CN112666156A - 一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法，该方法是将纳米金溶液与目标生物大分子适配体共同孕育，得到适配体@AuNPs复合物溶液；将适配体@AuNPs复合物溶液分别与一系列不同浓度的标准目标生物大分子溶液共同孕育后，再加入NaCl溶液，且控制溶液体系pH，依据标准目标生物大分子溶液浓度和显色的关系，建立浓度与颜色比对卡；将待测标准目标生物大分子溶液替换标准目标生物大分子溶液进行反应后，根据NaCl溶液显示的颜色在浓度与颜色比对卡确定待测目标生物大分子溶液的浓度范围，该方法具有特异性高、灵敏度高、检测范围广等特点，且可以实现可视化检测生物大分子。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物大分子的可视化检测方法，特别涉及一种通过将核酸适体作为识别分子，用没有修饰的金纳米颗粒作为信号探针，通过体系颜色的变化便可以肉眼准确区分体系中生物大分子的浓度范围，属于生物传感领域。
背景技术
近年来，随着生物传感器的快速发展，生物大分子(如胰岛素、蛋白等)的检测方法也变得多种多样，主要有表面等离子体共振、电化学发光、荧光、电化学生物传感法和酶联免疫吸附法等，这些检测方法虽然具有高灵敏度和高选择性，但是比较耗时，成本昂贵，且需要特定的仪器设备，这将严重影响它们的实际应用。因此，建立一种简便、特异、灵敏、准确的生物大分子检测方法具有重要意义。
由于金纳米颗粒自身的高消光系数、唯一的尺寸和形状以及尺寸依附光学性质等性质，目前其已被广泛应用于检测金属离子、核酸、酶和蛋白等(Bai X,Shao C,Han X,etal.Visual detection of sub-femtomole DNA by a gold nanoparticle seededhomogeneous reduction assay:Toward a generalized sensitivity-enhancingstrategy[J].Biosensors&Bioelectronics,2010,25(8):1984-1988.)。在以往的研究中，金纳米粒子表现出了非凡的光学响应，这主要是由于其优异的局域表面等离子体共振(LSPR)特性。金纳米粒子的吸收光谱在可见光范围内，该特性允许研究者们用肉眼目视检测各种分析物。但是目前基于金纳米粒子的比色传感器仍存在许多问题：首先，外界环境的变化(温度、pH、盐和带电分子)可能导致纳米粒子的聚集，这种无反应的聚集会导致假阳性/阴性结果，从而影响比色的结果。有文献曾报道盐的阳离子或阴离子组成不同会影响金纳米粒子比色传感的结果 (Liu X,He F,Zhang F,et al.Dopamine and MelamineBinding to Gold Nanoparticles Dominates Their Aptamer-Based Label-FreeColorimetric Sensing[J]. Analytical Chemistry,2020,92(13),9370-9378.)。其次，有些纳米颗粒上识别的分子可能需要进行繁琐的修饰，这会导致整个的检测过程十分漫长。第三，在一些比色实验中，金纳米溶液的颜色变化强度或变色种类有限，使得用肉眼进行比色鉴定变得困难(Ma X,He S,Qiu B,et al.Noble Metal Nanoparticle-BasedMulticolor Immunoassays:An Approach toward Visual Quantification of theAnalytes with the Naked Eye[J].Acs Sensors,2019.)。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种特异性高、灵敏度高、检测范围广的可视化检测生物大分子的方法。
本发明提供的检测生物大分子的方法，并非以治疗和诊断疾病为直接或间接目的，而仅仅是为解决现有技术在检测生物大分子的方法存在的一些缺陷作出改进。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法，该方法包括以下步骤：
1)以浓度为5～15nM纳米金溶液与目标生物大分子适配体按摩尔比1:4～6 共同孕育，得到适配体@AuNPs复合物溶液；
2)将适配体@AuNPs复合物溶液分别与一系列不同浓度的标准目标生物大分子溶液共同孕育后，再与浓度为40～80mM的NaCl溶液反应，且控制溶液体系pH在6～8范围内，依据不同浓度的标准目标生物大分子溶液对应的氯化钠溶液显示不同颜色，建立浓度与颜色比对卡；
3)将待测标准目标生物大分子溶液替换步骤2)的标准目标生物大分子溶液进行反应后，根据氯化钠溶液显示的颜色在浓度与颜色比对卡确定待测目标生物大分子溶液的浓度范围。
本发明提出的对生物大分子可视化特异性检测的方法，检测原理如下：一般来说纳米金溶液本身显示红色，且其能够稳定、均一地存在，但是在加入高浓度的氯化钠溶液时，由于产生电子屏蔽效应使纳米金聚沉，从而导致纳米金溶液显示蓝色，同时，纳米金的紫外特征吸收峰发生红移。而发明人发现，当在纳米金溶液中加入适量比例以及适当碱基含量的适配体时，纳米金溶液在高浓度氯化钠溶液中仍保持红色，主要是因为加入的适配体能暴露足够的带负电荷的碱基吸附到纳米金表面，形成适配体-纳米金复合物(适配体@GNPs)，当静电斥力大于范德华吸引力时，可以有效阻止纳米金受范德华吸引而聚沉，从而增强纳米金的稳定性，使其不聚沉，因此适量的适配体起到了保护纳米金的作用。基于上述原理，当向适配体@GNPs体系中加入与适配体对应的生物大分子时，生物大分子和适配体之间特异性结合，造成适配体从纳米金表面上脱附下来，使纳米金的耐盐性降低，结果使得在高浓度氯化钠溶液中纳米金发生聚沉，溶液的颜色由红色变为紫色或者蓝色，且随着生物大分子浓度的增加，造成越来越多的适配体从纳米金表面脱离下来，使越来越多的纳米金失去保护，体系内纳米金聚集的比例不断增加，使溶液的颜色由红色逐渐变为紫红，紫蓝和蓝色。需要特别说明的是，一般纳米金在氯化钠溶液中通过聚集或分散发生紫外吸收变化是公知的，但是金纳米溶液的颜色变化强度或变色种类有限，使得用肉眼进行比色鉴定变得困难，因此难以通过肉眼判断其显色变化，而本发明的关键严格控制适配体与纳米金反应比例，以及控制NaCl溶液的浓度和pH，使得纳米金的聚沉导致的颜色变化现象可以直接用肉眼进行观察，从而仅通过颜色的变化便能实现对生物大分子的定性和定量检测。
作为一个优选的方案，所述纳米金平均水合粒径为20～25nm。
作为一个优选的方案，纳米金与目标生物大分子适配体的摩尔比例为1:5。当AuNPs与IBA的比例为1:5时，整个反应体系达到最佳状态，各种浓度的目标生物大分子溶液在高浓度氯化钠溶液中的颜色区分度更加明显，更有利于直接通过肉眼区分不同浓度的目标生物大分子。
作为一个优选的方案，所述目标生物大分子适配体包含30～40个碱基。碱基数量过高或过低都会影响纳米金在氯化钠溶液中的稳定性以及显色，以胰岛素适配体为例，与加入36个碱基的适配体(5’-GCT GGT GGT GGG GGG GGT GGT AGG GTG TCT TCT TCG-3’)和40个碱基的适配体(5’-AGC TTG GTG GTG GGG GGG GTG GTA GGG TGT CTT CTT CGA A-3’)的体系相比，加入30个碱基的适配体(5’-GGT GGT GGG GGG GGT GGTAGG GTG TCT TCT-3’)的体系颜色区分度更加明显，可以更清楚的区分不同浓度区间内的胰岛素浓度。
作为一个优选的方案，所述NaCl溶液的浓度为55～65mM。当NaCl的浓度为60mM时，整个溶液体系的灵敏度达到最佳状态。对适配体@GNPs体系在加入和未加入目标生物大分子的这两种情况进行对比，于适配体@GNPs体系未加入目标生物大分子时，在518nm处的紫外吸收值减去适配体@GNPs体系中加入胰岛素时在518nm处的紫外吸收值的吸收差值在盐浓度为60mM时达到最大值，且在该浓度下，体系颜色区分度更加明显，因此，当盐浓度为60mM时是体系最佳的盐浓度。
作为一个优选的方案，溶液体系的pH控制在7～7.5范围内，最好是控制溶液体系的pH值为7.4，在太酸性或者太碱性条件下，体系是不稳定的，这可能是由于在低pH(<6)或者高pH(>8)条件下会影响溶液的静电反应，从而影响其显色。
作为一个优选的方案，目标生物大分子适配体与纳米金共同孕育的时间不小于3min。
作为一个优选的方案，适配体@AuNPs复合物与标准目标生物大分子溶液或待测目标生物大分子溶液共同孕育的时间不小于3min。
作为一个优选的方案，加入NaCl溶液反应的时间不小于3min。
本发明提出的对生物大分子可视化特异性检测的方法，生物大分子可以为胰岛素，以生物大分子选择胰岛素为例进行说明。如选择的胰岛素适配体的序列为： 5’-GGTGGT GGG GGG GGT GGTAGG GTG TCT TCT-3’(可购买于生工生物工程(上海)股份有限公司)。
本发明纳米金通过如下具体方法合成：在三口烧瓶中加入100mL 0.01％ (w/v)氯金酸(HAuCl4)水溶液，并不断搅拌，当溶液加热到沸腾时，快速加入2mL 2％(w/v)柠檬酸钠，这时出现明显的颜色变化，由无色到黑蓝再到紫最后是酒红色，这时继续加热15min，在此过程中保持回流状态并不断搅拌，将三口烧瓶从油浴锅中移出，放置到搅拌器上继续搅拌，冷却到室温，即得到纳米金溶液。
本发明利用纳米金溶液来合成适配体@AuNPs复合物的具体方法：在离心管中加入50μL 20nM准备好的纳米金(最终浓度10nM)，向其加入10μL 500nM 生物大分子适配体(最终浓度50nM)培育3min，使其形成适配体-AuNPs复合物溶液。
本发明的适配体-纳米金复合物用于检测过程：向上述适配体@GNPs溶液中加入20μL不同浓度的胰岛素，再培育3min，随后，向其加入20μL 300mMNaCl (最终浓度60nM)，使最终的体积达到100μL，并调节pH在7.4，保持溶液体系平衡3min，用肉眼直接观察颜色变化进行定性分析，并通过与颜色比对卡上的颜色进行对比得知其大概的浓度范围。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
本发明的技术方案通过适配体与金纳米颗粒的有效组装，在高盐环境下实现了对生物大分子特异性的检测，具有信号强、特异性高、灵敏度高、检测浓度范围广等优点，有利于生物大分子的定性和定量应用。
本发明的技术方案金纳米颗粒通过DNA核酸序列来稳定，其稳定性好，具有稳定信号，且纳米粒子的尺寸小，耐环境影响力强；并且应用核酸适体的高选择性和特异性的特点可以有效改善现有技术灵敏度低和检测限的问题。
本发明的技术方案利用金纳米颗粒与核酸适体的有效组装在高盐环境下对胰岛素的检测，可以通过肉眼直接判断，具有快速、高效，准确的特点，仅需3 min作用，即可达到稳定的检测，检测的结果准确性高。
附图说明
【图1】为纳米金浓度对体系的影响。
【图2】为适配体序列对于比色适体传感器的影响。
【图3】为AuNPs与核酸适体按不同比例组装后上清液的紫外吸光度图。
【图4】为NaCl浓度对纳米金溶液的紫外吸收光谱在518nm处的峰值的影响。
【图5】为pH对IBA@GNPs复合物在加入胰岛素后A685/A518值的影响。
【图6】为在未加入和加入胰岛素的纳米金溶液聚沉的动力学曲线。
【图7】为对目标物和干扰物做的特异性检测图。
【图8】为体系与不同浓度胰岛素反应后的颜色变化图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制权利要求的保护范围。
实施例1
合成纳米金的具体过程如下：首先，在三口烧瓶中加入100mL 0.01％(w/v) 氯金酸(HAuCl4)水溶液，并不断搅拌，当溶液加热到沸腾时，快速加入2mL 2％ (w/v)柠檬酸钠，这时出现明显的颜色变化，由无色到黑蓝再到紫最后是酒红色，这时继续加热15min，在此过程中保持回流状态并不断搅拌，将三口烧瓶从油浴锅中移出，放置到搅拌器上继续搅拌，冷却到室温，将合成的纳米金溶液转移到干净的试剂瓶中。
纳米金的表征主要通过三种检测手段：首先是利用紫外分光光度计检测合成的纳米金，在518nm处出现明显的吸收峰。根据文献，13nm的纳米颗粒在518 nm处的紫外吸光系数是2.78×108M-1·cm-1，基于此可估算出合成的纳米金的浓度大约为2.5nM。用动态光散射检测合成的纳米金，平均水合粒径为23.01nm，粒径比较均一。最后用透射电子显微镜检测合成的纳米金，纳米金比较分散，颗粒大小基本相同。以上表征说明纳米金合成成功，将纳米金溶液储存在4℃冰箱里以备后面使用。
比色法检测胰岛素：
比色法适配体传感器对胰岛素进行检测，主要包括两部分内容，第一部分内容是用肉眼观察溶液的颜色进行定性分析，得到颜色显色底板，用于区分与胰岛素相关的疾病，第二部分内容是用紫外可见分光光度计检测胰岛素进行定量分析。
检测胰岛素的具体步骤如下：首先在离心管中加入50μL 20nM准备好的纳米金，向其加入10μL500nM胰岛素的适配体IBA(最终浓度50nM)培育3min 使其形成适配体-纳米金复合物(IBA@GNPs)，然后向IBA@GNPs溶液中加入 20μL不同浓度的胰岛素，再培育3min。随后，向其加入20μL of 300mMNaCl (最终浓度60nM)，使最终的体积达到100μL。调节溶液体系pH＝7.4，并保持溶液体系平衡3min，用肉眼直接观察颜色变化进行定性分析，并用相机拍下此时的颜色，然后用紫外吸收分光光度计检测该溶液体系进行定量分析，检测波长范围是从850到400nm，保存实验数据。所有的实验步骤在室温下进行操作。图1为纳米金浓度对比色适配体传感器的影响，纳米金原始浓度估算为2.5nM。从图中可以看出当纳米金浓度太大时，颜色过深，区分度不高，当纳米金浓度太小时，颜色太浅，区分不开，因此最合适的浓度是原始纳米金浓度的4倍，因此实验过程中使用的纳米金浓度的估算值是10nM。
图2为适配体序列对于比色适体传感器的影响，(A)30个碱基的适配体序列；(B)36个碱基的适配体序列；(C)40个碱基的适配体序列在不同浓度胰岛素下对应的颜色图。从图中可以看出，相比于36和40个碱基的适配体来讲，30 个碱基的适配体颜色区分度更高，说明对于此比色体系来说，30个碱基的适配体是最合适的适配体。
图3为AuNPs与核酸适体(30个碱基)按不同比例组装后上清液的紫外吸光度图。从图中可以看出AuNPs与核酸适体最合适的比例为1:5。
图4为纳米金溶液的紫外吸收光谱在518nm处的峰值来说明NaCl浓度的影响。未修饰的纳米金溶液(a)，适配体@AuNPs复合物在未加入(b)和加入 (c)胰岛素，这些体系在加入不同浓度的NaCl之后绘制的图。净吸光度(d) 等于适配体@AuNPs复合物在未加入(b)和加入(c)胰岛素的吸收值的差值。从(d)曲线可以看出，在518nm处的吸收差值在盐浓度为60mM时达到最大值。由此可知，当盐浓度为60mM时是最佳的盐浓度，在该浓度下，实验的灵敏度最好。
图5为适配体@AuNPs复合物在加入胰岛素后A685/A518值来出示pH的影响。插图是与pH相对应的颜色变化图。从图中可以看出，体系在pH＝6～8时是比较稳定的，在太酸性或者太碱性条件下，体系是不稳定的，体系的颜色变化如插图所示。因此，本方案选择pH＝7.4作为最合适的pH。
图6为在未加入和加入胰岛素的纳米金溶液聚沉的动力学曲线。如图所示，随着反应时间的增加，吸收值比率A685/A518也增加，并在3min时达到平稳。因此，基于实验的高灵敏度和省时的要求，本方案选择3min为最佳的检测时间。
图7为比色适配体传感器针对不同的目标物的选择性，胰岛素的浓度是0.5nM， PB的浓度是10nM，HSA和HIgG的浓度都是100nM。插图为与不同的溶液体系相对应的颜色图。说明该比色适配体传感器的选择性是非常好的，对胰岛素的检测不受其他物质的干扰。
图8为不同浓度胰岛素对应的颜色图。该图可作为胰岛素浓度的标准显色底板，当用该比色适配体传感器用来检测胰岛素时，可直接通过肉眼观察进行定性分析，而不需要其他复杂的仪器，同时，观察溶液的颜色并与标准显示底板进行对比，就可以判断出胰岛素的含量区间。
Claims (7)
1.一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)以浓度为5～15nM纳米金溶液与目标生物大分子适配体按摩尔比1:4～6共同孕育，得到适配体@AuNPs复合物溶液；
2)将适配体@AuNPs复合物溶液分别与一系列不同浓度的标准目标生物大分子溶液共同孕育后，再与浓度为40～80mM的NaCl溶液反应，且控制溶液体系pH在6～8范围内，依据不同浓度的标准目标生物大分子溶液对应的氯化钠溶液显示不同颜色，建立浓度与颜色比对卡；
3)将待测标准目标生物大分子溶液替换步骤2)的标准目标生物大分子溶液进行反应后，根据氯化钠溶液显示的颜色在浓度与颜色比对卡确定待测目标生物大分子溶液的浓度范围。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法，其特征在于：所述纳米金平均水合粒径为20～25nm。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法，其特征在于：纳米金与目标生物大分子适配体的摩尔比例为1:5。
4.根据权利要求1所述的一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法，其特征在于：所述目标生物大分子适配体包含30～40个碱基。
5.根据权利要求1所述的一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法，其特征在于：所述NaCl溶液的浓度为55～65mM。
6.根据权利要求1所述的一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法，其特征在于：所述溶液体系的pH控制在7～7.5范围内。
7.根据权利要求1所述的一种基于核酸适体和金纳米颗粒有效组装对生物大分子可视化特异性检测的方法，其特征在于：
目标生物大分子适配体与纳米金共同孕育的时间不小于3min；
适配体@AuNPs复合物与标准目标生物大分子溶液或待测目标生物大分子溶液共同孕育的时间不小于3min；
加入NaCl溶液反应的时间不小于3min。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114088786A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-02-25 | 江苏大学 | 基于钌(ii)配合物的可视化电化学发光传感器的构建方法及其在检测ota上的应用 |
| CN114533889A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-27 | 中南大学 | 一种DNA功能化PBNPs纳米酶制备方法和在靶向光热治疗剂制备中的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101278062A (zh) * | 2005-08-11 | 2008-10-01 | 伊利诺斯大学理事会 | 基于适配体的比色传感器体系 |
| CN104914099A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-09-16 | 东华大学 | 一种基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法 |
| CN106501203A (zh) * | 2016-10-09 | 2017-03-15 | 中南大学 | 一种基于核酸适体的人胰岛素检测方法 |
| CN107389665A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-24 | 江南大学 | 一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法 |
| WO2020097692A1 (en) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Newsouth Innovations Pty Limited | Methods for detecting a biological molecule |
-
2020
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101278062A (zh) * | 2005-08-11 | 2008-10-01 | 伊利诺斯大学理事会 | 基于适配体的比色传感器体系 |
| CN104914099A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-09-16 | 东华大学 | 一种基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法 |
| CN106501203A (zh) * | 2016-10-09 | 2017-03-15 | 中南大学 | 一种基于核酸适体的人胰岛素检测方法 |
| CN107389665A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-24 | 江南大学 | 一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法 |
| WO2020097692A1 (en) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Newsouth Innovations Pty Limited | Methods for detecting a biological molecule |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JUNLI FENG ET AL: "Naked-eyes detection of Shigella flexneri in food samples based on a novel gold nanoparticle-based colorimetric aptasensor", 《FOOD CONTROL》 * |
| 栾云霞等: "基于非标记核酸适配体可视化检测黄曲霉毒素 B1的方法研究", 《食品安全质量检测学报》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114088786A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-02-25 | 江苏大学 | 基于钌(ii)配合物的可视化电化学发光传感器的构建方法及其在检测ota上的应用 |
| CN114088786B (zh) * | 2021-10-19 | 2024-02-13 | 深圳万知达技术转移中心有限公司 | 基于钌(ii)配合物的可视化电化学发光传感器的构建方法及其在检测ota上的应用 |
| CN114533889A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-27 | 中南大学 | 一种DNA功能化PBNPs纳米酶制备方法和在靶向光热治疗剂制备中的应用 |
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