CN110823848A - 一种细胞内Ag+的荧光成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种细胞中Ag⁺的荧光成像方法，该方法通过设计并合成可与Ag⁺发生碱基错配识别的生物分子，并将其组装到具有中空、多孔结构特性的纳米金载体表面，构建具有“孔帽”的纳米金复合材料。当其进入细胞后，细胞内的Ag⁺因与纳米载体表面的生物分子作用使得生物分子脱离纳米载体表面，“孔帽”被打开，纳米载体内的染料分子得以释放，实现对细胞内Ag⁺的荧光成像。本发明所采用的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料具有结构简单、设计巧妙、性能稳定、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对Ag⁺选择性好、响应时间短、便于实时监测等诸多优点，能够方便、快捷地实现细胞内Ag⁺的高灵敏、高选择性的荧光成像。

Description

一种细胞内Ag+的荧光成像方法

技术领域

本发明涉及一种细胞内Ag⁺的荧光成像方法，具体涉及一种基于碱基错配识别技术的细胞内Ag⁺的荧光成像方法。

背景技术

作为重金属离子的银离子(Ag⁺)与汞离子(Hg²⁺)类似，是一种具有较高毒性的金属离子，也是一种广泛分布的环境污染物。即使在低浓度下，也会对环境和人类造成严重且永久性的毒害。更为严重的是，通过被污染的水源，Ag⁺可以在农产品和水产品中不断累积后进入人类的食物链。如果长时间暴露于Ag⁺存在的环境中，可能会导致人类在身体和神经系统方面的退行性疾病的缓慢发生。因此，建立高效、灵敏、经济的Ag⁺的检测方法在环境监测、食品安全和临床诊断等领域具有非常重要的意义。

目前，用于Ag⁺检测的传统方法主要包括等离子体质谱法(ICP-AES)、原子吸收/发射光谱法和极谱法等方法。但是，这些方法常常需要繁杂的操作、耗时的分析和昂贵、复杂的设备等，使它们在资源有限的环境中无法使用，另外，这些方法在检测灵敏度和选择性方面也有待改进。要克服这些缺点，迫切需要开发出既简单、灵敏、又经济、高效的测定方法来满足生物、医药、环境等领域对Ag⁺的检测需求。

由于金属离子可以与碱基对形成配位键，可以代替常规的Watson-Crick碱基对中的氢键形成金属-碱基对，这种作用对于金属离子快速、高效的检测具有重要意义，因此受到广泛关注。其中，胞嘧啶(C)可与Ag⁺形成C-Ag⁺-C碱基对，这种结合很稳定，可以利用这种特殊结构的生成实现对Ag⁺的检测。而且，由于C-C碱基错配只识别Ag⁺而形成Ag⁺侨联的碱基对，使得Ag⁺的检测具有非常高的特异性和选择性。本发明根据Ag⁺的这一反应特性，将其与富含胞嘧啶的核酸生物分子相结合，巧妙地应用到具有中空、多孔结构的纳米材料领域，为Ag⁺的高灵敏检测及其荧光成像提供了新型、特异、高效的技术。采用具有中空、多孔结构的纳米金作为纳米载体，利用C-C碱基错配对Ag⁺特有的生物识别作用构建纳米复合材料检测Ag⁺及其荧光成像技术还未见文献报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，针对基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料检测Ag⁺及其荧光成像技术未见报道，因此，本发明的第一目的：提出并构建一种新型的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料，具体是利用中空、多孔的纳米金作为纳米载体，设计并合成可被Ag⁺识别的生物分子，并将其组装到纳米载体表面，一方面作为“孔帽”用于封堵纳米载体的孔口，防止孔内物质的外泄；另一方面作为Ag⁺的识别探针可与Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应，当该纳米复合材料通过细胞内吞作用进入细胞后，组装在纳米载体表面的可被Ag⁺识别的生物分子就会与细胞内的Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应，形成C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米载体表面，从而使封堵的“孔帽”被打开，纳米载体内的染料分子得以释放，最终实现荧光信号的增强与成像检测。因此，可通过荧光信号的强弱指示细胞内Ag⁺的存在及其浓度大小。本发明所采用的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料具有结构简单、设计巧妙、性能稳定、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对Ag⁺选择性好、响应时间短、便于实时监测等诸多优点，能够方便、快捷地实现细胞内Ag⁺的高灵敏、高选择性的荧光成像，并为生物体内组织及细胞内相关生物分子的检测、荧光成像提供重要的技术和方法；本发明的第二目的：提供一种基于碱基错配识别技术的细胞内Ag⁺的荧光成像方法。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明提出的检测Ag⁺的纳米金复合材料是以中空、多孔结构的纳米金作为纳米载体，利用其中空、多孔的结构特性，在其内部装载客体分子如荧光染料，优选采用地荧光染料是罗丹明B。为了防止荧光染料的外泄，本发明设计并合成可被Ag⁺识别的生物分子，并将其组装到纳米载体表面形成“孔帽”用于封堵孔口，起到防止孔内物质外泄的作用；其中，所述的可被Ag⁺识别的生物分子是经过特别设计并合成的、具有一定碱基长度的、富含胞嘧啶的核酸生物分子，其碱基序列为5’-TCCTCC CTC CTT AAG GAA CCA CCC ACC A-3’，该生物分子作为Ag⁺的识别探针被组装到中空、多孔结构的纳米金表面后形成“孔帽”，而“孔帽”的组装则是通过在纳米载体表面预先修饰正电荷修饰剂的方法而实现的，优选采用地正电荷修饰剂是聚二烯丙基二甲基氯化铵。

一种采用基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料进行细胞内Ag⁺的荧光成像方法，包括如下步骤：

(1)设计并合成可与Ag⁺通过碱基错配识别的、具有一定碱基长度的、富含胞嘧啶的核酸生物分子，该核酸生物分子能够与Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应；

(2)将聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液与具有中空、多孔结构的纳米金载体混合，10-12h后离心分离，移除上清液；

(3)加入染料分子溶液，10-12h后加入(1)步设计并合成的、可识别Ag⁺的核酸生物分子溶液，10-12h后离心分离，移除上清液，用MOPS缓冲溶液稀释备用；

(4)取适量细胞悬浮液，离心分离，移除上清液，使用Ag⁺溶液培养细胞后离心，移除上清液；

(5)加入(3)步制得的溶液孵育细胞后进行激光共聚焦扫描成像；

其中，所述的可识别Ag⁺的生物分子，其碱基序列为5’-TCC TCC CTC CTT AAG GAACCA CCC ACC A-3’；所述的染料分子是罗丹明B；所述的细胞是宫颈癌细胞。

本发明的有益效果：本发明提出的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料是将可识别Ag⁺的生物分子与具有中空、多孔结构的纳米金材料相结合，通过设计并合成可被Ag⁺识别的生物分子，并将其组装到纳米载体表面形成“孔帽”，利用可识别Ag⁺的生物分子与Ag⁺发生的碱基错配识别反应，形成C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米载体表面，从而使封堵的“孔帽”被打开，纳米载体内的染料分子得以释放，实现了荧光信号的增强与成像检测。本发明所采用的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料具有结构简单、设计巧妙、性能稳定、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对Ag⁺选择性好、响应时间短、便于实时监测等诸多优点，尤为重要的是，C-C碱基错配只识别Ag⁺而形成Ag⁺侨联的碱基对，使得细胞内Ag⁺的荧光成像具有非常高的特异性和选择性，不会受到任何其它常见干扰物质如Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺等金属离子的影响，因此，能够方便、快捷地实现细胞内Ag⁺的高灵敏、高选择性的荧光成像，在生物体内或细胞内Ag⁺的成像检测领域发挥重要作用，同时也为肿瘤细胞荧光成像的研究和应用提供新的方法和技术。

可以预见，本发明提出的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料及其制备方法和荧光成像技术具有巨大的医学应用潜力和广阔的应用前景，将在重大疾病的早期诊断与治疗、食品、生物医药、医学、环境等诸多领域发挥重要的作用。

附图说明

图1.宫颈癌细胞中Ag⁺的荧光成像照片。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实验仪器：THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；Leica TCS SP5II激光共聚焦扫描仪(德国莱卡公司)。

实验试剂：聚二烯基丙二甲基氯化铵(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；罗丹明B(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；可被Ag⁺识别的生物分子是经过特别设计并合成的、具有一定碱基长度的、富含胞嘧啶的核酸生物分子，其碱基序列为5’-TCC TCC CTC CTTAAG GAA CCA CCC ACC A-3’(上海生工生物工程股份有限公司)，MOPS缓冲溶液为0.01M(pH7.0,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

实施例1：

一种制备本发明提出的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料的方法，包括如下步骤：

(1)设计并合成可与Ag⁺通过碱基错配识别的、具有一定碱基长度的、富含胞嘧啶的核酸生物分子，该核酸生物分子能够与Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应；

(2)将中空、多孔结构的纳米金载体溶液(400μL)离心，移除上清液，加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液(200μL，11.664mg/mL)，37℃10h后离心分离，移除上清液；

(3)加入罗丹明B溶液(2μL，终浓度1.0×10^-4mol/L)，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液稀释至100μL，37℃10h后加入可识别Ag⁺的生物分子溶液(10μL，终浓度1.0×10^-6mol/L)，37℃10h后离心分离，移除上清液，用MOPS缓冲溶液稀释备用；

其中，所述的可识别Ag⁺的核酸生物分子，其碱基序列为5’-TCC TCC CTC CTT AAGGAA CCA CCC ACC A-3’；所述的具有中空、多孔结构的纳米金材料按文献方法获得(W.Wang,C.Chen,X.X.Li,S.Y.Wang and X.L.Luo.Chem.Commun.,2015,51,9109–9112.)。

实施例2:

一种采用基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料进行细胞内Ag⁺的荧光成像的方法如下：

(1)取适量细胞悬浮液，离心分离，移除上清液，使用100μL终浓度为1.0×10^-4M的硝酸银溶液培养细胞，37℃、20.0min后离心，移除上清液；

(2)加入实施例1中制得的溶液，置于37℃恒温水浴箱孵育细胞15.0min后进行激光共聚焦扫描成像；

(3)将孵育好的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上，激发波长：559nm；接收波长：580-630nm；

其中，所述的细胞是宫颈癌细胞。

图1为宫颈癌细胞中Ag⁺的荧光成像照片。结果表明，当本发明提出的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料通过细胞内吞作用进入细胞后，组装在纳米载体表面的可被Ag⁺识别的生物分子与细胞内的Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应，形成C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米载体表面，从而使封堵的“孔帽”被打开，纳米载体内的染料分子得以释放，最终获得了细胞内Ag⁺的荧光成像结果。

本发明提出的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料具有结构简单、易合成、性能优异、稳定、经济、灵敏、高效等优点，并且不会受到其它常见干扰物质如Cd²⁺，Hg²⁺，Pb^{2 +}，Cu²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺等金属离子的影响，具有高的特异性和选择性，可用于肿瘤细胞中Ag⁺的高灵敏、高选择性的荧光成像，尤为重要的是，本发明提出的基于碱基错配识别技术的纳米金复合材料及其制备方法、Ag⁺的细胞成像及检测技术具有巨大的医学应用潜力和广阔的应用前景，将在重大疾病的早期诊断与治疗、食品、生物医药、医学、环境等诸多领域发挥重要的作用。

序列表

<110> 青岛科技大学

<120> 一种细胞内Ag⁺的荧光成像方法

<141> 2018-08-13

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcctccctcc ttaaggaacc acccacca 28

Claims (4)

1.一种细胞内Ag⁺的荧光成像方法，其特征在于利用设计并合成的、可与Ag⁺通过碱基错配识别的生物分子，并将其组装到具有中空、多孔结构特性的纳米金载体表面，一方面作为“孔帽”用于封堵纳米载体的孔口，防止孔内染料分子的外泄；另一方面作为Ag⁺的识别探针可与细胞内Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应，形成C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米金载体表面，从而使封堵的“孔帽”被打开，纳米载体内的染料分子得以释放，实现细胞内Ag⁺的荧光成像，步骤如下：

(1)设计并合成可与Ag⁺通过碱基错配识别的、具有一定碱基长度的、富含胞嘧啶的核酸生物分子，该核酸生物分子能够与Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应；

(2)将聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液与具有中空、多孔结构的纳米金载体混合，10-12h后离心分离，移除上清液；

(3)加入染料分子溶液，10-12h后加入(1)步设计并合成的、可识别Ag⁺的核酸生物分子溶液，10-12h后离心分离，移除上清液，用MOPS缓冲溶液稀释备用；

(4)取适量细胞悬浮液，离心分离，移除上清液，使用Ag⁺溶液培养细胞后离心，移除上清液；

(5)加入(3)步制得的溶液孵育细胞后进行激光共聚焦扫描成像。

2.一种如权利要求1所述的细胞内Ag⁺的荧光成像方法，其特征在于：所述的可与Ag⁺通过碱基错配识别的核酸生物分子，其碱基序列为5’-TCC TCC CTC CTT AAG GAA CCA CCCACC A-3’。

3.一种如权利要求1所述的细胞内Ag⁺的荧光成像方法，其特征在于：所述的染料分子是罗丹明B。

4.一种如权利要求1所述的细胞内Ag⁺的荧光成像方法，其特征在于：所述的细胞是Hela细胞。