CN107228941A - 一种可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒及方法。所述试剂盒包括核酸适配体试纸条以及核酸适配体反应液；所述核酸适配体试纸条包括样品垫、反应膜、吸收垫和底板；所述反应膜上设置有检测线T线和质控线C线；所述检测线T线固定包被有含有5'‑AAC AAA GAA CCC CCC CCC C‑3'的捕获序列；所述质控线C线固定包被有质控探针；所述核酸适配体反应液中包括序列为5'‑X₁‑TTT CTT TCT TCC CCC CGG TTG TTT GTT‑Y₁‑3'的核酸适配体，其中X₁为显示信号强度的指示剂，Y₁为与所述质控探针互补的序列。该试剂盒用于汞和阴离子同时检测时灵敏度高、选择性好。

Description

一种可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，具体而言，涉及一种可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒及方法。

背景技术

汞离子(Hg²⁺)和银离子(Ag⁺)是高毒性金属离子和广泛的环境污染物中的两种，即使在低浓度下也会对环境和人造成严重的永久性的损害。更严重的是，通过污染水源，Ag⁺和Hg²⁺可以积累到农产品和水产品中，进入人类的食物链。Hg²⁺污染对人类有着极大的危害，人体无法通过自身的代谢排泄食物链或其他途径积累在体内的微量汞，而微量汞在体内的积累将直接导致心脏、肝、甲状腺等疾病，甚至导致神经系统紊乱、慢性中毒及智力障碍。纳米银有着特殊的杀菌、催化和光学特性，在电子、电镀、感光等行业有着广泛的应用，这些涉及银的行业的生产和应用中会产生含银的工业废水，这种含银废水对环境的污染非常严重。在现有Ag⁺的环境中长时间暴露的情况下，人可能引起缓慢进行的物理和神经退行性疾病。因此，Hg²⁺和Ag⁺的检测在环境监测，食品安全和临床诊断领域非常重要。

汞能够和胸腺嘧啶T形成T-Hg-T结构，银离子能够和胞嘧啶C形成C-Ag-C的结构，利用这一原理已经建立了一些基于DNA的用于检测水，药物，食品和临床样品中的Hg²⁺或Ag⁺检测到方法。但是这些检测都是单种金属离子检测。然而，Hg²⁺和Ag⁺通常共存于水，土壤甚至生物系统中，对于Hg²⁺和Ag⁺的共存系统，这些测定需要不同的检测方法和实验条件以同时检测Hg²⁺和Ag⁺，这增加了这些测定的复杂性和不便。为了满足实际样品分析的实际需要，也有人建立能够同时检测Hg²⁺和Ag⁺的方法，然而这些方法在实际应用中遭受某些限制，例如使用掩蔽剂，低灵敏度和复杂性。因此，在实际样品中实现Hg²⁺和Ag⁺的简单和同时检测仍然是一个巨大的挑战。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明设计了一种基于核酸适配体的试剂盒，可以同时检测汞离子和离子，具有简单快速的优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

描写独权的技术方案。

根据本发明的一方面，本发明涉及一种可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，所述试剂盒包括核酸适配体试纸条以及核酸适配体反应液；

所述核酸适配体试纸条包括样品垫、反应膜、吸收垫和底板；

所述反应膜上设置有检测线T线和质控线C线；

所述检测线T线固定包被有含有5'-AAC AAA GAA CCC CCC CCC C-3'的捕获序列；

所述质控线C线固定包被有质控探针；

所述核酸适配体反应液中包括序列为5'-X₁-TTT CTT TCT TCC CCC CGG TTG TTTGTT-Y₁-3'的核酸适配体，其中X₁为显示信号强度的指示剂，Y₁为与所述质控探针互补的序列。

本发明还涉及一种使用所述的试剂盒检测汞和/或银离子的方法，包括：

1).将核酸适配体反应液与待检离子液混合孵育得到反应混合物；

2).将所述反应混合物加到核酸适配体试纸条的样品垫上；

3).在质控线C线出现检测信号的前提下，检测检测线T线的信号值，将所述信号值代入预先建好的Hg²⁺和/或Ag⁺的浓度-信号值标准曲线，从而得知待检离子液中Hg²⁺和/或Ag⁺的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本发明提供的核酸适配体在用于Hg²⁺和Ag⁺同时检测时反应快速、灵敏度高、选择性好；

2)、通过优化反应体系及反应条件，本申请在检测Hg²⁺和Ag⁺时具有更高的灵敏度及更宽的线性范围；其中反应Ag⁺和Hg²⁺的检测极限均低至500ppb，且Ag⁺和Hg²⁺的浓度与荧光信号成线性比例关系；

3)、核酸适配体具有非常好的热稳定性，因此本发明的试纸条还可以常温储运，具有货架期长、结果可靠等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的基于核酸适配体同时检测汞和银离子的试纸条的示意图；附图标记为：1-样品垫；2-检测线T线；3-质控线C线；4-反应膜；5-吸收垫；6-底板；

图2为试纸条上Hg²⁺的荧光适配体浓度优化结果；①～⑥依次为0.2μM、0.1μM、0.08μM、0.05μM、0.02μM、0.01μM；

图3为适配体荧光试纸条检测Hg²⁺线性范围结果；

图4为适配体荧光试纸条检测Ag⁺线性范围结果。

具体实施方式

一种可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，所述试剂盒包括核酸适配体试纸条以及核酸适配体反应液；

所述试纸条包括样品垫、反应膜、吸收垫和底板；

所述反应膜上设置有检测线T线和质控线C线；

所述检测线T线固定包被有含有5'-AAC AAA GAA CCC CCC CCC C-3'的捕获序列；

所述质控线C线固定包被有质控探针；

所述核酸适配体反应液中包括序列为5'-X₁-TTT CTT TCT TCC CCC CGG TTG TTTGTT-Y₁-3'的核酸适配体，其中X₁为显示信号强度的指示剂，Y₁为与所述质控探针互补的序列。

本发明试纸条结构组成示意图如图1所示。

本发明的检测原理为：

首先将样品与显示信号强度的指示剂(例如荧光素)标记的适配体在室温下反应5分钟，形成检测靶标-适配体复合物，然后将反应混合物加到试纸条样品垫上，反应混合物在层析作用下上行至反应膜检测线处。反应混合物中剩余游离的荧光素标记适配体会与检测线T线处的互补片段结合，在检测线处出现荧光；而反应混合物中剩余的靶标-荧光素适配体复合物等会继续在层析作用下上行至质控线C线处与另一段互补序列结合，在质控线C线处出现荧光信号。如果样品中待检靶标浓度越高，则剩余的游离荧光素标记适配体越少，检测线T线处的荧光强度越低；反之如果样品中待检靶标浓度越低，则剩余的游离荧光素标记适配体越多，检测线T线处的荧光强度越高；因此样品中的靶标浓度与检测线处的荧光强度成反比，根据检测线处的荧光信号强度可以计算出样品中的待检汞离子或银离子的浓度。

优选的，如上所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，在所述核酸适配体反应液中，所述核酸适配体的浓度为0.06μM～0.1μM；优选为0.08μM。

优选的，如上所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，所述捕获序列和所述质控探针通过偶联生物素包被在标记有亲和素的所述反应膜上；

更优选的，所述捕获序列的3'段偶联有5'-(CH₂)3-Biotin-3'。

优选的，如上所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，所述X₁包括荧光物质、生物素、放射性同位素、电子致密物、胶体金或酶中的任一种。

优选的，如上所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、OregonGreen 488、Oregon Green500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

优选的，如上所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，所述Y₁包括PolyA、PolyT、PolyG或PolyC中的一种。

优选的，如上所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，所述Y₁的核苷酸的数量为9～18个；更优选为12～15个，还可以选择13、14个。

优选的，如上所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

一种使用如上所述的试剂盒检测汞和/或银离子的方法，包括：

1).将核酸适配体反应液与待检离子液混合孵育得到反应混合物；

2).将所述反应混合物加到核酸适配体试纸条的样品垫上；

3).在质控线C线出现检测信号的前提下，检测检测线T线的信号值，将所述信号值代入预先建好的Hg²⁺和/或Ag⁺的浓度-信号值标准曲线，从而得知待检离子液中Hg²⁺和/或Ag⁺的含量。

本发明提供的试剂盒可用于单独检测汞或银离子，也可用于二者的同时检测。

优选的，如上所述的检测汞和/或银离子的方法，在步骤1)中，所述核酸适配体反应液与所述待检离子液的混合比为1：(7～11)；更优选为1：(8～11)；最优选为1:9。

优选的，如上所述的检测汞和/或银离子的方法，在步骤2)中，所述反应混合物的上样量为50μL～70μL；更优选为60μL。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1试纸条的制备

首先本发明设计了一段核酸适配体序列及其两段互补序列，其中两段互补序列末端分别修饰生物素，然后通过和亲和素结合，分别固定在检测线T线处和C线处。其中核酸适配体序列既可以结合汞离子，也可以结合银离子，因此本试纸条可同时检测汞离子和银离子。

优选的，本发明的核酸适配体序列及两段互补序列如下：

1、核酸适配体及T线和C线核酸序列合成：

本发明设计的三段寡核苷酸序列按上述序列及修饰方式，委托上海生物工程有限公司合成。

2、试纸条耗材购买：样品垫(GL-b04)和吸收垫(H5076)均购自上海杰一生物公司，JB6底板、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜(NC膜)(Sartotius CN140)均购自上海捷宁生物公司。

3、C线探针溶液制备：将1mg链霉亲和素溶解于1mL pH为7.4的0.01mM磷酸盐缓冲液(PBS)中，将50μL链霉亲和素溶液和350μL 5μMDNA探针1混合，并在室温下反应2小时。

4、T线探针溶液制备与以上方法相同。

5、点样：将硝酸纤维素膜，玻璃纤维素膜，样品垫和吸收垫按照图1所示按顺序彼此层压2mm并粘贴到JB 6底板上。然后用点样仪把T线探针溶液和C线探针溶液喷至硝酸纤维素膜上，将试纸条放入37℃的培养箱中孵育30min，用试纸条切割机切成4mm宽的试纸条，放入自封袋里，在干燥的环境中放置备用。

实施例2试纸条条件优化

1、试纸条最适适配体浓度的优化

为了达到最佳的检测结果，要确定荧光适配体的最佳用量，游离的适配体过量，会与适配体靶标复合物竞争杂交到T线的DNA探针1上，降低反应的灵敏度，而且浪费试剂，增加该检测方法的成本。由于随着靶标物浓度的增加，T线的峰值减小，无靶物质时的峰值为最大值，如果适配体量太少，T线的峰值不够大，会使T线显荧光不足，造成反应的检测范围小，不能达到检测的目的。由上海生工公司合成的Cy5标记的适配体分别稀释为0.01μM,0.02μM,0.05μM,0.08μM,0.1μM，和90μL缓冲液(50mM Tris-HAC pH＝7.4，20mM Mg(AC)2,20mM KAC,10mM NaAC,1％蔗糖,0.1％Tween 20,0.5g/mL PEG)混合在室温下反应10min后，取60μL反应液滴加到样品垫上，用试纸条荧光扫描仪在610nm波长下扫描试纸条的荧光强度。实验结果如图2，当浓度为0.01,0.02μM时，T线和C线处的荧光峰值较小，说明适配体浓度过小不足以与TC结合，当适配体浓度为0.05μM时，T线的吸收峰面积为668，峰值略低，而0.2μM时的峰值又过大会影响到反应的灵敏度，因此该反应选择0.08μM的适配体参与反应。

实施例3试纸条的灵敏度检测研究

1、Hg²⁺灵敏度检测

基于以上优化的检测条件，通过该基于适配体竞争法的试纸条分析了不同浓度的Hg²⁺标准液(400ppb,500ppb,600ppb,700ppb,800ppb,900ppb,1000ppb)取上述反应优化好的量的反应液，滴加到试纸条的样品垫上，每个样品重复三次，每个样品滴加时间相隔1min，放置10min后用试纸条荧光扫描仪扫描试纸条的荧光强度。

如图3，T线的荧光强度随着Hg²⁺浓度的增加荧光强度降低，并在500ppb-1ppm之间成线性。该方法检测灵敏度为500bp，标准曲线方程为用y＝-1.501x+1814.6，R²＝0.984。

2、Ag⁺灵敏度检测

基于以上优化的检测条件，通过该基于适配体竞争法的试纸条分析了不同浓度的Ag⁺标准液(400ppb,500ppb,600ppb,700ppb,800ppb,900ppb,1000ppb)，取上述反应优化好的量的反应液，滴加到试纸条的样品垫上，每个样品重复三次，每个样品滴加时间相隔1min，放置10min后用试纸条荧光扫描仪扫描试纸条的荧光强度。

如图4，T线的荧光强度随着Ag⁺浓度的增加荧光强度降低，并在500ppb-1ppm之间成线性。该方法检测灵敏度为500bp，标准曲线方程为y＝-1.5365x+1763.6，R²＝0.9815。

实施例4

在样品溶液中加入1ppm的不同离子(Pb²⁺,Cu²⁺,Li⁺,Zn²⁺,Na⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,K⁺,Hg²⁺和Ag⁺)，在上述优化好的实验条件基础上，代替Hg²⁺和Ag⁺进行实验，使用试纸条荧光扫描仪扫描试纸条的荧光强度，考察其他金属离子对此检测方法Hg²⁺和Ag⁺的干扰。在同样的反应条件下，用其他重金属离子进行试纸条实验，结果发现，其他重金属离子并不能使实验中T线荧光强度降低，说明试纸条有良好的特异性。而Hg²⁺、Ag⁺能使T线下降接近80％左右。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120> 一种可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒及方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacaaagaac ccccccccc 19

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttctttctt ccccccggtt gtttgtt 27

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaaaaaaaa aa 12

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttttttttt tt 12

Claims (10)

1.一种可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸适配体试纸条以及核酸适配体反应液；

所述核酸适配体试纸条包括样品垫、反应膜、吸收垫和底板；

所述反应膜上设置有检测线T线和质控线C线；

所述检测线T线固定包被有含有5'-AAC AAA GAA CCC CCC CCC C-3'的捕获序列；

所述质控线C线固定包被有质控探针；

所述核酸适配体反应液中包括序列为5'-X₁-TTT CTT TCT TCC CCC CGG TTG TTT GTT-Y₁-3'的核酸适配体，其中X₁为显示信号强度的指示剂，Y₁为与所述质控探针互补的序列。

2.根据权利要求1所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，其特征在于，在所述核酸适配体反应液中，所述核酸适配体的浓度为0.06μM～0.1μM；优选为0.08μM。

3.根据权利要求1所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，其特征在于，所述捕获序列和所述质控探针通过偶联生物素包被在标记有亲和素的所述反应膜上；

优选的，所述捕获序列的3'段偶联有5'-(CH₂)3-Biotin-3'。

4.根据权利要求1所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，其特征在于，所述X₁包括荧光物质、生物素、放射性同位素、电子致密物、胶体金或酶中的任一种。

5.根据权利要求4所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，其特征在于，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

6.根据权利要求1所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，其特征在于，所述Y₁包括PolyA、PolyT、PolyG或PolyC中的一种。

7.根据权利要求6所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，其特征在于，所述Y₁的核苷酸的数量为9～18个。

8.根据权利要求1所述的可同时检测汞和银离子的核酸适配体试剂盒，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

9.一种使用权利要求1～8任一项所述的试剂盒检测汞和/或银离子的方法，其特征在于，包括：

1).将核酸适配体反应液与待检离子液混合孵育得到反应混合物；

2).将所述反应混合物加到核酸适配体试纸条的样品垫上；

3).在质控线C线出现检测信号的前提下，检测检测线T线的信号值，将所述信号值代入预先建好的Hg²⁺和/或Ag⁺的浓度-信号值标准曲线，从而得知待检离子液中Hg²⁺和/或Ag⁺的含量。

10.根据权利要求9所述的检测汞和/或银离子的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述核酸适配体反应液与所述待检离子液的混合比为1：(7～11)；

优选的，在步骤2)中，所述反应混合物的上样量为50μL～70μL。