CN106770107A - 一种检测Hg2+的生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可用于环境监测、医疗卫生、食品安全、生命科学等领域的检测Hg2+的生物传感器及其制备方法。本发明利用表面正电荷修饰技术及静电作用将金纳米笼与Hg2+识别探针相结合，构建了带有分子生物门的纳米载体，通过特异性的分子识别反应，导致富含T碱基的单链DNA分子门被打开，释放出荧光分子，实现了荧光信号的检测。因此，利用该生物传感器，能够实现对Hg2+的高灵敏、高选择性检测。同时，基于本发明的纳米载体中客体分子的可控释放技术也为肿瘤靶向、药物输送、重大疾病的临床诊断与治疗提供新的途径和方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种Hg2+传感器及其制备方法，具体涉及一种可在生物体内、食品、医药以及环境中应用的用于检测Hg2+的生物传感器及其制备方法。
背景技术
众所周知，重金属污染对人类身体健康和生存环境造成了日益严重的影响。汞是一种具有严重生理毒性的重金属，具有高迁移性及生物富集性，广泛分布于各类环境介质和食物链中，通过迁移和转化作用，循环于水体、土壤、大气和生物圈等。Hg2+废水污染物是构成水体污染的重要组成部分，排入水中的无极汞污染物不能被生物降解，而是参与食物链循环，可被微生物转化为毒性更强的甲基汞，在生物体内大量富集后经过食物链(尤其是鱼类)进入人体，严重威胁着人类的健康，可造成中枢神经系统、内分泌系统及脑部的损害，此外，它可能还会破坏人体免疫系统，甚至导致死亡。为此，美国环境保护署(EPA)和欧共体分别提出了饮用水中汞的最大容许值为10nM和5nM。
因此，建立快速、灵敏、准确的Hg2+检测方法不仅有助于环境监测，同时对于临床医学、生命科学、食品卫生、医药及化妆品等诸多领域也有着重要的现实意义。
目前，Hg2+的检测方法主要包括：分光光度法、原子吸收/发射光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法(ICPMS)、冷蒸气原子荧光光谱法、色谱法、电化学法等，然而，相比于昂贵的仪器和试剂、繁杂的样品预处理、耗时的检测流程等，荧光法更适合于Hg2+的检测，不但较好地满足了方便、经济、快捷地检测要求，同时，还具有高灵敏、高选择性的优点，在水环境治理、临床医学、创造生态文明环境及保障人民健康方面具有重大的现实意义。
近年来，现代分子生物学技术及纳米新材料的发展为Hg2+的高灵敏、特异性生物传感检测技术提供了新的思路和有利条件，涌现出许多新技术、新方法。作为金纳米粒子家族中的新生代，金纳米笼一经问世就引发了广泛的关注和研究。研究表明，包括Hg2+在内的多种金属离子能够特异性地和核苷酸“桥连”，使之形成稳定的金属离子-碱基对。其中，Hg2+能够和错配的DNA碱基对T-T相互作用，形成稳定的T-Hg2+-T碱基对，这种特性已在生物传感的设计与应用方面显示出巨大的潜力，为Hg2+的检测提供了新型、特异、高效的检测平台。采用表面正电荷修饰的金纳米笼作为纳米容器，利用富含T碱基的单链DNA与金纳米笼表面的静电作用构建生物传感器的技术还未见文献报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，针对基于富含T碱基的单链DNA-金纳米笼的生物传感器未见报道，因此，本发明的第一目的：提出并构建一种新型的可用于检测Hg2+的生物传感器，即将金纳米笼与富含T碱基的单链DNA和表面正电荷修饰技术相结合，使该生物传感器具有可生物响应的分子门，一旦加入待测靶分子如Hg2+，将会发生Hg2+与富含T碱基的单链DNA之间的特异性分子识别反应，即在T-Hg2+-T的配位作用下，富含T碱基的单链DNA转变成类似发卡型的双螺旋结构，导致富含T碱基的单链DNA从金纳米笼表面脱离，使封堵笼孔的分子门被打开，并使孔内的客体分子如荧光分子被释放出来，体系的荧光信号得到增强。因此，可由体系的荧光强度的增加来指示Hg2+的存在及其浓度大小。利用该生物传感器，能够实现对Hg2+的高灵敏、高选择性检测，为环境监测、食品卫生、医药及化妆品等诸多领域的应用与研究提供新方法；本发明的第二目的：提供一种检测Hg2+的生物传感器的制备方法。将本发明提出的生物传感器用于Hg2+的荧光检测，能够显著地提高Hg2+检测的灵敏度和准确度。
本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明提出的检测Hg2+的生物传感器是以金纳米笼作为纳米载体，利用其空心多孔的结构特性，在其内部装载客体分子如荧光分子，为了防止荧光分子的外泄，通过在其表面组装富含T碱基的单链DNA分子门，将金纳米笼表面的孔封堵；其中，所述的富含T碱基的单链DNA是经过特别设计的，使之能够与Hg2+发生特异性的识别反应，它的碱基序列为3’-TTT GTT TGT TGG CCC CCC TTC TTT CTT A-5’，它可以通过静电作用被组装到金纳米笼表面，具体可以通过在金纳米笼表面修饰正电荷的方法而将其组装到金纳米笼表面，优选地采用正电荷修饰剂聚二烯丙基二甲基氯化铵在金纳米笼表面修饰一层聚阳离子。
优选地，上述的检测Hg2+的生物传感器，所述的荧光分子是罗丹明B。
一种制备本发明提出的检测Hg2+的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将磁珠与金纳米笼溶液混合，室温振荡8-12h，磁分离，移除上清液，加入阳离子表面修饰剂聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，室温振荡过夜；
(2)磁分离，移除上清液，加入荧光物质罗丹明B溶液，室温振荡过夜；
(3)加入富含T碱基的单链DNA溶液，室温振荡过夜；
(4)磁分离，清洗，即制得检测Hg2+的生物传感器。
本发明的有益效果：本发明提出的检测Hg2+的生物传感器是将金纳米笼与富含T碱基的单链DNA相结合，通过静电作用形成分子生物门，利用靶分子Hg2+与分子门之间的特异性的分子识别反应，使富含T碱基的单链DNA分子门被打开，释放出荧光分子，实现了荧光信号的检测，该方法使Hg2+的检测灵敏度得到显著提高，可实现对靶分子Hg2+高灵敏、高选择性的检测。本发明提出的的检测Hg2+的生物传感器具有结构简单，稳定性好，可控性强，荧光信号灵敏等优点，同时，不受其它常见干扰物质如Pb2+，Zn2+，Cd2+，Ni2+，Fe3+，Ca2+，Cu2+等离子的影响，具有高的选择性，可应用于环境监测、医疗卫生等领域Hg2+的荧光检测。实验结果表明，采用本发明提出并制备的检测Hg2+的生物传感器可在5.0×10-12～1.0×10-9M范围内实现对Hg2+的高灵敏、高选择性检测。该检测Hg2+的生物传感器及其制备方法和检测技术在环境监测、医疗卫生、食品安全、生命科学等领域具有较大的应用潜力和广阔的应用前景。
附图说明
图1不同Hg2+浓度的荧光信号强度。
图2 Hg2+浓度与荧光信号强度的线性关系。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。
实验仪器：THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；F-4600荧光分光光度计(日立，日本)；磁性分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心)。
实验试剂：3-4μm巯基修饰磁珠(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；罗丹明B(阿拉丁)；富含T碱基的单链DNA：3’-TTT GTT TGT TGG CCC CCC TTC TTT CTT A-5’(上海生工生物工程股份有限公司)，PBS缓冲溶液为0.01M(pH 7.4,Na2HPO4-NaH2PO4)。
实施例1：
一种制备本发明提出的检测Hg2+的生物传感器的方法，包括如下步骤：
(1)取20μL巯基磁珠，用PBS缓冲溶液清洗后与400μL金纳米笼均匀混合，室温振荡10h，磁分离，用PBS缓冲溶液清洗，移除上清液，向所得到磁珠-金纳米笼的复合物中加入200μL浓度为11.664mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，室温振荡10h；
(2)磁分离上述溶液，用PBS缓冲溶液清洗后加入100μL1.0×10-5mol/L罗丹明B的PBS溶液，室温振荡10h；
(3)向上述溶液加入10μL浓度为1.0×10-5M的富含T碱基的单链DNA溶液，37℃振荡12h，磁分离，移除上清液，检测Hg2+的生物传感器制备完成；
其中，所述的巯基磁珠是购买的商品(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；所述的金纳米笼按文献方法获得(G.D.Moon,S.W.Choi,X.Cai,W.Y.Li,E.C.Cho,U.Jeong,L.V.Wang and Y.N.Xia.J.Am.Chem.Soc.2011,133,4762–4765)。
实施例2:
一种利用本发明提出的生物传感器用于Hg2+的检测，方法如下：
(1)将Hg2+样品溶液加入到本发明提出的检测Hg2+的生物传感器中，用PBS缓冲溶液(PH＝7.4)稀释，37℃恒温振荡2h，发生Hg2+与富含T碱基的单链DNA之间的特异性分子识别反应，即在T-Hg2+-T的配位作用下，富含T碱基的单链DNA转变成类似发卡型的双螺旋结构，导致富含T碱基的单链DNA从金纳米笼表面脱离，使封堵笼孔的分子门被打开，并使孔内的客体分子罗丹明B被释放出来；
(2)磁分离上述溶液，收集上清液，荧光检测，检测条件：激发波长和发射波长分别为530、573nm。
图1为不同浓度的Hg2+对应的荧光信号强度，Hg2+的浓度分别为(0；1.0×10-13；5.0×10-13；1.0×10-12；5.0×10-12；1.0×10-11；4.0×10-11；8.0×10-11；1.0×10-10；5.0×10-10；1.0×10-9；1.0×10-8；1.0×10-7M)；图2为Hg2+浓度与荧光信号强度的线性关系。结果表明，Hg2+浓度在5.0×10-12～1.0×10-9M时，荧光信号强度与Hg2+浓度的对数值呈良好的线性关系，其线性方程为：FL＝332.6791+64.6606lgCHg 2+(10-13M)，线性相关系数为0.9963。
本发明将纳米技术与分子生物技术相结合，通过特异性的分子识别反应，可实现对Hg2+高灵敏、高选择性的检测。具体是将金纳米笼与富含T碱基的单链DNA和表面正电荷修饰技术相结合，使该生物传感器具有可生物响应的分子门，一旦有Hg2+存在，则发生Hg2+与富含T碱基的单链DNA之间的特异性分子识别反应，即在T-Hg2+-T的配位作用下，富含T碱基的单链DNA转变成类似发卡型的双螺旋结构，导致富含T碱基的单链DNA从金纳米笼表面脱离，使封堵笼孔的分子门被打开，并使孔内的客体分子罗丹明B被释放出来，因此，利用该生物传感器，能够实现对Hg2+的高灵敏、高选择性检测。
本发明提出的以金纳米笼为载体的的生物传感器具有结构简单，稳定性好，可控性强，荧光信号灵敏等优点，同时，不受其它常见干扰物质如Pb2+，Zn2+，Cd2+，Ni2+，Fe3+，Ca2+，Cu2+等离子的影响，具有高的选择性，可用于Hg2+的高灵敏、特异性检测，不但能够为环境监测、医疗卫生、食品安全、生命科学等领域重金属的检测提供新的途径和方法，同时，基于本发明的纳米载体中客体分子的可控释放技术也为肿瘤靶向、药物输送、重大疾病的临床诊断与治疗带来新的思路。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛科技大学
<120> 一种检测 Hg2+的生物传感器及其制备方法
<160> 1
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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Claims (5)
1.一种检测Hg2+的生物传感器，其特征在于：该传感器是由磁珠、金纳米笼、荧光物质和Hg2+识别探针构建而成。
2.一种如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于：所述的Hg2+识别探针是富含T碱基的单链DNA，它与Hg2+能够发生特异性的识别反应。
3.一种如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于：所述的Hg2+识别探针是碱基序列为3’-TTT GTT TGT TGG CCC CCC TTC TTT CTT A-5’的富含T碱基的单链DNA。
4.一种如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于：所述的Hg2+识别探针是通过静电作用被组装到金纳米笼表面。
5.一种如权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)将磁珠与金纳米笼溶液混合，室温振荡8-12h，磁分离，移除上清液，加入阳离子表面修饰剂聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，室温振荡过夜；
(2)磁分离，移除上清液，加入荧光物质罗丹明B溶液，室温振荡过夜；
(3)加入Hg2+识别探针，室温振荡过夜；
(4)磁分离，清洗，即制得检测Hg2+的生物传感器；
其中，所述的Hg2+识别探针的碱基序列为3’-TTT GTT TGT TGG CCC CCC TTC TTT CTTA-5’。
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