CN110128389A

CN110128389A - 一种检测二氧化硫的可逆荧光探针及其应用

Info

Publication number: CN110128389A
Application number: CN201910410184.1A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 马燕燕; 高雯杰; 赵玉萍
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2019-08-16

Abstract

本发明提供了一种检测二氧化硫的可逆荧光探针，结构式为：。可以通过5‑二甲氨基萘磺酰氯和1‑(4‑哌嗪‑1‑基‑苯基)乙酮反应的产物与N,N‑二乙基水杨醛反应制得。本发明提供的可逆荧光探针通过光谱实验对二氧化硫进行评估，并对该探针进行生物成像。本发明所述的比率型荧光消除了背景、环境、浓度的干扰，该可逆的比率型的SO₂荧光探针对于研究二氧化硫及其衍生物在生物体内的功能具有重要的意义。

Description

一种检测二氧化硫的可逆荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测二氧化硫的荧光探针及其应用。

背景技术

二氧化硫是最常见、最简单的硫氧化物。中国二氧化硫是大气中主要污染物之一，是衡量大气是否遭到污染的重要标志。世界上有很多城市发生过二氧化硫危害的严重事件，使很多人中毒或死亡。在我国的一些城镇，大气中二氧化硫的危害较为普遍而又严重。SO₂是一种无色具有强烈刺激性气味的气体，易溶解于人体的血液和其他黏性液。大气中的SO₂会导致呼吸道炎症、支气管炎、肺气肿、眼结膜炎症等。同时还会使青少年的免疫力降低，抗病能力变弱。研究发现，暴露于高剂量的硫酸氢盐中，不仅是导致呼吸疾病，也与肺癌，心血管疾病的原凶，同时与许多神经系统疾病，如中风、偏头痛、阿尔兹海默症也有不可分的关系，尽量避免接触有害气体。SO₂还能与大气中的飘尘黏附，当人体呼吸时吸入带有SO₂的飘尘，会使SO₂的毒性增强。研究表明，在高浓度的SO₂的影响下，植物产生急性危害，叶片表面产生坏死斑，或直接使植物叶片枯萎脱落；在低浓度SO₂的影响下，植物的生长机能受到影响，造成产量下降，品质变坏。因此，发展一种有效快速检测二氧化硫及其衍生物的技术具有重要意义。

近年来，对生物体和环境中重要的物种进行识别和成像是一个重要的研究课题。与其他分析工具相比，荧光探针具有操作简单，检测限低，灵敏度高等优点，被广泛用于生物化学，药学以及环境研究和工业领域中的诊断，监测和分析工具。FRET（荧光能量共振转移机制）是目前设计比率荧光探针应用最广泛的方法之一，该机理设计的比值荧光探针有两个完全分开的发射峰，能有效的避免光谱重叠，能消除背景、环境、浓度的干扰。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一种检测SO₂的荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液、细胞或生物体内SO₂的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测二氧化硫的可逆荧光探针，简称DSF，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）5-二甲氨基萘磺酰氯和1-(4-哌嗪-1-基-苯基)乙酮在二氯甲烷中以4-二甲氨基吡啶（DMAP）为催化剂，在二环己基碳二亚胺（DCC）存在、氮气保护下反应，反应结束后除去溶剂并提纯，得到化合物1：；

（2）氮气保护下，化合物1和N,N-二乙基水杨醛在浓硫酸中加热搅拌反应，反应结束后反应液滴加入0-4℃的水中，滴加高氯酸至沉淀完全，抽滤后固体提纯得荧光探针。

步骤（1）中，提纯方法为以二氯甲烷为淋洗剂，经硅胶柱提纯。

步骤（2）中，反应温度为90℃。

步骤（2）中，水与反应液的体积比为2-3:1。

步骤（2）中，提纯方法为以二氯甲烷：甲醇= 20:1为淋洗剂，经硅胶柱提纯。

一种上述荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中二氧化硫或亚硫酸氢盐试剂中的应用。

本发明的机理如下：

本发明利用FRET机制的优点根据亚硫酸氢或亚硫酸盐的亲核性，设计了基于丹酰氯为荧光团，以醛基C=O键为反应活性中心，亚硫酸氢或亚硫酸盐通过亲核加成进攻不饱和C=O键，使SO₂衍生物与其进行加成反应，而在甲醛存在下荧光又恢复原来的状态。在二氧化硫存在下，该探针所发射的荧光由近红外变成了绿光，在甲醛存在下，发射的荧光又变为近红外：

。

本发明具有以下优点：

本发明提供的可逆荧光探针通过光谱实验对二氧化硫进行评估，并对该探针进行生物成像。本发明所述的比率型荧光消除了背景、环境、浓度的干扰，该可逆的比率型的SO₂荧光探针对于研究二氧化硫及其衍生物在生物体内的功能具有重要的意义。

附图说明

图1：探针DSF的¹H NMR谱；

图2：探针DSF的¹³C NMR谱；

图3：探针DSF不同浓度的二氧化硫的滴定测试；

图4：探针DSF不同浓度的甲醛的滴定测试；

图5：探针DSF在PBS缓冲液中二氧化硫和甲醛的动力学测试实验；

图6：DSF探针对不同离子的选择性；

图7：DSF荧光探针的细胞成像测试；

图8：DSF荧光探针在小鼠体内的成像测试。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的合成

（1）称取1.345 g 5-二甲氨基萘磺酰氯（5 mmol）于合适的反应瓶中，加入1.3 g的1-(4-哌嗪-1-基-苯基)乙酮（6 mmol）再加入二环己基碳二亚胺（1.5 g，7.5 mmol）和4-二甲氨基吡啶（30 mg，0.25 mmol），然后在加入10 mL的无水二氯甲烷在氮气保护下室温反应24h，旋干后以二氯甲烷为淋洗剂，经硅胶柱提纯后得到化合物1：

；

（2）称取4.38 g化合物2（10 mmol）和氮氮二乙基水杨醛（1.93 g，10 mmol）于合适的反应瓶中，加入10 mL的浓硫酸作溶剂在氮气保护下90℃条件下搅拌6 h。加热后颜色为灰褐色且随时间颜色逐渐加深。反应结束后，将其慢慢滴加入冰水中加入1mL高氯酸然后抽滤，以二氯甲烷：甲醇= 20:1为淋洗剂，经硅胶色谱柱提纯后得到荧光探针DSF：

。

其¹H NMR图谱如图1所示，其¹³C NMR图谱如图2。

实施例2 荧光探针对不同浓度二氧化硫和甲醛的响应

测试溶液为2 mL体系，使得测试液中，探针的浓度为10 μM，测试使用的亚硫酸氢钠的浓度分别为1 µM、2 µM、5 µM、10 µM、15 µM、20 µM、30 µM、40 µM、50 µM、60 µM、70 μM，其中含乙腈的体积分数为20 %。继而进行吸收光谱测试和荧光检测（λ_ex= 365 nm）。如图3所示，随着亚硫酸氢钠浓度的增加，550 nm处的荧光强度逐渐增加，635 nm处的荧光强度逐渐降低，当亚硫酸氢钠浓度达到50 μM时，反应体系荧光强度达到饱和状态。

测试试液为2 mL体系，探针的浓度为10 μM，加入50 µM亚硫酸氢钠于溶液中。然后加入不同浓度的甲醛浓度分别为5 µM、10 µM、20 µM、30 µM、40 µM、50 µM、60 µM、70 µM、80µM、90 µM、100 µM、150 µM、200 µM、300 μM。如图4所示，随着甲醛浓度的增加，550 nm处的荧光强度逐渐减弱，635 nm处的荧光强度逐渐增强，当甲醛浓度达到200 μM时，反应体系荧光强度达到饱和状态。

实施例3 荧光探针检测二氧化硫和甲醛的动力学

配制探针终浓度为10 μM，含20 %乙腈溶液的PBS溶液，体系pH为7，每隔30 s进行荧光检测（λ_ex=365 nm，λ_em=550 nm和635 nm）。第90s时加入亚硫酸氢钠（终浓度为50 μM）反应，第4 min再加入甲醛（FA），使其终浓度为200 μM，得不同时间点体系中荧光强度，建立荧光强度比值与时间的标准曲线，结果如图5所示：加入亚硫酸氢钠后荧光比值迅速升高，能够在30s内达到平衡；加入甲醛后荧光比值下降。说明探针能够通过加入甲醛实现对二氧化硫的可逆检测。

实施例4 荧光探针对不同离子的选择性

配制探针终浓度为10 μM，含20%乙腈溶液的PBS溶液，体系pH为7，测试离子的浓度为2.5 mM，氨基酸的浓度为5 mM，活性氧活性氮浓度为100 μM。进行荧光检测（λ_ex= 365 nm,λ_em= 550 nm，635 nm），建立荧光强度比值与不同离子相对应的柱状图，如图6所示，其中，1-28号测试体系分别为：探针、KCl、乙二醛、DTBP（过氧化二叔丁基）、NaBr、KNO₃、MgCl₂、KI、NaNO₂、苯甲醛、NaCNO、TBHP（过氧化氢叔丁基）、NaF、乙酸铵、H₂O₂、Hcy、GSH、CaCl₂、AlCl₃、Cys、ZnCl₂、CuCl₂、NH₃PO₄、Na₂S、BaCl₂、FeSO₄、HClO、Na₂SO₃。结果显示，探针只能够对亚硫酸钠有响应，对其他物质几乎没有响应。

实施例5 荧光探针在活细胞中的成像应用

将适当密度的HeLa细胞接种到灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37℃，5 % CO₂）中培养，待细胞贴壁后，向培养皿中加入本发明所述检测二氧化硫的荧光探针DSF，使其终浓度均为5 μM。继续培养0.5 h，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞三次，其中一个加入适量亚硫酸氢钠水溶液，终浓度为50 μM，孵育0.5 h后。成像结束后向其中加入200 μM甲醛，孵育0.5 h后弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞三次，随后进行成像实验。如图7所示，只加入探针时，细胞具有很强的红色荧光，加入二氧化硫后红色荧光减弱，绿色荧光增强，加入甲醛后又恢复原来的红色荧光。

实施例6 荧光探针在小鼠中的成像应用

将4周大小的Balb/c小鼠注射一定量麻醉剂后，在其腹腔注射100 μL 50 μM的探针DSF溶液，利用活体成像仪成像（λex =580 nm，λem=640 nm），如图8所示：在仅注射探针的位置有很强的红色荧光，而在其原位置又注射二氧化硫后，在活体成像仪下随时间显示荧光减弱，在5min内达到稳定；再次注射甲醛后荧光又随时间推移而变强在10min内达到稳定。表明在活体动物内本发明的探针也能够可逆化检测。

Claims

1.一种检测二氧化硫的可逆荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，提纯方法为以二氯甲烷为淋洗剂，经硅胶柱提纯；步骤（2）中，提纯方法为以二氯甲烷：甲醇= 20:1为淋洗剂，经硅胶柱提纯。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，反应温度为90℃。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，水与反应液的体积比为2-3:1。

6.一种如权利要求1所述的荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中二氧化硫或亚硫酸氢盐试剂中的应用。