CN101278062A - 基于适配体的比色传感器体系 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于测定样品中分析物存在及任选地测定其浓度的基于适配体的比色传感器体系。本发明还提供了使用所述传感器体系的方法以及包括所述传感器的试剂盒。所述传感器使用连接器和寡核苷酸功能化粒子形成可响应于分析物而解聚的聚集体。

Description

基于适配体的比色传感器体系
联邦政府资助的研究或开发
本申请的主题部分地得到以下研究基金和合同的资助：国家科学基金合同号CTS-0120978和DMR-0117792。美国政府可以享有本发明的权利。
背景技术
检测样品中分析物存在与否的能力具有重要意义。例如，当诸如铅、汞、镉、铬、砷等多种金属和金属离子存在于饮用供水中时，会对健康造成严重威胁。为了防止饮用供水和其他供水受到污染，在将工业废物流排放到水处理厂之前，通常要对其进行检测。还可以在生物流体(例如血液以及来自体组织的体液)中测试多种分析物，以确定机体是否与有害物接触或者是否处于疾病状态。例如，近来需要在各种样品中测定痕量炭疸菌。
比色法通常用于检测土壤、水、废物流、生物样品、体液等中的金属和离子。与基于仪器的分析方法(例如原子吸收光谱法)相比，比色法快速，并对设备或使用者的精通程度几乎没有要求。例如，当加入含有浓度增加的硝酸根离子(NO3 -)的水样时，水族馆管理人员可以利用变为暗粉色的比色试验。按此方式，比色试验显示样品中存在待测分析物，如硝酸盐，同时通过所产生的特定色调指示样品中分析物的量。虽然常规比色试验十分有用，但其仅能应用于有限的分析物，且经常不能检测到非常少量或痕量的分析物。
由以上描述可看出，日益需要可以识别较宽范围的痕量分析物并增加分析可信度的比色传感器体系。
发明内容
一种用于检测分析物的传感器体系，所述传感器体系包括：包括响应于分析物而折叠的适配体的连接器和与第二寡核苷酸连接的第二粒子，所述第二寡核苷酸与至少一部分所述适配体互补。所述连接器可以包括延伸物，与第一粒子连接的第一寡核苷酸与至少一部分所述延伸物互补。
一种用于检测分析物的方法，所述方法包括：将聚集体与样品混合，以检测响应于所述分析物的颜色变化。所述聚集体可以包括连接器和第二粒子。所述聚集体还可以包括第一粒子，所述连接器可以包括延伸物。
一种用于检测分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：含有用于形成聚集体的体系的第一容器，所述聚集体包括第二粒子和连接器，所述连接器包括响应于分析物而折叠的适配体。所述第二粒子与第二寡核苷酸连接，所述第二寡核苷酸与至少一部分所述适配体互补。
一种用于检测适配体对分析物的灵敏性和选择性的方法，所述方法包括：将聚集体与分析物混合，检测响应于所述分析物的颜色变化，并测定是否DNA链折叠而提供颜色变化。所述聚集体包括第二粒子和连接器，所述连接器包括DNA链。所述聚集体还可以包括第一粒子。所述连接器可以包括延伸物。
为了清晰一致地理解说明书和权利要求书，提供以下定义。
术语“样品”定义为待分析的、可能含有待测分析物的组合物。通常，用于分析的样品是液态的，优选的样品是含水混合物。样品可来自任意来源，例如来自废物流的工业样品或者诸如血液、尿液或唾液等生物样品。样品还可以是工业样品或生物样品的衍生物，例如提取物、稀释物、滤液或复水的沉淀。
术语“分析物”定义为可能存在于样品中的一种或多种物质。用分析方法来测定样品中分析物的存在、量或浓度。
术语“比色”定义为一种分析方法，其中当分析物存在或不存在时，构成传感器体系的一种或多种试剂产生颜色变化。
术语“显色”(light-up)”是指响应于样品中的分析物而发生所需颜色变化的比色传感器体系。
术语“不显色”(light-down)”是指样品中存在分析物时不发生颜色变化，而在样品中不存在分析物时发生所需颜色变化的比色传感器体系。
术语“灵敏性”是指传感器体系能检测到的分析物浓度的最小增加(分辨率)或指传感器体系可以从背景信号分辨出响应于分析物的信号的最低浓度(检测下限)。因此，传感器体系对分析物越灵敏，体系对低浓度分析物的测定越好。
术语“选择性”是指在其他物质存在时，传感器体系检测目标分析物的能力。
术语“杂交”是指在低严格条件下，第一多核苷酸与至少一种第二核苷酸形成至少一个氢键的能力。
术语“适配体(aptamer)”是指响应于分析物而发生构象变化的核酸链。
术语“构象变化”是指适配体从其他状态变为三级结构的过程。为了简化，术语“折叠”可用于替换“构象变化”。
附图说明
参考以下的附图和说明可以更好地理解本发明。附图中的元件不必须是按比例绘制的，也不意图准确地表示分子或其相互作用，而重在解释本发明的原理。
图1示出测定样品中分析物存在及任选测定其浓度的比色分析方法。
图2A示出依赖于两个分析物分子而折叠的适配体。
图2B示出依赖于两个腺苷分子而折叠的适配体的碱基对。
图3A示出在腺苷分析物存在下聚集体的解聚。
图3B示出寡核苷酸功能化粒子和连接器的尾-尾杂交。
图3C示出寡核苷酸功能化粒子和连接器的头-尾杂交。
图3D示出寡核苷酸功能化粒子和连接器的头-头杂交。
图4示出通过聚集的(实线)和解聚的(虚线)金纳米粒子从样品发出的光的波长的消光比的曲线图。
图5A显示含有鸟苷(○)、胞苷(▲)、尿苷(□)和腺苷(●)的样品的消光比随时间变化的图。
图5B示出1分钟后从传感器体系颜色变化观察到的消光比和腺苷分析物浓度之间的相关性图。
图5C示出6分钟内多个腺苷浓度的消光比的曲线图。
图6A示出钾离子传感器体系的连接器的延伸物和适配体部分以及寡核苷酸功能化粒子的序列。
图6B示出在K(I)分析物存在下折叠的适配体。
图6C示出钾离子传感器对于多种金属离子的消光比。
图7A示出可卡因传感器体系的连接器的延伸物和适配体部分以及寡核苷酸功能化粒子的序列。
图7B示出在可卡因分析物存在下折叠的适配体。
图8A显示含有腺苷(△)、蔗糖(○)和可卡因(●)的样品的消光比随时间变化的曲线图。
图8B示出聚集1分钟后从传感器体系颜色变化观察到的消光比和可卡因分析物浓度之间的相关性图。
图8C示出5分钟内多个可卡因分析物浓度的消光比的曲线图。
具体实施方式
适配体可能比基于核酸的催化剂更易于分离。与核酸酶相关的适配体的较简单结构还可以设计出核酸酶不适用的分析物传感器体系。本发明利用了这个发现，即通过在适配体的折叠和未折叠的构象与寡核苷酸功能化粒子之间选择杂交强度，可以响应于分析物释放粒子。按此方式，提供了一种显色比色传感器，其在室温下响应于所选分析物发生所需的颜色变化，因而克服了U.S.Ser.No.10/144,679中公开的传感器体系的缺点。
图1示出测定样品102中分析物105的存在及任选测定其浓度的比色分析方法100。在110中，选择将利用方法100测定其存在/浓度的分析物105。
在一个方面中，分析物105可以是使适配体124折叠的任何离子。在另一个方面中，分析物105可以是使适配体124折叠的任何金属离子。优选的具有+1(I)形式氧化态的一价离子包括NH4 +、K(I)、Li(I)、Tl(I)和Ag(I)。优选的具有+2(II)形式氧化态的二价金属离子包括Mg(II)、Ca(II)、Mn(II)、Co(II)、Ni(II)、Zn(II)、Cd(II)、Cu(II)、Pb(II)、Hg(II)、Pt(II)、Ra(II)、Sr(II)、Ni(II)和Ba(II)。优选的具有+3(III)、+4(IV)、+5(V)或+6(VI)形式氧化态的三价和更高价金属离子包括Co(III)、Cr(III)、Ce(IV)、As(V)、U(VI)、Cr(VI)和镧系元素离子。更优选的分析物离子包括一价金属离子和对活生物体有毒性的金属离子，例如Ag(I)、Pb(II)、Hg(II)、U(VI)和Cr(VI)。
在另一个方面中，分析物105可以是使适配体124折叠的任何生物分子。优选的生物分子包括大生物分子，例如蛋白质(例如涉及HIV、hCG-激素、胰岛素的蛋白质)、抗体、生长因子、酶、病毒(例如HIV、天花)、病毒衍生的组分(例如HIV衍生的分子)、细菌(例如炭疽菌)、细菌衍生的分子和组分(例如炭疽菌衍生的分子)或细胞。优选的生物分子还可以包括小生物分子，例如氨基酸(例如精氨酸)、核苷酸(例如ATP、GTP)、神经递质(例如多巴胺)、辅助因子(例如生物素)、肽或氨基糖苷等。
在另一个方面中，分析物105可以是使适配体124折叠的任何有机分子。优选的有机分子包括药物，例如抗生素和茶碱，或受管制物质，例如可卡因、染料、寡糖、多糖、葡萄糖、氮肥、杀虫剂、二氧芑、酚类、2，4-二氯苯氧乙酸、神经毒气、三硝基甲苯(TNT)或二硝基甲苯(DNT)。
一旦选择了分析物105，就选择了响应于分析物105而折叠的一个或多个适配体124。可以通过体外选择、定向进化、或本领域技术人员公知的其他方法进行适配体的选择120。适配体的选择120可以提供在所选分析物1 05存在下显示出增强折叠(由此提供传感器灵敏性)的一个或多个适配体。选择120还可排除在样品102中所选分析物存在下折叠而在非所选分析物和/或其他物类存在下不折叠的适配体(由此提供传感器选择性)。
例如，可以选择与K(I)特异结合而不与Na(I)、Li(I)、Cs(I)、Rb(I)或其他竞争性金属离子显著结合的适配体。在一个方面中，可以通过分离与K(I)结合的适配体，然后除去与Na(I)、Li(I)、Cs(I)或Rb(I)结合的任何适配体达到以上目的。在另一个方面中，先除去与Na(I)、Li(I)、Cs(I)或Rb(I)结合的适配体，然后再分离与K(I)结合的适配体。按此方式，可以提高适配体的选择性。
适配体124包括在分析物105存在下折叠的核酸链。在一个方面中，可认为折叠是从一级或二级结构向三级结构的转化。适配体的碱基序列可以设计为使适配体可与至少一个寡核苷酸功能化粒子发生至少部分杂交。在这一方面中，适配体124的至少一部分碱基序列可与寡核苷酸功能化粒子的至少一个寡核苷酸互补。
适配体124可以由脱氧核苷酸形成，所述脱氧核苷酸可以是天然的、非天然的或经修饰的核酸。也可以使用肽核酸(PNA)，所述肽核酸包括聚酰胺骨架和核苷碱基(例如购自Biosearch，Inc.，Bedford，MA)。
下表I列出分析物、与分析物结合并响应于分析物而折叠的一个或多个适配体、记载每种适配体序列的一个或多个参考文献。这些和其他适配体的分析物结合区可用于连接器128中。例如，下表I中给出的SEQ IDNO.10可卡因适配体的非分析物结合区可经修饰而提供适配体GGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC(SEQ IDNO.56)并包括在连接器128中。
表I
Figure A20068003656300141
Figure A20068003656300151
Figure A20068003656300161
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在120中选择适宜的一个或多个适配体后，形成包括适配体124的连接器128。在一个方面中，可直接将适配体124用作连接器128。在另一个方面中，可通过将适配体124与一个或多个延伸物126连接而形成连接器128。
延伸物126可以是与适配体124连接的任何核酸序列，所述适配体可以与一个或多个寡核苷酸功能化粒子发生至少部分杂交，并且与分析方法100相容。在这一方面中，延伸物126的至少一部分碱基序列可以与一个或多个寡核苷酸功能化粒子的至少一个寡核苷酸互补。在一个方面中，可通过固相合成连接适配体124与延伸物126形成连接器128。在另一个方面中，在合成连接器128的适配体124部分后，继续合成以形成延伸物126。类似地，可使用适配体124序列延伸连接器128。
优选地，延伸物126包括1～100个碱基。在一个方面中，延伸物126中的至少50％、70％或90％的碱基能够与第一寡核苷酸功能化粒子的互补部分杂交，例如图3A中粒子336的TGAGTAGACACT-5’(SEQ ID NO.43)部分，而延伸物中的至少50％、35％、25％或10％的碱基能够与第二寡核苷酸功能化粒子杂交，例如图3A中的粒子337。
在选择或合成连接器128后，可以在130中形成聚集体132。聚集体132包括连接器128和寡核苷酸功能化粒子136。考虑到其组分的物理尺寸，聚集体132可以很大。
连接器128与寡核苷酸功能化粒子136杂交，其包括适配体124并可以包括延伸物126。例如，如果第一和第二寡核苷酸功能化粒子分别具有碱基序列3’-AAAAAAAAAAAATGAGTAGACACT(SEQ ID NO.44)和5’-CCCAGGTTCTCT(SEQ ID NO.45)，则包括在腺苷分析物存在下折叠的适配体124和延伸物126的连接器128的适宜序列可以是5’-ACTCATCTGTGAAGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT(SEQ ID NO.46)。
对于腺苷分析物，连接器128的延伸物126部分是ACTCATCTGTGAAGAGA(SEQ ID NO.47)的序列部分，此部分使延伸物126与第一功能化粒子的12个碱基及第二功能化粒子的5个碱基杂交。类似地，连接器128的适配体124部分是ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT(SEQ ID NO.18)的序列部分，此部分使适配体124的ACCTGGG(SEQ ID NO.48)部分与第二功能化粒子的TGGACCC(SEQ ID NO.49)部分杂交。
因为粒子136显示出距离依赖性的光学性质，所以当粒子紧密固定于聚集体132中时呈一种颜色，而随着粒子间的距离增加发生颜色变化。例如，当粒子136是金纳米粒子时，聚集体132在水溶液中显示蓝色，而当解聚时变为红色。
当连接器128的适配体124部分与分析物105结合并响应于分析物而折叠时，发生解聚。当适配体124折叠时，会损失其与第二寡核苷酸功能化粒子杂交的部分。这种杂交损失使第二寡核苷酸功能化粒子从聚集体132中分离出来。因此，当粒子136从聚集体132中扩散出来时，溶液由蓝色变为红色。
粒子136可以是显示距离依赖性的光学性质并与传感器体系的操作相容的任何物类。适合的粒子可包括诸如金、银、铜和铂等金属；诸如CdSe、CdS和镀有ZnS的CdS或CdSe等半导体；以及磁性胶体材料，例如在Josephson，Lee等人的Angewandte Chemie，International Edition(2001)，40(17)，3204-3206中记载的那些。具体使用的粒子可以包括ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs。
在优选的方面中，所述粒子为金(Au)纳米粒子，具有5-70纳米(nm)或10-50nm的平均直径。在更优选的方面中，将平均直径为10-15nm的金纳米粒子功能化到寡核苷酸上。
关于如何制备寡核苷酸功能化金粒子的更详细处理方法，可参见U.S.P.No.6,361,944；Mirkin等，Nature(London)1996，382，607-609；Storhoff等，J.Am.Chem.Soc.1998，20，1959-1064；以及Storhoff等，Chem.Rev.(Washington，D.C.)1999，99，1849-1862。尽管目前优选为金纳米粒子，但是发生距离依赖性颜色变化的诸如无机晶体、量子点等其他物类也可以连接到寡核苷酸上。
在140中，聚集体132可以与样品102结合。在150中，监测样品102的颜色变化。如果没有发生颜色变化，则在样品102中不存在分析物105。如果在160中发生颜色变化，则在样品102中存在分析物105。颜色变化表示分析物105使适配体124折叠，从而使粒子136从聚集体132中扩散出来并且进入样品102的溶液中。因此，分析方法100提供了一种“显色”传感器体系，因为当分析物105存在时，颜色发生变化。
响应于分析物105而发生基本上完全颜色变化的速率可被认为是传感器体系的响应时间。在一个方面中，当可见区中的吸收峰增加20％时，可以认为颜色变化是基本上完全的。在另一个方面中，当金粒子在522～700nm内的消光系数增加100％时，可以认为颜色变化是基本上完全的。传感器体系的优选响应时间是1秒～60分钟或2秒～10分钟。传感器体系的更优选响应时间是5秒～2分钟或8秒～12秒。传感器体系的优选操作温度范围是0℃～60℃或15℃～40℃。传感器体系的更优选操作温度范围是23℃～37℃或25℃～30℃。在另一个方面中，当在23℃～37℃下进行分析方法100时，优选的响应时间可以小于2分钟或是1～12秒。
在170中，使用本领域技术人员公知的比色定量方法可以量化响应于分析物105的颜色变化的程度。例如获自Hach Co.，Loveland，CO或者LaMotte Co.，Chestertown，MD的各种比色轮(color comparator wheel)可用于本发明。除了样品外，还可以分析含有已知量的所选分析物的标准样品以增加比较的准确度。如果需要更高的准确度，可以使用各种类型的分光光度计在需要的浓度范围内绘制Beer曲线。然后将样品的颜色与该曲线相比较，并测定样品中存在的分析物浓度。适合的分光光度计包括Hewlett-Packard 8453和Bausch&Lomb Spec-20。
在另一个方面中，可以修改方法100来测定适配体对分析物105的灵敏性和选择性。在这一方面中，在120中选择可能是响应于分析物105的适配体的一个或多个DNA链。在125中，可以使用延伸物126来修饰DNA链，或可以不使用延伸物。在130中，由DNA链和适宜的粒子形成聚集体。在140中，聚集体与分析物105结合。如果聚集体发生颜色变化，则DNA链是目标105的适宜的适配体序列。按此方式，可以测试120中所选的多种适配体以用于比色传感器体系中。
图2A示出依赖于两个分析物分子发生构象变化而采用折叠结构230的适配体224。图2B示出响应于两个腺苷分子而形成折叠结构230的适配体224的特定碱基对。尽管这个特定的适配体序列依赖于腺苷分析物的两个分子而折叠，但是其他适配体也可响应于一个分析物分子而折叠。
图2C示出与延伸物226连接形成连接器228的适配体224。延伸物226包括A部分和B部分，其中A部分包括足量的互补碱基以与第一粒子236的寡核苷酸形成稳定杂交。例如，包括12个腺嘌呤碱基的非互补的多聚腺嘌呤链(A12)可以附加到第一粒子236的互补序列上以强化杂交稳定性。可以选择延伸物226的B部分的序列以消除固有地形成稳定的二级结构的连接器。诸如可在(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)(M.Zuker.Mfold web server fornucleic acid folding and hybridization prediction.Nucleic Acids Res.31(13)，3406-15，(2003))得到的M-fold等计算机程序能够用于预测待消除的稳定连接器。例如，如果连接器的稳定序列是ACTCATCTGTGAAGATGACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT(SEQ ID NO.50)，那么通过用GA碱基替换下划线的TG碱基可以得到序列ACTCATCTGTGAAGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT(SEQ ID NO.51)，则使连接器成为固有不稳定的。
适配体224包括C部分和D部分。在一个方面中，延伸物226的B部分和适配体224的C部分其结合与第二粒子237的杂交稳定性可以小于A部分和第一粒子236的杂交稳定性。在优选的方面中，C+B/第二粒子杂交的熔融温度高于传感器体系的使用温度。在另一优选的方面中，与第二粒子237的寡核苷酸序列杂交的B部分的熔融温度小于传感器体系的使用温度。在另一优选的方面中，C+D+分析物复合体的稳定性应该大于C部分与第二粒子237的杂交稳定性。在另一个方面中，B部分和C部分的序列应短至与传感器体系的操作相容。
图3A示出在腺苷分析物305存在下聚集体332的解聚。聚集体332由多个聚集体单元331形成。每个聚集体单元331由连接器328形成，所述连接器分别与3’硫醇-寡核苷酸功能化粒子336和5’硫醇-寡核苷酸功能化粒子337杂交。连接器328包括适配体部分324和延伸物部分326。3’A12AdeAu粒子336与延伸物326杂交，而5’AdeAu粒子337与延伸物326和适配体324杂交形成聚集体单元331。
尽管示出了连接器和粒子的一个碱基序列，但是可以改变相对链上的碱基以保持配对状态。例如，只要寡核苷酸粒子的配对碱基由鸟嘌呤变为腺嘌呤，则可以将连接器228的A部分或B部分的任何胞嘧啶变为胸腺嘧啶。
在腺苷分析物305存在下，连接器328的适配体部分324发生折叠，因此消除了连接器328的适配体部分324和5’-AdeAu粒子337之间的至少一部分杂交。适配体324和5’-AdeAu粒子337之间的这种杂交损失使5’-AdeAu粒子释放到溶液中。
随着5’AdeAu粒子337被释放，蓝色聚集体332开始解聚，形成部分聚集体390。随着粒子337从聚集体332中扩散出来，这种部分解聚将红色添加到蓝色溶液中，因此得到紫色溶液。如果样品中存在足量的腺苷分析物305，反应将继续进行直至聚集体332完全解聚得到395。由于粒子336和337之间的距离较大，使得完全解聚产生红色溶液。
粒子336和337的相互排列(尾-尾、头-尾或头-头)可能影响聚集体单元331结合的紧密度。图3B示出当诸如336和337等功能化粒子与连接器328以尾-尾排列杂交时形成的聚集体单元331。通过反转寡核苷酸连接粒子的一端或两端，可以分别选择头-尾(图3C)或头-头(图3D)杂交。因此，通过将功能化粒子336的3’端反转为5’端，粒子338可以杂交得到图3C的头-尾排列。类似地，通过将功能化粒子336的3’端反转为粒子338的5’端及通过将粒子337的5’端反转为粒子339的3’端，粒子338和339可以杂交得到图3D的头-头排列。
目前，优选图3B的尾-尾杂交排列，因为图3C的头-尾杂交排列和3D的头-头杂交排列可能产生在空间上阻碍适配体结合和/或聚集体形成的聚集体。然而，例如通过减小粒子平均直径或通过增加功能化到粒子上的碱基数和延伸物的长度，可以降低这种空间位阻。
尽管图中没有显示，但是图3A的方法也可以应用到其他分析物，包括钾离子、可卡因和上表I所列的分析物。下表II给出连接器、腺苷、K(I)和可卡因传感器体系用粒子的碱基序列。每个连接器的适配体部分以大写字母出现，而每个连接器的延伸物部分以小写字母出现。
表II
  名称 序列   SEQ.ID NO.
  腺苷连接器 5’-actcatctgtgaagagaACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT   46
  3’-A12AdeAu 3’-AAAAAAAAAAAATGAGTAGACACT   44
  5’-AdeAu 5’-CCCAGGTTCTCT   45
  钾连接器 5’-actcatctgtgatctaaGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG   52
  3’-A12K(I)Au 3’-AAAAAAAAAAAATGAGTAGACACT   44
  5’-K(I)Au 5’-AACCCTTAGA   53
  可卡因连接器 5’-actcatctgtgaatctcGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC   54
  3’-A12CocAu 3’-AAAAAAAAAAAATGAGTAGACACT   44
  5’-CocAu 5’-GTCTCCCGAGA   55
样品的离子强度可以影响形成聚集体的部分结合在一起的紧密程度。较高盐浓度利于聚集，从而减慢传感器的响应，而较低盐浓度却可能缺少维持聚集体所需的离子强度。在一个方面中，样品可能含有或用试剂改变后含有30mM和更大浓度的一价金属离子。例如，可以用Na+离子改变样品的离子强度。在优选的方面中，含有聚集体的样品的一价金属离子的浓度是150～400mM。目前，特别优选的一价金属离子浓度对腺苷和钾分析物来说约为300mM，对可卡因分析物来说约为150mM。pH也可影响聚集体的结合，可能归因于多聚核苷酸碱基对在较低pH下的质子化作用。在一个方面中，优选的pH为5～9，更为优选的是近于中性的pH。
因此，在将传感器与聚集体结合之前，通过调节样品的离子强度和pH可以改进传感器性能。取决于样品，可以优选将样品或分析物加到含有聚集体的溶液中(其中离子强度和pH是可控制的)或者反之。
可以试剂盒形式提供包括适配体、延伸物和寡核苷酸功能化粒子的传感器体系。在一个方面中，所述试剂盒包括可连接形成连接器的适配体和延伸物。在另一个方面中，所述试剂盒包括延伸物，但不包括适配体，由用户提供或单独提供适配体。在这一方面中，所述试剂盒还可包括连接所供应的延伸物与适配体所需的试剂。在这一方面中，所述试剂盒还可用于检测各种适配体对所选分析物的特异性和/或选择性。因此，所述试剂盒除了用于检测分析物外还可用于选择适宜的适配体。在另一个方面中，所述试剂盒包括装有连接器和寡核苷酸功能化粒子的外包装。
可以将这些试剂盒中的一种或多种组分分开装入单独的容器中，或者以聚集状态提供它们。如果被分别提供，则可以在引入样品之前形成聚集体。在试剂盒中可提供额外的缓冲液和/或pH改变剂以调节样品的离子强度和/或pH。
容器可采用瓶式、盆式、袋式、封袋式、管式、安瓿式等形式，可以部分地用塑料、玻璃、纸、箔、
Figure A20068003656300251
蜡等材料制成或全部由它们制成。容器可配备完全或部分可拆卸的盖子，盖子可以在初始时是容器的一部分或可以通过机械、粘合剂或其他方式附于容器上。容器还可配备塞子，可以通过注射针进入容器内容物中。在一个方面中，外包装可以由纸或塑料制成，而容器则是玻璃安瓿。
外包装可以包括关于组分的使用说明书。还可以包括比色器、标准分析物溶液(例如10μM的分析物溶液)以及显色辅助设备(例如薄层色谱(TLC)板、试管和小玻璃管)。可以包括具有两个或多个被膜隔开的隔间的容器，其中膜可被除去以进行混合。外包装还可包括用于制备分析样品的过滤器和稀释剂。
在另一个方面中，除本发明的传感器体系外，所述试剂盒还可包括多个传感器体系以进一步增加分析物测定的可靠性并减少用户出错的可能性。在一个方面中，可以包括本发明的多个显色传感器体系。在另一个方面中，也可包括“不显色”传感器体系和本发明的显色传感器体系。包含在本发明要求保护的试剂盒中的适合的不显色传感器可基于DNA酶/底物/粒子聚集体，其中当所选分析物存在时，不形成所述聚集体。包含在本发明要求保护的试剂盒中的适合的不显色传感器的详细描述可参见例如2004年1月13日提交的名称为“Biosensors Based on Directed Assemblyof Particles”的美国专利申请10/756,825，在此引入该文献作为参考。
上述说明并不是将本发明的范围限定为所述实施方案，而是使本领域技术人员能够实施和使用本发明。类似地，下面的实施例不用于限定所附权利要求或者其等同方案的范围，而仅是用于解释本发明。可以理解的是，在所附权利要求和其等同方案的范围内，可以对如下程序进行多种变化。
实施例
所有的DNA样品均购自Integrated DNA Technology Inc.，Coralville，IA。通过凝胶电泳纯化形成延伸物的DNA样品，而通过标准脱盐纯化形成寡核苷酸功能化粒子的硫醇-修饰的DNA样品。腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷和可卡因购自Aldrich。采用文献方法制备平均直径为13nm的金纳米粒子，并用12-mer硫醇-修饰的DNA进行功能化，例如Storhoff等人在“One-pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single baseimperfections using gold particle probes”，JACS 120：1959-1964(1998)中公开的方法。金纳米粒子的平均直径通过透射电子显微镜(JEOL 2010)核实。
实施例1：比色腺苷传感器的制备
在300mM NaCl、25mM Tris-醋酸盐缓冲液，pH 8.2和100nM腺苷适配体/延伸物(腺苷连接器)存在下，将500μL 5′AdeAu(在522nm下消光值为2.2)和500μL 3′A12AdeAu(在522nm下消光值为2.2)混合。将样品升温至65℃保持1分钟，然后缓慢冷却至4℃。在此过程中，纳米粒子由红色变为深紫色。离心样品，收集沉淀，然后分散在2000μL相同缓冲液中(300mMNaCl、25mM Tris-醋酸盐缓冲液，pH 8.2)。使用悬浮液检测腺苷。
实施例2：腺苷的比色法检测
将100μL实施例1中的传感器悬浮液加到少量体积的浓腺苷溶液中。例如，加入2μL 50mM的腺苷，使得终浓度为1mM。使用紫外-可见分光光度计或通过裸眼监测颜色变化。
实施例3：腺苷传感器的性能监测
使用紫外-可见消光光谱法监测实施例2样品的颜色变化。图4示出解聚过程中样品在特定波长下的消光比的曲线图。图4的虚线表明单独的13nm纳米粒子在522nm显示出的强消光峰，其为深红色。从图4的实线可以看出，经聚集，522nm的峰强度降低，并移至更长波长，而700nm区域的消光提高，产生了红色到蓝色的转变。因此，在522～700nm下的较高消光比与单独的纳米粒子的红色相关，而低的消光比与聚集的纳米粒子的蓝色相关。使用消光比监测粒子的聚集状态。
实施例4：腺苷传感器的选择性和灵敏性
将100μL实施例1制备的腺苷传感器体系加到紫外-可见分光光度计的石英比色皿(Hellma，德国)中。将少量体积(1-5μL)的包括腺苷、尿苷、胞苷或鸟苷的溶液加到分光光度计的比色皿中，使比色皿中的分析物浓度达到所需水平。
使用Hewlett-Packard 8453分光光度计监测每个比色皿中作为时间函数的分散动力学。图5A示出在522和700nm下绘制的作为时间函数的消光比的图。由该图可以看出，当消光比作为时间函数时，只有腺苷显著增加，而尿苷、胞苷和鸟苷与背景的颜色变化一致。因此证实了传感器的高选择性。
图5B示出聚集5分钟后从传感器体系颜色变化观察到的消光比和腺苷分析物浓度之间的相关性图。从约0.1到约1.5mM，传感器体系呈明显的异常线性。
图5C示出6分钟内多个腺苷分析物浓度的消光比的曲线图。该图表明所述传感器体系具有在几分钟内有效区分不同分析物浓度的能力。因此，确立了所述传感器体系具有提供准确定量信息的能力。
除了图5B的仪器方法外，还可以很方便地目视观察传感器呈现的颜色。随着腺苷浓度从0mM增大到2mM，可以观察到颜色从蓝色变到红色的过程。尿苷、胞苷和鸟苷与背景的颜色相似。
实施例5：比色钾离子传感器的制备
图6A-图6B示出包括在K(I)存在下折叠的适配体的分析物传感器体系。图6A示出连接器的延伸物和适配体部分以及寡核苷酸功能化粒子的序列。图6B示出在K(I)分析物存在下折叠的适配体。为了制备K(I)传感器体系，在300mM NaCl、25mM Tris-醋酸盐缓冲液，pH 8.2和100nM钾离子适配体/延伸物(钾连接器)存在下，将500μL 5′-K(I)Au(在522nm下消光值为2.2)和500μL 3′-A12K(I)Au(在522nm下消光值为2.2)混合。将样品升温至65℃保持1分钟，然后缓慢冷却至4℃。在此过程中，纳米粒子由红色变为深紫色。离心样品，收集沉淀，然后分散在10μL相同缓冲液中(300mMNaCl、25mM Tris-醋酸盐缓冲液，pH 8.2)。使用悬浮液检测K+。
实施例6：钾的比色法检测
用去离子水分别溶解LiCl、NaCl、KCl、RbCl或CsCl盐，制备Li+、Na+、K+、Rb+或Cs+离子的金属离子溶液，离子浓度为3M。由这些金属离子贮备溶液制备含有25mM Tris-醋酸盐缓冲液，pH 8.2和300mM Li+、Na+、K+、Rb+或Cs+离子的溶液。对于每个含有99μL金属离子的溶液，向这五种溶液的每种溶液中加入1μL实施例5的K(I)传感器体系。因此，每种溶液含有约300mM Li+、Na+、K+、Rb+或Cs+金属离子，还含有3mMNa+离子作为背景。在1小时内将每种样品加热至65℃，然后缓慢冷却至4℃。用紫外-可见分光光度计或裸眼监测颜色变化。图6C示出在Li+、Na+、K+、Rb+或Cs+离子存在下钾离子传感器体系的消光比，因此证实了传感器体系对K(I)的选择性。
实施例7：比色可卡因传感器的制备
图7A-图7B示出包括在可卡因存在下折叠的适配体的分析物传感器体系。图7A示出连接器的延伸物和适配体部分以及寡核苷酸功能化粒子的序列。图7B示出在可卡因分析物存在下折叠的适配体。为了制备可卡因传感器体系，在300mM NaCl、25mM Tris-醋酸盐缓冲液，pH 8.2和100nM可卡因适配体/延伸物(可卡因连接器)存在下，将500μL 5′CocAu(在522nm下消光值为2.2)和500μL 3′A12CocAu(在522nm下消光值为2.2)混合。将样品升温至65℃保持1分钟，然后缓慢冷却至4℃。在此过程中，纳米粒子由红色变为深紫色。离心样品，收集沉淀。然后，将收集到的沉淀分散于2000μL另一缓冲液中(150mM NaCl、25mM Tris-醋酸盐缓冲液，pH 8.2)。使用悬浮液检测可卡因。
实施例8：可卡因的比色法检测
将100μL上述制备的可卡因传感器悬浮液与少量体积的浓可卡因溶液混合。例如，将1μL 100mM可卡因加到悬浮液中，使得终浓度为1mM。用紫外-可见分光光度计或裸眼监测颜色变化。
实施例9：可卡因传感器的选择性和灵敏性
将100μL实施例7制备的可卡因传感器体系加到紫外-可见分光光度计的石英比色皿(Hellma，德国)中。将少量体积(0.5-2μL)的包括可卡因、腺苷或蔗糖的溶液加到分光光度计的比色皿中，使比色皿中的分析物浓度达到所需水平。
使用Hewlett-Packard 8453分光光度计监测每个比色皿中作为时间函数的分散动力学。图8A示出在522和700nm下绘制的作为时间函数的消光比的图。由该图可以看出，当消光比作为时间函数时，只有可卡因显著增加，而腺苷和蔗糖与背景的颜色变化一致。因此证实了传感器的高选择性。
图8B示出聚集1分钟后从传感器体系颜色变化观察到的消光比和可卡因分析物浓度之间的相关性图。从约0.1到约1mM，传感器体系呈明显的异常线性。
图8C示出5分钟内多个可卡因分析物浓度的消光比的曲线图。该图表明所述传感器体系具有在几分钟内有效区分不同分析物浓度的能力。因此，确立了所述传感器体系具有提供准确定量信息的能力。
除了图8B的仪器方法外，还可以很方便地目视观察传感器呈现的颜色。随着可卡因浓度从0mM增大到1mM，可以观察到颜色从蓝色变到红色的过程。腺苷和蔗糖与背景的颜色相似。
本领域技术人员应认识到，从提供的说明书、附图以及实施例可以在未背离所附权利要求书及其等同方案确定的本发明范围下对本发明的优选实施方案做出修改和变化。
序列表
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>陆艺(LU，YI)
刘珏文(LIU，JUEWEN)
<120>基于适配体的比色传感器体系
(APTAMER-BASED COLORIMETRIC SENSOR SYSTEMS)
<130>ILL01-076-US
<140>11/202,380
<141>2005-08-11
<160>59
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>1
gggttagggt tagggttagg g            21
<210>2
<211>29
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>2
aggcgaggug aaaugagcgg uaauagccu    29
<210>3
<211>95
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>3
gggagaggau acuacacgug auagucaggg aacaugacaa acacagggac uugcgaaaau    60
caguguuuug ccauugcaug uagcagaagc uuccg                               95
<210>4
<211>132
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>4
gggagaattc ccgcggcaga agcccacctg gctttgaact ctatgttatt gggtggggga    60
aacttaagaa aactaccacc cttcaacatt accgcccttc agcctgccag cgccctgcag    120
cccgggaagc tt                                                        132
<210>5
<211>38
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>5
ggaucccgac uggcgagagc cagguaacga auggaucc                            38
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>6
ccggccaagg gtgggaggga gggggccgg                                      29
<210>7
<211>61
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>7
auggcaccga ccauaggcuc ggguugccag agguuccaca cuuucaucga aaagccuaug    60
c                                                                    61
<210>8
<211>33
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>8
ggcgauacca gccgaaaggc ccuuggcagc guc                                 33
<210>9
<211>52
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>9
gauaggacga uuaucgaaaa ucaccagauu ggacccuggu uaacgaucca uu            52
<210>10
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>10
gggagacaag gataaatcct tcaatgaagt gggtcgaca                           39
<210>11
<211>67
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>11
gggaauuccg cgugugcgcc gcggaagagg gaauauagag gccagcacau agugaggccc    60
uccuccc                                                              67
<210>12
<211>72
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>12
gggagcucag aauaaacgcu caaggaggac cgugcacucc ucgaacauuu cgagaugaga    60
cacggauccu gc                                                        72
<210>13
<211>44
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>13
gacgagaagg agugcugguu auacuagcgg uuaggucacu cguc                     44
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>14
acctggggga gtattgcgga ggaaggt                         27
<210>15
<211>31
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>15
ggaagagaug gcgacuaaaa cgacuugucg c                    31
<210>16
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>16
ucuagcaguu cagguaacca cguaagauac gggucuaga            39
<210>17
<211>84
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<220>
<221>修饰的碱基(modified_base)
<222>(44)
<223>a，c，g，or u
<220>
<221>修饰的碱基(modified_base)
<222>(56)
<223>a，c，g，or u
<400>17
gggagcucag aauaaacgcu caacccgaca gaucggcaac gccnuguuuu cgacangaga    60
caccgauccu gcaccaaagc uucc                                           84
<210>18
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>18
acctggggga gtattgcgga ggaaggt                                        27
<210>19
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>19
gcagtctcgt cgacacccag cagcgcatgt aactcccata catgtgtgtg ctggatccga    60
cgcag                                                                65
<210>20
<211>52
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>20
gggcacgagc gaagggcaua agcugacgaa agucagacaa gacauggugc cc    52
<210>21
<211>49
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>21
ggaacccaac uaggcguuug aggggauucg gccacgguaa caaccccuc        49
<210>22
<211>45
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>22
gggcauaagg uauuuaauuc cauacaaguu uacaagaaag augca            45
<210>23
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>23
taaactaaat gtggagggtg ggacgggaag aagttta                     37
<210>24
<211>31
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>24
ccggugcgca uaaccaccuc agugcgagca a                                   31
<210>25
<211>108
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>25
gggagaauuc cgaccagaag cuuugguugu cuuguacguu cacuguuacg auuguguuag    60
guuuaacuac acuuugcaau cgcauaugug cgucuacaug gauccuca                 108
<210>26
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>26
gcggggttgg gcgggtgggt tcgctgggca gggggcgagt g                        41
<210>27
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>27
uacagaaugg guugguaggc auaccuaauc gagaaugaua                          40
<210>28
<211>113
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>28
ggagcucagc cuucacugca augggccgcu agguugaugu gcagugaagu cagcugaggc    60
ccagggcuga aaggaucgcc cuccucgacu cguggcacca cggucggauc cac           113
<210>29
<211>45
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence；Synthetic aptamer motif sequence)
<400>29
ggaucgcauu uggacuucug cccagggggc accacggucg gaucc                    45
<210>30
<211>60
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>30
ggccuaaaac auaccagauu ucgaucugga gaggugaaga auucgaccac cuaggccggu    60
<210>31
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>31
acgtgaatga tagacgtatg tcgagttgct gtgtgcggat gaacgt                  46
<210>32
<211>107
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体结构序列
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer motif sequence)
<400>32
gggagcugag aauaaacgcu caagggcaac gcgggcaccc cgacaggugc aaaaacgcac    60
cgacgcccgg ccgaagaagg ggauucgaca ugaggcccgg auccggc                  107
<210>33
<211>24
<212>RNA
<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400>33
uccguuuuca gucgggaaaa acug                                           24
<210>34
<211>15
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>34
ggttggtgtg gttgg                                                     15
<210>35
<211>23
<212>RNA
<213>未知生物体(Unknown Organism)
<220>
<223>未知生物体的描述：VEGF结构序列
(Description of Unknown Organism：VEGF motif sequence)
<400>35
gcgguaggaa gaauuggaag cgc                                            23
<210>36
<211>98
<212>RNA
<213>未知生物体(Unknown Organism)
<220>
<223>未知生物体的描述：NF-kB
(Description of Unknown Organism：NF-kB)
<400>36
gggauauccu cgagacauaa gaaacaagau agauccugaa acuguuuuaa gguuggccga  60
ucuucugcuc gagaaugcau gaagcguucc auauuuuu                          98
<210>37
<211>37
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>37
ggggcacgtt tatccgtccc tcctagtggc gtgcccc                           37
<210>38
<211>44
<212>RNA
<213>未知生物体(Unknown Organism)
<220>
<223>未知生物体的描述：延伸因子Tu
(Description of Unknown Organism：Elongation factor Tu)
<400>38
ggggcuauug ugacucagcg guucgacccc gcuuagcucc acca                   44
<210>39
<211>39
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>39
ugacguccuu agaauugcgc auuccucaca caggaucuu                         39
<210>40
<211>96
<212>DNA
<213>未知生物体(Unknown Organism)
<220>
<223>未知生物体的描述：YPEN-1内皮细胞序列
(Description of Unknown Organism：YPEN-1 endothelial sequence)
<400>40
ataccagctt attcaattag gcggtgcatt gtggttggta gtatacatga ggtttggttg    60
agactagtcg caagatatag atagtaagtg caatct                              96
<210>41
<400>41
000
<210>42
<211>28
<212>RNA
<213>劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)
<400>42
aggacccucg agggagguug cgcagggu                                       28
<210>43
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>43
tcacagatga gt                                                        12
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>44
tcacagatga gtaaaaaaaa aaaa                                           24
<210>45
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>45
cccaggttct ct                                       12
<210>46
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>46
actcatctgt gaagagaacc tgggggagta ttgcggagga aggt    44
<210>47
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>47
actcatctgt gaagaga                                  17
<210>48
<211>7
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>48
acctggg                                             7
<210>49
<211>7
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>49
tggaccc                                             7
<210>50
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的连接器
(Description of Artificial Sequence：Synthetic linker)
<400>50
actcatctgt gaagatgacc tgggggagta ttgcggagga aggt    44
<210>51
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的连接器
(Description of Artificial Sequence：Synthetic linker)
<400>51
actcatctgt gaagagaacc tgggggagta ttgcggagga aggt    44
<210>52
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的钾连接器
(Description of Artificial Sequence：Synthetic potassium linker)
<400>52
actcatctgt gatctaaggg ttagggttag ggttaggg          38
<210>53
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>53
aacccttaga                                                       10
<210>54
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的可卡因连接器
(Description of Artificial Sequence：Synthetic cocaine linker)
<400>54
actcatctgt gaatctcggg agacaaggat aaatccttca atgaagtggg tctccc    56
<210>55
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>55
gtctcccgag a                                                     11
<210>56
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer)
<400>56
gggagacaag gataaatcct tcaatgaagt gggtctccc                       39
<210>57
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer)
<400>57
acctggggga gtattgcgga ggaaggt                      27
<210>58
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
(Description of Artificial Sequence：Synthetic oligonucleotide)
<400>58
gtctcccgag at                                      12
<210>59
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的适配体
(Description of Artificial Sequence：Synthetic aptamer)
<400>59
gggagacaag gataaatcct tcaatgaagt gggtctccc         39

Claims (53)

1. 一种用于检测分析物的传感器体系，所述传感器体系包括：
包括响应于分析物而折叠的适配体的连接器；和
与第二寡核苷酸连接的第二粒子，所述第二寡核苷酸与至少一部分所述适配体互补。
2. 如权利要求1所述的体系，其中所述连接器包括延伸物。
3. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述第二寡核苷酸与至少一部分所述延伸物互补。
4. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中至少一部分形成所述延伸物的碱基在没有所述分析物时抑制所述连接器形成固有稳定的二级结构。
5. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其还包括与第一寡核苷酸连接的第一粒子，所述第一寡核苷酸与至少一部分所述延伸物互补。
6. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述延伸物包括1～100个碱基，至少50％的碱基与所述第一或第二寡核苷酸互补。
7. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述第一寡核苷酸的一部分与所述延伸物不互补。
8. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述适配体与所述分析物的杂交稳定性大于所述适配体的一部分与所述第二寡核苷酸的杂交稳定性。
9. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述第一和第二粒子包括选自金属、半导体、磁性物质及其组合的材料。
10. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述第一和第二粒子含有金。
11. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述分析物是金属离子。
12. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述分析物选自大生物分子、小生物分子和有机分子。
13. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述连接器包括具有选自SEQ ID NO.46、52、54及其保守修饰的变异体的序列的多聚核苷酸。
14. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述适配体包括具有选自SEQ ID NO.1-42及其保守修饰的变异体的序列的多聚核苷酸。
15. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中
所述第一寡核苷酸包括具有含有SEQ ID NO.44及其保守修饰的变异体的序列的多聚核苷酸，和
所述第二寡核苷酸包括具有选自SEQ ID NO.45、53、55及其保守修饰的变异体的序列的多聚核苷酸。
16. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述连接器包括SEQID NO.54，所述第一寡核苷酸包括SEQ ID NO.44，且所述第二寡核苷酸包括SEQ ID NO.55。
17. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述体系的响应时间小于60分钟。
18. 如前述权利要求中任一项所述的体系，其中所述体系在23℃～37℃下的响应时间小于10分钟。
19. 一种用于检测分析物的方法，所述方法包括：
将聚集体与样品混合；和
检测响应于所述分析物的颜色变化，所述聚集体包括：
包括响应于所述分析物而折叠的适配体的连接器；和
与第二寡核苷酸连接的第二粒子，所述第二寡核苷酸与至少一部分所述适配体互补。
20. 如前述权利要求中任一项所述的方法，所述聚集体还包括与第一寡核苷酸连接的第一粒子，所述第一寡核苷酸与至少一部分延伸物互补，所述延伸物形成所述连接器的一部分。
21. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸与至少一部分所述延伸物互补。
22. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一部分形成所述延伸物的碱基在没有所述分析物时抑制所述连接器形成固有稳定的二级结构。
23. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述延伸物包括1～100个碱基，至少50％的碱基与所述第一或第二寡核苷酸互补。
24. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述适配体与所述分析物的杂交稳定性大于所述适配体的一部分与所述第二寡核苷酸的杂交稳定性。
25. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括调节所述样品的离子强度。
26. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合选自将所述样品加到所述聚集体中或将所述聚集体加到所述样品中。
27. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二粒子含有金。
28. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析物选自金属离子、大生物分子、小生物分子和有机分子。
29. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述适配体包括具有选自SEQ ID NO.1-42及其保守修饰的变异体的序列的多聚核苷酸。
30. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中
所述第一寡核苷酸包括具有含有SEQ ID NO.44及其保守修饰的变异体的序列的多聚核苷酸，和
所述第二寡核苷酸包括具有选自SEQ ID NO.45、53、55及其保守修饰的变异体的序列的多聚核苷酸。
31. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在23℃～37℃下的响应时间小于10分钟。
32. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合在20℃～30℃下进行。
33. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚集体响应于所述分析物而解聚。
34. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述响应与所述样品中所述分析物的量成正比。
35. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括量化颜色变化。
36. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品的来源选自生物来源、工业废物流和人用供水。
37. 一种用于检测分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：
用于形成聚集体的体系，所述体系包括：
包括响应于所述分析物而折叠的适配体的连接器；和
与第二寡核苷酸连接的第二粒子，所述第二寡核苷酸与至少一部分所述适配体互补；
至少一个含有所述聚集体形成体系的第一容器，其中样品可加到选自第一容器和第二容器的容器中。
38. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述适配体与所述分析物的杂交稳定性大于所述适配体的一部分与所述第二寡核苷酸的杂交稳定性。
39. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述适配体包括具有选自SEQ ID NO.1-42及其保守修饰的变异体的序列的多聚核苷酸。
40. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包括形成所述聚集体的说明书。
41. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，所述聚集体形成体系还包括与第一寡核苷酸连接的第一粒子，所述第一寡核苷酸与至少一部分延伸物互补，所述延伸物形成所述连接器的一部分。
42. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述第二寡核苷酸与至少一部分所述延伸物互补。
43. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述延伸物包括1～100个碱基，至少50％的碱基与所述第一或第二寡核苷酸互补。
44. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包括改变所述样品的离子强度的试剂。
45. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包括改变所述样品的离子强度的说明书。
46. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包括改变所述样品的pH的试剂，所述试剂选自酸和碱。
47. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包括量化响应于所述聚集体解聚的颜色变化的装置。
48. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述装置选自分光光度计和比色器。
49. 如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包括响应于所述分析物的不显色传感器体系。
50. 一种用于检测适配体对分析物的灵敏性和选择性的方法，所述方法包括：
将聚集体与分析物混合；
检测响应于所述分析物的颜色变化，所述聚集体包括：
包括DNA链的连接器；和
与第二寡核苷酸连接的第二粒子，所述第二寡核苷酸与至少一部分所述DNA链互补；
测定是否所述DNA链折叠而提供颜色变化。
51. 如前述权利要求中任一项所述的方法，所述聚集体还包括与第一寡核苷酸连接的第一粒子，所述第一寡核苷酸与至少一部分延伸物互补，所述延伸物形成所述连接器的一部分。
52. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸与至少一部分所述延伸物互补。
53. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述延伸物包括1～100个碱基，至少50％的碱基与所述第一或第二寡核苷酸互补。
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