CN109705847B - 一种二氧化硫的比率荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种二氧化硫的比率荧光探针及其合成方法和应用。所述二氧化硫荧光探针，结构式为：

。本发明提供的荧光探针NaSF能够快速可逆的识别SO₂，消除了背景、环境、浓度的干扰，对检测环境及生物体系中的二氧化硫具有潜在的应用价值。此外，该探针成功应用于细胞成像，同时用于小鼠活体成像在生物体分析检测中显示出很大的优越性。

Description

一种二氧化硫的比率荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种检测二氧化硫荧光探针及其合成方法。

背景技术

二氧化硫(化学式SO₂)是最常见、最简单的硫氧化物。大气主要污染物之一。火山爆发时会喷出该气体，在许多工业过程中也会产生二氧化硫。在日常生活中，SO₂衍生物被广泛用作酶抑制剂、抗菌剂、医药产品、食品和饮料必不可少的防腐剂，它们大量用于范围广泛的行业。研究发现，暴露于高剂量的硫酸氢盐中，不仅是导致呼吸疾病，也与肺癌，心血管疾病的原凶，同时与许多神经系统疾病，如中风、偏头痛、阿尔兹海默症也有不可分的关系。二氧化硫吸入后会溶解到人体的血液中。轻度中毒时，发生流泪、畏光、咳嗽、咽喉痛；严重中毒者可在数小时之内发生肺水肿，出现心慌、胸闷、呼吸困难、咯血。长期低浓度接触，可出现头痛、头昏、乏力等全身症状。尽量避免接触有害气体。因此，发展一种有效快速检测二氧化硫及其衍生物的技术具有重要意义。

近年来，对生物体和环境中重要的物种进行检测是一个热点的研究课题。与其他分析工具相比，荧光探针具有操作简单，检测限低，灵敏度高等优点，被广泛用于生物化学，药学以及环境研究和工业领域中的诊断，监测和分析工具。文献中已经报道了一些检测二氧化硫荧光探针。然而，大多数探针是基于荧光强度变化检测二氧化硫的，该类探针容易受到样品环境条件、探针浓度等因素的影响。相反，比值荧光探针可以避免这些因素的影响。FRET(荧光能量共振转移机制)是目前设计比率荧光探针应用最广泛的方法之一，该机理设计的比值荧光探针有两个完全分开的发射峰，能有效的避免光谱重叠。基于此，本文根据亚硫酸氢或亚硫酸盐的亲核性，设计了以FRET荧光信号传感为原理可逆性检测二氧化硫的比率型荧光探针。此类可逆的比率型对研究SO₂在生物体内的生理功能具有重要意义。通过动力学实验证明，该探针能够快速可逆的识别SO₂。本发明所述的比率型荧光消除了背景、环境、浓度的干扰，对检测环境及生物体系中的二氧化硫具有潜在的应用价值。此外，该探针成功应用于细胞成像，同时用于小鼠活体成像在生物体分析检测中显示出很大的优越性。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种可逆检测二氧化硫的比率型荧光探针 (NaSF)，该探针选择性好、灵敏度高。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种可逆检测二氧化硫的比率型荧光探针，简称为NaSF，其结构式如式(I)所示：

式(I)。

一种上述探针的合成方法，包括以下步骤：

(1)4-溴-1,8-萘二甲酸酐与β-氨基丙酸在乙醇中加热回流，冷却至室温抽滤，提纯后得化合物1：

(2)在DCC(二环己基碳二亚胺)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)存在下，步骤(1)所得化合物1与哌嗪苯乙酮于无水二氯甲烷中在保护气氛下室温反应，提纯得到化合物2：

(3)化合物2与四氢吡咯，在保护气氛下，于乙二醇、甲醚混合液中加热回流，得到红色溶液；然后将其滴加到冰水后抽滤、提纯得橙黄色化合物3：

(4)在保护气下，化合物3与N,N二乙基水杨醛于浓硫酸中加热反应，然后将反应液加入过量高氯酸，混匀后加至冰水中，抽滤、提纯后得到荧光探针：

步骤(1)中，4-溴-1,8-萘二甲酸酐与β-氨基丙酸物质的量比为4:3。

步骤(1)中，反应温度为80-90℃。

步骤(1)中，反应时间为3-5h。

步骤(2)中，化合物1与哌嗪苯乙酮物质的量比为5:6。

步骤(2)中，反应时间为20-24h。

步骤(3)中，化合物2与四氢吡咯物质的量比为1:5。

步骤(3)中，反应温度为125-135℃。

步骤(3)中，反应时间为5-6h。

步骤(4)中，化合物3与N,N二乙基水杨醛物质的量比为1:1。

步骤(4)中，反应温度为85-95℃。

步骤(4)中，反应时间为5-6h。

步骤(2)、(3)、(4)中，保护气体选自氮气或氩气。

一种上述荧光探针在检测溶液、细胞和生物体中SO₂的应用。

所述SO₂在溶液、细胞和生物体中为HSO₃ ^-或SO₃ ^2-。

荧光探针的检测原理如下：

本发明所述的可逆识别二氧化硫的比率型荧光探针，在存在二氧化硫水溶液中，所发射的荧光由645nm(近红外)变成了550nm；在甲醛存在下，发射的荧光又变为645nm(近红外)。

本发明的有益效果为：

本发明提供的荧光探针NaSF对二氧化硫有响应，且在甲醛存在下荧光可逆，能够快速可逆的识别SO₂，消除了背景、环境、浓度的干扰，为生物及环境中检测二氧化硫的应用奠定了可靠的理论基础，对检测环境及生物体系中的二氧化硫具有潜在的应用价值。此外，该探针成功应用于细胞成像，同时用于小鼠活体成像在生物体分析检测中显示出很大的优越性。

附图说明

图1是荧光探针NaSF的核磁表征：¹H NMR谱(a)和¹³C NMR谱(b)；

图2是荧光探针NaSF不同浓度二氧化硫的滴定测试；

图3是荧光探针NaSF不同浓度甲醛的滴定测试；

图4是荧光探针NaSF在PBS缓冲液中二氧化硫及甲醛的动力学测试实验；

图5是荧光探针NaSF对不同离子的选择性；

图6是荧光探针NaSF的细胞成像测试；

图7是荧光探针NaSF的小鼠活体成像测试。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1荧光探针的合成

(1)将化合物1的合成

称取的4-溴-1,8-萘二甲酸酐(2.38g，16mmol)和的β-氨基丙酸(1.68g，12mmol)于合适的反应瓶中，加入10mL无水乙醇溶解，在氮气保护下，85℃的条件下加热回流3-5h，等体系温度冷却至室温时出现沉淀，然后抽滤，以二氯甲醛：甲醇＝20:1为淋洗液过硅胶柱纯化，得到灰色固体化合物1。

(2)化合物2的合成

称取化合物1(1.74g，5mmol)和哌嗪苯乙酮(1.3g，6mmol)于合适的反应瓶中，再加入DCC(1.5g，7.5mmol)和DMAP(30mg，0.25mmol)，然后加入10mL的无水二氯甲烷，在氮气保护下，室温搅拌20h，旋蒸，以二氯甲醛:甲醇＝30:1为淋洗液过硅胶柱提纯后得到化合物2。

(3)化合物3的合成

称取化合物2(3.2g，6mmol)和四氢吡咯(2.1g，30mmol)于反应瓶中，再加入10mL乙二醇甲醚使其溶解，在氮气保护下，130℃回流5h，然后加入冰水中，抽滤，以二氯甲醛：甲醇＝25:2为淋洗液过硅胶柱提纯，得到橙色固体化合物3。

(4)化合物NaSF的合成

称取化合物3(1.59g，1mmol)和N，N-二乙基水杨醛(193mg，1mmol)于合适的反应瓶中，加入5mL的浓硫酸作溶剂，在氮气保护下，90℃条件下搅拌5h。加热后颜色为灰褐色且随时间颜色逐渐加深。反应结束后，加入100μL高氯酸，搅拌混匀后，将其慢慢滴加入冰水中，然后抽滤后，以二氯甲醛：甲醇＝20:1为淋洗液过硅胶柱得荧光探针NaSF。

实施例2荧光探针NaSF对二氧化硫和甲醛响应测试配制浓度为1mM实施例1获得的荧光探针NaSF的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。

(1)测试溶液为2mL体系，探针的终浓度为10μM，测试使用的亚硫酸氢钠的终浓度分别为1μM、2μM、5μM-70μM(以5为公差递增)，其中含乙腈的体积分数为 20％。继而进行荧光检测(λ_ex＝440nm,λ_em＝540nm，645nm)。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与亚硫酸氢钠浓度标准曲线，如图2。由图2可知，随着亚硫酸氢钠浓度的增加，540nm处的荧光强度逐渐增加，645nm处的荧光强度逐渐降低，当亚硫酸氢钠浓度达到50μM时，反应体系荧光强度达到饱和状态。

(2)测试溶液为2mL体系，探针的终浓度浓度为10μM，测试时，亚硫酸氢钠的终浓度为50μM，其中含乙腈的体积分数为20％。然后加入不同浓度的甲醛浓度分别为5 μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、 120μM、150μM、200μM、300μM。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与甲醛浓度标准曲线，如图3。由图3可知，随着甲醛浓度的增加，540nm处的荧光强度逐渐减弱，645 nm处的荧光强度逐渐增强，当甲醛浓度达到200μM时，反应体系荧光强度达到饱和状态。

实施例3荧光探针NaSF对二氧化硫及甲醛响应的动力学测试配制探针终浓度为10μM，含20％乙腈(体积分数)的PBS溶液，体系pH为7.4，加入亚硫酸氢钠(终浓度为50μM)充分作用，约12s后加入终浓度为200μM的甲醛，从加入亚硫酸氢钠开始，每隔三秒进行荧光检测(λ_ex＝440nm，λ_em＝540nm和645nm)，得各体系中荧光强度，建立荧光强度I₆₄₅/I₅₄₀比值与时间的标准曲线，如图4。由图4可知，随着二氧化硫的加入540nm处的荧光强度与645nm处的荧光强度比值很快达到平衡，加入甲醛后，540nm处的荧光强度与645nm处的荧光强度比值约150s后达到平衡。

实施例4荧光探针NaSF对不同离子、活性小分子和氨基酸的选择性。

配制浓度为1mM实施例1获得的荧光探针NaSF的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液溶液待用。配制浓度为100mM的溶液(1-27号母液)作为备用：苯甲醛、NaNO₂、 NaF、TBHP(过氧化氢叔丁基)、KNO₃、KI、DTBP(过氧化二叔丁基)、MgCl₂、 NaCNS、NH₃PO4、KCl、NaBr、CaCl₂、H₂O₂、乙二醛、乙酸铵、BaCl₂、Hcy、NaClO、 ZnCl₂、探针NaSF、FeSO₄、CuCl₂、AlCl₃、Cys、Na₂S、NaHSO₃(100μM)。

在5mL的容量瓶中加入50μL探针母液、950μL乙腈、50μL不同离子(或氨基酸)或5μL活性氧，用PBS溶液(pH为7.4)定容，测试离子及氨基酸的浓度为 1mM，活性氧浓度为100μM，摇匀，然后进行荧光检测(λ_ex＝440nm,λ_em＝540nm， 645nm)，建立I₆₄₅/I₅₄₀与各离子的柱状图，如图5。由图5可以发现，各种离子(或氨基酸及活性氧小分子)对探针NaSF的荧光几乎没有影响。

实施例5荧光探针NaSF的细胞成像测试将适当密度的HeLa细胞接种到两个灭菌的35mm成像培养皿中，在CO₂培养箱(温度为 37℃，5％CO₂)中培养，待细胞贴壁后，向培养皿中加入实施例1获得的荧光探针 NaSF，使其终浓度均为10μM。继续培养0.5h，弃掉培养基，用PBS缓冲液(pH为 7.4)冲洗细胞三次，进行明场与荧光成像(λ_ex＝405nm,λ_em＝500-550nm(绿色通道)λ_em＝663-738nm(红色通道))，如图6a1-a4，可知，细胞具有微弱的绿色荧光，发出较强的红色荧光。随后向其中加入适量亚硫酸氢钠水溶液，终浓度为50μM，孵育0.5h后，PBS 缓冲液(pH为7.4)洗细胞三次后进行明场与荧光成像(λ_ex＝405nm,λ_em＝500-550nm(绿色通道)λ_em＝663-738nm(红色通道))，如图6b1-b4，可知，细胞红色荧光减弱，绿色荧光有一定的增强，但红色荧光与绿色荧光比值明显减弱。随后加入甲醛200μM，培养0.5h，弃掉培养基，用PBS缓冲液(pH为7.4)冲洗细胞三次，进行明场与荧光成像(λ_ex＝405nm,λ_em＝500-550nm(绿色通道)λ_em＝663-738nm(红色通道))，如图6c1-c4，可知，细胞具有很强的红色荧光，且比值与探针相近，说明该探针能够可逆的检测细胞中 SO₂。

实施例6荧光探针NaSF的小白鼠成像将4周大小的Balb/c小鼠注射一定量麻醉剂后，在其腹腔注射100μL 50μM实施例1获得的探针NaSF溶液，利用活体成像仪成像(λ_ex＝580nm，λ_em＝640nm)，如图7。由图7 可知，在仅注射探针的位置有很强的红色荧光，而在其原位置又注射二氧化硫后，在活体成像仪下显示无荧光，再次注射甲醛后荧光又变强。表明在活体动物内本发明的探针也能够可逆化检测。

Claims (6)

1.一种可逆检测二氧化硫的比率型荧光探针，其结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）4-溴-1,8-萘二甲酸酐与β-氨基丙酸在乙醇中加热回流，冷却至室温抽滤，提纯后得化合物1：

；

（2）在DCC和DMAP存在下，步骤（1）所得化合物1与哌嗪苯乙酮于无水二氯甲烷中在保护气氛下室温反应，提纯得到化合物2：

；

（3）化合物2与四氢吡咯，在保护气氛下，于乙二醇、甲醚混合液中加热回流，得到红色溶液；然后将其滴加到冰水后抽滤、提纯得橙黄色化合物3：

；

（4）在保护气氛下，化合物3与N,N二乙基水杨醛于浓硫酸中加热反应，然后将反应液加入过量高氯酸，混匀后加至冰水中，抽滤、提纯后得到荧光探针：

。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，4-溴-1,8-萘二甲酸酐与β-氨基丙酸物质的量比为4:3；步骤（2）中，化合物1与哌嗪苯乙酮物质的量比为5:6；步骤（3）中，化合物2与四氢吡咯物质的量比为1:5；步骤（4）中，化合物3与N,N二乙基水杨醛物质的量比为1:1。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，反应温度为80-90 ℃；步骤（2）中，反应时间为20-24 h；步骤（3）中，反应温度为125-135℃；步骤（4）中，反应温度为85-95 ℃。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）、（3）、（4）中，保护气氛选自氮气或氩气。

6.一种如权利要求1所述的探针在制备检测溶液、细胞和生物体中SO₂试剂的应用。

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