CN108218822B - 一种检测羟胺的比值型荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测羟胺的荧光探针，为含有生物素基团的罗丹明衍生物，其中苯甲酸基团为羟胺的响应位点。所述探针与羟胺反应前荧光峰值约为637 nm，反应后峰值约为590 nm。通过两波长下的荧光强度比值变化，可以定性测定羟胺；在一定范围内，两波长下的荧光强度比值与羟胺浓度呈线性关系，可用于定量测定羟胺浓度。本发明提供的荧光探针特异性好、灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（550‑750 nm）。

Description

一种检测羟胺的比值型荧光探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种用于检测活细胞内羟胺的荧光探针及其合成方法。
背景技术
羟胺（NH2OH）是氨的一种氧化态，广泛应用于工业和医药领域。在生物体系内，羟胺可作为一氧化氮供体，并参与许多生物过程。在细胞代谢过程中，羟胺为L-精氨酸转化为一氧化氮过程中的一种中间体。该过程涉及到精氨酸肟水解为L-瓜氨酸和羟胺。随后，羟胺在过氧化氢存在的情况下和在过氧化氢酶的催化下转化为一氧化氮和过氧自由基。同时有研究表明，羟胺在过氧自由基的进攻下也可转化为一氧化氮。因而，在炎症细胞中，羟胺和过氧自由基易发生反应生成一氧化氮。例如，羟胺可作为小鼠肾脏血管的血管扩张剂。同时，羟胺可作为胰岛素释放的抑制剂，以及激活K+通道。因此，寻求一种快速灵敏的羟胺检测方法对于研究羟胺的生理功能具有重要的作用。
传统的羟胺检测方法主要有高效液相（HPLC）、气相（GC）、分光光度测定方法和循环伏安法等，但这些检测方法需要昂贵复杂的检测设备，且检测过程中较为繁琐，不适合大批量检测和实时检测。相比之下，荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、操作简单等优点，而且对生物样品基本没有损伤，已经广泛用于生物体系中各种生物小分子的检测。目前，能够用于检测细胞内羟胺的荧光探针未见报道。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好的羟胺荧光探针具有重要的意义。
发明内容
针对目前缺乏检测细胞内羟胺的荧光探针的问题，本发明提供一种检测细胞内羟胺的荧光探针，该探针选择性好、灵敏度高。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、成本低。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测羟胺的比值型荧光探针，其结构式如式（I）所示：
式（I）。
所述荧光探针为含有生物素基团的罗丹明衍生物，其中苯甲酸基团为羟胺的响应位点。
一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
（1）将原料1和原料2在浓硫酸中加热反应，反应完毕后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，缓慢滴加高氯酸析出红色固体，分离得化合物1：
；
（2）将罗丹明B和过量三氯氧磷在二氯乙烷中加热回流，反应得化合物2，然后除二氯乙烷：
；
（3）低温下将化合物2的二氯甲烷溶液加入化合物1的二氯甲烷溶液中，在三乙胺存在下反应，分离纯化得荧光探针：
。
所述步骤（1）中原料1与原料2的摩尔比为1:1。所述步骤（2）中罗明丹B与三氯氧磷的摩尔比为1:10。所述步骤（3）中化合物1与化合物2的摩尔比为1:1-1.2。
所述步骤（1）中反应温度为90-100℃。步骤（2）中加热温度为80℃。步骤（3）中，所述低温为0-4℃；反应温度为20-25℃。
所述步骤（1）中分离步骤为抽滤后干燥。所述步骤（3）中分离纯化步骤为反应液除溶剂，以二氯甲烷:甲醇= 10:1（v/v）为流动相，通过液相制备色谱或者柱层析提纯。
一种上述荧光探针在定性或定量荧光检测溶液或者细胞中羟胺的应用。
本发明的荧光探针的检测机理如下：当不存在羟胺时，荧光探针发射化合物1部分的荧光，峰值约为637 nm；在羟胺存在的条件下，可以将荧光探针中的苯甲酸部分转化为苯甲酰羟胺，淬灭化合物1部分的荧光，此时发射罗丹明荧光团的红色荧光，峰值约为590 nm。通过两波长下的荧光强度比值变化，可以定性测定羟胺；在一定范围内，两波长下的荧光强度比值与羟胺浓度呈线性关系，可用于定量测定羟胺浓度。
本发明具有以下优点：
本发明所述的检测活细胞内羟胺的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本发明所述的检测活细胞内羟胺的荧光探针具有高特异性，在进行相应羟胺检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内羟胺的实时测定，具有广阔的应用前景。本发明所述的检测活细胞内羟胺的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（550-750 nm），可以实现对活细胞内羟胺快速准确检测的目的。
附图说明
图1是化合物1的1H NMR图谱；
图2 是荧光探针的1H NMR图谱；
图3是荧光探针在不同浓度羟胺条件下的荧光光谱；
图4荧光探针与羟胺浓度的线性关系数据；
图5是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱；
图6是荧光探针在活细胞中的成像应用。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 荧光探针的合成
将原料1（1 mmol）和原料2（1 mmol）加入5 mL浓硫酸中，90℃加热反应4小时，冷却至室温。将反应液倒入10 mL冰水中，缓慢滴加2 mL高氯酸析出红色固体，分离纯化得荧光探针得纯品化合物1（产率52%），其1H NMR图谱见图1。
将罗丹明B（1 mmol）和1 mL三氯氧磷溶于15 mL二氯乙烷之中加热回流。反应3 h之后，旋转除掉二氯乙烷，加入15 mL二氯甲烷溶解。随后，在0℃下，将该溶液缓慢滴加到化合物1的二氯甲烷溶液中（含有0.2 mL三乙胺），25℃下搅拌4h。反应结束之后，将反应液旋干，通过液相制备/柱层析（二氯甲烷:甲醇 = 10:1）得到得纯品荧光探针（产率2%），其1HNMR图谱见图2。
实施例2荧光探针对羟胺的响应
以乙醇溶解实施例1中获得的探针化合物，加入PBS缓冲液配制成5μM探针缓冲溶液（含20%乙醇，pH = 7.4），为探针工作液。
以盐酸羟胺在水溶液中供应羟胺；加入到上述针缓冲溶液，使羟胺浓度从5 μM等差递增到200 μM，共40个，加入等量缓冲液为对照；然后进行荧光检测（λEx= 540nm），计算各体系中荧光强度；通过分析590 nm和637nm处的荧光强度比值与羟胺浓度的关系，评估该探针对羟胺的响应性能（见图3和图4）。图2表明，随着羟胺浓度的增大，溶液的590 nm处的荧光强度逐渐增强，而637nm处的荧光强度逐渐减弱。图4表明，当羟胺浓度在0-80 μM范围内，溶液的荧光强度比值与羟胺的浓度呈较好的线性关系，可采用公式Y = -0.02867x +3.3077表示，其中Y为637nm 和590 nm处的荧光强度比值，x为羟胺的浓度（μM）。
实施例3荧光探针对羟胺的特异性分析
取15份实施例2中的探针工作液5 mL，然后分别向该体系中依次加入50 μL浓度为200 μM的探针、Hcys、Na2S、Na2SO3、Cys、GSH、Vc、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、精氨酸、氨水、氯化铵等相关分析物的缓冲溶液，编号依次为1-14，其中编号15为羟胺。然后进行荧光检测（λEx= 540nm），计算各体系中荧光强度，评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性（见图5）。从图中看出，当探针溶液中加入Hcys、Na2S、Na2SO3、Cys、GSH、VC、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、精氨酸、氨水、氯化铵等相关分析物时，只有羟胺可以导致溶液产生显著的荧光变化，而加入其他小分子时溶液的荧光基本没有变化，这表示该探针只对羟胺有响应，而不受其他小分子的干扰。
实施例4荧光探针在活细胞中的成像
将宫颈癌细胞系（HeLa细胞）放在培养基（含10%BAS的DMEM培养基）中，放置于条件为37℃、5% CO2和20% O2的培养箱中培养24 -48h。用微量进样器吸取实施例1中获得的荧光探针溶液（10 μM）注入含有HeLa细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。加入100 μM羟胺溶液，继续培养30 min。之后用PBS（磷酸盐缓冲溶液）冲洗培养细胞3次，进行荧光成像（λEx= 561 nm）。结果见图6，其中A图为只加5 μM探针的细胞明场照片；B图为只加5 μM探针的细胞红色通道荧光照片（570-620 nm）；C图为只加5 μM探针的细胞近红外红色通道荧光照片（663-738 nm）；D图为图A、图B和图C的叠加照片；E图为加入5 μM探针和100 μM羟胺的细胞明场照片；F图为加入5 μM探针和100 μM羟胺的细胞红色通道荧光照片（570-620 nm）；G图为加入5 μM探针和100 μM羟胺的细胞近红外红色通道荧光照片（663-738 nm）；H图为图E、图F和图G的叠加照片。从A、B、C、D图中看出，只加入探针时，细胞近红外通道荧光较强，而红色通道荧光较弱；从E、F、G、H图中看出，加入5 μM探针和100μM羟胺之后，细胞产生明显的荧光变化，细胞近红外通道荧光减弱，而红色通道荧光增强，这表示该探针可用于检测细胞中的羟胺。

Claims (7)

1.一种检测羟胺的比值型荧光探针，其结构式如式（I）所示：
式（I）。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将原料1和原料2在浓硫酸中加热反应，反应完毕后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，缓慢滴加高氯酸析出红色固体，分离得化合物1：
；
（2）将罗丹明B和过量三氯氧磷在二氯乙烷中加热回流，反应后除二氯乙烷，得化合物2：
；
（3）0-4℃下将化合物2的二氯甲烷溶液加入化合物1的二氯甲烷溶液中，在三乙胺存在下反应，分离纯化得荧光探针：
。
3.一种如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中原料1与原料2的摩尔比为1:1；步骤（3）中化合物1与化合物2的摩尔比为1:1-1.2。
4.一种如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中反应温度为90-100℃；步骤（2）中加热温度为80℃；步骤（3）中，所述反应温度为20-25℃。
5.一种如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（1）中分离步骤为抽滤后干燥。
6.一种如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（3）中分离纯化步骤为反应液除溶剂，以体积比为10:1的二氯甲烷:甲醇为流动相，通过液相制备色谱或者柱层析提纯。
7.一种如权利要求l所述的荧光探针在制备用于定性或定量荧光检测溶液或者细胞中羟胺产品中的应用。
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