识别布洛芬的单链核酸适配体探针与金纳米粒子结合形成金纳米粒子-核酸适配体复合探针，在有布洛芬存在的情况下，核酸适配体探针与布洛芬特异性结合，从而引起金纳米粒子表面核酸适配体构象变化，使得金纳米粒子对盐的耐受能力降低从而出现金纳米粒子聚沉出现蓝色的现象，实现对布洛芬的超灵敏快速检测。
为了达到上述目的，本发明提供了一种基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，包括：以单链核酸布洛芬适配体为布洛芬的识别探针，将不同浓度的布洛芬标准溶液与金纳米颗粒溶液、单链核酸布洛芬适配体溶液和盐溶液混合，得到不同浓度的标准检测液，经过反应后，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，通过紫外分光光度计检测体系的吸光值，绘制标准曲线，利用该标准曲线检测待测样品中的布洛芬的浓度。
优选地，所述的单链核酸布洛芬适配体为长度为76bp的单链DNA探针，5′端修饰了巯基(-SH)。
优选地，所述的单链核酸布洛芬适配体的序列为：5′-SHATACCAGCTTATTCAATTCCACAGACCCTTAGCTTTCCTATTATTCTGCGCGACGCTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3′。
优选地，所述的单链核酸布洛芬适配体溶液的浓度为0.2μM。
优选地，所述的反应时间为30min。
优选地，所述的盐溶液为氯化钠溶液。
更优选地，所述的盐溶液的浓度为浓度为1M。
优选地，所述的吸光值为在650nm和520nm处的吸光值A650和A520；以A640/A520为标准曲线的横坐标或纵坐标。
优选地，所述的待测样品为环境水样。
优选地，所述的金纳米颗粒溶液的制备方法包括：将氯金酸水溶液在油浴中加热恒温于92±4℃，在搅拌条件下，加入柠檬酸三钠溶液，氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶4，继续搅拌反应至溶液变成清亮透明的橙红色或紫红色，得到金纳米颗粒溶液。
更优选地，所述的金纳米颗粒溶液的制备过程中所用到的玻璃器皿均经过彻底清洁，所述的清洁步骤包括清洗后，用铬酸洗液充分浸泡12-36h，后用清水将铬酸洗液冲洗干净，最后用超纯水冲洗3-4遍，放入烘箱干燥，待用。
本发明的原理在于：
本发明基于核酸适配体探针的非标记型布洛芬的快速比色检测法，以单链核酸适配体为布洛芬的识别探针，使用金纳米粒子，在没有单链核酸适配体探针保护的条件下会由于高盐浓度引起金纳米粒子的聚沉；当所述金纳米粒子上有可以特异性识别布洛芬的核酸适配体探针保护的条件下，不会被相同浓度的盐溶液引起金纳米粒子的聚沉；在有布洛芬核酸适配体探针保护的金纳米粒子溶液中，加入不同浓度的布洛芬溶液后，布洛芬与能识别布洛芬的核酸适配体探针特异性结合，引起金纳米粒子表面核酸适配体探针的脱落，从而重新引起金纳米粒子的聚沉淀现象；不同浓度的布洛芬溶液引起金纳米粒子聚沉的程度不同，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，实现布洛芬的快速现场检测。
本发明利用可特异性识别布洛芬的核酸适配体探针与金纳米粒子非特异性结合，得到核酸适配体-金纳米粒子复合物探针，保护金纳米粒子溶液耐受一定浓度的盐溶液而不发生聚沉现象。而在布洛芬存在的条件下，核酸适配体探针与布洛芬特异性结合，引起布洛芬核酸适配体在金纳米粒子表面产生构象变化，使得金纳米粒子失去耐盐能力而聚集，从而建立了布洛芬的非标记型快速、超灵敏、现场比色检测法，通过肉眼观察金纳米粒子溶液的颜色变化，定性分析检测体系中是否存在目标检测物布洛芬；通过建立反应后金纳米粒子溶液的紫外-可见吸光光度值，建立吸光光度值与布洛芬浓度之间的线性关系，实现定量检测目标物布洛芬的浓度，整个检测工作可在较短时间内完成并得到检测结果。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)提供了一种对目标布洛芬非常敏感的适配体作为分子识别元件。与抗体相比，核酸适配体具有靶分子范围广，亲合力强，特异性高，稳定性好，制备、修饰方便快速，变性复性可逆，分子量小，无毒性、无免疫原性、组织渗透性好等优点。检测工作可在较短时间内完成并得到定性和定量检测结果。
(2)基于本发明所述的适配体，制备得到相应的适配体电化学生物传感器，可以将样品中布洛芬目标物的存在转变为光信号进行快速检测。它将比色方法的高灵敏性和适配体高度特异性识别作用相结合，制备简单、灵敏度高、检测费用低、易于微型化、可再生，不受样品中其它情况干扰。
(3)本发明解决了现有布洛芬检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长的缺点。本发明采用可特异性识别布洛芬的核酸适配体应用于比色分析生物传感器，大大提高了检测的灵敏性和特异性，降低了检测成本和检测方案的复杂性，是一种检测快速，检测成本低，检测灵敏性高，操作简单的检测技术。
(4)本发明为通用型检测方法，只需要将与金纳米粒子非特异性结合的核酸适配体探针的序列进行相应的改变和替换，即可实现其他目标物的快速、现场检测。
附图说明
图1为基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法示意图；
图2为适配体修饰纳米金比色法检测布洛芬的紫外-可见吸收光谱图；
图3为适配体修饰纳米金比色法检测布洛芬浓度与吸光度比值线性关系图；
图4为适配体修饰纳米金比色法检测布洛芬特异性检测结果图；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1适配体修饰纳米金比色法对布洛芬的检测
一种基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，具体步骤如图1所示：
1、制备金纳米颗粒：
(1)玻璃器皿的清洁
多次试验证明，玻璃器皿的清洁是纳米金制备成功与否的关键，如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的形成，形成颗粒大小不以、颜色微红、无色或浑浊不透明的溶液。所以必须在制备纳米金之前将所有玻璃器皿彻底清洁，所述的清洁步骤为认真清洗后，用铬酸洗液充分浸泡24h，后用清水将铬酸洗液冲洗干净，最后用超纯水冲洗3-4遍，放入烘箱干燥，待用。
(2)具体制备步骤
100mL圆底烧杯中加入50mL超纯水，用洗净的1mL移液管移取0.5mL事先配置好的1％的氯金酸水溶液于50mL超纯水中，使得溶液中氯金酸浓度降低至0.01％(w/v)，将此溶液在油浴中加热恒温与92±4℃。在磁子的剧烈搅拌下，迅速加入1.6mL事先配置好的柠檬酸三钠溶液(1％)，氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶300，继续搅拌反应，在反应的前三分钟，溶液基本没变化，3分钟之后，溶液开始变蓝，几分钟后变为蓝紫，继续恒温搅拌，在20分钟之后溶液变红，最后变成清亮透明的橙红色，即为金纳米颗粒溶液。
2、单链核酸布洛芬适配体的制备：
本发明所述的单链核酸布洛芬适配体序列为：
5′-SHATACCAGCTTATTCAATTCCACAGACCCTTAGCTTTCCTATTATTCTGCGCGACGCTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3′。
将单链核酸布洛芬适配体离心后加入Tris-HCl缓冲溶液溶解为1μmol/L溶液放入4℃冰箱中备用。
3、标准曲线的绘制：
以单链核酸布洛芬适配体为布洛芬的识别探针，在8个2mL离心管中各加入200μL步骤1制备的浓度为25nmol/L的金纳米颗粒溶液，100μL步骤2制备的1μmol/L单链核酸布洛芬适配体溶液，得到金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液，再分别加入0、10、40、70、100、130、160、190μL布洛芬标准溶液，用超纯水定容至500μL，再加入10μL 1M氯化钠溶液，得到不同浓度的标准检测液。常温下反应30min，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，通过紫外分光光度计在190-800nm波长范围内扫描检测体系的紫外-可见吸收光谱，得到体系在650nm和520nm处的吸光值A650和A520(OD)，以布洛芬浓度为横坐标，A640/A520为纵坐标得到标准曲线，建立紫外吸收峰强度与目标布洛芬浓度之间的线性关系，如图2所示，绘制标准曲线，得到回归方程为：y＝0.02592x+0.54205，R2＝0.9902，整个实例方法所得检出限(S/N＝3)为0.0004ng/mL，实现布洛芬的超灵敏定量检测。
4、利用该标准曲线检测待测样品中的布洛芬的浓度：
实际水样取自中国上海市松江区广富林路的生活小区内，在2mL离心管中加入200μL步骤1制备的浓度为25nmol/L的金纳米颗粒溶液，100μL步骤2制备的1μmol/L单链核酸布洛芬适配体溶液，得到金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液，再加入100μL(稀释比例1∶100)稀释后的实际水样，用超纯水定容至500μL，再加入10μL 1M氯化钠溶液，室温下孵育30min后如中左面第二个样品所示，并用100μL超纯水溶液做空白对照；通过紫外分光光度计在190-800nm波长范围内扫描检测体系的紫外-可见吸收光谱，得到体系在650nm和520nm处的吸光值A650和A520(OD)，通过实施例1中得到的传感器灵敏度曲线y＝0.02592x+0.54205，R2＝0.9902可以计算出水样中所含布洛芬的含量为10μg/L。
对比例1：适配体修饰纳米金比色法对萘普生的检测
在2mL离心管中加入200μL步骤1制备的浓度为25nmol/L的金纳米颗粒溶液，100μL步骤2制备的1μmol/L单链核酸布洛芬适配体溶液，得到金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液，加入浓度为100μM萘普生溶液的100μL，用超纯水定容至500μL，再加入10μL 1M氯化钠溶液，室温下孵育30min后如图3中所示左面第三个样品所示，并用100μL超纯水溶液做空白对照；一方面通过肉眼观察离心管中溶液的聚沉情况和颜色变化，通过与空白对照管的比较，发现颜色不会发生明显变化，接近于空白对照管的颜色，说明适配体修饰纳米金比色法不会对干扰物萘普生产生反应，另一方面紫外可见风光光度计测定上述离心管中溶液，图4为分别测定含有金纳米粒子核酸适配体探针复合物与100μL超纯水溶液、布洛芬溶液、氟比洛芬溶液、萘普生溶液在190-800nm处的紫外-可见吸收光谱，可以得到在萘普生溶液在650nm没有出现新的峰，即说明核酸适配体探针不能与萘普生特异性结合，金纳米粒子在核酸适配体探针的存在下产生耐盐能力而没有产生聚集，即此方法可以应用于特异性识别萘普生和布洛芬的混合物。
对比例2适配体修饰纳米金比色法对氟比洛芬的检测
在2mL离心管中加入200μL步骤1制备的浓度为25nmol/L的金纳米颗粒溶液，100μL步骤2制备的1μmol/L单链核酸布洛芬适配体溶液，得到金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液，加入加入浓度为100μM氟比洛芬溶液的100μL，用超纯水定容至500μL，再加入10μL 1M氯化钠溶液，室温下孵育30min后如图3中所示左面第四个样品所示，并用100μL超纯水溶液做空白对照；一方面通过肉眼观察离心管中溶液的聚沉情况和颜色变化，通过与空白对照管的比较，发现颜色不会发生明显变化，接近于空白对照管的颜色，说明适配体修饰纳米金比色法不会对干扰物氟比洛芬产生反应，另一方面用紫外可见风光光度计测定上述离心管中溶液，图4为分别测定含有金纳米粒子核酸适配体探针复合物与100μL超纯水溶液、布洛芬溶液、氟比洛芬溶液、萘普生溶液在190-800nm处的紫外-可见吸收光谱，通过图4在190-800nm处的紫外-可见吸收光谱，可以得到氟比洛芬溶液在650nm没有出现新的峰，即说明核酸适配体探针不能与氟比洛芬特异性结合，金纳米粒子在核酸适配体探针的存在下产生耐盐能力而没有产生聚集，峰没有产生迁移，即此方法可以应用于特异性识别氟比洛芬和布洛芬的混合物。
Claims (10)
1.一种基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，包括：以单链核酸布洛芬适配体为布洛芬的识别探针，将不同浓度的布洛芬标准溶液与金纳米颗粒溶液、单链核酸布洛芬适配体溶液和盐溶液混合，得到不同浓度的标准检测液，经过反应后，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，通过紫外分光光度计检测体系的吸光值，绘制标准曲线，利用该标准曲线检测待测样品中的布洛芬的浓度。
2.如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，所述的单链核酸布洛芬适配体为长度为76bp的单链DNA探针，5′端修饰了巯基。
3.如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，所述的单链核酸布洛芬适配体的序列为：5′-SHATACCAGCTTATTCAATTCCACAGACCCTTAGCTTTCCTATTATTCTGCGCGACGCTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3′。
4.如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，所述的单链核酸布洛芬适配体溶液的浓度为0.2μM。
5.如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，所述的反应时间为30min。
6.如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，所述的盐溶液为氯化钠溶液。
7.如权利要求6所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，所述的盐溶液的浓度为1M。
8.如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，所述的吸光值为在650nm和520nm处的吸光值A650和A520；以A640/A520为标准曲线的横坐标或纵坐标。
9.如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，所述的待测样品为环境水样。
10.如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，所述的金纳米颗粒溶液的制备方法包括：将氯金酸水溶液在油浴中加热恒温于92±4℃，在搅拌条件下，加入柠檬酸三钠溶液，氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶4，继续搅拌反应至溶液变成清亮透明的橙红色或紫红色，得到金纳米颗粒溶液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150916 |